Summary
ここでは、最適化された差動超遠心法による肝癌組織由来の小さな細胞外小胞の濃縮について説明します。
Abstract
組織由来の小さな細胞外小胞(sEV)は、ソース細胞の機能状態と組織の間質空間の特性を反映することができます。これらのsEVの効率的な濃縮は、それらの生物学的機能の研究にとって重要な前提条件であり、臨床検出技術と治療キャリア技術の開発の鍵です。sEVは通常ひどく汚染されているため、組織から分離することは困難です。この研究は、肝癌組織から高品質のsEVを迅速に濃縮する方法を提供します。この方法には、消化酵素(コラゲナーゼDおよびDNase Ι)と組織とのインキュベーション、70 μmセルストレーナーによるろ過、差動超遠心分離、および0.22 μmメンブレンフィルターによるろ過の4段階のプロセスが含まれます。差動超遠心分離ステップの最適化とろ過ステップの追加により、この方法で得られるsEVの純度は、従来の示差超遠心分離によって達成されるものよりも高くなります。これは、組織由来sEVの研究のための重要な方法論と裏付けとなるデータを提供します。
Introduction
小さな細胞外小胞(sEV)は、直径が約30 nmから150 nmで、さまざまな細胞から分泌されます1。それらは組織細胞と通信し、脂質、タンパク質、DNA、RNAなどの重要な生体分子をさまざまな臓器、組織、細胞、および細胞内部分に輸送することにより、局所または遠隔の微小環境を調節することができます。したがって、それらはまた、受信者セル2、3の挙動を変えることができる。特定のsEVの単離と精製は、病気の発症および経過中の生物学的挙動を研究するための不可欠な前提条件です。ゴールドスタンダードと見なされている差動超遠心分離は、sEVを通常存在する組織から分離するために一般的に使用されます4。組織破片、細胞破片、大きな小胞、およびアポトーシス小体は、sEVのみを残してこの技術によって除去することができます。
コラゲナーゼDおよびDNaseIは、細胞または小胞の分子特性に影響を及ぼさないことが示されており、両方の酵素の特性が細胞外マトリックス5における小胞の放出に寄与する。これらの酵素は、ヒト転移性黒色腫組織、結腸癌組織、および結腸粘膜組織からsEVを抽出するために使用されています5、6、7。しかし、これらの方法におけるコラゲナーゼDとDNase Iの濃度と消化時間は異なり、一貫性のない結論につながります。他のサブタイプのsEVの共沈を避けるために、研究者はろ過および/または示差遠心分離によってより大きな細胞外小胞(直径0.1 μmまたは0.2 μm)を除去しました8。ソース組織に応じて、単離および精製の異なる方法が必要とされる場合がある9、10。
従来の差動超遠心分離法を使用して肝臓組織からsEVを抽出すると、上清の表面に白質の層が形成され、その特性を決定する方法はありません。以前の研究11では、この白質の層がsEVの純度に影響を与えることがわかりました。従来の方法で分離されたサンプルの粒子数とタンパク質濃度は現在の方法よりも高かったが、多くの汚染物質が結果の再現性を低下させる可能性があるため、変動係数は大きかった。すなわち、洗剤を用いて(すなわち、1%Triton X-100中の粒子の溶解度を検出する)と、この方法で得られたsEVの純度が高いことを見出した。そこで、この方法を用いて大腸がん組織由来のsEVを単離・精製し、プロテオミクス研究を行っています。
現在、肝臓がんにおけるsEVの研究は、主に血清、血漿、および細胞培養の上清に焦点を当てています12,13,14。しかし、肝臓がん組織由来のsEVは、肝臓がんの生理学的病理と周囲の微小環境をより正確に反映し、他のEVの劣化や汚染を効果的に回避することができます15,16。示差超遠心法を使用することで、この方法は収量を豊かにし、高品質のsEVを得ることができ、肝臓がんのさらなる研究のための重要な基礎を提供します。この方法により、肝癌組織を鋭利な分離により分離し、コラゲナーゼDおよびDNaseIによって解離させることができます。次いで、細胞破片、大きな小胞、およびアポトーシス小体は、濾過および示差超遠心分離によってさらに除去される。最後に、sEVは後の研究のために分離および精製されます。
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Protocol
ヒト肝癌組織は、甘南医科大学第一附属病院で肝悪性腫瘍と診断された患者から採取されました。すべての患者がインフォームドコンセントフォームに署名し、ヒト組織サンプルの収集は甘南医科大学第一付属病院の倫理委員会によって承認されました。このプロトコルで使用されるすべての材料、機器、およびソフトウェアに関連する詳細については、 材料の表 を参照してください。
1. 事前準備
- 転写脱色シェーカーをインキュベーターに入れ、温度を37°Cに設定する。 その他の必要な機器については、 図1 を参照してください。
- メスと鉗子に75%のアルコールをスプレーして清掃します。
- 6 mgのコラゲナーゼD(4 mg/mL)と24 μLのDNase Ι(80 U/mL)を測定し、1.5 mLのRPMI-1640塩基性培地に添加して消化液を調製します。添加剤が完全に溶解するまで、穏やかな反転で混合します。
