Summary
Здесь мы описываем обогащение небольших внеклеточных везикул, полученных из ткани рака печени, с помощью оптимизированного метода дифференциального ультрацентрифугирования.
Abstract
Небольшие внеклеточные везикулы (sEV), полученные из ткани, могут отражать функциональное состояние исходных клеток и характеристики интерстициального пространства ткани. Эффективное обогащение этих sEV является важной предпосылкой для изучения их биологической функции и ключом к разработке методов клинического обнаружения и технологии терапевтического носительства. Трудно изолировать sEV от тканей, потому что они обычно сильно загрязнены. Это исследование предоставляет метод быстрого обогащения высококачественных sEV из ткани рака печени. Метод включает в себя четырехступенчатый процесс: инкубацию пищеварительных ферментов (коллагеназы D и ДНКазы Ι) с тканью, фильтрацию через клеточный сетчатый фильтр 70 мкм, дифференциальное ультрацентрифугирование и фильтрацию через мембранный фильтр 0,22 мкм. Благодаря оптимизации стадии дифференциального ультрацентрифугирования и добавлению ступени фильтрации чистота электромобилей, полученных этим методом, выше, чем при классическом дифференциальном ультрацентрифугировании. Он предоставляет важную методологию и вспомогательные данные для изучения sEV тканевого происхождения.
Introduction
Малые внеклеточные везикулы (sEV) имеют диаметр от 30 до 150 нм и секретируются различными клетками1. Они могут общаться с тканевыми клетками и регулировать локальное или отдаленное микроокружение, транспортируя важные биологические молекулы, такие как липиды, белки, ДНК и РНК, к различным органам, тканям, клеткам и внутриклеточным частям. Таким образом, они также могут изменять поведение клеток-реципиентов 2,3. Выделение и очистка специфических электромобилей является важной предпосылкой для изучения их биологического поведения во время развития и течения заболевания. Дифференциальное ультрацентрифугирование, считающееся золотым стандартом, обычно используется для отделения sEV от тканей, в которых они обычно находятся4. С помощью этого метода можно удалить тканевый мусор, клеточный мусор, крупные везикулы и апоптотические тела, оставив только sEV.
Было показано, что коллагеназа D и ДНКаза I не влияют на молекулярные характеристики клеток или везикул, при этом свойства обоих ферментов способствуют высвобождению везикул во внеклеточном матриксе 5. Эти ферменты использовались для извлечения sEV из ткани метастатической меланомы человека, ткани рака толстой кишки и ткани слизистой оболочки толстой кишки 5,6,7. Однако концентрация и время переваривания коллагеназы D и ДНКазы I в этих методах различаются, что приводит к противоречивым выводам. Чтобы избежать соосаждения других подтипов sEV, исследователи удалили более крупные внеклеточные везикулы (0,1 мкм или 0,2 мкм в диаметре) путем фильтрации и/или дифференциального центрифугирования8. В зависимости от исходной ткани могут потребоваться различные методы выделения и очистки 9,10.
Использование традиционного метода дифференциального ультрацентрифугирования для извлечения sEV из ткани печени приводит к образованию слоя белого вещества на поверхности надосадочной жидкости без какого-либо способа определения его свойств. В предыдущем исследовании11 было обнаружено, что этот слой белого вещества влияет на чистоту электромобилей. Хотя количество частиц и концентрация белка в образцах, выделенных традиционным методом, были выше, чем в современных методах, коэффициент вариации был большим, возможно, потому, что многие загрязняющие вещества могут привести к плохой повторяемости результатов. То есть, используя моющее средство (т.е. детектируя растворимость частиц в 1% Triton X-100), мы обнаружили, что чистота sEV, полученных этим методом, была больше. Следовательно, мы используем этот метод для выделения и очистки sEV, полученных из ткани колоректального рака, для протеомных исследований.
