Summary
כאן אנו מתארים את העשרת שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות שמקורן ברקמת סרטן הכבד באמצעות שיטת אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית אופטימלית.
Abstract
שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEVs) שמקורן ברקמה יכולות לשקף את המצב התפקודי של תאי המקור ואת מאפייני החלל הבין-תאי של הרקמה. העשרה יעילה של כלי רכב חשמליים אלה היא תנאי מוקדם חשוב לחקר תפקודם הביולוגי ומפתח לפיתוח טכניקות זיהוי קליניות וטכנולוגיית נשאות טיפולית. קשה לבודד sEV מרקמה מכיוון שהם בדרך כלל מזוהמים מאוד. מחקר זה מספק שיטה להעשרה מהירה של sEV באיכות גבוהה מרקמת סרטן הכבד. השיטה כוללת תהליך בן ארבעה שלבים: דגירה של אנזימי עיכול (collagenase D ו-DNase Ι) עם רקמות, סינון דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר, אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית וסינון דרך מסנן קרום של 0.22 מיקרומטר. בשל אופטימיזציה של שלב אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית והוספת שלב סינון, טוהר ה- sEV המתקבל בשיטה זו גבוה מזה שהושג על ידי אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית קלאסית. הוא מספק מתודולוגיה חשובה ונתונים תומכים לחקר sEV נגזר רקמות.
Introduction
שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEVs) הן בקוטר של כ-30 ננומטר עד 150 ננומטר והן מופרשות על ידי תאים שונים1. הם יכולים לתקשר עם תאי רקמה ולווסת את המיקרו-סביבה המקומית או הרחוקה על ידי העברת מולקולות ביולוגיות חשובות כגון שומנים, חלבונים, דנ"א ורנ"א לאיברים, רקמות, תאים וחלקים תוך-תאיים שונים. לכן, הם יכולים גם לשנות את ההתנהגות של תאים נמענים 2,3. בידוד וטיהור של כלי רכב חשמליים ספציפיים הוא תנאי מוקדם חיוני לחקר ההתנהגות הביולוגית שלהם במהלך התפתחות המחלה ובמהלכה. אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית - הנחשבת לתקן הזהב - משמשת בדרך כלל להפרדת כלי רכב חשמליים מהרקמות שבהן הם שוכנים בדרך כלל4. פסולת רקמות, פסולת תאים, שלפוחיות גדולות וגופים אפופטוטיים ניתנים להסרה באמצעות טכניקה זו, ומשאירים רק את ה- sEVs.
הודגם כי Collagenase D ו-DNase I אינם משפיעים על המאפיינים המולקולריים של תאים או שלפוחיות, כאשר התכונות של שני האנזימים תורמות לשחרור שלפוחיות במטריצה החוץ תאית 5. אנזימים אלה שימשו למיצוי sEV מרקמת מלנומה גרורתית אנושית, רקמת סרטן המעי הגס ורקמת רירית המעי הגס 5,6,7. עם זאת, הריכוז וזמן העיכול של collagenase D ו- DNase I בשיטות אלה שונים, מה שמוביל למסקנות לא עקביות. כדי למנוע משקעים משותפים של תת-סוגים אחרים של sEVs, חוקרים הסירו בועיות חוץ-תאיות גדולות יותר (0.1 מיקרומטר או 0.2 מיקרומטר קוטר) על ידי סינון ו / או צנטריפוגה דיפרנציאלית8. בהתאם לרקמת המקור, שיטות שונות של בידוד וטיהור עשויות להידרש 9,10.
שימוש בשיטת האולטרה-צנטריפוגה הדיפרנציאלית המסורתית כדי לחלץ sEV מרקמת הכבד יוצר שכבה של חומר לבן על פני השטח של הסופרנטנט, ללא כל דרך לקבוע את תכונותיו. במחקר קודם11, שכבה זו של חומר לבן נמצאה כמשפיעה על טוהר ה-sEVs. למרות שמספר החלקיקים וריכוז החלבונים של הדגימות שבודדו בשיטה המסורתית היו גבוהים מאלה של השיטה הנוכחית, מקדם השונות היה גדול, אולי משום שמזהמים רבים יכולים להוביל לחזרתיות לקויה של התוצאות. כלומר, באמצעות חומר ניקוי (כלומר, זיהוי מסיסות של חלקיקים ב-1% טריטון X-100), מצאנו כי טוהר ה-sEV המתקבל בשיטה זו היה גדול יותר. לפיכך, אנו משתמשים בשיטה זו כדי לבודד ולטהר sEV שמקורם ברקמת סרטן המעי הגס לצורך מחקר פרוטאומי.