- 事前に、70 μmおよび0.22 μmのセルストレーナーを1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で湿らせます。
- 100 mmの滅菌細胞培養皿をアイスボックスの上に置き、解凍後の肝臓組織を保持します。
- 肝細胞癌組織単離後15分以内に、組織ブロック表面の血液をPBSで洗い流し、組織を滅菌凍結チューブに移し、実験まで-80°Cで2週間以内保存します。
2.組織解離
- -80°Cの冷凍庫から組織サンプルを取り出し、2 mm x 2 mm x 2 mmの断片にカットした約400 mgの組織をアイスボックスの10 cm細胞培養皿に入れます。
- 組織を1.5 mLの消化液を含む6ウェルプレートに移動します。次に、プレートを転移脱色シェーカー(20 rpm / min)に置き、37°Cで20分間インキュベートして、肝がん組織を完全に解離させ、sEVを放出します。
- インキュベーターから6ウェルプレートを取り出し、アイスボックスに置きます。80 μLのホスファターゼ阻害剤と200 μLの完全プロテアーゼ阻害剤溶液を加えて、消化を停止します。
- 消化液を70 μmのセルストレーナーに移し、ゆっくりとろ過して大きな組織の破片を取り除きます。ろ液を集め、2 mLの遠沈管に入れます。
3.差動超遠心分離
注:すべての遠心分離ステップを4°Cで実行します。
- ろ液を500 × g で10分間遠心分離し、新しい2 mL遠沈チューブに上清を回収します。その後、小さな組織の破片のほとんどを取り除くことができます。
- 上清を3,000 × g で20分間遠心分離し、細胞残渣を除去します。ピペットの先端が表面の白い物質に触れるまで、上清を新しい遠心チューブに慎重に移します。
- 残りの液体を3,000 × gで3分間遠心分離します。次いで、上清を吸引して小胞の採取を容易にする。sEVの純度を確保するために、白い物質が吸引されていないことを確認してください。
- 採取した上清を12,000 × g で20分間遠心分離し、900 μLの上清を4.7 mLの超遠心チューブに移します。残りの液体を12,000 × g で3分間遠心分離し、両方の上清を集めて同じ超遠心チューブに混合します。チューブをPBSで完全に満たします。
- 上清を100,000 × g で60分間遠心分離します。上清を廃棄し、超遠心チューブにPBSを満たし、100,000 × g で60分間遠心分離してペレットを再懸濁します。ペレットを50 μLのPBSで再懸濁します。
- 1 mL滅菌シリンジを使用してsEV懸濁液を吸引し、0.22 μmのメンブレンフィルターでろ過します。ろ液を600 μLの遠沈管に集め、-80°Cで保存してさらに分析します。
4.濃縮品質の評価
- 透過型電子顕微鏡でsEVの形態を観察します。
- 次に、10μLのsEVサンプルを銅ネットに落とし、室温で10分間インキュベートし、無菌蒸留水で洗浄し、吸収紙を使用して余分な液体を取り除きます。
- 10 μLの2%酢酸ウラニルを銅ネットに滴下し、1分間陰性染色します。ろ紙を使用して銅ネットの表面の液体を吸収し、白熱灯の下で2分間乾燥させます。
- 銅メッシュを透過型電子顕微鏡で観察し、80kVで画像化します。
- ナノ粒子フローサイトメーターを使用して、sEVのサイズ分布と純度を測定します。
- 機械を始動する前に、200 μLの品質管理、200 μLのシリカナノスフィア、2 x 200 μLの超純水、2 x 200 μLの洗浄液、および200 μLのPBSを含むチューブを準備します。
注:sEVサンプルをテストする前に、機器の品質管理を実行し、粒子サイズ標準をテストする必要があります(サイズ分布は、同じ検出条件下で直径の異なる複数のナノミクロスフェア[68-155 nm]で生成された標準曲線を使用して計算する必要があります)。QCビーズとシリカナノスフィアを超純水で100倍希釈し、全量200μLとした。 - 洗浄液の量(>10 mL)を確認し、シース液と廃液のレベル(20〜30 cm)の違いに注意してください。
- 機器の主電源をオフにします。20秒後、コンピューターの電源を入れ、ソフトウェアを実行するために機器が正しく接続されていることを示すビープ音が鳴るのを待ちます。
- [ スタートアップ ]をクリックして、カメラ、レーザー、エアポンプの電源を入れます。
- シースフロー-起動をクリックし、超純水をローディングプラットフォームに置きます。4分後(楽器のカウントダウン)、[サンプルブースト]をクリックします|サンプルアンロード。
- 30秒後、ブランクチューブをローディングプラットフォームに置き、 サンプルブースト|サンプルアンロード。次に、超純水を入れたチューブをローディングプラットフォームに置き、同時にサンプル ブースト|シースフローパージ。
- 手動操作をクリックし、粒子濃縮チューブをローディングプラットフォームに置きます。次に、サンプルブーストを1分間クリックし、同時に「SAMP」で250 nm標準FL SiNPsの品質管理を選択します。インフ」
- サンプルサンプリングをクリックし、SPCMをクリックして検出器をオンにします。
注:この時点で、リアルタイムの信号波形を確認できます。 - [自動サンプリング]をクリックし、[サンプリングSETに1.0]と入力して、圧力を1KPaに固定します。ツールバーをクリックし、[大信号]を選択します。
