Summary
Her beskriver vi anrikningen av små ekstracellulære vesikler avledet fra leverkreftvev gjennom en optimalisert differensial ultrasentrifugeringsmetode.
Abstract
Små ekstracellulære vesikler (sEVs) avledet fra vev kan gjenspeile den funksjonelle statusen til kildecellene og egenskapene til vevets interstitielle rom. Effektiv anrikning av disse sEV-ene er en viktig forutsetning for studiet av deres biologiske funksjon og en nøkkel til utviklingen av kliniske deteksjonsteknikker og terapeutisk bærerteknologi. Det er vanskelig å isolere sEV fra vev fordi de vanligvis er sterkt forurenset. Denne studien gir en metode for rask anrikning av høykvalitets sEV fra leverkreftvev. Metoden innebærer en fire-trinns prosess: inkubasjon av fordøyelsesenzymer (kollagenase D og DNase Ι) med vev, filtrering gjennom en 70 μm cellesil, differensiell ultrasentrifugering og filtrering gjennom et 0,22 μm membranfilter. På grunn av optimaliseringen av differensialultrasentrifugeringstrinnet og tilsetning av et filtreringstrinn, er renheten til sEVene oppnådd ved denne metoden høyere enn det som oppnås ved klassisk differensial ultrasentrifugering. Det gir en viktig metodikk og støttedata for studiet av vevsavledede sEVs.
Introduction
Små ekstracellulære vesikler (sEVs) er ca. 30 nm til 150 nm i diameter og utskilles av forskjellige celler1. De kan kommunisere med vevsceller og regulere det lokale eller fjerne mikromiljøet ved å transportere viktige biologiske molekyler som lipider, proteiner, DNA og RNA til forskjellige organer, vev, celler og intracellulære deler. Dermed kan de også endre oppførselen til mottakerceller 2,3. Isolering og rensing av spesifikke sEV-er er en viktig forutsetning for å studere deres biologiske oppførsel under utvikling og sykdomsforløp. Differensiell ultrasentrifugering - betraktet som gullstandarden - brukes ofte til å skille sEV fra vevene der de normalt bor4. Vevsrester, cellerester, store vesikler og apoptotiske legemer kan fjernes ved denne teknikken, og etterlater bare sEV-ene.
Kollagenase D og DNase I har vist seg å ikke påvirke molekylære egenskaper av celler eller vesikler, med egenskapene til begge enzymer som bidrar til frigjøring av vesikler i den ekstracellulære matriksen 5. Disse enzymene har blitt brukt til å trekke ut sEVs fra humant metastatisk melanomvev, tykktarmskreftvev og kolonslimhinnevev 5,6,7. Imidlertid varierer konsentrasjonen og fordøyelsestiden for kollagenase D og DNase I i disse metodene, noe som fører til inkonsekvente konklusjoner. For å unngå coprecipitation av andre subtyper av sEVs, har forskere fjernet større ekstracellulære vesikler (0, 1 μm eller 0, 2 μm i diameter) ved filtrering og / eller differensialsentrifugering8. Avhengig av kildevevet kan det være nødvendig med forskjellige metoder for isolering og rensing 9,10.
Ved å bruke den tradisjonelle differensialmetoden for ultrasentrifugering for å trekke ut sEV fra levervev, resulterer det i et lag av hvitt materiale på overflaten av supernatanten, uten noen måte å bestemme egenskapene på. I en tidligere studie11 ble dette laget av hvit substans funnet å påvirke renheten til sEVs. Selv om partikkelantallet og proteinkonsentrasjonen i prøver isolert med den tradisjonelle metoden var høyere enn i dagens metode, var variasjonskoeffisienten stor, muligens fordi mange miljøgifter kan føre til dårlig repeterbarhet av resultatene. Det vil si at ved bruk av vaskemiddel (dvs. påvisning av løseligheten av partikler i 1% Triton X-100), fant vi at renheten til sEV oppnådd ved denne metoden var større. Derfor bruker vi denne metoden til å isolere og rense sEVs avledet fra kolorektalt kreftvev for proteomisk forskning.