В настоящее время исследования sEVs при раке печени сосредоточены в основном на сыворотке, плазме и надосадочной жидкостиклеточной культуры 12,13,14. Тем не менее, sEV, полученные из ткани рака печени, могут более точно отражать физиологическую патологию и окружающее микроокружение рака печени и эффективно избегать деградации и загрязнения других EV15,16. С использованием дифференциального ультрацентрифугирования этот метод позволяет обогатить выход и получить высококачественные sEV, обеспечивая важную основу для дальнейшего изучения рака печени. Этот метод позволяет разделить ткань рака печени путем резкого разделения и диссоциировать коллагеназой D и ДНКазой I. Затем клеточный мусор, крупные везикулы и апоптотические тела дополнительно удаляются фильтрацией и дифференциальным ультрацентрифугированием. Наконец, sEV выделяют и очищают для последующих исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ткань рака печени человека была собрана у пациентов с диагнозом злокачественное новообразование печени в Первой дочерней больнице Медицинского университета Ганнана. Все пациенты подписали форму информированного согласия, а сбор образцов тканей человека был одобрен комитетом по этике Первой дочерней больницы Медицинского университета Ганнань. Подробные сведения обо всех материалах, оборудовании и программном обеспечении, используемых в этом протоколе, см. в таблице материалов .
1. Подготовка
- Поместите шейкер для обесцвечивания переноса в инкубатор и установите температуру 37 °C. На рисунке 1 показано все остальное необходимое оборудование.
- Очистите скальпель и щипцы, сбрызнув их 75% спиртом.
- Приготовьте пищеварительный раствор, отмерив 6 мг коллагеназы D (4 мг/мл) и 24 мкл ДНКазы Ι (80 ЕД/мл) и добавив их к 1,5 мл основной среды RPMI-1640. Перемешивайте путем легкой инверсии до полного растворения добавок.
- Заранее увлажните клеточные сетчатые фильтры размером 70 мкм и 0,22 мкм физиологическим раствором с фосфатным буфером (PBS).
- Поместите 100-миллиметровую стерильную чашку для культивирования клеток на холодильник, чтобы удерживать ткани печени после размораживания.
- В течение 15 мин после выделения тканей гепатоцеллюлярной карциномы смыть кровь с поверхности тканевого блока PBS, перенести ткань в стерильную замороженную пробирку и хранить при -80 °C до проведения эксперимента не более 2 недель.
2. Диссоциация тканей
- Извлеките образец ткани из морозильной камеры при температуре -80 °C и поместите примерно 400 мг ткани, разрезанной на фрагменты размером 2 мм x 2 мм x 2 мм, в 10-сантиметровую чашку для культивирования клеток на холодильнике.
- Переместите ткань в 6-луночную пластину с 1,5 мл пищеварительного раствора; затем поместите пластину на шейкер для обесцвечивания переноса (20 об/мин) для инкубации в течение 20 минут при 37 ° C для полной диссоциации ткани рака печени и высвобождения sEV.
- Выньте 6-луночную тарелку из инкубатора и поместите ее на холодильник. Добавьте 80 мкл ингибитора фосфатазы и 200 мкл полного раствора ингибитора протеазы, чтобы остановить пищеварение.
- Переведите пищеварительный раствор в клеточный фильтр 70 мкм и медленно отфильтруйте его, чтобы удалить крупный тканевый мусор. Соберите фильтрат и поместите его в центрифужную пробирку объемом 2 мл.
3. Дифференциальное ультрацентрифугирование
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все этапы центрифугирования при температуре 4 °C.
- Центрифугируйте фильтрат при 500 × г в течение 10 мин и соберите надосадочную жидкость в новую центрифужную пробирку объемом 2 мл. Затем можно удалить большую часть мелкого тканевого мусора.
- Центрифугируют надосадочную жидкость при 3000 × г в течение 20 мин для удаления клеточного мусора. Осторожно перенесите надосадочную жидкость в новую центрифужную пробирку до тех пор, пока кончик пипетки не коснется белого вещества на поверхности.
- Центрифугируют оставшуюся жидкость при 3 000 × г в течение 3 мин; Затем аспирируйте надосадочную жидкость, чтобы облегчить сбор везикул. Чтобы обеспечить чистоту электромобилей, убедитесь, что белое вещество не всасывается.
- Центрифугируют собранную надосадочную жидкость при дозе 12 000 × г в течение 20 мин и переносят 900 мкл надосадочной жидкости в ультрацентрифужную пробирку объемом 4,7 мл. Центрифугируют оставшуюся жидкость при 12 000 × г в течение 3 мин, а затем собирают и смешивают оба надосадочных продукта в одну и ту же ультрацентрифужную пробирку. Полностью заполните тюбик PBS.
- Центрифугируют надосадочные жидкости при дозе 100 000 × г в течение 60 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу, заполнив ультрацентрифужную пробирку PBS и снова центрифугируя при 100 000 × г в течение 60 мин. Ресуспендируйте гранулу 50 мкл PBS.
