Summary
هنا نصف إثراء الحويصلات الصغيرة خارج الخلية المشتقة من أنسجة سرطان الكبد من خلال طريقة الطرد المركزي التفاضلي الأمثل.
Abstract
يمكن أن تعكس الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs) المشتقة من الأنسجة الحالة الوظيفية للخلايا المصدر وخصائص الفضاء الخلالي للنسيج. يعد الإثراء الفعال لهذه المركبات الكهربائية شرطا أساسيا مهما لدراسة وظيفتها البيولوجية ومفتاحا لتطوير تقنيات الكشف السريري وتكنولوجيا الناقل العلاجي. من الصعب عزل sEVs عن الأنسجة لأنها عادة ما تكون ملوثة بشدة. توفر هذه الدراسة طريقة للإثراء السريع ل sEVs عالية الجودة من أنسجة سرطان الكبد. تتضمن الطريقة عملية من أربع خطوات: حضانة الإنزيمات الهاضمة (كولاجيناز D و DNase Ι) بالأنسجة ، والترشيح من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر ، والطرد المركزي التفاضلي ، والترشيح من خلال مرشح غشاء 0.22 ميكرومتر. نظرا لتحسين خطوة الطرد المركزي التفاضلي وإضافة خطوة ترشيح ، فإن نقاء sEVs التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة أعلى من تلك التي حققها الطرد المركزي التفاضلي الكلاسيكي. يوفر منهجية مهمة وبيانات داعمة لدراسة sEVs المشتقة من الأنسجة.
Introduction
يبلغ قطر الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs) حوالي 30 نانومتر إلى 150 نانومتر وتفرزها خلايا مختلفة1. يمكنهم التواصل مع خلايا الأنسجة وتنظيم البيئة المكروية المحلية أو البعيدة عن طريق نقل جزيئات بيولوجية مهمة مثل الدهون والبروتينات والحمض النووي والحمض النووي الريبي إلى مختلف الأعضاء والأنسجة والخلايا والأجزاء داخل الخلايا. وبالتالي ، يمكنهم أيضا تغيير سلوك الخلايا المتلقية 2,3. يعد عزل وتنقية sEVs المحددة شرطا أساسيا لدراسة سلوكها البيولوجي أثناء تطور المرض ومساره. يستخدم الطرد المركزي التفاضلي - الذي يعتبر المعيار الذهبي - بشكل شائع لفصل sEVs عن الأنسجة التي يقيمون فيها عادة4. يمكن إزالة حطام الأنسجة وحطام الخلايا والحويصلات الكبيرة والأجسام المبرمج بواسطة هذه التقنية ، مع ترك sEVs فقط.
لقد ثبت أن كولاجيناز D و DNase I لا يؤثران على الخصائص الجزيئية للخلايا أو الحويصلات ، حيث تساهم خصائص كلا الإنزيمين في إطلاق الحويصلات في المصفوفة خارج الخلية 5. تم استخدام هذه الإنزيمات لاستخراج sEVs من أنسجة سرطان الجلد النقيلي البشري ، وأنسجة سرطان القولون ، والأنسجة المخاطية القولونية5،6،7. ومع ذلك ، فإن تركيز ووقت هضم كولاجيناز D و DNase I في هذه الطرق يختلفان ، مما يؤدي إلى استنتاجات غير متسقة. لتجنب الترسيب المشترك لأنواع فرعية أخرى من sEVs ، قام الباحثون بإزالة حويصلات أكبر خارج الخلية (قطرها 0.1 ميكرومتر أو 0.2 ميكرومتر) عن طريق الترشيح و / أو الطرد المركزي التفاضلي8. اعتمادا على الأنسجة المصدر ، قد تكون هناك حاجة إلى طرق مختلفة للعزل والتنقية 9,10.
يؤدي استخدام طريقة الطرد المركزي التفاضلي التقليدي لاستخراج sEVs من أنسجة الكبد إلى طبقة من المادة البيضاء على سطح المادة الطافية ، دون أي طريقة لتحديد خصائصها. في دراسة سابقة11 ، وجد أن هذه الطبقة من المادة البيضاء تؤثر على نقاء sEVs. على الرغم من أن عدد الجسيمات وتركيز البروتين للعينات المعزولة بالطريقة التقليدية كانا أعلى من تلك الموجودة في الطريقة الحالية ، إلا أن معامل الاختلاف كان كبيرا ، ربما لأن العديد من الملوثات يمكن أن تؤدي إلى ضعف تكرار النتائج. أي باستخدام المنظفات (أي اكتشاف قابلية ذوبان الجسيمات في 1٪ Triton X-100) ، وجدنا أن نقاء sEVs التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة كان أكبر. ومن ثم ، فإننا نستخدم هذه الطريقة لعزل وتنقية sEVs المشتقة من أنسجة سرطان القولون والمستقيم للبحث البروتيني.