- レーザーの水平位置を調整し、レーザーを 2μmに設定します。次に、 L または R をクリックして、信号が強く均一であることを確認します。
- [ 記録する時間 ]をクリックしてデータを収集すると、終了すると自動的に[バッファ]にジャンプします。次に、データをNafファイルに保存し、[ サンプル-アンロード]をクリックします。
- 洗浄液チューブをローディングプラットフォームに置き、サンプル ブーストをクリックし、1分後に サンプルアンロードをクリックします。超純水を使用して、キャピラリーチップから残留洗浄液を除去します。
- 粒子サイズの標準チューブをローディングプラットフォームに置き、 サンプルブースト を1分間クリックします。
- 68-155 nm Std FL SiNPsの品質管理を「SAMP.Inf」をクリックし、[サンプルサンプリング]をクリックします。次に、ツールバーをクリックして、[小信号]を選択します。
- [ 記録する時間 ]をクリックしてデータを収集すると、終了すると自動的に [バッファ ]にジャンプします。次に、データをNafファイルに保存し、[ サンプル-アンロード]をクリックします。
- 洗浄液チューブをローディングプラットフォームに置き、[サンプル ブースト]をクリックし、[ サンプルアンロード ]をクリックしてから1分後に配置します。超純水を使用して、キャピラリーチップから残留洗浄液を除去します。
- PBSチューブをローディングプラットフォームに置きます。 サンプルブースト を1分間クリックします。
- 68-155 nm Std FL SiNPsの品質管理を「SAMP.Inf」をクリックし、[サンプルサンプリング]をクリックします。次に、ツールバーをクリックして、[小信号]を選択します。
- [ 記録する時間 ]をクリックしてデータを収集すると、終了すると自動的に [バッファ ]にジャンプします。データを Naf ファイルに保存し、[ サンプル - アンロード] をクリックします。
- 洗浄液チューブをローディングプラットフォームに置き、1分後にサンプル ブースト と サンプルアンロード をクリックします。超純水を使用して、キャピラリーチップから残留洗浄液を除去します。
- 手順 4.2.17-4.2.20 で前述したサンプル情報を確認します。PBS (ステップ 4.2.17) を sEV サンプルに変更し、データを分析します。
- 機械を始動する前に、200 μLの品質管理、200 μLのシリカナノスフィア、2 x 200 μLの超純水、2 x 200 μLの洗浄液、および200 μLのPBSを含むチューブを準備します。
- ウェスタンブロットでsEVをさらに特定します。
- 製造元の指示に従って、BCAタンパク質定量キットを使用して、sEVおよび組織のタンパク質濃度を測定します。
- これらの定量結果に基づいて、sEVの負荷量を計算します(たとえば、ウェルあたり5 μgのタンパク質の場合)。ローディングバッファーを1:4の比率で追加し、混合物をボルテックスします。
- 100°Cの金属浴(ドライサーモスタット)で10分間変性させた後、12%ポリアクリルアミドゲル上でタンパク質を60Vで80分間分離します。
- 転写バッファー(25 mM Tris、192 mM グリシン、20% メタノール)を使用して、ゲルを 0.22 μm ポリビニリデンジフルオリドメンブレンに 220 mA で 2 時間移します。
- メンブレンをトリス緩衝生理食塩水トゥイーン(TBST)中の5%脱脂粉乳で室温で1時間ブロックし、一次抗体(ウサギモノクローナル抗ヒトCD9抗体、ウサギモノクローナル抗ヒトCD63抗体、ウサギモノクローナル抗ヒトTSG101抗体、マウスモノクローナル抗ヒトGM130抗体)とともに4°Cで一晩インキュベートします。 一次抗体を5%無脂肪乳で1:1,000で希釈します。
- TBSTで3回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体でメンブレンを室温で1時間インキュベートします。
- ECLブロッティング基質を用いてHRP結合抗体を検出し、画像を収集・解析します。
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Representative Results
ヒト肝がん組織由来のsEVは、肝臓がん患者の診断、治療、予後において重要な役割を果たしてきました。この方法では、一般的な実験機器を使用して、肝臓がん組織に由来するsEVを分離および精製しました。これは、sEVの研究に方法論的サポートを提供する可能性があります。図2は、肝がん組織からsEVを濃縮する一般的なプロセスを示しています。組織の細胞間空間におけるsEVは、組織の切断と酵素加水分解によって完全に放出されます。さらに、消化液を70μmのフィルターでろ過して、大きな組織片を除去します。さらに、微分遠心分離ステップ(500 × g、3,000 × g、および12,000 × g)を実行して、小さな組織破片、細胞破片、大きな小胞、およびアポトーシス体を除去しました(図3A-C)。