For tiden er forskningen på sEVs i leverkreft hovedsakelig fokusert på serum, plasma og cellekulturens supernatant12,13,14. Imidlertid kan sEVs avledet fra leverkreftvev mer nøyaktig gjenspeile den fysiologiske patologien og det omkringliggende mikromiljøet av leverkreft og effektivt unngå nedbrytning og forurensning av andre EVs15,16. Ved bruk av differensial ultrasentrifugering kan denne metoden berike utbyttet og oppnå sEV av høy kvalitet, noe som gir et viktig grunnlag for videre studier av leverkreft. Denne metoden gjør at leverkreftvevet kan separeres ved skarp separasjon og dissosieres av kollagenase D og DNase I. Deretter fjernes det cellulære rusk, store vesikler og apoptotiske legemer ytterligere ved filtrering og differensiell ultrasentrifugering. Til slutt blir sEV-ene isolert og renset for senere studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Humant leverkreftvev ble samlet inn fra pasienter diagnostisert med hepatisk malignitet ved First Affiliated Hospital of Gannan Medical University. Alle pasientene signerte et informert samtykkeskjema, og innsamlingen av humane vevsprøver ble godkjent av etikkomiteen ved First Affiliated Hospital of Gannan Medical University. Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle materialer, utstyr og programvare som brukes i denne protokollen.
1. Forberedelse
- Plasser transferensavfargingshakeren i inkubatoren og sett temperaturen på 37 °C. Se figur 1 for alt annet nødvendig utstyr.
- Rengjør skalpellen og tangen ved å spraye dem med 75% alkohol.
- Forbered fordøyelsesløsningen ved å måle 6 mg kollagenase D (4 mg / ml) og 24 μl DNase Ι (80 U / ml) og tilsett dem til 1,5 ml RPMI-1640 basisk medium. Bland med forsiktig inversjon til tilsetningsstoffene er fullstendig oppløst.
- På forhånd fuktes 70 μm og 0,22 μm cellesiler med 1x fosfatbufret saltvann (PBS).
- Legg en 100 mm steril cellekulturskål på isboksen for å holde levervevet etter avriming.
- Innen 15 minutter etter isolering av hepatocellulært karsinomvev, skyll av blodet på overflaten av vevsblokken med PBS, overfør vevet til et sterilt frosset rør og oppbevar det ved -80 °C til forsøket i ikke mer enn 2 uker.
2. Vev dissosiasjon
- Fjern vevsprøven fra fryseren på -80 °C og legg ca. 400 mg av vevskuttet i 2 mm x 2 mm x 2 mm fragmenter i 10 cm cellekulturfat på isboksen.
- Flytt vevet inn i en 6-brønnsplate med 1,5 ml fordøyelsesløsning; Legg deretter platen på overføringsavfargingshakeren (20 o / min) for å inkubere i 20 minutter ved 37 ° C for fullstendig dissosiasjon av leverkreftvevet og frigjøring av sEVs.
- Fjern 6-brønnplaten fra inkubatoren og legg den på isboksen. Tilsett 80 μL fosfatasehemmer og 200 μL komplett proteasehemmerløsning for å stoppe fordøyelsen.
- Overfør fordøyelsesløsningen til 70 μm cellesil og filtrer den sakte for å fjerne eventuelle store vevsrester. Samle filtratet og legg det i et 2 ml sentrifugerør.
3. Differensiell ultrasentrifugering
MERK: Utfør alle sentrifugeringstrinnene ved 4 °C.
- Sentrifuger filtratet ved 500 × g i 10 minutter og samle supernatanten i et nytt 2 ml sentrifugerør. Det meste av småvevsrestene kan da fjernes.