כיום, המחקר על sEVs בסרטן הכבד מתמקד בעיקר בסרום, פלזמה, ואת supernatant של תרבית התא12,13,14. עם זאת, sEVs שמקורם ברקמת סרטן הכבד יכולים לשקף בצורה מדויקת יותר את הפתולוגיה הפיזיולוגית ואת המיקרו-סביבה הסובבת את סרטן הכבד ולמנוע ביעילות את הפירוק והזיהום של כלי רכב חשמליים אחרים15,16. עם השימוש אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית, שיטה זו יכולה להעשיר את התשואה ולקבל sEV באיכות גבוהה, מתן בסיס חשוב למחקר נוסף של סרטן הכבד. שיטה זו מאפשרת לרקמת סרטן הכבד להיות מופרדת על ידי הפרדה חדה ולהיות מנותקת על ידי collagenase D ו- DNase I. לאחר מכן, פסולת התא, שלפוחיות גדולות, גופים אפופטוטיים מוסרים עוד יותר על ידי סינון אולטרה צנטריפוגה דיפרנציאלית. לבסוף, הרכבים החשמליים מבודדים ומטוהרים למחקרים מאוחרים יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
רקמת סרטן הכבד האנושית נאספה מחולים שאובחנו עם ממאירות בכבד בבית החולים המסונף הראשון של האוניברסיטה הרפואית גנאן. כל החולים חתמו על טופס הסכמה מדעת, ואיסוף דגימות רקמה אנושית אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים המסונף הראשון של האוניברסיטה הרפואית גנאן. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הציוד והתוכנות המשמשים בפרוטוקול זה.
1. הכנה
- מניחים את שייקר הסרת הצבע העברה באינקובטור ולהגדיר את הטמפרטורה על 37 °C (77 °F). ראו איור 1 עבור כל שאר הציוד הדרוש.
- נקו את האזמל והמלקחיים על ידי ריסוס שלהם ב-75% אלכוהול.
- הכינו את תמיסת העיכול על ידי מדידת 6 מ"ג של collagenase D (4 מ"ג/מ"ל) ו-24 μL של DNase Ι (80 U/mL) והוספתם ל-1.5 מ"ל של RPMI-1640 Basic Medium. מערבבים בהיפוך עדין עד שהתוספים מומסים לחלוטין.
- מראש, יש להרטיב מסננות תאים של 70 מיקרומטר ו-0.22 מיקרומטר עם 1x מלח חוצץ פוספט (PBS).
- הניחו צלחת תרבית תאים סטרילית בקוטר 100 מ"מ על ארגז הקרח כדי להחזיק את רקמות הכבד לאחר ההפשרה.
- בתוך 15 דקות לאחר בידוד רקמת קרצינומה hepatocellular, לשטוף את הדם על פני השטח של בלוק הרקמה עם PBS, להעביר את הרקמה לתוך צינור קפוא סטרילי, ולאחסן אותו ב -80 ° C עד הניסוי לא יותר מ 2 שבועות.
2. דיסוציאציה של רקמות
- הוציאו את דגימת הרקמה מהמקפיא בטמפרטורה של 80°C והכניסו כ-400 מ"ג של הרקמה - חתוכה לרסיסים של 2 מ"מ x 2 מ"מ x 2 מ"מ - לתוך צלחת תרבית התאים בקוטר 10 ס"מ שעל ארגז הקרח.
- להעביר את הרקמה לתוך צלחת 6 באר עם 1.5 מ"ל של פתרון העיכול; לאחר מכן, הניחו את הצלחת על שייקר הסרת הצבע של טרנספר (20 סל"ד לדקה) כדי לדגור במשך 20 דקות בטמפרטורה של 37°C לדיסוציאציה מוחלטת של רקמת סרטן הכבד ושחרור של sEVs.
- מוציאים את צלחת 6 הקידוחים מהאינקובטור ומניחים אותה על ארגז הקרח. הוסף 80 μL של מעכב phosphatase ו 200 μL של פתרון מעכב פרוטאז מלא כדי לעצור את העיכול.
- העבירו את תמיסת העיכול למסננת התאים בגודל 70 מיקרומטר וסננו אותה לאט כדי להסיר פסולת רקמות גדולה. אספו את התסנין והניחו אותו בצינור צנטריפוגה של 2 מ"ל.
3. אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית
הערה: בצע את כל שלבי הצנטריפוגה ב- 4 °C.