في الوقت الحاضر ، تركز الأبحاث حول sEVs في سرطان الكبد بشكل أساسي على المصل والبلازما والمادة الطافية لثقافة الخلايا12،13،14. ومع ذلك ، يمكن أن تعكس sEVs المشتقة من أنسجة سرطان الكبد بشكل أكثر دقة علم الأمراض الفسيولوجية والبيئة المكروية المحيطة بسرطان الكبد وتتجنب بشكل فعال تدهور وتلوث المركبات الكهربائية الأخرى15,16. مع استخدام الطرد المركزي التفاضلي ، يمكن لهذه الطريقة إثراء الغلة والحصول على sEVs عالية الجودة ، مما يوفر أساسا مهما لمزيد من الدراسة لسرطان الكبد. تتيح هذه الطريقة فصل أنسجة سرطان الكبد عن طريق الفصل الحاد وفصلها عن طريق كولاجيناز D و DNase I. بعد ذلك ، تتم إزالة الحطام الخلوي والحويصلات الكبيرة والأجسام المبرمج عن طريق الترشيح والطرد المركزي التفاضلي. أخيرا ، يتم عزل sEVs وتنقيتها للدراسات اللاحقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم جمع أنسجة سرطان الكبد البشري من المرضى الذين تم تشخيص إصابتهم بالأورام الخبيثة الكبدية في المستشفى الأول التابع لجامعة جنان الطبية. وقع جميع المرضى على نموذج موافقة مستنيرة ، وتمت الموافقة على جمع عينات الأنسجة البشرية من قبل لجنة الأخلاقيات في المستشفى الأول التابع لجامعة جنان الطبية. راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والمعدات والبرامج المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. التحضير
- ضع شاكر إزالة اللون في الحاضنة واضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية. انظر الشكل 1 لجميع المعدات الأخرى المطلوبة.
- نظف المشرط والملقط عن طريق رشها بنسبة 75٪ كحول.
- تحضير محلول الهضم عن طريق قياس 6 ملغ من كولاجيناز D (4 ملغ / مل) و 24 ميكرولتر من DNase Ι (80 وحدة / مل) وإضافتها إلى 1.5 مل من الوسط الأساسي RPMI-1640. تخلط عن طريق انقلاب لطيف حتى تذوب المواد المضافة تماما.
- مقدما ، رطب مصافي الخلايا 70 ميكرومتر و 0.22 ميكرومتر مع 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
- ضع طبق زراعة خلايا معقمة 100 مم على صندوق الثلج لتثبيت أنسجة الكبد بعد إذابة الجليد.
- في غضون 15 دقيقة بعد عزل أنسجة سرطان الخلايا الكبدية ، شطف الدم على سطح كتلة الأنسجة مع برنامج تلفزيوني ، ونقل الأنسجة إلى أنبوب مجمد معقم ، وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى التجربة لمدة لا تزيد عن 2 أسابيع.
2. تفكك الأنسجة
- أخرج عينة الأنسجة من الفريزر -80 درجة مئوية وضع حوالي 400 مجم من الأنسجة المقطعة إلى شظايا 2 مم × 2 مم × 2 مم - في طبق زراعة الخلايا 10 سم على صندوق الثلج.
- نقل الأنسجة إلى لوحة 6 آبار مع 1.5 مل من محلول الجهاز الهضمي. بعد ذلك ، ضع اللوحة على شاكر إزالة اللون (20 دورة في الدقيقة / دقيقة) لاحتضانها لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية للتفكك الكامل لأنسجة سرطان الكبد وإطلاق sEVs.
- أخرج اللوحة المكونة من 6 آبار من الحاضنة وضعها على صندوق الثلج. أضف 80 ميكرولتر من مثبطات الفوسفاتيز و 200 ميكرولتر من محلول مثبط الأنزيم البروتيني الكامل لوقف عملية الهضم.
- انقل المحلول الهضمي إلى مصفاة الخلايا 70 ميكرومتر وقم بترشيحه ببطء لإزالة أي بقايا أنسجة كبيرة. اجمع المرشح وضعه في أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل.
3. الطرد المركزي التفاضلي
ملاحظة: قم بتنفيذ جميع خطوات الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية.
- أجهزة الطرد المركزي المرشح في 500 × غرام لمدة 10 دقائق وجمع طاف في أنبوب طرد مركزي جديد 2 مل. يمكن بعد ذلك إزالة معظم بقايا الأنسجة الصغيرة.