- Sentrifuge supernatanten ved 3000 × g i 20 minutter for å fjerne celleavfall. Overfør supernatanten forsiktig til et nytt sentrifugerør til pipettespissen er i ferd med å berøre det hvite stoffet på overflaten.
- Sentrifuge den gjenværende væsken ved 3000 × g i 3 minutter; Deretter aspirerer du supernatanten for å lette samlingen av vesikler. For å sikre renheten til sEV-ene, må du sørge for at det hvite stoffet ikke aspireres.
- Sentrifuge den oppsamlede supernatanten ved 12 000 × g i 20 minutter og overfør 900 μl av supernatanten til et 4,7 ml ultrasentrifugerør. Sentrifuge den gjenværende væsken ved 12 000 × g i 3 minutter og samle og bland deretter begge supernatantene i samme ultrasentrifugerør. Fyll røret helt med PBS.
- Sentrifuger supernatantene ved 100 000 × g i 60 minutter. Kast supernatanten og resuspender pelleten ved å fylle ultrasentrifugerøret med PBS og sentrifugere igjen ved 100 000 × g i 60 minutter. Resuspender pelleten med 50 μL PBS.
- Aspirer sEV-suspensjonen med en 1 ml steril sprøyte og filtrer den gjennom et 0,22 μm membranfilter. Samle filtratet i et 600 μL sentrifugerør og oppbevar det ved -80 °C for videre analyse.
4. Evaluering av berikelseskvalitet
- Observer morfologien til sEV-ene under et transmisjonselektronmikroskop.
- Slipp deretter 10 μL av sEV-prøven på et kobbernett, inkuber ved romtemperatur i 10 minutter og rengjør den med sterilt destillert vann ved å bruke absorberende papir for å fjerne overflødig væske.
- Slipp 10 μL 2% uranylacetat på kobbernettet for negativ farging i 1 min. Bruk filterpapir til å absorbere væsken på overflaten av kobbernettet og tørk den i 2 minutter under en glødelampe.
- Observer kobbernettet under et transmisjonselektronmikroskop og bilde ved 80 kV.
- Bruk et cytometer for nanopartikkelflyt for å bestemme størrelsen, fordelingen og renheten til sEVene.
- Før maskinen startes, må du forberede rør som inneholder 200 μL kvalitetskontroll, 200 μL silika nanosfærer, 2 x 200 μL ultrarent vann, 2 x 200 μL rengjøringsløsning og 200 μL PBS.
MERK: Før du tester sEV-prøvene, er det nødvendig å utføre kvalitetskontroll på instrumentet og teste partikkelstørrelsesstandarden (størrelsesfordelingen må beregnes ved hjelp av standardkurver generert med flere nanomikrosfærer med forskjellige diametre [68-155 nm] under samme deteksjonstilstand). QC-perler og silikananosfærer ble fortynnet 100x med ultrarent vann i et totalt volum på 200 μL. - Kontroller volumet på rengjøringsløsningen (>10 ml) og merk forskjellen mellom nivåene av kappevæsken og avfallsvæsken (20-30 cm).
- Slå av hovedstrømforsyningen til instrumentet; Etter 20 s, slå på datamaskinen og vent på pipene som indikerer at instrumentet er riktig tilkoblet for å kjøre programvaren.
- Klikk på Start opp for å slå på kameraet, laseren og luftpumpen.
- Klikk på Sheath Flow-Start Up, og plasser ultrarent vann på lasteplattformen. Etter 4 min (instrumentets nedtelling), klikk på Sample-Boosting | Prøve-lossing.
- Etter 30 s, plasser det tomme røret på lasteplattformen og klikk på Sample-Boosting | Prøve-lossing. Plasser deretter røret som holder det ultrarene vannet på lasteplattformen, og klikk samtidig på Sample-Boosting | Slire flyt-rensing.