- Аспирируют суспензию sEV с помощью стерильного шприца объемом 1 мл и фильтруют ее через мембранный фильтр 0,22 мкм. Соберите фильтрат в центрифужную пробирку объемом 600 мкл и храните его при температуре -80 °C для дальнейшего анализа.
4. Оценка качества обогащения
- Наблюдайте за морфологией sEV под просвечивающим электронным микроскопом.
- Затем капните 10 мкл образца sEV на медную сетку, инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут и очистите стерильной дистиллированной водой, используя абсорбирующую бумагу для удаления лишней жидкости.
- Капните 10 мкл 2% уранилацетата на медную сетку для негативного окрашивания в течение 1 мин. Используйте фильтровальную бумагу, чтобы впитать жидкость на поверхности медной сетки, и высушите ее в течение 2 минут под лампой накаливания.
- Наблюдайте за медной сеткой под просвечивающим электронным микроскопом и изображением при 80 кВ.
- Используйте проточный цитометр наночастиц для определения распределения по размерам и чистоты sEV.
- Перед запуском машины подготовьте пробирки, содержащие 200 мкл контроля качества, 200 мкл наносфер кремнезема, 2 x 200 мкл сверхчистой воды, 2 x 200 мкл чистящего раствора и 200 мкл PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед тестированием образцов sEV необходимо провести контроль качества на приборе и проверить стандарт размера частиц (распределение по размерам должно быть рассчитано с использованием стандартных кривых, генерируемых несколькими наномикросферами разного диаметра [68-155 нм] при одном и том же условии обнаружения). Шарики контроля качества и наносферы кремнезема разбавляли в 100 раз сверхчистой водой в общем объеме 200 мкл. - Проверьте объем чистящего раствора (>10 мл) и обратите внимание на разницу между уровнями жидкости оболочки и отработанной жидкости (20-30 см).
- Выключите основное питание прибора; Через 20 секунд включите компьютер и дождитесь звуковых сигналов, указывающих на то, что прибор правильно подключен для запуска программного обеспечения.
- Нажмите « Пуск », чтобы включить камеру, лазер и воздушный насос.
- Нажмите на кнопку «Поток оболочки-Пуск» и поместите сверхчистую воду на погрузочную платформу. Через 4 минуты (обратный отсчет инструмента) нажмите на Sample-Boosting | Выборка-выгрузка.
- Через 30 секунд поместите заготовку на загрузочную платформу и нажмите «Повышение пробы» | Выборка-выгрузка. Затем поместите пробирку со сверхчистой водой на грузовую платформу и одновременно нажмите « Повышение пробы» | Обтекание-продувка оболочки.
- Нажмите « Ручное управление» и поместите трубку для концентрации частиц на загрузочную платформу. Затем нажмите на Sample-Boosting в течение 1 минуты и одновременно выберите 250 нм Std FL SiNPs контроль качества в поле «SAMP. Инф."
- Нажмите на Sample-Sampling и включите детектор, нажав на SPCM.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе можно увидеть форму сигнала в реальном времени. - Нажмите « Автоматический отбор проб» и введите 1.0 в «Набор для отбора проб», чтобы зафиксировать давление на уровне 1 кПа. Нажмите на панель инструментов и выберите «Большой сигнал».
- Отрегулируйте горизонтальное положение лазера и установите лазер на 2 мкм; затем нажмите на L или R , чтобы убедиться, что сигнал сильный и равномерный.
- Нажмите « Время записи», чтобы собрать данные, которые по завершении автоматически перейдут в буфер. Затем сохраните данные в файле Naf и нажмите «Sample-Unload».
- Поместите пробирку с чистящим раствором на загрузочную платформу, нажмите « Повышение пробы», а через 1 минуту нажмите « Выгрузка пробы». Используйте сверхчистую воду, чтобы удалить остатки чистящего раствора с наконечника капилляра.
- Поместите стандартную пробирку размером частиц на загрузочную платформу и нажмите « Повышение пробы » в течение 1 минуты.
- Выберите 68-155 нм Std FL SiNPs контроля качества в разделе «SAMP. Inf» и нажмите « Sample-Sampling». Затем нажмите на панель инструментов и выберите «Маленький сигнал».