- جهاز طرد مركزي على متن المادة الطافية عند 3000 × جم لمدة 20 دقيقة لإزالة حطام الخلية. انقل المادة الطافية بعناية إلى أنبوب طرد مركزي جديد حتى يصبح طرف الماصة على وشك لمس المادة البيضاء على السطح.
- أجهزة الطرد المركزي السائل المتبقي عند 3000 × جم لمدة 3 دقائق ؛ ثم ، نضح الطافي لتسهيل جمع الحويصلات. لضمان نقاء sEVs ، تأكد من عدم استنشاق المادة البيضاء.
- أجهزة الطرد المركزي التي تم جمعها عند 12000 × جم لمدة 20 دقيقة ونقل 900 ميكرولتر من المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي فائق سعة 4.7 مل. قم بطرد السائل المتبقي عند 12000 × جم لمدة 3 دقائق ثم قم بجمع وخلط كل من المواد الطافية في نفس أنبوب الطرد المركزي الفائق. املأ الأنبوب بالكامل باستخدام برنامج تلفزيوني.
- أجهزة الطرد المركزي للطاف في 100000 × غرام لمدة 60 دقيقة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات عن طريق ملء أنبوب الطرد المركزي الفائق ب PBS والطرد المركزي مرة أخرى عند 100000 × جم لمدة 60 دقيقة. أعد تعليق الحبيبات ب 50 ميكرولتر من PBS.
- نضح تعليق sEV باستخدام حقنة معقمة 1 مل وترشيحه من خلال مرشح غشاء 0.22 ميكرومتر. اجمع المرشح في أنبوب طرد مركزي سعة 600 ميكرولتر وقم بتخزينه في درجة حرارة -80 درجة مئوية لمزيد من التحليل.
4. تقييم جودة التخصيب
- مراقبة مورفولوجيا sEVs تحت المجهر الإلكتروني الإرسال.
- بعد ذلك ، قم بإسقاط 10 ميكرولتر من عينة sEV على شبكة نحاسية ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، وتنظيفها بالماء المقطر المعقم ، باستخدام ورق ماص لإزالة السائل الزائد.
- قم بإسقاط 10 ميكرولتر من أسيتات اليورانيل 2٪ على شبكة النحاس للتلطيخ السلبي لمدة دقيقة واحدة. استخدم ورق الترشيح لامتصاص السائل الموجود على سطح الشبكة النحاسية وتجفيفه لمدة 2 دقيقة تحت مصباح متوهج.
- راقب الشبكة النحاسية تحت المجهر الإلكتروني النافذ والصورة عند 80 كيلو فولت.
- استخدم مقياس تدفق الجسيمات النانوية لتحديد توزيع حجم ونقاء sEVs.
- قبل بدء تشغيل الماكينة ، قم بإعداد أنابيب تحتوي على 200 ميكرولتر من مراقبة الجودة ، و 200 ميكرولتر من الكريات النانوية السيليكا ، و 2 × 200 ميكرولتر من الماء عالي النقاء ، و 2 × 200 ميكرولتر من محلول التنظيف ، و 200 ميكرولتر من PBS.
ملاحظة: قبل اختبار عينات sEV ، من الضروري إجراء مراقبة الجودة على الجهاز واختبار معيار حجم الجسيمات (يجب حساب توزيع الحجم باستخدام منحنيات قياسية تم إنشاؤها باستخدام عدة كرات نانوية دقيقة بأقطار مختلفة [68-155 نانومتر] تحت نفس حالة الكشف). تم تخفيف حبات مراقبة الجودة والكريات النانوية السيليكا 100x بماء فائق النقاء بحجم إجمالي يبلغ 200 ميكرولتر. - تحقق من حجم محلول التنظيف (>10 مل) ولاحظ الفرق بين مستويات سائل الغمد وسائل النفايات (20-30 سم).
- قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة الرئيسي للأداة ؛ بعد 20 ثانية ، قم بتشغيل الكمبيوتر وانتظر أصوات التنبيه التي تشير إلى أن الجهاز متصل بشكل صحيح لتشغيل البرنامج.
- انقر فوق بدء التشغيل لتشغيل الكاميرا والليزر ومضخة الهواء.
- انقر فوق غمد التدفق - بدء التشغيل ، وضع الماء عالي النقاء على منصة التحميل. بعد 4 دقائق (العد التنازلي للأداة) ، انقر فوق تعزيز العينة | عينة تفريغ.
- بعد 30 ثانية ، ضع الأنبوب الفارغ على منصة التحميل وانقر على تعزيز العينة | عينة تفريغ. بعد ذلك ، ضع الأنبوب الذي يحمل الماء عالي النقاء على منصة التحميل ، وفي نفس الوقت ، انقر فوق تعزيز العينة | غمد التدفق تطهير.
