Summary
Nous décrivons ici l’enrichissement de petites vésicules extracellulaires dérivées du tissu cancéreux du foie grâce à une méthode d’ultracentrifugation différentielle optimisée.
Abstract
Les petites vésicules extracellulaires (sEV) dérivées du tissu peuvent refléter l’état fonctionnel des cellules sources et les caractéristiques de l’espace interstitiel du tissu. L’enrichissement efficace de ces sEV est une condition préalable importante à l’étude de leur fonction biologique et une clé pour le développement de techniques de détection clinique et de technologie de support thérapeutique. Il est difficile d’isoler les sEV des tissus, car ils sont généralement fortement contaminés. Cette étude fournit une méthode pour l’enrichissement rapide de sEVs de haute qualité à partir de tissus cancéreux du foie. La méthode implique un processus en quatre étapes: l’incubation des enzymes digestives (collagénase D et DNase Ι) avec les tissus, la filtration à travers une passoire cellulaire de 70 μm, l’ultracentrifugation différentielle et la filtration à travers un filtre à membrane de 0,22 μm. Grâce à l’optimisation de l’étape d’ultracentrifugation différentielle et à l’ajout d’une étape de filtration, la pureté des sEV obtenus par cette méthode est supérieure à celle obtenue par l’ultracentrifugation différentielle classique. Il fournit une méthodologie importante et des données à l’appui pour l’étude des EV dérivés de tissus.
Introduction
Les petites vésicules extracellulaires (sEV) mesurent environ 30 nm à 150 nm de diamètre et sont sécrétées par diverses cellules1. Ils peuvent communiquer avec les cellules tissulaires et réguler le microenvironnement local ou distant en transportant des molécules biologiques importantes telles que les lipides, les protéines, l’ADN et l’ARN vers divers organes, tissus, cellules et parties intracellulaires. Ainsi, ils peuvent également modifier le comportement des cellules receveuses 2,3. L’isolement et la purification de sEVs spécifiques est une condition préalable essentielle à l’étude de leur comportement biologique au cours du développement et de l’évolution de la maladie. L’ultracentrifugation différentielle, considérée comme l’étalon-or, est couramment utilisée pour séparer les sEV des tissus dans lesquels ils résident normalement4. Les débris tissulaires, les débris cellulaires, les grandes vésicules et les corps apoptotiques peuvent être éliminés par cette technique, ne laissant que les sEV.
Il a été démontré que la collagénase D et la DNase I n’affectent pas les caractéristiques moléculaires des cellules ou des vésicules, les propriétés des deux enzymes contribuant à la libération de vésicules dans la matrice extracellulaire 5. Ces enzymes ont été utilisées pour extraire les sEV du tissu de mélanome métastatique humain, du tissu cancéreux du côlon et du tissu de la muqueuse colique 5,6,7. Cependant, la concentration et le temps de digestion de la collagénase D et de la DNase I dans ces méthodes diffèrent, ce qui conduit à des conclusions incohérentes. Pour éviter la coprécipitation d’autres sous-types de SEV, les chercheurs ont retiré des vésicules extracellulaires plus grandes (0,1 μm ou 0,2 μm de diamètre) par filtration et/ou centrifugation différentielle8. Selon le tissu source, différentes méthodes d’isolement et de purification peuvent être nécessaires 9,10.
L’utilisation de la méthode traditionnelle d’ultracentrifugation différentielle pour extraire les sEV du tissu hépatique entraîne une couche de substance blanche à la surface du surnageant, sans aucun moyen de déterminer ses propriétés. Dans une étude précédente11, cette couche de substance blanche affectait la pureté des sEV. Bien que le nombre de particules et la concentration en protéines des échantillons isolés par la méthode traditionnelle soient plus élevés que ceux de la méthode actuelle, le coefficient de variation était important, peut-être parce que de nombreux polluants peuvent entraîner une mauvaise répétabilité des résultats. C’est-à-dire qu’en utilisant un détergent (c’est-à-dire en détectant la solubilité des particules dans 1% Triton X-100), nous avons constaté que la pureté des sEV obtenus par cette méthode était plus grande. Par conséquent, nous utilisons cette méthode pour isoler et purifier les sEV dérivés du tissu du cancer colorectal pour la recherche protéomique.
