Summary
Qui descriviamo l'arricchimento di piccole vescicole extracellulari derivate dal tessuto del cancro del fegato attraverso un metodo di ultracentrifugazione differenziale ottimizzato.
Abstract
Piccole vescicole extracellulari (sEV) derivate dal tessuto possono riflettere lo stato funzionale delle cellule sorgente e le caratteristiche dello spazio interstiziale del tessuto. L'arricchimento efficiente di questi veicoli elettrici è un prerequisito importante per lo studio della loro funzione biologica e una chiave per lo sviluppo di tecniche di rilevamento clinico e tecnologia di supporto terapeutico. È difficile isolare i sEV dal tessuto perché di solito sono fortemente contaminati. Questo studio fornisce un metodo per il rapido arricchimento di sEV di alta qualità dal tessuto del cancro del fegato. Il metodo prevede un processo in quattro fasi: l'incubazione di enzimi digestivi (collagenasi D e DNasi Ι) con tessuto, filtrazione attraverso un filtro cellulare da 70 μm, ultracentrifugazione differenziale e filtrazione attraverso un filtro a membrana da 0,22 μm. Grazie all'ottimizzazione della fase di ultracentrifugazione differenziale e all'aggiunta di una fase di filtrazione, la purezza dei sEV ottenuti con questo metodo è superiore a quella ottenuta dalla classica ultracentrifugazione differenziale. Fornisce un'importante metodologia e dati di supporto per lo studio dei sEV derivati dai tessuti.
Introduction
Le piccole vescicole extracellulari (sEV) hanno un diametro di circa 30-150 nm e sono secrete da varie cellule1. Possono comunicare con le cellule dei tessuti e regolare il microambiente locale o distante trasportando importanti molecole biologiche come lipidi, proteine, DNA e RNA a vari organi, tessuti, cellule e parti intracellulari. Pertanto, possono anche modificare il comportamento delle celle riceventi 2,3. L'isolamento e la purificazione di specifici sEV è un prerequisito essenziale per studiare il loro comportamento biologico durante lo sviluppo e il decorso della malattia. L'ultracentrifugazione differenziale, considerata il gold standard, è comunemente usata per separare i sEV dai tessuti in cui risiedono normalmente4. Detriti tissutali, detriti cellulari, grandi vescicole e corpi apoptotici possono essere rimossi con questa tecnica, lasciando solo i sEV.
È stato dimostrato che la collagenasi D e la DNasi I non influenzano le caratteristiche molecolari delle cellule o delle vescicole, con le proprietà di entrambi gli enzimi che contribuiscono al rilascio di vescicole nella matrice extracellulare 5. Questi enzimi sono stati utilizzati per estrarre sEVs dal tessuto melanoma metastatico umano, dal tessuto del cancro del colon e dal tessuto della mucosa del colon 5,6,7. Tuttavia, la concentrazione e il tempo di digestione della collagenasi D e della DNasi I in questi metodi differiscono, portando a conclusioni incoerenti. Per evitare la coprecipitazione di altri sottotipi di sEV, i ricercatori hanno rimosso vescicole extracellulari più grandi (0,1 μm o 0,2 μm di diametro) mediante filtrazione e/o centrifugazione differenziale8. A seconda del tessuto di origine, possono essere necessari diversi metodi di isolamento e purificazione 9,10.
Utilizzando il tradizionale metodo di ultracentrifugazione differenziale per estrarre i sEV dal tessuto epatico si ottiene uno strato di sostanza bianca sulla superficie del surnatante, senza alcun modo di determinarne le proprietà. In uno studio precedente11, questo strato di sostanza bianca è stato trovato per influenzare la purezza dei sEV. Sebbene il numero di particelle e la concentrazione proteica dei campioni isolati con il metodo tradizionale fossero superiori a quelli del metodo attuale, il coefficiente di variazione era elevato, probabilmente perché molti inquinanti possono portare a una scarsa ripetibilità dei risultati. Cioè, usando il detergente (cioè, rilevando la solubilità delle particelle in 1% Triton X-100), abbiamo scoperto che la purezza dei sEV ottenuti con questo metodo era maggiore. Quindi, usiamo questo metodo per isolare e purificare i sEV derivati dal tessuto del cancro del colon-retto per la ricerca proteomica.