- انقر فوق التشغيل اليدوي وضع أنبوب تركيز الجسيمات على منصة التحميل. ثم ، انقر فوق تعزيز العينة لمدة 1 دقيقة وحدد في نفس الوقت 250 نانومتر Std FL SiNPs مراقبة الجودة في "SAMP. إنف."
- انقر فوق أخذ العينات وقم بتشغيل الكاشف بالنقر فوق SPCM.
ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن رؤية شكل موجة الإشارة في الوقت الفعلي. - انقر فوق أخذ العينات التلقائي وأدخل 1.0 في Sampling SET لإصلاح الضغط عند 1 كيلو باسكال. انقر فوق شريط الأدوات وحدد إشارة كبيرة.
- اضبط الوضع الأفقي لليزر واضبط الليزر على 2 ميكرومتر ؛ ثم ، انقر فوق L أو R للتأكد من أن الإشارة قوية وموحدة.
- انقر فوق وقت التسجيل لجمع البيانات ، والتي ستنتقل تلقائيا إلى Buffer عند الانتهاء. بعد ذلك ، احفظ البيانات في ملف Naf وانقر فوق نموذج إلغاء التحميل.
- ضع أنبوب محلول التنظيف على منصة التحميل ، وانقر فوق تعزيز العينة ، وبعد 1 دقيقة ، انقر فوق تفريغ العينة. استخدم الماء عالي النقاء لإزالة محلول التنظيف المتبقي من طرف الشعيرات الدموية.
- ضع الأنبوب القياسي بحجم الجسيمات على منصة التحميل وانقر على تعزيز العينة لمدة 1 دقيقة.
- حدد 68-155 نانومتر Std FL SiNPs مراقبة الجودة في "SAMP. Inf" وانقر على أخذ عينات العينة. ثم ، انقر فوق شريط الأدوات وحدد إشارة صغيرة.
- انقر فوق وقت التسجيل لجمع البيانات ، والتي ستنتقل تلقائيا إلى Buffer عند الانتهاء. بعد ذلك ، احفظ البيانات في ملف Naf وانقر فوق نموذج إلغاء التحميل.
- ضع أنبوب محلول التنظيف على منصة التحميل ، وانقر فوق تعزيز العينة ، وانقر فوق تفريغ العينة بعد 1 دقيقة. استخدم الماء عالي النقاء لإزالة محلول التنظيف المتبقي من طرف الشعيرات الدموية.
- ضع أنبوب PBS على منصة التحميل ؛ انقر فوق تعزيز العينة لمدة 1 دقيقة.
- حدد 68-155 نانومتر Std FL SiNPs مراقبة الجودة في "SAMP. Inf" وانقر على أخذ عينات العينة. ثم ، انقر فوق شريط الأدوات وحدد إشارة صغيرة.
- انقر فوق وقت التسجيل لجمع البيانات ، والتي ستنتقل تلقائيا إلى المخزن المؤقت عند الانتهاء. احفظ البيانات في ملف Naf وانقر فوق نموذج إلغاء التحميل.
- ضع أنبوب محلول التنظيف على منصة التحميل ، وانقر فوق تعزيز العينة وتفريغ العينة بعد 1 دقيقة. استخدم الماء عالي النقاء لإزالة محلول التنظيف المتبقي من طرف الشعيرات الدموية.
- تحقق من معلومات العينة كما هو موضح سابقا في الخطوات 4.2.17-4.2.20 ؛ قم بتغيير PBS (الخطوة 4.2.17) إلى عينة sEV وتحليل البيانات.
- قبل بدء تشغيل الماكينة ، قم بإعداد أنابيب تحتوي على 200 ميكرولتر من مراقبة الجودة ، و 200 ميكرولتر من الكريات النانوية السيليكا ، و 2 × 200 ميكرولتر من الماء عالي النقاء ، و 2 × 200 ميكرولتر من محلول التنظيف ، و 200 ميكرولتر من PBS.
- مزيد من تحديد sEVs بواسطة لطخة الغربية.
- تحديد تركيزات البروتين من sEVs والأنسجة باستخدام مجموعة قياس كمية البروتين BCA وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- احسب حجم تحميل sEVs (على سبيل المثال ، ل 5 ميكروغرام من البروتين لكل بئر) بناء على هذه النتائج الكمية. أضف مخزن التحميل بنسبة 1: 4 ودوامة الخليط.
- بعد تغيير الطبيعة في حمام معدني 100 درجة مئوية (ترموستات جاف) لمدة 10 دقائق ، افصل البروتين على جل بولي أكريلاميد 12٪ عند 60 فولت لمدة 80 دقيقة.