À l’heure actuelle, la recherche sur les sEV dans le cancer du foie se concentre principalement sur le sérum, le plasma et le surnageant de la culture cellulaire12,13,14. Cependant, les sEV dérivés du tissu cancéreux du foie peuvent refléter plus précisément la pathologie physiologique et le microenvironnement environnant du cancer du foie et éviter efficacement la dégradation et la pollution d’autres VE15,16. Avec l’utilisation de l’ultracentrifugation différentielle, cette méthode peut enrichir le rendement et obtenir des EVE de haute qualité, fournissant une base importante pour l’étude ultérieure du cancer du foie. Cette méthode permet de séparer le tissu cancéreux du foie par séparation nette et d’être dissocié par la collagénase D et la DNase I. Ensuite, les débris cellulaires, les grandes vésicules et les corps apoptotiques sont éliminés par filtration et ultracentrifugation différentielle. Enfin, les sEV sont isolés et purifiés pour des études ultérieures.
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Protocol
Le tissu cancéreux du foie humain a été recueilli chez des patients atteints de malignité hépatique au premier hôpital affilié de l’Université médicale de Gannan. Tous les patients ont signé un formulaire de consentement éclairé et la collecte d’échantillons de tissus humains a été approuvée par le comité d’éthique du premier hôpital affilié de l’Université médicale de Gannan. Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, équipements et logiciels utilisés dans ce protocole.
1. Préparation
- Placez l’agitateur décolorant de transfert dans l’incubateur et réglez la température à 37 °C. Voir la figure 1 pour tous les autres équipements nécessaires.
- Nettoyez le scalpel et les forceps en les aspergeant avec de l’alcool à 75%.
- Préparer la solution digestive en mesurant 6 mg de collagénase D (4 mg/mL) et 24 μL de DNase Ι (80 U/mL) et en les ajoutant à 1,5 mL de milieu basique RPMI-1640. Mélanger par inversion douce jusqu’à dissolution complète des additifs.
- Au préalable, humidifiez les crépines cellulaires de 70 μm et 0,22 μm avec 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Placer une boîte de culture cellulaire stérile de 100 mm sur la glacière pour retenir les tissus hépatiques après la décongélation.
- Dans les 15 minutes suivant l’isolement du tissu du carcinome hépatocellulaire, rincer le sang à la surface du bloc tissulaire avec du PBS, transférer le tissu dans un tube congelé stérile et le conserver à -80 °C jusqu’à l’expérience pendant 2 semaines au maximum.
2. Dissociation tissulaire
- Retirer l’échantillon de tissu du congélateur à −80 °C et placer environ 400 mg du tissu - coupé en fragments de 2 mm x 2 mm x 2 mm - dans la boîte de culture cellulaire de 10 cm sur la glacière.
- Déplacer le tissu dans une plaque à 6 puits avec 1,5 mL de solution digestive; puis placer la plaque sur l’agitateur décolorant de transfert (20 tr/min) pour incuber pendant 20 min à 37 °C pour une dissociation complète du tissu cancéreux du foie et la libération des sEVs.
- Retirez la plaque à 6 puits de l’incubateur et placez-la sur la glacière. Ajouter 80 μL d’inhibiteur de phosphatase et 200 μL de solution complète d’inhibiteur de protéase pour arrêter la digestion.
- Transférer la solution digestive dans la passoire cellulaire de 70 μm et la filtrer lentement pour éliminer les gros débris tissulaires. Recueillir le filtrat et le placer dans un tube à centrifuger de 2 mL.
3. Ultracentrifugation différentielle
REMARQUE: Effectuez toutes les étapes de centrifugation à 4 ° C.