Attualmente, la ricerca sulle EV nel cancro del fegato si concentra principalmente sul siero, sul plasma e sul surnatante della coltura cellulare12,13,14. Tuttavia, le sEV derivate dal tessuto del cancro del fegato possono riflettere più accuratamente la patologia fisiologica e il microambiente circostante del cancro del fegato ed evitare efficacemente la degradazione e l'inquinamento di altri EV15,16. Con l'uso dell'ultracentrifugazione differenziale, questo metodo può arricchire la resa e ottenere sEV di alta qualità, fornendo una base importante per l'ulteriore studio del cancro del fegato. Questo metodo consente al tessuto del cancro del fegato di essere separato da una netta separazione e di essere dissociato dalla collagenasi D e DNasi I. Quindi, i detriti cellulari, le grandi vescicole e i corpi apoptotici vengono ulteriormente rimossi mediante filtrazione e ultracentrifugazione differenziale. Infine, i sEV vengono isolati e purificati per studi successivi.
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Protocol
Il tessuto del cancro del fegato umano è stato raccolto da pazienti con diagnosi di malignità epatica presso il primo ospedale affiliato della Gannan Medical University. Tutti i pazienti hanno firmato un modulo di consenso informato e la raccolta di campioni di tessuto umano è stata approvata dal comitato etico del primo ospedale affiliato della Gannan Medical University. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, le attrezzature e il software utilizzati in questo protocollo.
1. Preparazione
- Posizionare lo shaker decolorante di trasferimento nell'incubatore e impostare la temperatura a 37 °C. Vedere la Figura 1 per tutte le altre attrezzature necessarie.
- Pulire il bisturi e la pinza spruzzandoli con alcool al 75%.
- Preparare la soluzione digestiva misurando 6 mg di collagenasi D (4 mg/ml) e 24 μL di DNasi Ι (80 U/mL) e aggiungendoli a 1,5 mL di terreno basico RPMI-1640. Mescolare per inversione delicata fino a completa dissoluzione degli additivi.
- In anticipo, inumidire i filtri cellulari da 70 μm e 0,22 μm con 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Posizionare una capsula di coltura cellulare sterile da 100 mm sulla ghiacciaia per contenere i tessuti del fegato dopo lo scongelamento.
- Entro 15 minuti dopo l'isolamento del tessuto del carcinoma epatocellulare, sciacquare il sangue sulla superficie del blocco tissutale con PBS, trasferire il tessuto in un tubo congelato sterile e conservarlo a -80 ° C fino all'esperimento per non più di 2 settimane.
2. Dissociazione tissutale
- Rimuovere il campione di tessuto dal congelatore a -80 °C e introdurre circa 400 mg di tessuto tagliato in frammenti di 2 mm x 2 mm x 2 mm nella capsula di coltura cellulare da 10 cm sulla ghiacciaia.
- Spostare il tessuto in una piastra a 6 pozzetti con 1,5 ml della soluzione digestiva; quindi, posizionare la piastra sullo shaker decolorante transfert (20 rpm/min) per incubare per 20 minuti a 37 °C per la completa dissociazione del tessuto tumorale del fegato e il rilascio dei sEV.
- Rimuovere la piastra a 6 pozzetti dall'incubatore e posizionarla sulla ghiacciaia. Aggiungere 80 μL di inibitore della fosfatasi e 200 μL di soluzione completa di inibitore della proteasi per interrompere la digestione.
- Trasferire la soluzione digestiva nel filtro cellulare da 70 μm e filtrarla lentamente per rimuovere eventuali detriti tissutali di grandi dimensioni. Raccogliere il filtrato e metterlo in una provetta da centrifuga da 2 ml.
3. Ultracentrifugazione differenziale
NOTA: Eseguire tutte le fasi di centrifugazione a 4 °C.