- انقل الجل إلى غشاء ثنائي فلوريد البولي فينيليدين 0.22 ميكرومتر عند 220 مللي أمبير لمدة ساعتين باستخدام مخزن النقل المؤقت (25 مللي متر تريس ، 192 مللي مول جليكاين ، 20٪ ميثانول).
- سد الغشاء ب 5٪ حليب جاف منزوع الدسم في Tween محلول ملحي مخزن من Tris (TBST) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة واحتضانه بالجسم المضاد الأساسي (الجسم المضاد CD9 أحادي النسيلة للأرانب ، الجسم المضاد CD63 أحادي النسيلة للأرانب ، الجسم المضاد TSG101 أحادي النسيلة للأرانب ، الجسم المضاد GM130 أحادي النسيلة للفأر) طوال الليل عند 4 درجات مئوية. تمييع الأجسام المضادة الأولية في 5٪ حليب خالي الدسم في 1: 1000.
- بعد ثلاث غسلات مع TBST ، احتضان الغشاء مع بيروكسيديز الفجل (HRP) - الجسم المضاد الثانوي المترافق في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
- اكتشف الجسم المضاد المرتبط ب HRP باستخدام ركيزة نشاف ECL ، ثم اجمع الصور وحللها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لعبت sEVs من أنسجة سرطان الكبد البشرية دورا حاسما في تشخيص وعلاج وتشخيص مرضى سرطان الكبد. استخدمت هذه الطريقة أدوات مخبرية شائعة لعزل وتنقية sEVs المشتقة من أنسجة سرطان الكبد. قد يوفر هذا دعما منهجيا لدراسة المركبات الكهربائية السريعة. يوضح الشكل 2 العملية العامة لإثراء sEVs من أنسجة سرطان الكبد. يتم إطلاق sEVs في المساحات بين الخلايا للأنسجة بالكامل من خلال قطع الأنسجة والتحلل الأنزيمي. علاوة على ذلك ، يتم ترشيح المحلول الهضمي من خلال مرشحات 70 ميكرومتر لإزالة شظايا الأنسجة الكبيرة. علاوة على ذلك ، تم تنفيذ خطوات الطرد المركزي التفاضلي (عند 500 × جم ، و 3000 × جم ، و 12000 × جم) لإزالة حطام الأنسجة الصغيرة ، وحطام الخلايا ، والحويصلات الكبيرة ، والأجسام المبرمج (الشكل 3A-C).
للحصول على sEVs عالية النقاء ، تم تكرار خطوتين للطرد المركزي التفاضلي (عند 3000 × جم و 12000 × جم) لمدة 3 دقائق حتى تمت إزالة المادة البيضاء على السطح. تم طرد المادة الطافية التي تم جمعها بالطرد المركزي عند 100000 × جم لمدة 60 دقيقة لإزالة المواد القابلة للذوبان ، ثم تم غسل الكريات عن طريق تعليقها في برنامج تلفزيوني (الشكل 3D ، E). بعد الطرد المركزي عند 100000 × جم لمدة 60 دقيقة ، تم إعادة تعليق الحبيبات في 50 ميكرولتر من PBS. أخيرا ، تم ترشيح العينة من خلال غشاء 0.22 ميكرومتر وجمعها في أنبوب طرد مركزي 600 ميكرولتر (الشكل 3F) لإزالة تداخل المواد الجيلاتينية وتحسين نقاء sEVs.
تم فحص sEVs المنقى تحت المجهر الإلكتروني النافذ ، والذي كشف عن وجود sEVs مع مورفولوجيا على شكل كوب (الشكل 4A ، B). تراوح حجم الجسيمات من 40 نانومتر إلى 200 نانومتر ، وكان متوسط حجم الجسيمات 89 نانومتر (الشكل 5 أ ، ب). قمنا بتقييم جودة الحويصلات من خلال نسبة الحويصلات في جميع الجسيمات بناء على قابلية ذوبان الجسيمات في 1٪ Triton X-100. تم حساب نقاء sEVs على النحو التالي (1 - C2 / C1) × 100٪ ، حيث يمثل C1 و C2 أعداد الجسيمات المكتشفة قبل 1 ساعة من وبعد معاملة Triton X-100 ، على التوالي11. أظهرت هذه البيانات أن نقاء sEVs المخصب كان 68.32٪ (الشكل 5C-E). بعد استخراج sEVs من أنسجة سرطان الكبد ، تمت معالجة العينات باستخدام PBS و 1٪ Triton X-100 لتقييم نقاء sEVs. بعد العلاج ، تم تمييز sEVs بجزيئات FITC CD9 و CD9 + للكشف عنها في مقياس تدفق الجسيمات النانوية. وجد أن عدد جسيمات CD9 + في مجموعة الاختبار انخفض (الشكل التكميلي S1). تم الكشف عن علامات البروتين من sEVs - مثل CD63 و CD9 و TSG101 - بواسطة اللطخة الغربية. تم استخدام GM130 كعلامة تحكم سلبية ل sEVs12 ، والتي تم العثور عليها في خلايا الأنسجة ولكن ليس في sEVs (الشكل 6). تم الكشف عن علامات البروتين من sEVs المشتقة من الخلايا والأنسجة - CD63 و ALIX و TSG101 - بواسطة اللطخة الغربية. تم استخدام GM130 كعلامة تحكم سلبية ل sEVs (الشكل التكميلي 2).