- Centrifuger le filtrat à 500 × g pendant 10 min et recueillir le surnageant dans un nouveau tube à centrifuger de 2 mL. La plupart des petits débris tissulaires peuvent alors être enlevés.
- Centrifuger le surnageant à 3 000 × g pendant 20 min pour éliminer les débris cellulaires. Transférer délicatement le surnageant dans un nouveau tube à centrifuger jusqu’à ce que l’extrémité de la pipette soit sur le point de toucher la substance blanche à la surface.
- Centrifuger le liquide restant à 3 000 × g pendant 3 min; Ensuite, aspirez le surnageant pour faciliter la collecte des vésicules. Pour assurer la pureté des sEV, assurez-vous que la substance blanche n’est pas aspirée.
- Centrifuger le surnageant recueilli à 12 000 × g pendant 20 minutes et transférer 900 μL du surnageant dans un tube à ultracentrifuger de 4,7 mL. Centrifuger le liquide restant à 12 000 × g pendant 3 minutes, puis recueillir et mélanger les deux surnageants dans le même tube à ultracentrifugation. Remplissez complètement le tube avec du PBS.
- Centrifuger les surnageants à 100 000 × g pendant 60 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille en remplissant le tube à ultracentrifugeuses de PBS et en centrifugeant à nouveau à 100 000 × g pendant 60 min. Remettez la pastille en suspension avec 50 μL de PBS.
- Aspirez la suspension sEV à l’aide d’une seringue stérile de 1 mL et filtrez-la à travers un filtre à membrane de 0,22 μm. Recueillir le filtrat dans un tube à centrifuger de 600 μL et le conserver à −80 °C pour une analyse plus approfondie.
4. Évaluation de la qualité de l’enrichissement
- Observer la morphologie des sEV au microscope électronique à transmission.
- Ensuite, déposez 10 μL de l’échantillon de sEV sur un filet en cuivre, incuber à température ambiante pendant 10 minutes et nettoyez-le avec de l’eau distillée stérile, en utilisant du papier absorbant pour éliminer l’excès de liquide.
- Déposer 10 μL d’acétate d’uranyle à 2 % sur le filet de cuivre pour une coloration négative pendant 1 min. Utilisez du papier filtre pour absorber le liquide à la surface du filet de cuivre et séchez-le pendant 2 min sous une lampe à incandescence.
- Observez le treillis de cuivre sous un microscope électronique à transmission et imagez à 80 kV.
- Utilisez un cytomètre à flux de nanoparticules pour déterminer la distribution granulométrique et la pureté des sEV.
- Avant le démarrage de la machine, préparez des tubes contenant 200 μL de contrôle qualité, 200 μL de nanosphères de silice, 2 x 200 μL d’eau ultrapure, 2 x 200 μL de solution de nettoyage et 200 μL de PBS.
NOTE: Avant de tester les échantillons sEV, il est nécessaire d’effectuer un contrôle de qualité sur l’instrument et de tester l’étalon granulométrique (la distribution granulométrique doit être calculée à l’aide de courbes étalons générées avec plusieurs nanomicrosphères de diamètres différents [68-155 nm] dans les mêmes conditions de détection). Des billes de QC et des nanosphères de silice ont été diluées 100x avec de l’eau ultrapure dans un volume total de 200 μL. - Vérifiez le volume de la solution de nettoyage (>10 mL) et notez la différence entre les niveaux du liquide de la gaine et du liquide usagé (20-30 cm).
- Coupez l’alimentation principale de l’instrument; Après 20 s, allumez l’ordinateur et attendez les bips indiquant que l’instrument est correctement connecté pour exécuter le logiciel.
- Cliquez sur Démarrer pour allumer la caméra, le laser et la pompe à air.
- Cliquez sur Sheath Flow-Start Up et placez de l’eau ultrapure sur la plate-forme de chargement. Après 4 min (compte à rebours de l’instrument), cliquez sur Sample-Boosting | Échantillon-déchargement.