高純度のsEVを得るために、表面の白色物質が除去されるまで、2つの差動遠心分離ステップ(3,000 × g と12,000 × g)を3分間繰り返しました。回収した上清を100,000 × g で60分間超遠心して可溶性物質を除去し、ペレットをPBSに再懸濁して洗浄しました(図3D、E)。100,000 × g で60分間遠心分離した後、ペレットを50 μLのPBSに再懸濁しました。最後に、サンプルを0.22 μmのメンブレンでろ過し、600 μLの遠沈管に回収して(図3F)、ゼラチン状物質の干渉を取り除き、sEVの純度を向上させました。
精製したsEVを透過型電子顕微鏡で調べたところ、カップ状の形態を持つsEVの存在が明らかになりました(図4A、B)。粒径は40nmから200nmの範囲であり、平均粒径は89nmであった(図5A、B)。1%Triton X-100への粒子の溶解度に基づいて、すべての粒子の小胞の比率によって小胞の品質を評価しました。sEVの純度は、(1-C2/C1)×100%として計算され、C1およびC2はそれぞれTriton X-100処理の前後1時間で検出された粒子数を表す11。これらのデータは、濃縮されたsEVの純度が68.32%であることを示しました(図5C-E)。肝癌組織からsEVを抽出した後、サンプルをPBSおよび1%Triton X-100で処理して、sEVの純度を評価しました。処理後、ナノ粒子フローサイトメーターで検出するために、sEVをFITC CD9およびCD9+粒子で標識しました。試験群ではCD9+粒子の数が減少したことがわかった(補足図S1)。CD63、CD9、TSG101などのsEVのタンパク質マーカーは、ウェスタンブロットによって検出されました。GM130はsEVの陰性対照マーカーとして使用されました12、組織細胞には見られましたが、sEVには見られませんでした(図6)。細胞および組織由来のsEVのタンパク質マーカー(CD63、ALIX、およびTSG101)をウェスタンブロットで検出しました。GM130は、sEVのネガティブコントロールマーカーとして使用されました(補足図2)。
図 1: プロトコルの要件。 (A)組織切片用の100 mm細胞培養皿、メス、ピンセット、(B)6ウェルプレート、(C)70 μm細胞ストレーナー、0.22 μmメンブレンフィルター、および細胞ストレーナー洗浄用ビーカー、(D)1 mL滅菌シリンジ、および(E)4.7 mL超遠心チューブ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:肝がん組織から小さな細胞外小胞を濃縮するプロセス。 凍結組織を秤量し、メスでスライスし、RPMI-1640培地、コラゲナーゼD、およびDNase Ιとともに37°Cで20分間インキュベートしました。 小さな細胞外小胞は、さらなる濾過および示差超遠心によって濃縮された。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:差動超遠心分離 。 (a)500× g で10分間遠心分離後、大量の組織破片(黄色ペレット)と上清(ピンク色の液体)が観察されます。(b)3,000× g で20分間遠心分離した後、上清から残留組織残渣と多量の細胞残渣を分離した。(C)12,000 × g で20分間遠心分離すると、大小胞アポトーシス体の汚染が排除されました。(D)ペレットを100,000 × g で60分間遠心分離して回収し、(E)遠心分離を100,000 × g で60分間繰り返して、小胞を洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水で可溶性不純物を除去した。(f)肝癌組織由来の微小細胞外小胞を0.22 μmフィルターでろ過した後にろ液を得た。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:透過型電子顕微鏡。 微小細胞外小胞の形状を透過型電子顕微鏡で観察した。スケールバー=(A)100nm、(B)200nm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:sEVのフローサイトメトリー。 代表的なSSCは、氷上で1時間、1%Triton X-100処理の前と(B)後にsEVの痕跡をバーストしました。(C)Triton X-100処理前(1,801イベント)および(D)Triton X-100処理後(91イベント)の代表的なSSC分布ヒストグラムは、それぞれ1時間にわたって収集されたデータから導き出された。(E)1%トリトンX-100を用いた電気自動車の純度測定。sEVの純度は、(1-C2/C1)×100%として計算され、C1およびC2はそれぞれTriton X-100処理の前後1時間で検出された粒子数を表します。略語:sEV =小さな細胞外小胞;SSC = 横方散乱。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:ウェスタンブロット。 ウェスタンブロットは、細胞抽出物およびsEV中のGM130、TSG101、CD63、およびCD9の分析に使用されました。略称:sEV =小さな細胞外小胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図S1:FITC CD9の検出。 (A)PBSおよび(B)1%Triton X-100処理を1時間行った後のCD9陽性sEVの割合をフローサイトメトリーにより検出した。