- Klikk på Manuell betjening og plasser partikkelkonsentrasjonsrøret på lasteplattformen. Klikk deretter på Sample-Boosting i 1 min og velg samtidig 250 nm Std FL SiNPs kvalitetskontroll i "SAMP. Inf.»
- Klikk på Sample-Sampling og slå detektoren på ved å klikke på SPCM.
MERK: På dette tidspunktet kan signalbølgeformen i sanntid sees. - Klikk på Auto Sampling og skriv inn 1.0 i Sampling SET for å fikse trykket ved 1 KPa. Klikk på verktøylinjen og velg Stort signal.
- Juster laserens horisontale posisjon og sett laseren til 2 μm; klikk deretter på L eller R for å sikre at signalet er sterkt og jevnt.
- Klikk på Tid for å registrere for å samle inn dataene, som automatisk hopper til Buffer når du er ferdig. Lagre deretter dataene i en Naf-fil og klikk på Sample-Unload.
- Plasser rengjøringsløsningsrøret på lasteplattformen, klikk på Sample-Boosting, og etter 1 min, klikk på Sample-Unload. Bruk ultrarent vann for å fjerne restrengjøringsløsningen fra kapillærspissen.
- Plasser standardrøret i partikkelstørrelse på lasteplattformen og klikk på Prøveboosting i 1 min.
- Velg 68-155 nm Std FL SiNPs kvalitetskontroll i "SAMP. Inf" og klikk på Sample-Sampling. Klikk deretter på verktøylinjen og velg Lite signal.
- Klikk på Tid for å registrere for å samle inn dataene, som automatisk hopper til Buffer når du er ferdig. Lagre deretter dataene i en Naf-fil og klikk på Sample-Unload.
- Plasser rengjøringsløsningsrøret på lasteplattformen, klikk på Sample-Boosting, og klikk på Sample-Unload etter 1 min. Bruk ultrarent vann for å fjerne restrengjøringsløsningen fra kapillærspissen.
- Plasser PBS-røret på lasteplattformen; klikk på Sample-Boosting i 1 min.
- Velg 68-155 nm Std FL SiNPs kvalitetskontroll i "SAMP. Inf" og klikk på Sample-Sampling. Klikk deretter på verktøylinjen og velg Lite signal.
- Klikk på Tid for å registrere for å samle inn data, som automatisk hopper til Buffer når du er ferdig. Lagre dataene i en Naf-fil og klikk på Sample-Unload.
- Plasser rengjøringsløsningsrøret på lasteplattformen, klikk på Sample-Boosting og Sample-Unload etter 1 min. Bruk ultrarent vann for å fjerne gjenværende rengjøringsløsning fra kapillærspissen.
- Kontroller eksempelinformasjonen som beskrevet tidligere i trinn 4.2.17-4.2.20; endre PBS (trinn 4.2.17) til sEV-prøven og analysere dataene.
- Før maskinen startes, må du forberede rør som inneholder 200 μL kvalitetskontroll, 200 μL silika nanosfærer, 2 x 200 μL ultrarent vann, 2 x 200 μL rengjøringsløsning og 200 μL PBS.
- Identifiser sEV-ene ytterligere med western blot.
- Bestem proteinkonsentrasjonene av sEV og vev ved å bruke BCA-proteinkvantifiseringssettet i henhold til produsentens instruksjoner.
- Beregn lastvolumet av sEV (f.eks. for 5 μg protein per brønn) basert på disse kvantitative resultatene. Tilsett lastebuffer i forholdet 1:4 og virv blandingen.
- Etter denaturering i et 100 °C metallbad (tørr termostat) i 10 minutter, separer proteinet på en 12 % polyakrylamidgel ved 60 V i 80 minutter.
- Overfør gelen til en 0,22 μm polyvinylidendifluoridmembran ved 220 mA i 2 timer ved bruk av overføringsbuffer (25 mM Tris, 192 mM glycin, 20% metanol).