- Centrifugare il filtrato a 500 × g per 10 minuti e raccogliere il surnatante in una nuova provetta da centrifuga da 2 ml. La maggior parte dei piccoli detriti tissutali può quindi essere rimossa.
- Centrifugare il surnatante a 3.000 × g per 20 minuti per rimuovere i detriti cellulari. Trasferire con cautela il surnatante in una nuova provetta da centrifuga fino a quando la punta della pipetta sta per toccare la sostanza bianca sulla superficie.
- Centrifugare il liquido rimanente a 3.000 × g per 3 minuti; Quindi, aspirare il surnatante per facilitare la raccolta delle vescicole. Per garantire la purezza dei sEV, assicurarsi che la sostanza bianca non sia aspirata.
- Centrifugare il surnatante raccolto a 12.000 × g per 20 minuti e trasferire 900 μL del surnatante in una provetta da ultracentrifuga da 4,7 ml. Centrifugare il liquido rimanente a 12.000 × g per 3 minuti, quindi raccogliere e mescolare entrambi i surnatanti nella stessa provetta ultracentrifuga. Riempire completamente il tubo con PBS.
- Centrifugare i surnatanti a 100.000 × g per 60 minuti. Scartare il surnatante e risospendere il pellet riempiendo il tubo ultracentrifugo con PBS e centrifugando nuovamente a 100.000 × g per 60 minuti. Risospendere il pellet con 50 μL di PBS.
- Aspirare la sospensione sEV utilizzando una siringa sterile da 1 mL e filtrarla attraverso un filtro a membrana da 0,22 μm. Raccogliere il filtrato in una provetta da centrifuga da 600 μL e conservarlo a -80 °C per ulteriori analisi.
4. Valutazione della qualità dell'arricchimento
- Osservare la morfologia dei sEV al microscopio elettronico a trasmissione.
- Quindi, far cadere 10 μL del campione sEV su una rete di rame, incubare a temperatura ambiente per 10 minuti e pulirlo con acqua distillata sterile, utilizzando carta assorbente per rimuovere il liquido in eccesso.
- Versare 10 μL di acetato di uranile al 2% sulla rete di rame per una colorazione negativa per 1 minuto. Utilizzare carta da filtro per assorbire il liquido sulla superficie della rete di rame e asciugarlo per 2 minuti sotto una lampada ad incandescenza.
- Osservare la maglia di rame al microscopio elettronico a trasmissione e l'immagine a 80 kV.
- Utilizzare un citometro a flusso di nanoparticelle per determinare la distribuzione dimensionale e la purezza dei sEV.
- Prima di avviare la macchina, preparare provette contenenti 200 μL di controllo qualità, 200 μL di nanosfere di silice, 2 x 200 μL di acqua ultrapura, 2 x 200 μL di soluzione detergente e 200 μL di PBS.
NOTA: Prima di testare i campioni sEV, è necessario effettuare un controllo di qualità sullo strumento e testare lo standard granulometrico (la distribuzione dimensionale deve essere calcolata utilizzando curve standard generate con diverse nanomicrosfere di diametri diversi [68-155 nm] nella stessa condizione di rivelazione). Le perle di QC e le nanosfere di silice sono state diluite 100 volte con acqua ultrapura in un volume totale di 200 μL. - Controllare il volume della soluzione detergente (>10 ml) e notare la differenza tra i livelli del liquido della guaina e del liquido di scarto (20-30 cm).
- Spegnere l'alimentazione principale dello strumento; Dopo 20 s, accendere il computer e attendere i segnali acustici che indicano che lo strumento è collegato correttamente per eseguire il software.
- Fare clic su Start Up per accendere la fotocamera, il laser e la pompa dell'aria.
- Fare clic su Sheath Flow-Start Up e posizionare acqua ultrapura sulla piattaforma di carico. Dopo 4 minuti (conto alla rovescia dello strumento), fare clic su Sample-Boosting | Campionamento-Scarico.