- Нажмите « Время записи», чтобы собрать данные, которые по завершении автоматически перейдут в буфер . Затем сохраните данные в файле Naf и нажмите «Sample-Unload».
- Поместите пробирку с чистящим раствором на загрузочную платформу, нажмите « Повышение пробы» и нажмите « Выгрузка пробы через 1 минуту». Используйте сверхчистую воду, чтобы удалить остатки чистящего раствора с наконечника капилляра.
- Поместите трубу PBS на грузовую платформу; нажмите на Sample-Boosting в течение 1 минуты.
- Выберите 68-155 нм Std FL SiNPs контроля качества в разделе «SAMP. Inf» и нажмите « Sample-Sampling». Затем нажмите на панель инструментов и выберите «Маленький сигнал».
- Нажмите « Время записи», чтобы собрать данные, которые по завершении автоматически перейдут в буфер . Сохраните данные в файле Naf и нажмите «Sample-Unload».
- Поместите трубку с чистящим раствором на загрузочную платформу, нажмите « Повышение пробы » и « Выгрузка образца» через 1 минуту. Используйте сверхчистую воду, чтобы удалить остатки чистящего раствора с наконечника капилляра.
- Проверьте информацию об образце, как описано ранее в шагах 4.2.17-4.2.20; измените PBS (этап 4.2.17) на образец sEV и проанализируйте данные.
- Перед запуском машины подготовьте пробирки, содержащие 200 мкл контроля качества, 200 мкл наносфер кремнезема, 2 x 200 мкл сверхчистой воды, 2 x 200 мкл чистящего раствора и 200 мкл PBS.
- Далее идентифицируйте sEV по вестерн-блоттингу.
- Определите концентрацию белка в sEV и тканях с помощью набора для количественного определения белка BCA в соответствии с инструкциями производителя.
- Рассчитайте объем загрузки sEV (например, для 5 мкг белка на лунку) на основе этих количественных результатов. Добавьте загрузочный буфер в соотношении 1:4 и перемешайте смесь.
- После денатурации в металлической ванне с температурой 100 °C (сухой термостат) в течение 10 мин отделяют белок на 12% полиакриламидном геле при 60 В в течение 80 мин.
- Перенесите гель на мембрану поливинилидендифторида 0,22 мкм при 220 мА в течение 2 ч с использованием буфера для переноса (25 мМ Tris, 192 мМ глицина, 20% метанола).
- Заблокируйте мембрану 5% обезжиренным сухим молоком в трис-буферизованном физиологическом растворе Tween (TBST) на 1 ч при комнатной температуре и инкубируйте с первичным антителом (моноклональное антитело CD9 кролика, моноклональное антитело CD63 кролика, моноклональное антитело TSG101 кролика, моноклональное антитело против человека GM130 мыши) на ночь при температуре 4 ° C. Разбавьте первичные антитела в 5% обезжиренном молоке в соотношении 1:1000.
- После трех промывок TBST инкубируйте мембрану с конъюгированным вторичным антителом пероксидазы хрена (HRP) при комнатной температуре в течение 1 часа.
- Определите антитело, связанное с HRP, с помощью субстрата для блоттинга ECL, а затем соберите и проанализируйте изображения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
sEV из тканей рака печени человека сыграли решающую роль в диагностике, лечении и прогнозе пациентов с раком печени. В этом методе использовались обычные лабораторные инструменты для выделения и очистки sEV, полученных из тканей рака печени; это может обеспечить методологическую поддержку для изучения sEV. На рисунке 2 показан общий процесс обогащения sEV из тканей рака печени. sEV в межклеточных пространствах тканей полностью высвобождаются путем разрезания тканей и ферментативного гидролиза. Далее пищеварительный раствор фильтруют через фильтры 70 мкм для удаления крупных фрагментов тканей. Кроме того, были выполнены этапы дифференциального центрифугирования (при 500 × г, 3000 × г и 12 000 × г) для удаления мелкого тканевого мусора, клеточного мусора, крупных везикул и апоптотических телец (рис. 3A-C).