- Blokker membranen med 5% fettfri tørrmelk i Tris-bufret saltvann Tween (TBST) i 1 time ved romtemperatur og inkuber med primært antistoff (kaninmonoklonalt anti-humant CD9-antistoff, kaninmonoklonalt anti-humant CD63-antistoff, kaninmonoklonalt anti-humant TSG101-antistoff, monoklonalt antihumant GM130-antistoff fra mus) over natten ved 4 °C. Fortynn de primære antistoffene i 5% fettfri melk ved 1: 1,000.
- Etter tre vasker med TBST, inkuber membranen med pepperrotperoksidase (HRP)-konjugert sekundært antistoff ved romtemperatur i 1 time.
- Oppdag det HRP-koblede antistoffet ved hjelp av ECL-blottingsubstrat, og samle deretter inn og analyser bildene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
sEVs fra humant leverkreftvev har spilt en avgjørende rolle i diagnosen, behandlingen og prognosen til pasienter med leverkreft. Denne metoden brukte vanlige laboratorieinstrumenter for å isolere og rense sEVs avledet fra leverkreftvev; Dette kan gi metodisk støtte til studiet av sEV. Figur 2 illustrerer den generelle prosessen med å berike sEV fra leverkreftvev. sEV i de intercellulære rommene i vev frigjøres fullt ut gjennom vevskjæring og enzymatisk hydrolyse. Videre filtreres fordøyelsesløsningen gjennom 70 μm filtre for å fjerne store vevsfragmenter. Videre ble differensialsentrifugeringstrinn utført (ved 500 × g, 3000 × g og 12 000 × g) for å fjerne små vevsrester, cellerester, store vesikler og apoptotiske legemer (figur 3A-C).
For å oppnå sEV med høy renhet ble to differensialsentrifugeringstrinn (ved 3000 × g og 12 000 × g) gjentatt i 3 minutter til det hvite stoffet på overflaten ble fjernet. Den oppsamlede supernatanten ble ultrasentrifugert ved 100 000 × g i 60 minutter for å fjerne løselige stoffer, og pelletsene ble deretter vasket ved å bli resuspendert i PBS (figur 3D, E). Etter sentrifugering ved 100 000 × g i 60 minutter ble pelleten resuspendert i 50 μL PBS. Til slutt ble prøven filtrert gjennom en 0,22 μm membran og samlet i et 600 μL sentrifugerør (figur 3F) for å fjerne interferensen fra gelatinøse stoffer og forbedre renheten til sEV-ene.
De rensede sEV-ene ble undersøkt under et transmisjonselektronmikroskop, som avslørte tilstedeværelsen av sEV med en koppformet morfologi (figur 4A,B). Partikkelstørrelsen varierte fra 40 nm til 200 nm, og gjennomsnittlig partikkelstørrelse var 89 nm (figur 5A,B). Vi vurderte kvaliteten på vesiklene ved forholdet mellom vesiklene i alle partiklene basert på oppløseligheten av partiklene i 1% Triton X-100. Renheten til sEV ble beregnet som (1 - C2 / C1) × 100%, hvor C1 og C2 representerer partikkeltallene som ble oppdaget 1 time før og etter Triton X-100-behandling, henholdsvis11. Disse dataene viste at renheten til de berikede sEV-ene var 68,32 % (figur 5C-E). Etter å ha ekstrahert sEVs fra leverkreftvev, ble prøvene behandlet med PBS og 1% Triton X-100 for å evaluere renheten til sEVs. Etter behandling ble sEV-ene merket med FITC CD9- og CD9+-partikler for deteksjon i nanopartikkelstrømningscytometeret. Det ble funnet at antall CD9+-partikler i testgruppen gikk ned (tilleggsfigur S1). Proteinmarkørene til sEVs, som CD63, CD9 og TSG101, ble detektert av western blot. GM130 ble brukt som negativ kontrollmarkør for sEVs12, som ble funnet i vevsceller, men ikke i sEVs (figur 6). Proteinmarkørene til sEV avledet fra celler og vev - CD63, ALIX og TSG101 - ble detektert av western blot. GM130 ble brukt som negativ kontrollmarkør for sEV (tilleggsfigur 2).