- Dopo 30 secondi, posizionare il tubo grezzo sulla piattaforma di carico e fare clic su Sample-Boosting | Campionamento-Scarico. Quindi, posizionare il tubo che contiene l'acqua ultrapura sulla piattaforma di carico e, contemporaneamente, fare clic su Sample-Boosting | Spurgo del flusso della guaina.
- Fare clic su Funzionamento manuale e posizionare il tubo di concentrazione delle particelle sulla piattaforma di carico. Quindi, fare clic su Sample-Boosting per 1 minuto e contemporaneamente selezionare il controllo di qualità 250 nm Std FL SiNPs in "SAMP. Inf."
- Fare clic su Campionamento campione e accendere il rilevatore facendo clic su SPCM.
NOTA: A questo punto, è possibile visualizzare la forma d'onda del segnale in tempo reale. - Fare clic su Campionamento automatico e immettere 1.0 in Sampling SET per fissare la pressione a 1 KPa. Fare clic sulla barra degli strumenti e selezionare Segnale grande.
- Regolare la posizione orizzontale del laser e impostare il laser su 2 μm; quindi, fai clic su L o R per assicurarti che il segnale sia forte e uniforme.
- Fare clic su Time to Record per raccogliere i dati, che salteranno automaticamente a Buffer al termine. Quindi, salvare i dati in un file Naf e fare clic su Sample-Unload.
- Posizionare il tubo della soluzione detergente sulla piattaforma di carico, fare clic su Sample-Boosting e, dopo 1 minuto, fare clic su Sample-Unload. Utilizzare acqua ultrapura per rimuovere la soluzione detergente residua dalla punta capillare.
- Posizionare il tubo standard di dimensioni delle particelle sulla piattaforma di carico e fare clic su Sample-Boosting per 1 minuto.
- Selezionare il controllo di qualità 68-155 nm Std FL SiNPs in "SAMP. Inf" e fare clic su Campionamento campione. Quindi, fai clic sulla barra degli strumenti e seleziona Piccolo segnale.
- Fare clic su Time to Record per raccogliere i dati, che salteranno automaticamente a Buffer al termine. Quindi, salvare i dati in un file Naf e fare clic su Sample-Unload.
- Posizionare il tubo della soluzione detergente sulla piattaforma di carico, fare clic su Sample-Boosting e fare clic su Sample-Unload dopo 1 minuto. Utilizzare acqua ultrapura per rimuovere la soluzione detergente residua dalla punta capillare.
- Posizionare il tubo PBS sulla piattaforma di carico; clicca su Sample-Boosting per 1 min.
- Selezionare il controllo di qualità 68-155 nm Std FL SiNPs in "SAMP. Inf" e fare clic su Campionamento campione. Quindi, fai clic sulla barra degli strumenti e seleziona Piccolo segnale.
- Fare clic su Time to Record per raccogliere i dati, che salteranno automaticamente a Buffer al termine. Salvare i dati in un file Naf e fare clic su Sample-Unload.
- Posizionare il tubo della soluzione detergente sulla piattaforma di carico, fare clic su Sample-Boosting e Sample-Unload dopo 1 minuto. Utilizzare acqua ultrapura per rimuovere la soluzione detergente residua dalla punta capillare.
- Controllare le informazioni di esempio come descritto in precedenza nei passaggi 4.2.17-4.2.20; modificare il PBS (passaggio 4.2.17) nel campione sEV e analizzare i dati.
- Prima di avviare la macchina, preparare provette contenenti 200 μL di controllo qualità, 200 μL di nanosfere di silice, 2 x 200 μL di acqua ultrapura, 2 x 200 μL di soluzione detergente e 200 μL di PBS.
- Identifica ulteriormente i sEV per western blot.
- Determinare le concentrazioni proteiche dei sEV e dei tessuti utilizzando il kit di quantificazione delle proteine BCA secondo le istruzioni del produttore.
- Calcolare il volume di carico dei sEV (ad esempio, per 5 μg di proteine per pozzetto) sulla base di questi risultati quantitativi. Aggiungere il buffer di carico in rapporto 1:4 e vortice la miscela.