- צנטריפוגה את התסנין ב 500 × גרם במשך 10 דקות ולאסוף את supernatant בצינור צנטריפוגה חדש 2 מ"ל. לאחר מכן ניתן להסיר את רוב פסולת הרקמה הקטנה.
- צנטריפוגה את הסופרנאטנט במהירות של 3,000 × גרם למשך 20 דקות כדי להסיר פסולת תאים. מעבירים בזהירות את הסופרנאטנט לצינור צנטריפוגה חדש עד שקצה הפיפטה עומד לגעת בחומר הלבן שעל פני השטח.
- צנטריפוגה את הנוזל הנותר ב 3,000 × גרם במשך 3 דקות; לאחר מכן, שאפו את supernatant כדי להקל על איסוף שלפוחיות. כדי להבטיח את טוהר הרכבים החשמליים, יש לוודא כי החומר הלבן אינו שואף.
- צנטריפוגה את הסופרנאטנט שנאסף ב 12,000 × גרם למשך 20 דקות ולהעביר 900 μL של supernatant לצינור אולטרה צנטריפוגה 4.7 מ"ל. צנטריפוגה את הנוזל הנותר ב 12,000 × גרם במשך 3 דקות ולאחר מכן לאסוף ולערבב את שני supernatants לתוך אותו צינור ultracentrifuge. מלא את הצינור לחלוטין עם PBS.
- צנטריפוגה את הסופרנאטנטים ב-100,000 × גרם למשך 60 דקות. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה על ידי מילוי צינור האולטרה-צנטריפוגה ב-PBS וצנטריפוגה נוספת ב-100,000 × גרם למשך 60 דקות. להשעות את הגלולה עם 50 μL של PBS.
- שאפו את מתלה ה-sEV באמצעות מזרק סטרילי בנפח 1 מ"ל וסננו אותו דרך מסנן קרום של 0.22 מיקרומטר. אספו את התסנין בצינור צנטריפוגה של 600 μL ואחסנו אותו בטמפרטורה של -80°C לניתוח נוסף.
4. הערכת איכות ההעשרה
- התבוננו במורפולוגיה של כלי הרכב החשמליים תחת מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת.
- לאחר מכן, יש לזרוק 10 μL של דגימת sEV על רשת נחושת, לדגור בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות, ולנקות אותו עם מים מזוקקים סטריליים, באמצעות נייר סופג כדי להסיר נוזלים עודפים.
- יש לטפטף 10 μL של 2% אורניל אצטט על רשת הנחושת לקבלת צביעה שלילית למשך דקה אחת. השתמש בנייר מסנן כדי לספוג את הנוזל על פני רשת הנחושת ולייבש אותו במשך 2 דקות תחת מנורת ליבון.
- התבונן ברשת הנחושת תחת מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת ותמונה ב 80 kV.
- השתמש בציטומטר זרימת ננו-חלקיקים כדי לקבוע את התפלגות הגודל והטוהר של כלי הרכב החשמליים.
- לפני הפעלת המכונה, הכינו צינורות המכילים 200 μL של בקרת איכות, 200 μL של ננוספירות סיליקה, 2 x 200 μL של מים טהורים במיוחד, 2 x 200 μL של תמיסת ניקוי, ו 200 μL של PBS.
הערה: לפני בדיקת דגימות sEV, יש צורך לבצע בקרת איכות במכשיר ולבדוק את תקן גודל החלקיקים (יש לחשב את התפלגות הגודל באמצעות עקומות סטנדרטיות הנוצרות עם מספר ננומיקרוספרות בקטרים שונים [68-155 ננומטר] באותו תנאי זיהוי). חרוזי QC וננו-ספירות סיליקה דוללו פי 100 במים אולטרה-טהורים בנפח כולל של 200 מיקרוליטר. - בדקו את נפח תמיסת הניקוי (>10 מ"ל) ושימו לב להפרש בין רמות נוזל הנדן לנוזל הפסולת (20-30 ס"מ).
- כבה את אספקת החשמל העיקרית של המכשיר; לאחר 20 שניות, הפעל את המחשב והמתן לצפצופים המציינים שהמכשיר מחובר כראוי להפעלת התוכנה.
- לחץ על Start Up כדי להפעיל את המצלמה, הלייזר ומשאבת האוויר.
- לחץ על Sheath Flow-Start Up, והנח מים טהורים במיוחד על פלטפורמת הטעינה. לאחר 4 דקות (הספירה לאחור של המכשיר), לחץ על Sample-Boosting | פריקת דגימה.