Figur 1: Protokollkrav. (A) En 100 mm cellekulturfat, en skalpell og pinsett for vevskutting, (B) en 6-brønnsplate, (C) en 70 μm cellesil, et 0,22 μm membranfilter og et beger for rengjøring av cellesilen, (D) en 1 ml steril sprøyte og (E) et 4,7 ml ultrasentrifugerør. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Prosess for berikelse av små ekstracellulære vesikler fra leverkreftvev. Det frosne vevet ble veid, skåret med skalpell og ruget med RPMI-1640 medium, kollagenase D og DNase Ι i 20 minutter ved 37 °C. Små ekstracellulære vesikler ble beriket ved ytterligere filtrering og differensial ultrasentrifugering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Differensial ultrasentrifugering. (A) Etter sentrifugering ved 500 × g i 10 minutter kan en stor mengde vevsrester (gul pellet) og supernatant (rosa væske) observeres. (B) Etter sentrifugering ved 3000 × g i 20 minutter ble gjenværende vevsrester og en stor mengde celleavfall skilt fra supernatanten. (C) Sentrifugering ved 12 000 × g i 20 minutter eliminerte forurensning av apoptotiske legemer med stor vesikkel. (D) Pelletsene ble samlet opp ved sentrifugering ved 100 000 × g i 60 minutter. (E) Sentrifugeringen ble gjentatt ved 100 000 × g i 60 minutter for å vaske de små vesiklene og fjerne løselige urenheter med fosfatbufret saltvann. (F) Filtratet ble oppnådd etter filtrering av leverkreftvevsavledede små ekstracellulære vesikler gjennom 0,22 μm filtre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Transmisjonselektronmikroskopi. Formen på de små ekstracellulære vesiklene ble observert under et transmisjonselektronmikroskop. Skala bar = (A) 100 nm, (B) 200 nm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5 Flowcytometri for sEV. Representativ SSC sprengte spor av sEV (A) før og (B) etter 1% Triton X-100 behandling i 1 time på is. (C) Representativ SSC-fordelingshistogram for sEVs før (1,801 hendelser) og (D) etter (91 hendelser) Triton X-100-behandling avledet fra data samlet inn over 1 time hver. (E) Renhetsmåling for sEV-er ved bruk av 1 % Triton X-100. Renheten til sEVs ble beregnet som (1 - C2 / C1) × 100%, hvor C1 og C2 representerer partikkelnummeret som ble oppdaget 1 time før og etter Triton X-100-behandling, henholdsvis. Forkortelser: sEVs = små ekstracellulære vesikler; SSC = sidespredning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Western blot. Western blot ble brukt til analyse av GM130, TSG101, CD63 og CD9 i celleekstraktene og sEVene. Forkortelse: sEVs = små ekstracellulære vesikler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur S1: Deteksjon av FITC CD9. Prosentandelen av CD9-positive sEVs etter (A) PBS og (B) 1% Triton X-100 behandling i 1 time ble detektert ved flowcytometri. Forkortelser: sEVs = små ekstracellulære vesikler; FITC = fluoresceinisotiocyanat; PBS = fosfatbufret saltvann. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur S2: Western blot brukt til analyse av GM130, TSG101, CD63 og ALIX i celleavledede og vevsavledede sEVs. Forkortelse: sEVs = små ekstracellulære vesikler. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 3: Coomassie blå farging. Coomassie blå farging av de totale proteinene fra celleekstraktene og dyrkede explant-avledede sEVs og ferske og frosne vevsavledede sEVs. Forkortelse: sEVs = små ekstracellulære vesikler. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggstabell S1: Partikkel-til-protein-forholdet mellom sEV. Partikkel-til-protein-forholdet sammenlignet renhet og utbytte etter og før sentrifugeringstrinnet og filtreringstrinnet. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggstabell S2: Forholdet mellom vevsstørrelse og enzymkonsentrasjon. Sammenligning av forholdet mellom forskjellige enzymkonsentrasjoner og vevsblokkstørrelse ved bruk av partikkel-til-protein-forhold og partikkelantall sEVs. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver en repeterbar metode for å ekstrahere sEV fra leverkreftvev. Høykvalitets sEV oppnås ved skarp vevsisolering, behandling med fordøyelsesenzymer, differensiell ultrasentrifugering og 0,22 μm filtermembranfiltrering og rensing. For nedstrømsanalyse er det ekstremt viktig å sikre høy renhet av sEV-ene. I prosessen med differensial sentrifugering vil et lag av hvite stoffer (ukjent sammensetning) vises på overflaten av supernatanten. Siden dette laget ville forurense sEV-ene, fjernet vi det så mye som mulig ved gjentatt sentrifugering (3000 × g og 12 000 × g) og filtrering gjennom en 0,22 μm membran (tilleggstabell S1). På grunn av forstyrrelsen av dette hvite laget, risikerte vi å miste sEV mens vi aspirerte supernatanten. Derfor er det viktig å gå forsiktig gjennom flere sentrifugeringer og samle supernatanten så nøye som mulig uten å berøre den hvite substansen.
Denne protokollen kan rense høykvalitets levervev-avledede sEVs, men den har noen begrensninger. I disse forsøkene er volumet av vevsblokker vanligvis ~ 300-500 mg. Antallet sEV isolert fra ekstremt små vevsblokker var for lavt til å tillate senere studier. Tatt i betraktning påvirkningen av mengden fordøyelsesvæske på utbyttet av vevsavledede sEVs, bør vevsblokker som er for store deles inn i flere deler for ekstraksjon, eller mengden fordøyelsesenzymer bør økes for å sikre at vevsavledede sEVs kan oppnås fullt ut. I tillegg må metoden for isolering av sEV tilpasses vevsprøvens kompleksitet. Vi isolerte sEV fra levervev og kolorektalt kreftvev ved hjelp av denne metoden. Vi har imidlertid ikke utført denne protokollen på andre vev, og disse metodene må kanskje optimaliseres for isolering av andre vev, for eksempel ved å bruke forskjellige typer og konsentrasjoner av enzymer.
Gjennom disse prosedyrene er det svært viktig å skaffe sEV av høy kvalitet, og dette avhenger i stor grad av separasjonsmetoden, konsentrasjonen av fordøyelsesenzymer, inkubasjonstiden og riktig lagring av vev. I en tidligere studie11 ble det bestemt at den optimale kombinasjonen av dosering og inkubasjonstid for kollagenase D og DNase I som ble brukt til å skille sEV fra leverkreftvev var 4 mg / ml kollagenase D, 80 U / ml DNase I og 20 minutter inkubasjonstid (tilleggstabell S2). Vi sammenliknet også kvaliteten på sEVs fra ferskt vev versus frosset vev og fant at sEVs isolert fra ferskt vev hadde høyere totale mengder protein (tilleggsfigur 3). Renheten til de to typene sEV var imidlertid ikke signifikant forskjellig gjennom membranbrytende eksperiment (behandling med 1% Triton X-100), noe som indikerer at denne metoden også gjelder for ferskt leverkreftvev. Partikkelkonsentrasjonen og proteininnholdet i sEVs oppnådd ved denne metoden var henholdsvis 3,28 × 10 10 ± 0,84 × 10 10 partikler/100 mg vev og 11,62 μg ± 1,94 μg protein/100 mg vev. Det er imidlertid vanskelig å få tak i sEV fra ferskt vev i partier i rutinemessig klinisk arbeid; Derfor kan denne metoden gi en pålitelig og effektiv metode for storskala rensing av sEV i frosset leverkreftvev.