- Après 30 s, placez le tube vierge sur la plate-forme de chargement et cliquez sur Sample-Boosting | Échantillon-déchargement. Ensuite, placez le tube retenant l’eau ultrapure sur la plate-forme de chargement et, simultanément, cliquez sur Sample-Boosting | Purge d’écoulement de gaine.
- Cliquez sur Fonctionnement manuel et placez le tube de concentration de particules sur la plate-forme de chargement. Ensuite, cliquez sur Sample-Boosting pendant 1 min et sélectionnez simultanément le contrôle qualité 250 nm Std FL SiNPs dans « SAMP. Inf. »
- Cliquez sur Sample-Sampling et allumez le détecteur en cliquant sur SPCM.
REMARQUE: À ce stade, la forme d’onde du signal en temps réel peut être vue. - Cliquez sur Auto Sampling et entrez 1.0 dans Sampling SET pour fixer la pression à 1 KPa. Cliquez sur la barre d’outils et sélectionnez Large Signal.
- Ajustez la position horizontale du laser et réglez le laser à 2 μm; Ensuite, cliquez sur L ou R pour vous assurer que le signal est fort et uniforme.
- Cliquez sur Time to Record pour collecter les données, qui passeront automatiquement à Buffer une fois terminé. Ensuite, enregistrez les données dans un fichier Naf et cliquez sur Sample-Unload.
- Placez le tube de solution de nettoyage sur la plate-forme de chargement, cliquez sur Sample-Boosting, et après 1 min, cliquez sur Sample-Unload. Utilisez de l’eau ultrapure pour éliminer la solution de nettoyage résiduelle de l’extrémité capillaire.
- Placez le tube standard granulométrique sur la plate-forme de chargement et cliquez sur Sample-Boosting pendant 1 min.
- Sélectionnez le contrôle qualité 68-155 nm Std FL SiNPs dans « SAMP. Inf » et cliquez sur Sample-Sampling. Ensuite, cliquez sur la barre d’outils et sélectionnez Petit signal.
- Cliquez sur Time to Record pour collecter les données, qui passeront automatiquement à Buffer une fois terminé. Ensuite, enregistrez les données dans un fichier Naf et cliquez sur Sample-Unload.
- Placez le tube de solution de nettoyage sur la plate-forme de chargement, cliquez sur Sample-Boosting, puis cliquez sur Sample-Unload après 1 min. Utilisez de l’eau ultrapure pour éliminer la solution de nettoyage résiduelle de l’extrémité capillaire.
- Placez le tube PBS sur la plate-forme de chargement; cliquez sur Sample-Boosting pendant 1 min.
- Sélectionnez le contrôle qualité 68-155 nm Std FL SiNPs dans « SAMP. Inf » et cliquez sur Sample-Sampling. Ensuite, cliquez sur la barre d’outils et sélectionnez Petit signal.
- Cliquez sur Time to Record pour collecter des données, qui passeront automatiquement à Buffer une fois terminé. Enregistrez les données dans un fichier Naf et cliquez sur Sample-Unload.
- Placez le tube de solution de nettoyage sur la plate-forme de chargement, cliquez sur Sample-Boosting et Sample-Unload après 1 min. Utilisez de l’eau ultrapure pour éliminer la solution de nettoyage résiduelle de l’extrémité capillaire.
- Vérifier les informations de l’échantillon comme décrit précédemment aux étapes 4.2.17-4.2.20; remplacer le PBS (étape 4.2.17) par l’échantillon sEV et analyser les données.
- Avant le démarrage de la machine, préparez des tubes contenant 200 μL de contrôle qualité, 200 μL de nanosphères de silice, 2 x 200 μL d’eau ultrapure, 2 x 200 μL de solution de nettoyage et 200 μL de PBS.
- Identifiez davantage les sEV par transfert western.
- Déterminez les concentrations de protéines des sEV et des tissus à l’aide du kit de quantification des protéines BCA conformément aux instructions du fabricant.