- Dopo la denaturazione in un bagno metallico a 100 °C (termostato a secco) per 10 minuti, separare la proteina su un gel di poliacrilammide al 12% a 60 V per 80 minuti.
- Trasferire il gel su una membrana di difluoruro di polivinilidene da 0,22 μm a 220 mA per 2 ore utilizzando tampone di trasferimento (25 mM Tris, 192 mM glicina, 20% metanolo).
- Bloccare la membrana con latte secco scremato al 5% in Tris-buffered saline Tween (TBST) per 1 ora a temperatura ambiente e incubare con anticorpi primari (anticorpo monoclonale di coniglio anti-umano CD9, anticorpo monoclonale di coniglio CD63 anti-umano, anticorpo monoclonale di coniglio anti-umano TSG101, monoclonale di topo anticorpo GM130 umano) per una notte a 4 °C. Diluire gli anticorpi primari nel 5% di latte scremato a 1:1.000.
- Dopo tre lavaggi con TBST, incubare la membrana con anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano (HRP) a temperatura ambiente per 1 ora.
- Rilevare l'anticorpo legato all'HRP utilizzando il substrato di blotting ECL, quindi raccogliere e analizzare le immagini.
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Representative Results
Le sEV provenienti da tessuti di cancro del fegato umano hanno svolto un ruolo cruciale nella diagnosi, nel trattamento e nella prognosi dei pazienti con cancro al fegato. Questo metodo ha utilizzato strumenti di laboratorio comuni per isolare e purificare i sEV derivati dai tessuti del cancro del fegato; ciò può fornire un supporto metodologico per lo studio delle EV. La Figura 2 illustra il processo generale di arricchimento delle EV dai tessuti del cancro del fegato. Le sEV negli spazi intercellulari dei tessuti vengono completamente rilasciate attraverso il taglio dei tessuti e l'idrolisi enzimatica. Inoltre, la soluzione digestiva viene filtrata attraverso filtri da 70 μm per rimuovere grandi frammenti di tessuto. Inoltre, sono state eseguite fasi di centrifugazione differenziale (a 500 × g, 3.000 × g e 12.000 × g) per rimuovere piccoli detriti tissutali, detriti cellulari, grandi vescicole e corpi apoptotici (Figura 3A-C).
Per ottenere sEV di elevata purezza, due fasi di centrifugazione differenziale (a 3.000 × g e 12.000 × g) sono state ripetute per 3 minuti fino alla rimozione della sostanza bianca sulla superficie. Il surnatante raccolto è stato ultracentrifugato a 100.000 × g per 60 minuti per rimuovere le sostanze solubili e i pellet sono stati quindi lavati riprendendo in PBS (Figura 3D, E). Dopo centrifugazione a 100.000 × g per 60 minuti, il pellet è stato risospeso in 50 μL di PBS. Infine, il campione è stato filtrato attraverso una membrana da 0,22 μm e raccolto in una provetta da centrifuga da 600 μL (Figura 3F) per rimuovere l'interferenza delle sostanze gelatinose e migliorare la purezza dei sEV.
I sEV purificati sono stati esaminati al microscopio elettronico a trasmissione, che ha rivelato la presenza di sEV con una morfologia a forma di coppa (Figura 4A,B). La dimensione delle particelle variava da 40 nm a 200 nm e la dimensione media delle particelle era di 89 nm (Figura 5A,B). Abbiamo valutato la qualità delle vescicole dal rapporto delle vescicole in tutte le particelle in base alla solubilità delle particelle in 1% Triton X-100. La purezza dei sEV è stata calcolata come (1 - C2/C1) × 100%, dove C1 e C2 rappresentano il numero di particelle rilevate 1 ora prima e dopo il trattamento con Triton X-100, rispettivamente11. Questi dati hanno mostrato che la purezza dei sEV arricchiti era del 68,32% (Figura 5C-E). Dopo aver estratto i sEV dal tessuto del cancro del fegato, i campioni sono stati trattati con PBS e Triton X-100 all'1% per valutare la purezza dei sEV. Dopo il trattamento, i sEV sono stati marcati con particelle FITC CD9 e CD9+ per il rilevamento nel citometro a flusso di nanoparticelle. È stato riscontrato che il numero di particelle CD9+ nel gruppo di prova è diminuito (Figura supplementare S1). I marcatori proteici dei sEV, come CD63, CD9 e TSG101, sono stati rilevati dal western blot. GM130 è stato utilizzato come marcatore di controllo negativo dei sEV12, che è stato trovato nelle cellule tissutali ma non nei sEV (Figura 6). I marcatori proteici delle sEV derivate da cellule e tessuti - CD63, ALIX e TSG101 - sono stati rilevati da western blot. GM130 è stato utilizzato come marcatore di controllo negativo dei sEV (Figura supplementare 2).