Oppsummert beskriver denne protokollen en optimalisert anrikningsmetode for sEV-er, ved bruk av differensiell ultrasentrifugering og filtrering for å oppnå sEV-er med høy renhet. Disse vevs sEVene er egnet for nedstrømsanalyse, for eksempel karakterisering av biomolekylær sammensetning, og andre studier som tar sikte på å karakterisere deres fysiologiske eller patofysiologiske roller eller potensielle anvendelser som sykdomsmarkører.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takker First Affiliated Hospital of Gannan Medical University for å støtte dette arbeidet. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (tilskuddsnummer 82260422).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Membrane Filter Unit | Millex | SLGPR33RB | |
| 1 mL Sterile syringe | Hubei Xianming Medical Instrument Company | YL01329 | |
| 2% Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400-2 | |
| 4.7 mL Centrifuge Tube | Beckman Coulter | 361621 | |
| 6-well Cell cuture plate | LABSELECT | 11110 | |
| 50 mL Beaker | Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company | CF2100800 | |
| 70 µm Cell strainer | Biosharp | BS-70-XBS | |
| 100 mm Cell culture dish | CELL TER | CS016-0128 | |
| 600 µL Centrifuge tube | Axygen | MCT060C | |
| BCA protein quantification kit | Thermo Fisher | RJ240544 | |
| Beckman Coulter Optima-Max-TL | Beckman | A95761 | |
| BioRad Mini trans-blot | Bio-Rad | 1703930 | |
| BioRad Mini-Protean | Bio-Rad | 1645050 | |
| CD63 Antibody | Abcam | ab134045 | |
| CD9 Antibody | Abcam | ab263019 | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428HQ527333 | |
| Cleaning Solution | NanoFCM | C1801 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Copper net | Henan Zhongjingkeyi Technology Company | DJZCM-15-N1 | |
| Dry Thermostat | Hangzhou allsheng instruments company | AS-01030-00 | |
| FITC Anti Human CD9 Antibody | Elabscience | E-AB-F1086C | |
| Glycine | Solarbio | G8200 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody | Proteintech | SA00001-1 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody | Proteintech | SA00001-2 | |
| Methanol | Shanghai Zhenxing Chemical Company | ||
| Nanoparticle flow cytometer | NanoFCM INC | FNAN30E20112368 | |
| Phosphatase inhibitors(PhosSTOP) | Roche | 4906845001 | |
| Phosphate Buffered Saline(PBS) | Servicebio | G4202 | |
| Polyvinylidene Difluoride Membrane | Solarbio | ISEQ00010 | |
| QC Beads | NanoFCM | QS2502 | |
| RPMI-1640 basic medium | Biological Industries | C11875500BT | |
| Scalpel | Guangzhou Kehua Trading Company | NN-0623-1 | |
| Silica Nanospheres | NanoFCM | S16M-Exo | |
| Transference Decoloring Shaker TS-8 | Kylin-Bell | E0018 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Scientific | Talos L120C | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| TSG101 Antibody | Proteintech | 28283-1-AP | |
| Tweezer | Guangzhou Lige Technology Company | LG01-105-4X |
References
- Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
- Hou, R., et al. Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).
- Zhang, L., Yu, D. Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation - Efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Crescitelli, R., Lässer, C., Lötvall, J. Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues. Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).
- Crescitelli, R., et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433 (2020).
- Jang, S. C., et al. Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420 (2019).
- Muralidharan-Chari, V., et al. ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles. Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).
- Matejovič, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle. FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).
- Zhou, X., et al. Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice. Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).
- Chen, J., et al. Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method. Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).
- Fang, T., et al. Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer. Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).
- Huang, X., et al. RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma. Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).
- Chen, L., et al. HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway. Cell Death & Disease. 9 (5), 513 (2018).
- Jingushi, K., et al. Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin. International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).
- Camino, T., et al. Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366 (2020).