- Calculer le volume de charge des EV (p. ex., pour 5 μg de protéines par puits) en fonction de ces résultats quantitatifs. Ajouter un tampon de chargement dans un rapport de 1:4 et vortex le mélange.
- Après dénaturation dans un bain métallique à 100 °C (thermostat sec) pendant 10 min, séparer la protéine sur un gel de polyacrylamide à 12% à 60 V pendant 80 min.
- Transférer le gel sur une membrane de difluorure de polyvinylidène de 0,22 μm à 220 mA pendant 2 h à l’aide d’un tampon de transfert (25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% méthanol).
- Bloquer la membrane avec du lait en poudre écrémé à 5 % dans du Tween salin tamponné Tris (TBST) pendant 1 h à température ambiante et incuber avec un anticorps primaire (anticorps monoclonal anti-humain CD9 de lapin, anticorps monoclonal anti-humain CD63 de lapin, anticorps monoclonal anti-humain TSG101 de lapin, anticorps monoclonal monoclonal anti-humain GM130 de souris) pendant une nuit à 4 °C. Diluer les anticorps primaires dans du lait écrémé à 5 % à 1:1 000.
- Après trois lavages avec TBST, incuber la membrane avec un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) à température ambiante pendant 1 h.
- Détectez l’anticorps lié au HRP à l’aide d’un substrat de transfert ECL, puis collectez et analysez les images.
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Representative Results
Les sEV des tissus cancéreux du foie humain ont joué un rôle crucial dans le diagnostic, le traitement et le pronostic des patients atteints d’un cancer du foie. Cette méthode utilisait des instruments de laboratoire courants pour isoler et purifier les sEV dérivés des tissus cancéreux du foie; cela peut fournir un soutien méthodologique pour l’étude des EV. La figure 2 illustre le processus général d’enrichissement des EV à partir des tissus cancéreux du foie. Les sEVs dans les espaces intercellulaires des tissus sont entièrement libérés par la coupe tissulaire et l’hydrolyse enzymatique. De plus, la solution digestive est filtrée à travers des filtres de 70 μm pour éliminer les gros fragments de tissus. De plus, des étapes de centrifugation différentielle ont été effectuées (à 500 × g, 3 000 × g et 12 000 × g) pour éliminer les petits débris tissulaires, les débris cellulaires, les grandes vésicules et les corps apoptotiques (Figure 3A-C).
Pour obtenir des sEV de haute pureté, deux étapes de centrifugation différentielle (à 3 000 × g et 12 000 × g) ont été répétées pendant 3 minutes jusqu’à ce que la substance blanche à la surface soit éliminée. Le surnageant recueilli a été ultracentrifugé à raison de 100 000 × g pendant 60 minutes pour éliminer les substances solubles, puis les granulés ont été lavés en étant remis en suspension dans du PBS (figure 3D,E). Après centrifugation à 100 000 × g pendant 60 min, la pastille a été remise en suspension dans 50 μL de PBS. Enfin, l’échantillon a été filtré à travers une membrane de 0,22 μm et recueilli dans un tube à centrifuger de 600 μL (Figure 3F) pour éliminer l’interférence des substances gélatineuses et améliorer la pureté des sEV.