Figura 1: Requisiti del protocollo. (A) Un piatto di coltura cellulare da 100 mm, un bisturi e una pinzetta per affettare i tessuti, (B) una piastra a 6 pozzetti, (C) un filtro cellulare da 70 μm, un filtro a membrana da 0,22 μm e un becher per la pulizia del filtro cellulare, (D) una siringa sterile da 1 mL e (E) una provetta da ultracentrifuga da 4,7 ml. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Processo di arricchimento di piccole vescicole extracellulari dai tessuti tumorali del fegato. I tessuti congelati sono stati pesati, tagliati con un bisturi e incubati con terreno RPMI-1640, collagenasi D e DNasi Ι per 20 minuti a 37 °C. Piccole vescicole extracellulari sono state arricchite da ulteriore filtrazione e ultracentrifugazione differenziale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Ultracentrifugazione differenziale. (A) Dopo la centrifugazione a 500 × g per 10 minuti, si può osservare una grande quantità di detriti tissutali (pellet giallo) e surnatante (liquido rosa). (B) Dopo centrifugazione a 3.000 × g per 20 minuti, i detriti tissutali residui e una grande quantità di detriti cellulari sono stati separati dal surnatante. (C) La centrifugazione a 12.000 × g per 20 minuti ha eliminato la contaminazione dei corpi apoptotici a vescicole larghe. (D) I pellet sono stati raccolti mediante centrifugazione a 100.000 × g per 60 minuti. (E) La centrifugazione è stata ripetuta a 100.000 × g per 60 minuti per lavare le piccole vescicole e rimuovere le impurità solubili con soluzione salina tamponata fosfato. (F) Il filtrato è stato ottenuto dopo filtrazione delle piccole vescicole extracellulari derivate dal tessuto del cancro del fegato attraverso filtri da 0,22 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Microscopia elettronica a trasmissione. La forma delle piccole vescicole extracellulari è stata osservata al microscopio elettronico a trasmissione. Barra della scala = (A) 100 nm, (B) 200 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Citometria a flusso per le EV. Le SSC rappresentative hanno fatto esplodere tracce di sEV (A) prima e (B) dopo il trattamento Triton X-100 all'1% per 1 ora su ghiaccio. (C) Istogrammi rappresentativi di distribuzione SSC dei sEV prima (1.801 eventi) e (D) dopo (91 eventi) il trattamento con Triton X-100 derivato dai dati raccolti nell'arco di 1 ora ciascuno. (E) Misurazione della purezza per i veicoli elettrici utilizzando Triton X-100 all'1%. La purezza dei sEV è stata calcolata come (1 - C2/C1) × 100%, dove C1 e C2 rappresentano il numero di particelle rilevate 1 ora prima e dopo il trattamento con Triton X-100, rispettivamente. Abbreviazioni: sEVs = piccole vescicole extracellulari; SSC = dispersione laterale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Western blot. Western blot è stato utilizzato per l'analisi di GM130, TSG101, CD63 e CD9 negli estratti cellulari e nei sEV. Abbreviazione: sEVs = piccole vescicole extracellulari. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura supplementare S1: Rilevamento di FITC CD9. Le percentuali di sEV CD9-positivi dopo (A) PBS e (B) trattamento con Triton X-100 all'1% per 1 ora sono state rilevate mediante citometria a flusso. Abbreviazioni: sEVs = piccole vescicole extracellulari; FITC = isotiocianato di fluoresceina; PBS = soluzione salina tamponata con fosfato. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S2: Western blot utilizzato per l'analisi di GM130, TSG101, CD63 e ALIX in sEV di origine cellulare e tissutale. Abbreviazione: sEVs = piccole vescicole extracellulari. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 3: Colorazione blu di Coomassie. Colorazione blu di Coomassie delle proteine totali dagli estratti cellulari e dai sEV derivati da espianti in coltura e dai sEV freschi e congelati derivati dai tessuti. Abbreviazione: sEVs = piccole vescicole extracellulari. Clicca qui per scaricare questo file.