Для получения высокочистых sEV два этапа дифференциального центрифугирования (при 3000 × г и 12 000 × г) повторяли в течение 3 мин до тех пор, пока не удалялось белое вещество с поверхности. Собранную надосадочную жидкость ультрацентрифугировали при 100 000 × г в течение 60 мин для удаления растворимых веществ, а затем гранулы промывали ресуспендированием в PBS (рис. 3D, E). После центрифугирования при 100 000 × г в течение 60 мин гранулы ресуспендировали в 50 мкл PBS. Наконец, образец фильтровали через мембрану 0,22 мкм и собирали в центрифужную пробирку объемом 600 мкл (рис. 3F) для устранения интерференции студенистых веществ и улучшения чистоты электромобилей.
Очищенные sEV исследовали под просвечивающим электронным микроскопом, который выявил наличие sEV с чашеобразной морфологией (рис. 4A, B). Размер частиц варьировался от 40 нм до 200 нм, а средний размер частиц составлял 89 нм (рис. 5A, B). Мы оценивали качество везикул по соотношению везикул во всех частицах на основе растворимости частиц в 1% Triton X-100. Чистота sEV была рассчитана как (1 - C2 / C1) × 100%, где C1 и C2 представляют собой количество частиц, обнаруженное за 1 ч до и после обработки Triton X-100, соответственно11. Эти данные показали, что чистота обогащенных электромобилей составила 68,32% (рис. 5C-E). После извлечения sEV из ткани рака печени образцы обрабатывали PBS и 1% Triton X-100 для оценки чистоты sEV. После обработки sEV были помечены частицами FITC CD9 и CD9+ для обнаружения в проточном цитометре наночастиц. Было обнаружено, что количество частиц CD9+ в испытуемой группе уменьшилось (дополнительный рисунок S1). Белковые маркеры sEV, такие как CD63, CD9 и TSG101, были обнаружены с помощью вестерн-блоттинга. GM130 использовался в качестве отрицательного контрольного маркера sEVs12, который был обнаружен в тканевых клетках, но не в sEV (рис. 6). Белковые маркеры sEV, полученные из клеток и тканей - CD63, ALIX и TSG101 - были обнаружены с помощью вестерн-блоттинга. GM130 использовался в качестве отрицательного контрольного маркера sEV (дополнительный рисунок 2).
Рисунок 1: Требования протокола. (A) 100-миллиметровая чашка для клеточных культур, скальпель и пинцет для нарезки ткани, (B) 6-луночная пластина, (C) клеточный фильтр 70 мкм, мембранный фильтр 0,22 мкм и стакан для очистки клеточного фильтра, (D) стерильный шприц объемом 1 мл и (E) ультрацентрифужная пробирка объемом 4,7 мл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Процесс обогащения мелких внеклеточных везикул из тканей рака печени. Замороженные ткани взвешивали, разрезали скальпелем и инкубировали со средой RPMI-1640, коллагеназой D и ДНКазой Ι в течение 20 мин при 37 °C. Небольшие внеклеточные везикулы обогащали дальнейшей фильтрацией и дифференциальным ультрацентрифугированием. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Дифференциальное ультрацентрифугирование. (А) После центрифугирования при 500 × г в течение 10 мин может наблюдаться большое количество тканевого мусора (желтая гранула) и надосадочная жидкость (розовая жидкость). (B) После центрифугирования при 3000 × г в течение 20 мин остаточный тканевый мусор и большое количество клеточного мусора отделяли от надосадочной жидкости. (C) Центрифугирование при 12 000 × г в течение 20 мин устранило загрязнение апоптотических телец крупных везикул. (D) Гранулы собирали центрифугированием при 100 000 × г в течение 60 мин. (E) Центрифугирование повторяли при 100 000 × г в течение 60 мин для промывки мелких везикул и удаления растворимых примесей фосфатно-буферным физиологическим раствором. (F) Фильтрат был получен после фильтрации небольших внеклеточных везикул, полученных из тканей рака печени, через фильтры 0,22 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Просвечивающая электронная микроскопия. Форму мелких внеклеточных везикул наблюдали под просвечивающим электронным микроскопом. Масштабная линейка = (A) 100 нм, (B) 200 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Проточная цитометрия для sEV. Репрезентативные SSC лопнули следы sEV (A) до и (B) после 1% обработки Triton X-100 в течение 1 ч на льду. (C) Репрезентативные гистограммы распределения SSC sEV до (1,801 события) и (D) после (91 события) лечения Triton X-100, полученные на основе данных, собранных в течение 1 часа каждая. (E) Измерение чистоты электромобилей с использованием 1% Triton X-100. Чистота sEV была рассчитана как (1 - C2 / C1) × 100%, где C1 и C2 представляют собой количество частиц, обнаруженных за 1 ч до и после обработки Triton X-100 соответственно. Сокращения: sEVs = малые внеклеточные везикулы; SSC = боковой разброс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Вестерн-блоттинг. Вестерн-блоттинг использовали для анализа GM130, TSG101, CD63 