Les sEV purifiés ont été examinés au microscope électronique à transmission, qui a révélé la présence de sEV avec une morphologie en forme de coupe (Figure 4A,B). La taille des particules variait de 40 nm à 200 nm, et la taille moyenne des particules était de 89 nm (figure 5A,B). Nous avons évalué la qualité des vésicules par le rapport des vésicules dans toutes les particules en fonction de la solubilité des particules dans 1% Triton X-100. La pureté des sEV a été calculée comme suit : (1 - C2/C1) × 100 %, où C1 et C2 représentent le nombre de particules détectées 1 h avant et après le traitement Triton X-100, respectivement11. Ces données ont montré que la pureté des EVE enrichis était de 68,32% (Figure 5C-E). Après avoir extrait les sEV du tissu cancéreux du foie, les échantillons ont été traités avec du PBS et du Triton X-100 à 1% pour évaluer la pureté des sEV. Après traitement, les sEV ont été marqués avec des particules FITC CD9 et CD9+ pour la détection dans le cytomètre de flux de nanoparticules. Il a été constaté que le nombre de particules de CD9+ dans le groupe d’essai diminuait (figure supplémentaire S1). Les marqueurs protéiques des EV - tels que CD63, CD9 et TSG101 - ont été détectés par transfert Western. GM130 a été utilisé comme marqueur de contrôle négatif des sEVs12, qui ont été trouvés dans les cellules tissulaires mais pas dans les sEVs (Figure 6). Les marqueurs protéiques des sEV dérivés de cellules et de tissus - CD63, ALIX et TSG101 - ont été détectés par transfert Western. Le GM130 a été utilisé comme marqueur de contrôle négatif des sEV (figure supplémentaire 2).
Figure 1 : Exigences du protocole. (A) Une boîte de culture cellulaire de 100 mm, un scalpel et une pince à épiler pour le tranchage des tissus, (B) une plaque à 6 puits, (C) une crépine cellulaire de 70 μm, un filtre à membrane de 0,22 μm et un bécher pour nettoyer la crépine cellulaire, (D) une seringue stérile de 1 mL et (E) un tube à ultracentrifugation de 4,7 mL. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Processus d’enrichissement de petites vésicules extracellulaires à partir de tissus cancéreux du foie. Les tissus congelés ont été pesés, tranchés avec un scalpel et incubés avec un milieu RPMI-1640, de la collagénase D et de la DNase Ι pendant 20 minutes à 37 °C. Les petites vésicules extracellulaires ont été enrichies par une filtration supplémentaire et une ultracentrifugation différentielle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Ultracentrifugation différentielle. (A) Après centrifugation à 500 × g pendant 10 min, une grande quantité de débris tissulaires (pastille jaune) et de surnageant (liquide rose) peut être observée. (B) Après centrifugation à 3 000 × g pendant 20 min, les débris tissulaires résiduels et une grande quantité de débris cellulaires ont été séparés du surnageant. (C) La centrifugation à 12 000 × g pendant 20 min a éliminé la contamination des corps apoptotiques à grandes vésicules. (D) Les granulés ont été recueillis par centrifugation à 100 000 × g pendant 60 min. (E) La centrifugation a été répétée à 100 000 × g pendant 60 min pour laver les petites vésicules et éliminer les impuretés solubles avec une solution saline tamponnée au phosphate. (F) Le filtrat a été obtenu après filtration des petites vésicules extracellulaires dérivées du tissu cancéreux du foie à travers des filtres de 0,22 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Microscopie électronique à transmission. La forme des petites vésicules extracellulaires a été observée au microscope électronique à transmission. Barre d’échelle = (A) 100 nm, (B) 200 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Cytométrie en flux pour les sEV. Traces représentatives de SSC éclatées de sEVs (A) avant et (B) après 1% de traitement Triton X-100 pendant 1 h sur glace. (C) Histogrammes représentatifs de distribution SSC des sEVs avant (1 801 événements) et (D) après (91 événements) le traitement Triton X-100 dérivés des données recueillies sur 1 h chacun. (E) Mesure de la pureté des véhicules électriques utilisant un Triton X-100 à 1 %. La pureté des sEVs a été calculée comme suit : (1 - C2/C1) × 100%, où C1 et C2 représentent le nombre de particules détectées 1 h avant et après le traitement Triton X-100, respectivement. Abréviations : sEVs = petites vésicules extracellulaires ; SSC = dispersion latérale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Western blot. Le transfert Western a été utilisé pour l’analyse du GM130, du TSG101, du CD63 et du CD9 dans les extraits cellulaires et les SEV. Abréviation : sEVs = petites vésicules extracellulaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire S1 : Détection du CD9 FITC. Les pourcentages de SVE CD9 positifs après (A) PBS et (B) 1% Triton X-100 pendant 1 h ont été détectés par cytométrie en flux. Abréviations : sEVs = petites vésicules extracellulaires ; FITC = isothiocyanate de fluorescéine; PBS = solution saline tamponnée au phosphate. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S2 : Western blot utilisé pour l’analyse des GM130, TSG101, CD63 et ALIX dans les EVE d’origine cellulaire et tissulaire. Abréviation : sEVs = petites vésicules extracellulaires. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 3 : Coloration bleue de Coomassie. Coloration bleue de Coomassie des protéines totales des extraits cellulaires et des sEV dérivés d’explant cultivés et des SVE frais et congelés dérivés de tissus. Abréviation : sEVs = petites vésicules extracellulaires. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire S1 : Rapport particules/protéines des EVE. Le rapport particules/protéines a comparé la pureté et le rendement après et avant l’étape de centrifugation et l’étape de filtration. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire S2 : Relation entre la taille des tissus et la concentration enzymatique. Comparaison de la relation entre différentes concentrations enzymatiques et la taille des blocs tissulaires en utilisant le rapport particule/protéine et le nombre de particules de sEV. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Ce protocole décrit une méthode reproductible pour extraire les sEV du tissu cancéreux du foie. Les sEVs de haute qualité sont obtenus par isolation nette des tissus, traitement avec des enzymes digestives, ultracentrifugation différentielle et filtration et purification de la membrane filtrante de 0,22 μm. Pour l’analyse en aval, il est extrêmement important de garantir la haute pureté des sEV. Dans le processus de centrifugation différentielle, une couche de substances blanches (composition inconnue) apparaîtra à la surface du surnageant. Comme cette couche contaminerait les sEV, nous l’avons éliminée autant que possible par centrifugation répétée (3 000 × g et 12 000 × g) et filtration à travers une membrane de 0,22 μm (tableau supplémentaire S1). En raison de l’interférence de cette couche blanche, nous risquions de perdre des sEV en aspirant le surnageant. Par conséquent, il est important de procéder avec précaution à travers plusieurs centrifugations et de recueillir le surnageant aussi soigneusement que possible sans toucher la substance blanche.
Ce protocole peut purifier les sEV dérivés du tissu hépatique de haute qualité, mais il présente certaines limites. Dans ces expériences, le volume de blocs tissulaires est généralement ~300-500 mg. Le nombre de SEV isolés à partir de blocs tissulaires extrêmement petits était trop faible pour permettre des études ultérieures. Compte tenu de l’influence de la quantité de liquide digestif sur le rendement des EVE dérivés des tissus, les blocs tissulaires trop grands devraient être divisés en plusieurs parties pour l’extraction, ou la quantité d’enzymes digestives devrait être augmentée pour s’assurer que les EV dérivés des tissus peuvent être pleinement obtenus. De plus, la méthode d’isolement des EVs doit être adaptée à la complexité de l’échantillon de tissu. Nous avons isolé les sEV du tissu hépatique et du tissu cancéreux colorectal en utilisant cette méthode. Cependant, nous n’avons pas effectué ce protocole sur d’autres tissus, et ces méthodes peuvent avoir besoin d’être optimisées pour l’isolement d’autres tissus, par exemple, en utilisant différents types et concentrations d’enzymes.