- לאחר 30 שניות, הניחו את הצינור הריק על פלטפורמת הטעינה ולחצו על Sample-Boosting | פריקת דגימה. לאחר מכן, הניחו את הצינור המחזיק את המים האולטרה-טהורים על פלטפורמת הטעינה, ובו-זמנית, לחצו על Sample-Boosting | נדן זרימה-טיהור.
- לחץ על הפעלה ידנית והנח את צינור ריכוז החלקיקים על פלטפורמת הטעינה. לאחר מכן, לחץ על Sample-Boosting למשך דקה אחת ובחר בו זמנית בקרת איכות 250 ננומטר Std FL SiNPs ב- "SAMP. אינף."
- לחץ על דגימת דגימה והפעל את הגלאי על ידי לחיצה על SPCM.
הערה: בשלב זה, ניתן לראות את צורת הגל של האות בזמן אמת. - לחץ על Auto Sampling והזן 1.0 לתוך Sampling SET כדי לתקן את הלחץ ב- 1 KPa. לחץ על סרגל הכלים ובחר אות גדול.
- התאם את המיקום האופקי של הלייזר והגדר את הלייזר ל -2 מיקרומטר; לאחר מכן, לחץ על L או R כדי לוודא שהאות חזק ואחיד.
- לחץ על Time to Record כדי לאסוף את הנתונים, אשר יקפוץ אוטומטית למאגר בסיום. לאחר מכן, שמור את הנתונים בקובץ Naf ולחץ על פריקת דגימה.
- הניחו את צינור פתרון הניקוי על פלטפורמת הטעינה, לחצו על Sample-Boosting, ולאחר דקה לחצו על Sample-Unloading. השתמש במים טהורים במיוחד כדי להסיר את תמיסת הניקוי השיורית מקצה הנימים.
- הניחו את הצינור הסטנדרטי בגודל חלקיק על פלטפורמת הטעינה ולחצו על Sample-Boosting למשך דקה אחת.
- בחר 68-155 ננומטר Std FL SiNPs בקרת איכות ב "SAMP. Inf" ולחץ על Sample-Sampling. לאחר מכן, לחץ על סרגל הכלים ובחר אות קטן.
- לחץ על Time to Record כדי לאסוף את הנתונים, אשר יקפוץ אוטומטית למאגר בסיום. לאחר מכן, שמור את הנתונים בקובץ Naf ולחץ על פריקת דגימה.
- הניחו את צינור פתרון הניקוי על פלטפורמת הטעינה, לחצו על Sample-Boosting ולחצו על Sample-Unload לאחר דקה. השתמש במים טהורים במיוחד כדי להסיר את תמיסת הניקוי השיורית מקצה הנימים.
- מקם את צינור PBS על פלטפורמת הטעינה; לחץ על Sample-Boosting למשך דקה אחת.
- בחר 68-155 ננומטר Std FL SiNPs בקרת איכות ב "SAMP. Inf" ולחץ על Sample-Sampling. לאחר מכן, לחץ על סרגל הכלים ובחר אות קטן.
- לחץ על Time to Record כדי לאסוף נתונים, אשר יקפוץ אוטומטית למאגר בסיום. שמור את הנתונים בקובץ Naf ולחץ על Sample-Unload.
- הניחו את צינור פתרון הניקוי על פלטפורמת הטעינה, לחצו על Sample-Boosting ו-Sample-Unload לאחר דקה. השתמשו במים אולטרה-טהורים כדי להסיר שאריות תמיסת ניקוי מקצה הנימים.
- בדוק את המידע לדוגמה כמתואר קודם לכן בשלבים 4.2.17-4.2.20; שנה את PBS (שלב 4.2.17) למדגם sEV ונתח את הנתונים.
- לפני הפעלת המכונה, הכינו צינורות המכילים 200 μL של בקרת איכות, 200 μL של ננוספירות סיליקה, 2 x 200 μL של מים טהורים במיוחד, 2 x 200 μL של תמיסת ניקוי, ו 200 μL של PBS.
- זיהוי נוסף של כלי הרכב החשמליים על ידי כתם מערבי.
- קבע את ריכוזי החלבונים של כלי הרכב החשמליים והרקמות באמצעות ערכת כימות חלבון BCA בהתאם להוראות היצרן.
- חשב את נפח ההעמסה של sEV (למשל, עבור 5 מיקרוגרם חלבון לכל באר) בהתבסס על תוצאות כמותיות אלה. מוסיפים חיץ העמסה ביחס של 1:4 ומערבלים את התערובת.