略語:sEV =小さな細胞外小胞;FITC=フルオレセインイソチオシアネート;PBS =リン酸緩衝生理食塩水。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S2:細胞由来および組織由来sEVにおけるGM130、TSG101、CD63、およびALIXの分析に使用したウェスタンブロット。 略称:sEV =小さな細胞外小胞。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図3:クーマシーブルー染色。 細胞抽出物および培養外植片由来sEVおよび新鮮および凍結組織由来sEVからの総タンパク質のクーマシーブルー染色。略称:sEV =小さな細胞外小胞。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表S1:sEVの粒子対タンパク質比。 粒子対タンパク質比は、遠心分離工程および濾過工程前後の純度および収率を比較した。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表S2:組織サイズと酵素濃度の関係。 sEVの粒子対タンパク質比と粒子数を用いた異なる酵素濃度と組織ブロックサイズの関係の比較。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、肝臓癌組織からsEVを抽出するための再現性のある方法について説明しています。高品質のsEVは、鋭い組織分離、消化酵素による処理、差動超遠心分離、および0.22μmフィルター膜ろ過および精製によって得られます。ダウンストリーム分析では、sEVの高純度を確保することが非常に重要です。差動遠心分離の過程で、上清の表面に白い物質(未知の組成)の層が現れます。この層はsEVを汚染するため、遠心分離(3,000 × g 、12,000 × g)と0.22 μmの膜ろ過を繰り返して可能な限り除去しました(補足表S1)。この白い層の干渉により、上澄みを吸引しながらsEVを失うリスクがありました。そのため、複数回の遠心分離を慎重に進め、白い物質に触れずにできるだけ慎重に上清を回収することが重要です。
このプロトコルは、高品質の肝臓組織由来sEVを精製することができますが、いくつかの制限があります。これらの実験では、組織ブロックの容量は通常~300-500 mgです。非常に小さな組織ブロックから分離されたsEVの数は少なすぎて、その後の研究を行うことができませんでした。組織由来sEVの収量に及ぼす消化液量の影響を考慮すると、大きすぎる組織ブロックをいくつかの部分に分割して抽出するか、消化酵素の量を増やして組織由来sEVを十分に得る必要があります。さらに、sEVの単離方法は、組織サンプルの複雑さに適合させる必要があります。この方法を用いて肝臓組織および大腸癌組織からsEVを単離した。ただし、他の組織ではこのプロトコルを実行していないため、これらの方法は、たとえば、さまざまな種類と濃度の酵素を使用して、他の組織の分離に最適化する必要があるかもしれません。
これらの手順を通して、高品質のsEVを入手することは非常に重要であり、これは分離方法、消化酵素の濃度、インキュベーション時間、および組織の適切な保管に大きく依存します。以前の研究11では、肝癌組織からsEVを分離するために使用したコラゲナーゼDおよびDNaseIの投与量とインキュベーション時間の最適な組み合わせは、コラゲナーゼDが4 mg/mL、DNase Iが80 U/mL、およびインキュベーション時間が20分であることが決定されました(補足表S2)。また、新鮮組織と凍結組織からのsEVの品質を比較したところ、新鮮組織から分離されたsEVはタンパク質の総量が多いことがわかりました(補足図3)。しかし、2種類のsEVの純度は、膜破壊実験(1%Triton X-100による処理)によって有意差はなく、この方法は新鮮な肝癌組織にも適用可能であることが示された。この方法で得られたsEVの粒子濃度およびタンパク質含量は、それぞれ3.28 × 1010 ± 0.84 ×10 10 粒子/組織100 mgおよび11.62 μg ± 1.94 μg/組織100 mgであった。しかし、日常的な臨床作業では、新鮮な組織からバッチでsEVを入手することは困難です。したがって、この方法は、凍結肝癌組織中のsEVの大規模精製のための確実かつ効率的な方法を提供することができる。
要約すると、このプロトコルは、高純度のsEVを得るために差動超遠心分離とろ過を使用して、sEV用に最適化された濃縮方法について説明しています。これらの組織sEVは、生体分子組成の特性評価などのダウンストリーム分析や、生理学的または病態生理学的役割または疾患マーカーとしての潜在的なアプリケーションの特性評価を目的としたその他の研究に適しています。
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Disclosures
著者は開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