и CD9 в клеточных экстрактах и sEV. Аббревиатура: sEVs = малые внеклеточные везикулы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок S1: Обнаружение FITC CD9. Процентное содержание CD9-положительных sEV после (A) PBS и (B) 1% лечения Triton X-100 в течение 1 ч было обнаружено с помощью проточной цитометрии. Сокращения: sEVs = малые внеклеточные везикулы; FITC = изотиоцианат флуоресцеина; PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S2: Вестерн-блоттинг, используемый для анализа GM130, TSG101, CD63 и ALIX в sEV клеточного и тканевого происхождения. Аббревиатура: sEVs = малые внеклеточные везикулы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 3: Окрашивание Кумасси синим. Окрашивание синим цветом Coomassie общих белков из клеточных экстрактов и культивируемых sEV, полученных из экспланта, а также свежих и замороженных sEV, полученных из тканей. Аббревиатура: sEVs = малые внеклеточные везикулы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная таблица S1: Соотношение частиц и белков sEV. Соотношение частиц и белка сравнивало чистоту и выход после и до стадии центрифугирования и стадии фильтрации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная таблица S2: Взаимосвязь между размером ткани и концентрацией ферментов. Сравнение взаимосвязи между различными концентрациями ферментов и размером тканевых блоков с использованием соотношения частиц и белков и количества частиц sEV. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает воспроизводимый метод извлечения sEV из ткани рака печени. Высококачественные sEV получают путем резкой изоляции тканей, обработки пищеварительными ферментами, дифференциального ультрацентрифугирования, а также фильтрации и очистки фильтрующей мембраны 0,22 мкм. Для последующего анализа чрезвычайно важно обеспечить высокую чистоту электромобилей. В процессе дифференциального центрифугирования на поверхности надосадочной жидкости появится слой белых веществ (неизвестного состава). Поскольку этот слой загрязняет sEV, мы максимально удалили его путем повторного центрифугирования (3 000 × г и 12 000 × г) и фильтрации через мембрану 0,22 мкм (дополнительная таблица S1). Из-за интерференции этого белого слоя мы рисковали потерять sEV при аспирации надосадочной жидкости. Поэтому важно осторожно пройти несколько центрифугирований и собрать надосадочную жидкость как можно тщательнее, не касаясь белого вещества.
Этот протокол может очищать высококачественные sEV, полученные из ткани печени, но он имеет некоторые ограничения. В этих экспериментах объем тканевых блоков обычно составляет ~300-500 мг. Количество sEV, выделенных из чрезвычайно маленьких тканевых блоков, было слишком низким, чтобы можно было проводить последующие исследования. Учитывая влияние количества пищеварительной жидкости на выход тканевых sEV, тканевые блоки, которые слишком велики, должны быть разделены на несколько частей для экстракции или количество пищеварительных ферментов должно быть увеличено, чтобы обеспечить полное получение sEV из ткани. Кроме того, метод выделения sEV должен быть адаптирован к сложности образца ткани. С помощью этого метода мы выделили sEV из ткани печени и ткани колоректального рака. Однако мы не выполняли этот протокол на других тканях, и эти методы, возможно, потребуется оптимизировать для выделения других тканей, например, с использованием различных типов и концентраций ферментов.
На протяжении всех этих процедур очень важно получать высококачественные sEV, и это во многом зависит от метода разделения, концентрации пищеварительных ферментов, времени инкубации и правильного хранения тканей. В предыдущем исследовании11 было определено, что оптимальная комбинация дозировки и времени инкубации коллагеназы D и ДНКазы I, используемая для отделения sEV от тканей рака печени, составляла 4 мг / мл коллагеназы D, 80 ЕД / мл ДНКазы I и 20 минут инкубационного времени (дополнительная таблица S2). Мы также сравнили качество sEV из свежей ткани по сравнению с замороженной тканью и обнаружили, что sEV, выделенные из свежей ткани, имели более высокое общее количество белка (дополнительный рисунок 3). Тем не менее, чистота двух типов sEV существенно не различалась в эксперименте по разрушению мембраны (обработка 1% Triton X-100), что указывает на то, что этот метод также применим к свежей ткани рака печени. Концентрация частиц и содержание белка в sEV, полученных этим методом, составили 3,28 × 10 10 ± 0,84 × 10 частиц на 100 мг ткани и 11,62 мкг ± 1,94 мкг белка на 100 мг ткани соответственно. Тем не менее, трудно получить sEV из свежей ткани партиями в рутинной клинической работе; таким образом, этот метод может обеспечить надежный и эффективный метод крупномасштабной очистки sEV в замороженной ткани рака печени.