- לאחר דנטורציה באמבט מתכת של 100 מעלות צלזיוס (תרמוסטט יבש) למשך 10 דקות, יש להפריד את החלבון על ג'ל פוליאקרילאמיד 12% במתח של 60 וולט למשך 80 דקות.
- מעבירים את הג'ל לקרום פוליווינילידן דיפלואוריד 0.22 מיקרומטר ב-220 mA למשך שעתיים באמצעות מאגר העברה (25 mM Tris, 192 mM גליצין, 20% מתנול).
- יש לחסום את הממברנה עם חלב יבש 5% ללא שומן בטווין מלח חוצץ טריס (TBST) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ולדגור עם נוגדן ראשוני (נוגדן CD9 חד שבטי אנטי אנושי ארנב, נוגדן CD63 חד שבטי ארנב, נוגדן TSG101 חד שבטי ארנב, נוגדן GM130 חד שבטי עכבר) למשך הלילה ב -4 מעלות צלזיוס. יש לדלל את הנוגדנים הראשוניים בחלב 5% ללא שומן בקנ"מ 1:1,000.
- לאחר שלוש שטיפות עם TBST, יש לדגור על הממברנה עם נוגדן משני מצומד (HRP) בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
- זהה את הנוגדן המקושר ל- HRP באמצעות מצע ניקוי ECL, ולאחר מכן אסוף ונתח את התמונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
sEVs מרקמות סרטן כבד אנושיות מילאו תפקיד מכריע באבחון, בטיפול ובפרוגנוזה של חולים עם סרטן הכבד. שיטה זו השתמשה במכשירי מעבדה נפוצים כדי לבודד ולטהר sEV שמקורם ברקמות סרטן הכבד; זה עשוי לספק תמיכה מתודולוגית לחקר sEVs. איור 2 מדגים את התהליך הכללי של העשרת sEV מרקמות סרטן הכבד. sEVs בחללים הבין-תאיים של רקמות משוחררים במלואם באמצעות חיתוך רקמות והידרוליזה אנזימטית. יתר על כן, פתרון העיכול מסונן דרך מסננים 70 מיקרומטר כדי להסיר שברי רקמות גדולים. יתר על כן, שלבי צנטריפוגה דיפרנציאליים בוצעו (ב-500 × גרם, 3,000 × גרם ו-12,000 × גרם) כדי להסיר פסולת רקמות קטנות, פסולת תאים, שלפוחיות גדולות וגופים אפופטוטיים (איור 3A-C).
כדי להשיג כלי רכב חשמליים בעלי טוהר גבוה, חזרו על שני שלבי צנטריפוגה דיפרנציאליים (ב-3,000 × גרם וב-12,000 × גרם) במשך 3 דקות עד שהוסר החומר הלבן שעל פני השטח. הסופרנאטנט שנאסף עבר אולטרה-צנטריפוגה במשקל של 100,000 × גרם במשך 60 דקות כדי להסיר חומרים מסיסים, והכדורים נשטפו על-ידי השהיה מחדש ב-PBS (איור 3D,E). לאחר צנטריפוגה של 100,000 × גרם במשך 60 דקות, הגלולה הושעתה מחדש ב-50 מיקרוליטר של PBS. לבסוף, הדגימה סוננה דרך קרום של 0.22 מיקרומטר ונאספה בצינור צנטריפוגה של 600 מיקרומטר (איור 3F) כדי להסיר את ההפרעה של חומרים ג'לטיניים ולשפר את טוהר ה-sEVs.
כלי הרכב החשמליים המטוהרים נבדקו תחת מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, שחשף את נוכחותם של כלי רכב חשמליים עם מורפולוגיה בצורת (איור 4A,B). גודל החלקיקים נע בין 40 ננומטר ל-200 ננומטר, וגודל החלקיקים הממוצע היה 89 ננומטר (איור 5A,B). הערכנו את איכות השלפוחיות לפי היחס בין השלפוחיות בכל החלקיקים בהתבסס על מסיסות החלקיקים בטריטון X-100 1%. טוהר ה-sEV חושב כ-(1 - C2/C1) ×-100%, כאשר C1 ו-C2 מייצגים את מספרי החלקיקים שזוהו שעה אחת לפני ואחרי הטיפול בטריטון X-100, בהתאמה11. נתונים אלה הראו כי טוהר כלי הרכב החשמליים המועשרים היה 68.32% (תרשים 5C-E). לאחר חילוץ ה-sEVs מרקמת סרטן הכבד, הדגימות טופלו ב-PBS וב-1% Triton X-100 כדי להעריך את טוהר ה-sEVs. לאחר הטיפול, ה-sEVs סומנו בחלקיקי FITC CD9 ו-CD9+ לצורך זיהוי בציטומטר זרימת הננו-חלקיקים. נמצא כי מספר חלקיקי CD9+ בקבוצת הבדיקה ירד (איור משלים S1). הסמנים החלבוניים של sEV - כגון CD63, CD9 ו- TSG101 - זוהו על ידי כתם מערבי. GM130 שימש כסמן הבקרה השלילי של sEVs12, שנמצא בתאי רקמה אך לא ב-sEV (איור 6). הסמנים החלבוניים של sEV שמקורם בתאים וברקמות - CD63, ALIX ו-TSG101 - זוהו על ידי כתם מערבי. GM130 שימש כסמן הבקרה השלילי של כלי רכב חשמליים (איור משלים 2).