الشكل 1: متطلبات البروتوكول. أ: صحن زراعة خلايا 100 مم، ومشرط، وملاقط لتقطيع الأنسجة، ب: صفيحة من 6 آبار، ج: مصفاة خلوية قياسها 70 ميكرومتر، مرشح غشائي 0.22 ميكرومتر، وكأس زجاجية لتنظيف مصفاة الخلية، د: حقنة معقمة سعة 1 مل، ه: أنبوب طرد مركزي فائق سعة 4.7 مل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: عملية إثراء الحويصلات الصغيرة خارج الخلية من أنسجة سرطان الكبد. تم وزن الأنسجة المجمدة وتقطيعها بمشرط وتحضينها بوسط RPMI-1640 وكولاجيناز D و DNase Ι لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تم إثراء الحويصلات الصغيرة خارج الخلية عن طريق مزيد من الترشيح والطرد المركزي التفاضلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الطرد المركزي التفاضلي. (أ) بعد الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 10 دقائق ، يمكن ملاحظة كمية كبيرة من حطام الأنسجة (الحبيبات الصفراء) والمادة الطافية (السائل الوردي). (ب) بعد الطرد المركزي عند 3000 × جم لمدة 20 دقيقة ، تم فصل حطام الأنسجة المتبقية وكمية كبيرة من حطام الخلايا عن المادة الطافية. (ج) أدى الطرد المركزي عند 12000 × جم لمدة 20 دقيقة إلى القضاء على تلوث الأجسام المبرمج ذات الحويصلات الكبيرة. (د) جمعت الكريات من خلال الطرد المركزي عند 100000 × جم لمدة 60 دقيقة. (ه) تكرر الطرد المركزي عند 100000 × جم لمدة 60 دقيقة لغسل الحويصلات الصغيرة وإزالة الشوائب القابلة للذوبان بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات. (F) تم الحصول على الراشح بعد ترشيح الحويصلات الصغيرة خارج الخلية المشتقة من أنسجة سرطان الكبد من خلال مرشحات 0.22 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: المجهر الإلكتروني النافذ. لوحظ شكل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية تحت المجهر الإلكتروني النافذ. شريط المقياس = (أ) 100 نانومتر ، (ب) 200 نانومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: قياس التدفق الخلوي ل sEVs. آثار انفجار SSC التمثيلية ل sEVs (A) قبل و (B) بعد 1٪ علاج Triton X-100 لمدة 1 ساعة على الجليد. (ج) الرسوم البيانية التمثيلية لتوزيع SSC ل sEVs قبل (1801 حدثا) و (د) بعد (91 حدثا) معاملة Triton X-100 المستمدة من البيانات التي تم جمعها على مدار 1 ساعة لكل منهما. (ه) قياس النقاء للمركبات الكهربائية باستخدام 1٪ Triton X-100. تم حساب نقاء sEVs على النحو (1 - C2 / C1) × 100٪ ، حيث يمثل C1 و C2 رقم الجسيمات المكتشفة قبل 1 ساعة من وبعد معاملة Triton X-100 ، على التوالي. الاختصارات: sEVs = حويصلات صغيرة خارج الخلية. SSC = مبعثر جانبي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: اللطخة الغربية. تم استخدام اللطخة الغربية لتحليل GM130 و TSG101 و CD63 و CD9 في مستخلصات الخلايا و sEVs. اختصار: sEVs = حويصلات صغيرة خارج الخلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي S1: الكشف عن FITC CD9. تم الكشف عن النسب المئوية ل sEVs الإيجابية CD9 بعد (A) PBS و (B) 1٪ Triton X-100 للعلاج لمدة 1 ساعة بواسطة قياس التدفق الخلوي. الاختصارات: sEVs = حويصلات صغيرة خارج الخلية. FITC = فلوريسئين إيزوثيوسيانات ؛ PBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S2: اللطخة الغربية المستخدمة لتحليل GM130 و TSG101 و CD63 و ALIX في sEVs المشتقة من الخلايا والأنسجة المشتقة. اختصار: sEVs = حويصلات صغيرة خارج الخلية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 3: تلطيخ أزرق كوماسي. تلطيخ أزرق كوماسي للبروتينات الكلية من مستخلصات الخلايا و sEVs المستنبتة المشتقة من النباتات و sEVs المشتقة من الأنسجة الطازجة والمجمدة. اختصار: sEVs = حويصلات صغيرة خارج الخلية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الجدول التكميلي S1: نسبة الجسيمات إلى البروتين من sEVs. نسبة الجسيمات إلى البروتين مقارنة النقاء والعائد بعد وقبل خطوة الطرد المركزي وخطوة الترشيح. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الجدول التكميلي S2: العلاقة بين حجم الأنسجة وتركيز الإنزيم. مقارنة العلاقة بين تركيزات الإنزيم المختلفة وحجم كتلة الأنسجة باستخدام نسبة الجسيمات إلى البروتين وعدد الجسيمات من sEVs. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول طريقة قابلة للتكرار لاستخراج sEVs من أنسجة سرطان الكبد. يتم الحصول على sEVs عالية الجودة عن طريق عزل الأنسجة الحادة ، والعلاج بالإنزيمات الهضمية ، والطرد المركزي التفاضلي ، وترشيح وتنقية غشاء المرشح 0.22 ميكرومتر. بالنسبة لتحليل المصب ، من المهم للغاية ضمان النقاء العالي للمركبات الكهربائية الكهربائية. في عملية الطرد المركزي التفاضلي ، ستظهر طبقة من المواد البيضاء (تكوين غير معروف) على سطح المادة الطافية. نظرا لأن هذه الطبقة من شأنها أن تلوث المركبات الكهربائية ، فقد قمنا بإزالتها قدر الإمكان عن طريق الطرد المركزي المتكرر (3000 × جم و 12000 × جم) والترشيح من خلال غشاء 0.22 ميكرومتر (الجدول التكميلي S1). بسبب تداخل هذه الطبقة البيضاء ، خاطرنا بفقدان sEVs أثناء استنشاق المادة الطافية. لذلك ، من المهم المضي قدما بعناية من خلال أجهزة الطرد المركزي المتعددة وجمع المادة الطافية بعناية قدر الإمكان دون لمس المادة البيضاء.
يمكن لهذا البروتوكول تنقية sEVs المشتقة من أنسجة الكبد عالية الجودة ، ولكن له بعض القيود. في هذه التجارب ، يكون حجم كتل الأنسجة عادة ~ 300-500 ملغ. كان عدد sEVs المعزولة من كتل الأنسجة الصغيرة للغاية منخفضا جدا للسماح بإجراء دراسات لاحقة. بالنظر إلى تأثير كمية السائل الهضمي على محصول sEVs المشتقة من الأنسجة ، يجب تقسيم كتل الأنسجة الكبيرة جدا إلى عدة أجزاء للاستخراج ، أو يجب زيادة كمية الإنزيمات الهاضمة لضمان إمكانية الحصول على sEVs المشتقة من الأنسجة بالكامل. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تكييف طريقة عزل sEVs مع تعقيد عينة الأنسجة. قمنا بعزل sEVs من أنسجة الكبد وأنسجة سرطان القولون والمستقيم باستخدام هذه الطريقة. ومع ذلك ، لم نقم بإجراء هذا البروتوكول على الأنسجة الأخرى ، وقد تحتاج هذه الطرق إلى تحسينها لعزل الأنسجة الأخرى ، على سبيل المثال ، باستخدام أنواع وتركيزات مختلفة من الإنزيمات.
خلال هذه الإجراءات ، من المهم جدا الحصول على sEVs عالية الجودة ، وهذا يعتمد إلى حد كبير على طريقة الفصل ، وتركيز الإنزيمات الهضمية ، ووقت الحضانة ، والتخزين المناسب للأنسجة. في دراسة سابقة11 ، تم تحديد أن المزيج الأمثل من الجرعة ووقت حضانة كولاجيناز D و DNase I المستخدم لفصل sEVs عن أنسجة سرطان الكبد كان 4 مجم / مل من كولاجيناز D ، و 80 وحدة / مل من DNase I ، و 20 دقيقة من وقت الحضانة (الجدول التكميلي S2). قارنا أيضا جودة sEVs من الأنسجة الطازجة مقابل الأنسجة المجمدة ووجدنا أن sEVs المعزولة من الأنسجة الطازجة تحتوي على كميات إجمالية أعلى من البروتين (الشكل التكميلي 3). ومع ذلك ، لم يكن نقاء هذين النوعين من sEVs مختلفا بشكل كبير من خلال تجربة كسر الغشاء (العلاج بنسبة 1٪ Triton X-100) ، مما يشير إلى أن هذه الطريقة تنطبق أيضا على أنسجة سرطان الكبد الطازجة. كان تركيز الجسيمات ومحتوى البروتين من sEVs التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة 3.28 × 1010 ± 0.84 × 1010 جسيمات / 100 ملغ من الأنسجة و 11.62 ميكروغرام ± 1.94 ميكروغرام بروتين / 100 ملغ من الأنسجة ، على التوالي. ومع ذلك ، من الصعب الحصول على sEVs من الأنسجة الطازجة على دفعات في العمل السريري الروتيني. لذلك ، يمكن أن توفر هذه الطريقة طريقة موثوقة وفعالة لتنقية sEVs على نطاق واسع في أنسجة سرطان الكبد المجمدة.