Таким образом, этот протокол описывает оптимизированный метод обогащения для электромобилей с использованием дифференциального ультрацентрифугирования и фильтрации для получения электромобилей высокой чистоты. Эти тканевые sEV подходят для последующего анализа, такого как характеристика биомолекулярного состава, и других исследований, направленных на характеристику их физиологической или патофизиологической роли или потенциального применения в качестве маркеров заболевания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Первую дочернюю больницу Медицинского университета Ганнань за поддержку этой работы. Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (грант No 82260422).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Membrane Filter Unit | Millex | SLGPR33RB | |
| 1 mL Sterile syringe | Hubei Xianming Medical Instrument Company | YL01329 | |
| 2% Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400-2 | |
| 4.7 mL Centrifuge Tube | Beckman Coulter | 361621 | |
| 6-well Cell cuture plate | LABSELECT | 11110 | |
| 50 mL Beaker | Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company | CF2100800 | |
| 70 µm Cell strainer | Biosharp | BS-70-XBS | |
| 100 mm Cell culture dish | CELL TER | CS016-0128 | |
| 600 µL Centrifuge tube | Axygen | MCT060C | |
| BCA protein quantification kit | Thermo Fisher | RJ240544 | |
| Beckman Coulter Optima-Max-TL | Beckman | A95761 | |
| BioRad Mini trans-blot | Bio-Rad | 1703930 | |
| BioRad Mini-Protean | Bio-Rad | 1645050 | |
| CD63 Antibody | Abcam | ab134045 | |
| CD9 Antibody | Abcam | ab263019 | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428HQ527333 | |
| Cleaning Solution | NanoFCM | C1801 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Copper net | Henan Zhongjingkeyi Technology Company | DJZCM-15-N1 | |
| Dry Thermostat | Hangzhou allsheng instruments company | AS-01030-00 | |
| FITC Anti Human CD9 Antibody | Elabscience | E-AB-F1086C | |
| Glycine | Solarbio | G8200 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody | Proteintech | SA00001-1 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody | Proteintech | SA00001-2 | |
| Methanol | Shanghai Zhenxing Chemical Company | ||
| Nanoparticle flow cytometer | NanoFCM INC | FNAN30E20112368 | |
| Phosphatase inhibitors(PhosSTOP) | Roche | 4906845001 | |
| Phosphate Buffered Saline(PBS) | Servicebio | G4202 | |
| Polyvinylidene Difluoride Membrane | Solarbio | ISEQ00010 | |
| QC Beads | NanoFCM | QS2502 | |
| RPMI-1640 basic medium | Biological Industries | C11875500BT | |
| Scalpel | Guangzhou Kehua Trading Company | NN-0623-1 | |
| Silica Nanospheres | NanoFCM | S16M-Exo | |
| Transference Decoloring Shaker TS-8 | Kylin-Bell | E0018 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Scientific | Talos L120C | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| TSG101 Antibody | Proteintech | 28283-1-AP | |
| Tweezer | Guangzhou Lige Technology Company | LG01-105-4X |
References
- Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
- Hou, R., et al. Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).
- Zhang, L., Yu, D. Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation - Efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Crescitelli, R., Lässer, C., Lötvall, J. Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues. Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).
- Crescitelli, R., et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433 (2020).
- Jang, S. C., et al. Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420 (2019).
- Muralidharan-Chari, V., et al. ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles. Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).
- Matejovič, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle. FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).
- Zhou, X., et al. Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice. Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).
- Chen, J., et al. Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method. Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).
- Fang, T., et al. Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer. Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).
- Huang, X., et al. RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma. Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).
- Chen, L., et al. HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway. Cell Death & Disease. 9 (5), 513 (2018).
- Jingushi, K., et al. Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin. International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).
- Camino, T., et al. Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366 (2020).