איור 1: דרישות פרוטוקול. (A) צלחת תרבית תאים בקוטר 100 מ"מ, אזמל ופינצטה לחיתוך רקמות, (B) צלחת בעלת 6 בארות, (C) מסננת תאים בגודל 70 מיקרומטר, מסנן קרום בגודל 0.22 מיקרומטר וכוס לניקוי מסננת התא, (D) מזרק סטרילי בנפח 1 מ"ל, ו-(E) צינור אולטרה-צנטריפוגה בנפח 4.7 מ"ל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תהליך של העשרת שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות מרקמות סרטן הכבד. הרקמות הקפואות נשקלו, נחתכו באזמל והודגרו עם RPMI-1640 בינוני, collagenase D ו-DNase Ι במשך 20 דקות בטמפרטורה של 37°C. שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות הועשרו על ידי סינון נוסף ואולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית. (A) לאחר צנטריפוגה במהירות של 500 × גרם למשך 10 דקות, ניתן להבחין בכמות גדולה של פסולת רקמה (גלולה צהובה) וסופרנאטנט (נוזל ורוד). (B) לאחר צנטריפוגה של 3,000 × גרם במשך 20 דקות, שאריות פסולת רקמה וכמות גדולה של פסולת תאים הופרדו מהסופרנטנט. (C) צנטריפוגה בעוצמה של 12,000 × גרם למשך 20 דקות ביטלה את הזיהום של גופים אפופטוטיים בעלי שלפוחית גדולה. (D) הכדוריות נאספו באמצעות צנטריפוגות במהירות של 100,000 × גרם למשך 60 דקות. (E) הצנטריפוגה חזרה על עצמה בעוצמה של 100,000 × גרם במשך 60 דקות כדי לשטוף את השלפוחיות הקטנות ולהסיר זיהומים מסיסים במי מלח חוצצים פוספט. (F) התסנין התקבל לאחר סינון של שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות שמקורן ברקמת סרטן הכבד דרך מסננים של 0.22 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. צורתן של השלפוחיות החוץ-תאיות הקטנות נצפתה תחת מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. סרגל קנה מידה = (A) 100 ננומטר, (B) 200 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ציטומטריית זרימה עבור כלי רכב חשמליים. SSC מייצג פרץ עקבות של sEVs (A) לפני ו-(B) לאחר טיפול 1% Triton X-100 במשך שעה על קרח. (C) היסטוגרמות התפלגות SSC מייצגות של כלי הרכב החשמליים לפני (1,801 אירועים) ו-(D) אחרי (91 אירועים) טיפול Triton X-100 הנגזר מנתונים שנאספו במשך שעה כל אחד. (E) מדידת טוהר עבור כלי רכב חשמליים באמצעות 1% Triton X-100. טוהר ה-sEV חושב כ-(1 - C2/C1) ×-100%, כאשר C1 ו-C2 מייצגים את מספר החלקיקים שזוהו שעה אחת לפני ואחרי הטיפול בטריטון X-100, בהתאמה. קיצורים: sEVs = שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות; SSC = פיזור צד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: כתם מערבי. כתם מערבי שימש לניתוח GM130, TSG101, CD63 ו- CD9 בתמציות התאים וב- sEVs. קיצור: sEVs = שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים S1: זיהוי FITC CD9. האחוזים של sEV חיובי CD9 לאחר (A) PBS ו (B) 1% טיפול Triton X-100 במשך 1 שעה זוהו על ידי ציטומטריית זרימה. קיצורים: sEVs = שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות; FITC = isothiocyanate fluorescein; PBS = מלח חוצץ פוספט. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים S2: כתם מערבי המשמש לניתוח של GM130, TSG101, CD63 ו-ALIX ב-sEV שמקורו בתאים ורקמות. קיצור: sEVs = שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 3: כתמים כחולים של קומאסי. צביעה כחולה של קומאסי של סך החלבונים מתמציות התאים ו-sEV שמקורם בצמחים בתרבית ו-sEV טריים וקפואים שמקורם ברקמות. קיצור: sEVs = שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה משלימה S1: יחס חלקיקים לחלבון של sEVs. יחס חלקיק לחלבון השווה טוהר ותנובה לאחר ולפני שלב הצנטריפוגה ושלב הסינון. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה משלימה S2: הקשר בין גודל הרקמה לריכוז האנזים. השוואה של הקשר בין ריכוזי אנזימים שונים לבין גודל בלוק הרקמה באמצעות יחס חלקיק לחלבון ומספר חלקיקים של sEVs. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה חוזרת לחילוץ sEV מרקמת סרטן הכבד. sEV באיכות גבוהה מתקבלים על ידי בידוד רקמות חד, טיפול באנזימי עיכול, אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית, וסינון וטיהור קרום מסנן 0.22 מיקרומטר. עבור ניתוח במורד הזרם, חשוב מאוד להבטיח את הטוהר הגבוה של sEVs. בתהליך של צנטריפוגה דיפרנציאלית, שכבה של חומרים לבנים (הרכב לא ידוע) יופיע על פני השטח של supernatant. מכיוון ששכבה זו תזהם את כלי הרכב החשמליים, הסרנו אותה ככל האפשר באמצעות צנטריפוגות חוזרות (3,000 × גרם ו-12,000 × גרם) וסינון דרך קרום של 0.22 מיקרומטר (טבלה משלימה S1). בשל ההפרעה של שכבה לבנה זו, הסתכנו באיבוד כלי רכב חשמליים תוך שאיפת הסופרנטנט. לכן, חשוב להתקדם בזהירות דרך צנטריפוגות מרובות ולאסוף את הסופרנאטנט בזהירות רבה ככל האפשר מבלי לגעת בחומר הלבן.
פרוטוקול זה יכול לטהר sEV באיכות גבוהה שמקורו ברקמת כבד, אך יש לו כמה מגבלות. בניסויים אלה, נפח בלוקי הרקמה הוא בדרך כלל ~ 300-500 מ"ג. מספר ה-sEVs שבודדו מגושי רקמות קטנים מאוד היה נמוך מכדי לאפשר מחקרים נוספים. בהתחשב בהשפעה של כמות נוזל העיכול על התשואה של sEV שמקורו ברקמות, יש לחלק את גושי הרקמה הגדולים מדי למספר חלקים לצורך מיצוי, או להגדיל את כמות אנזימי העיכול כדי להבטיח שניתן יהיה להשיג sEV שמקורו ברקמה באופן מלא. בנוסף, יש להתאים את שיטת הבידוד של sEV למורכבות דגימת הרקמה. בודדנו sEV מרקמת הכבד ומרקמת סרטן המעי הגס בשיטה זו. עם זאת, לא ביצענו פרוטוקול זה על רקמות אחרות, וייתכן שיהיה צורך למטב שיטות אלה לבידוד רקמות אחרות, למשל, באמצעות סוגים וריכוזים שונים של אנזימים.
במהלך הליכים אלה, חשוב מאוד להשיג sEV באיכות גבוהה, וזה תלוי במידה רבה בשיטת ההפרדה, ריכוז אנזימי העיכול, זמן הדגירה, ואת האחסון הנכון של רקמות. במחקר קודם11 נקבע כי השילוב האופטימלי של מינון וזמן הדגירה של collagenase D ו-DNase שבו השתמשתי כדי להפריד sEV מרקמות סרטן הכבד היה 4 מ"ג/מ"ל של collagenase D, 80 U/mL של DNase I, ו-20 דקות של זמן דגירה (טבלה משלימה S2). השווינו גם את האיכות של sEV מרקמה טרייה לעומת רקמה קפואה, ומצאנו שלרכבים החשמליים שבודדו מרקמה טרייה היו כמויות חלבון כוללות גבוהות יותר (איור משלים 3). עם זאת, הטוהר של שני סוגי ה- sEV לא היה שונה באופן משמעותי באמצעות ניסוי שבירת הממברנה (טיפול ב- 1% Triton X-100), מה שמצביע על כך ששיטה זו ישימה גם לרקמת סרטן כבד טרייה. ריכוז החלקיקים ותכולת החלבון של sEV שהתקבלו בשיטה זו היו 3.28 × 10, 10 ± 0.84 × 10, 10 חלקיקים/100 מ"ג רקמה ו-11.62 מיקרוגרם ±-1.94 מיקרוגרם חלבון/100 מ"ג רקמה, בהתאמה. עם זאת, קשה להשיג sEVs מרקמה טרייה בקבוצות בעבודה קלינית שגרתית; לכן, שיטה זו יכולה לספק שיטה אמינה ויעילה לטיהור בקנה מידה גדול של sEV ברקמת סרטן כבד קפואה.