باختصار ، يصف هذا البروتوكول طريقة تخصيب محسنة للمركبات الكهربائية ، باستخدام الطرد المركزي الفائق التفاضلي والترشيح للحصول على sEVs عالية النقاء. هذه sEVs الأنسجة مناسبة للتحليل النهائي ، مثل توصيف التركيب الجزيئي الحيوي ، وغيرها من الدراسات التي تهدف إلى توصيف أدوارها الفسيولوجية أو الفيزيولوجية المرضية أو التطبيقات المحتملة كعلامات للمرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون المستشفى الأول التابع لجامعة جنان الطبية على دعم هذا العمل. تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (أرقام المنح 82260422).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Membrane Filter Unit | Millex | SLGPR33RB | |
| 1 mL Sterile syringe | Hubei Xianming Medical Instrument Company | YL01329 | |
| 2% Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400-2 | |
| 4.7 mL Centrifuge Tube | Beckman Coulter | 361621 | |
| 6-well Cell cuture plate | LABSELECT | 11110 | |
| 50 mL Beaker | Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company | CF2100800 | |
| 70 µm Cell strainer | Biosharp | BS-70-XBS | |
| 100 mm Cell culture dish | CELL TER | CS016-0128 | |
| 600 µL Centrifuge tube | Axygen | MCT060C | |
| BCA protein quantification kit | Thermo Fisher | RJ240544 | |
| Beckman Coulter Optima-Max-TL | Beckman | A95761 | |
| BioRad Mini trans-blot | Bio-Rad | 1703930 | |
| BioRad Mini-Protean | Bio-Rad | 1645050 | |
| CD63 Antibody | Abcam | ab134045 | |
| CD9 Antibody | Abcam | ab263019 | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428HQ527333 | |
| Cleaning Solution | NanoFCM | C1801 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Copper net | Henan Zhongjingkeyi Technology Company | DJZCM-15-N1 | |
| Dry Thermostat | Hangzhou allsheng instruments company | AS-01030-00 | |
| FITC Anti Human CD9 Antibody | Elabscience | E-AB-F1086C | |
| Glycine | Solarbio | G8200 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody | Proteintech | SA00001-1 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody | Proteintech | SA00001-2 | |
| Methanol | Shanghai Zhenxing Chemical Company | ||
| Nanoparticle flow cytometer | NanoFCM INC | FNAN30E20112368 | |
| Phosphatase inhibitors(PhosSTOP) | Roche | 4906845001 | |
| Phosphate Buffered Saline(PBS) | Servicebio | G4202 | |
| Polyvinylidene Difluoride Membrane | Solarbio | ISEQ00010 | |
| QC Beads | NanoFCM | QS2502 | |
| RPMI-1640 basic medium | Biological Industries | C11875500BT | |
| Scalpel | Guangzhou Kehua Trading Company | NN-0623-1 | |
| Silica Nanospheres | NanoFCM | S16M-Exo | |
| Transference Decoloring Shaker TS-8 | Kylin-Bell | E0018 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Scientific | Talos L120C | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| TSG101 Antibody | Proteintech | 28283-1-AP | |
| Tweezer | Guangzhou Lige Technology Company | LG01-105-4X |
References
- Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
- Hou, R., et al. Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).
- Zhang, L., Yu, D. Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation - Efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Crescitelli, R., Lässer, C., Lötvall, J. Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues. Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).
- Crescitelli, R., et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433 (2020).
- Jang, S. C., et al. Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420 (2019).
- Muralidharan-Chari, V., et al. ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles. Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).
- Matejovič, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle. FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).
- Zhou, X., et al. Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice. Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).
- Chen, J., et al. Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method. Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).
- Fang, T., et al. Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer. Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).
- Huang, X., et al. RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma. Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).
- Chen, L., et al. HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway. Cell Death & Disease. 9 (5), 513 (2018).
- Jingushi, K., et al. Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin. International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).
- Camino, T., et al. Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366 (2020).