Tout au long de ces procédures, il est très important d’obtenir des sEV de haute qualité, et cela dépend en grande partie de la méthode de séparation, de la concentration des enzymes digestives, du temps d’incubation et du stockage approprié des tissus. Dans une étude antérieure11, il a été déterminé que la combinaison optimale de dosage et de temps d’incubation de la collagénase D et de la DNase I utilisée pour séparer les EVes des tissus cancéreux du foie était de 4 mg/mL de collagénase D, 80 U/mL de DNase I et 20 minutes de temps d’incubation (tableau supplémentaire S2). Nous avons également comparé la qualité des EV provenant de tissus frais par rapport aux tissus congelés et avons constaté que les SEV isolés à partir de tissus frais contenaient des quantités totales plus élevées de protéines (Figure supplémentaire 3). Cependant, la pureté des deux types de sEV n’était pas significativement différente grâce à l’expérience de rupture de membrane (traitement avec 1% de Triton X-100), ce qui indique que cette méthode est également applicable aux tissus frais du cancer du foie. La concentration en particules et la teneur en protéines des EVe obtenues par cette méthode étaient respectivement de 3,28 × 10 10 ± 0,84 × 10 10 particules/100 mg de tissu et de 11,62 μg ± 1,94 μg de protéines/100 mg de tissu. Cependant, il est difficile d’obtenir des SEV à partir de tissus frais par lots dans le cadre de travaux cliniques de routine; par conséquent, cette méthode peut fournir une méthode fiable et efficace pour la purification à grande échelle des sEV dans les tissus cancéreux du foie congelés.
En résumé, ce protocole décrit une méthode d’enrichissement optimisée pour les sEV, utilisant l’ultracentrifugation différentielle et la filtration pour obtenir des sEV de haute pureté. Ces EV tissulaires conviennent à l’analyse en aval, comme la caractérisation de la composition biomoléculaire, et à d’autres études visant à caractériser leurs rôles physiologiques ou physiopathologiques ou leurs applications potentielles en tant que marqueurs de maladies.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le premier hôpital affilié de l’Université médicale de Gannan pour son soutien à ce travail. Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (numéros de subvention 82260422).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Membrane Filter Unit | Millex | SLGPR33RB | |
| 1 mL Sterile syringe | Hubei Xianming Medical Instrument Company | YL01329 | |
| 2% Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400-2 | |
| 4.7 mL Centrifuge Tube | Beckman Coulter | 361621 | |
| 6-well Cell cuture plate | LABSELECT | 11110 | |
| 50 mL Beaker | Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company | CF2100800 | |
| 70 µm Cell strainer | Biosharp | BS-70-XBS | |
| 100 mm Cell culture dish | CELL TER | CS016-0128 | |
| 600 µL Centrifuge tube | Axygen | MCT060C | |
| BCA protein quantification kit | Thermo Fisher | RJ240544 | |
| Beckman Coulter Optima-Max-TL | Beckman | A95761 | |
| BioRad Mini trans-blot | Bio-Rad | 1703930 | |
| BioRad Mini-Protean | Bio-Rad | 1645050 | |
| CD63 Antibody | Abcam | ab134045 | |
| CD9 Antibody | Abcam | ab263019 | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428HQ527333 | |
| Cleaning Solution | NanoFCM | C1801 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Copper net | Henan Zhongjingkeyi Technology Company | DJZCM-15-N1 | |
| Dry Thermostat | Hangzhou allsheng instruments company | AS-01030-00 | |
| FITC Anti Human CD9 Antibody | Elabscience | E-AB-F1086C | |
| Glycine | Solarbio | G8200 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody | Proteintech | SA00001-1 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody | Proteintech | SA00001-2 | |
| Methanol | Shanghai Zhenxing Chemical Company | ||
| Nanoparticle flow cytometer | NanoFCM INC | FNAN30E20112368 | |
| Phosphatase inhibitors(PhosSTOP) | Roche | 4906845001 | |
| Phosphate Buffered Saline(PBS) | Servicebio | G4202 | |
| Polyvinylidene Difluoride Membrane | Solarbio | ISEQ00010 | |
| QC Beads | NanoFCM | QS2502 | |
| RPMI-1640 basic medium | Biological Industries | C11875500BT | |
| Scalpel | Guangzhou Kehua Trading Company | NN-0623-1 | |
| Silica Nanospheres | NanoFCM | S16M-Exo | |
| Transference Decoloring Shaker TS-8 | Kylin-Bell | E0018 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Scientific | Talos L120C | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| TSG101 Antibody | Proteintech | 28283-1-AP | |
| Tweezer | Guangzhou Lige Technology Company | LG01-105-4X |
References
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