לסיכום, פרוטוקול זה מתאר שיטת העשרה אופטימלית עבור כלי רכב חשמליים, תוך שימוש באולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית וסינון לקבלת כלי רכב חשמליים בעלי טוהר גבוה. sEV רקמתיים אלה מתאימים לניתוח במורד הזרם, כגון אפיון הרכב ביומולקולרי, ומחקרים אחרים שמטרתם לאפיין את תפקידיהם הפיזיולוגיים או הפתופיזיולוגיים או יישומים פוטנציאליים כסמני מחלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים לבית החולים המסונף הראשון של האוניברסיטה הרפואית גנאן על תמיכתו בעבודה זו. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מספרי מענקים 82260422).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Membrane Filter Unit | Millex | SLGPR33RB | |
| 1 mL Sterile syringe | Hubei Xianming Medical Instrument Company | YL01329 | |
| 2% Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400-2 | |
| 4.7 mL Centrifuge Tube | Beckman Coulter | 361621 | |
| 6-well Cell cuture plate | LABSELECT | 11110 | |
| 50 mL Beaker | Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company | CF2100800 | |
| 70 µm Cell strainer | Biosharp | BS-70-XBS | |
| 100 mm Cell culture dish | CELL TER | CS016-0128 | |
| 600 µL Centrifuge tube | Axygen | MCT060C | |
| BCA protein quantification kit | Thermo Fisher | RJ240544 | |
| Beckman Coulter Optima-Max-TL | Beckman | A95761 | |
| BioRad Mini trans-blot | Bio-Rad | 1703930 | |
| BioRad Mini-Protean | Bio-Rad | 1645050 | |
| CD63 Antibody | Abcam | ab134045 | |
| CD9 Antibody | Abcam | ab263019 | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428HQ527333 | |
| Cleaning Solution | NanoFCM | C1801 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Copper net | Henan Zhongjingkeyi Technology Company | DJZCM-15-N1 | |
| Dry Thermostat | Hangzhou allsheng instruments company | AS-01030-00 | |
| FITC Anti Human CD9 Antibody | Elabscience | E-AB-F1086C | |
| Glycine | Solarbio | G8200 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody | Proteintech | SA00001-1 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody | Proteintech | SA00001-2 | |
| Methanol | Shanghai Zhenxing Chemical Company | ||
| Nanoparticle flow cytometer | NanoFCM INC | FNAN30E20112368 | |
| Phosphatase inhibitors(PhosSTOP) | Roche | 4906845001 | |
| Phosphate Buffered Saline(PBS) | Servicebio | G4202 | |
| Polyvinylidene Difluoride Membrane | Solarbio | ISEQ00010 | |
| QC Beads | NanoFCM | QS2502 | |
| RPMI-1640 basic medium | Biological Industries | C11875500BT | |
| Scalpel | Guangzhou Kehua Trading Company | NN-0623-1 | |
| Silica Nanospheres | NanoFCM | S16M-Exo | |
| Transference Decoloring Shaker TS-8 | Kylin-Bell | E0018 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Scientific | Talos L120C | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| TSG101 Antibody | Proteintech | 28283-1-AP | |
| Tweezer | Guangzhou Lige Technology Company | LG01-105-4X |
References
- Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
- Hou, R., et al. Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).
- Zhang, L., Yu, D. Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation - Efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Crescitelli, R., Lässer, C., Lötvall, J. Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues. Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).
- Crescitelli, R., et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433 (2020).
- Jang, S. C., et al. Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420 (2019).
- Muralidharan-Chari, V., et al. ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles. Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).
- Matejovič, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle. FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).
- Zhou, X., et al. Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice. Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).
- Chen, J., et al. Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method. Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).
- Fang, T., et al. Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer. Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).
- Huang, X., et al. RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma. Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).
- Chen, L., et al. HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway. Cell Death & Disease. 9 (5), 513 (2018).
- Jingushi, K., et al. Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin. International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).
- Camino, T., et al. Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366 (2020).