著者らは、この研究を支援してくれた甘南医科大学第一付属病院に感謝します。この研究は、中国国家自然科学財団(助成金番号82260422)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Membrane Filter Unit | Millex | SLGPR33RB | |
| 1 mL Sterile syringe | Hubei Xianming Medical Instrument Company | YL01329 | |
| 2% Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400-2 | |
| 4.7 mL Centrifuge Tube | Beckman Coulter | 361621 | |
| 6-well Cell cuture plate | LABSELECT | 11110 | |
| 50 mL Beaker | Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company | CF2100800 | |
| 70 µm Cell strainer | Biosharp | BS-70-XBS | |
| 100 mm Cell culture dish | CELL TER | CS016-0128 | |
| 600 µL Centrifuge tube | Axygen | MCT060C | |
| BCA protein quantification kit | Thermo Fisher | RJ240544 | |
| Beckman Coulter Optima-Max-TL | Beckman | A95761 | |
| BioRad Mini trans-blot | Bio-Rad | 1703930 | |
| BioRad Mini-Protean | Bio-Rad | 1645050 | |
| CD63 Antibody | Abcam | ab134045 | |
| CD9 Antibody | Abcam | ab263019 | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428HQ527333 | |
| Cleaning Solution | NanoFCM | C1801 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Copper net | Henan Zhongjingkeyi Technology Company | DJZCM-15-N1 | |
| Dry Thermostat | Hangzhou allsheng instruments company | AS-01030-00 | |
| FITC Anti Human CD9 Antibody | Elabscience | E-AB-F1086C | |
| Glycine | Solarbio | G8200 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody | Proteintech | SA00001-1 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody | Proteintech | SA00001-2 | |
| Methanol | Shanghai Zhenxing Chemical Company | ||
| Nanoparticle flow cytometer | NanoFCM INC | FNAN30E20112368 | |
| Phosphatase inhibitors(PhosSTOP) | Roche | 4906845001 | |
| Phosphate Buffered Saline(PBS) | Servicebio | G4202 | |
| Polyvinylidene Difluoride Membrane | Solarbio | ISEQ00010 | |
| QC Beads | NanoFCM | QS2502 | |
| RPMI-1640 basic medium | Biological Industries | C11875500BT | |
| Scalpel | Guangzhou Kehua Trading Company | NN-0623-1 | |
| Silica Nanospheres | NanoFCM | S16M-Exo | |
| Transference Decoloring Shaker TS-8 | Kylin-Bell | E0018 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Scientific | Talos L120C | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| TSG101 Antibody | Proteintech | 28283-1-AP | |
| Tweezer | Guangzhou Lige Technology Company | LG01-105-4X |
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