Tabella supplementare S1: Rapporto particelle/proteine dei sEV. Il rapporto particelle/proteine ha confrontato la purezza e la resa dopo e prima della fase di centrifugazione e della fase di filtrazione. Clicca qui per scaricare questo file.
Tabella supplementare S2: Relazione tra dimensione del tessuto e concentrazione enzimatica. Confronto della relazione tra diverse concentrazioni enzimatiche e dimensioni dei blocchi tissutali utilizzando il rapporto particella/proteina e il numero di particelle di sEV. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Questo protocollo descrive un metodo ripetibile per estrarre i sEV dal tessuto del cancro del fegato. I sEV di alta qualità sono ottenuti mediante isolamento dei tessuti acuti, trattamento con enzimi digestivi, ultracentrifugazione differenziale e filtrazione e purificazione della membrana filtrante da 0,22 μm. Per l'analisi a valle, è estremamente importante garantire l'elevata purezza dei sEV. Nel processo di centrifugazione differenziale, uno strato di sostanze bianche (composizione sconosciuta) apparirà sulla superficie del surnatante. Poiché questo strato avrebbe contaminato i sEV, lo abbiamo rimosso il più possibile mediante centrifugazione ripetuta (3.000 × g e 12.000 × g) e filtrazione attraverso una membrana da 0,22 μm (tabella supplementare S1). A causa dell'interferenza di questo strato bianco, abbiamo rischiato di perdere sEV mentre aspiravamo il surnatante. Pertanto, è importante procedere con attenzione attraverso centrifugazioni multiple e raccogliere il surnatante il più attentamente possibile senza toccare la sostanza bianca.
Questo protocollo può purificare sEV derivati dal tessuto epatico di alta qualità, ma ha alcune limitazioni. In questi esperimenti, il volume dei blocchi di tessuto è solitamente ~ 300-500 mg. Il numero di sEV isolati da blocchi di tessuto estremamente piccoli era troppo basso per consentire studi successivi. Considerando l'influenza della quantità di fluido digestivo sulla resa dei sEV derivati dai tessuti, i blocchi di tessuto troppo grandi dovrebbero essere divisi in più parti per l'estrazione, oppure la quantità di enzimi digestivi dovrebbe essere aumentata per garantire che i sEV derivati dai tessuti possano essere pienamente ottenuti. Inoltre, il metodo di isolamento dei veicoli elettrici deve essere adattato alla complessità del campione di tessuto. Abbiamo isolato i sEV dal tessuto epatico e dal tessuto del cancro del colon-retto usando questo metodo. Tuttavia, non abbiamo eseguito questo protocollo su altri tessuti e questi metodi potrebbero dover essere ottimizzati per l'isolamento di altri tessuti, ad esempio utilizzando diversi tipi e concentrazioni di enzimi.
Durante queste procedure, è molto importante ottenere sEV di alta qualità, e questo dipende in gran parte dal metodo di separazione, dalla concentrazione di enzimi digestivi, dal tempo di incubazione e dalla corretta conservazione dei tessuti. In uno studio precedente11, è stato determinato che la combinazione ottimale di dosaggio e tempo di incubazione della collagenasi D e DNasi I utilizzata per separare le sEV dai tessuti tumorali del fegato era 4 mg / ml di collagenasi D, 80 U / mL di DNasi I e 20 minuti di tempo di incubazione (Tabella supplementare S2). Abbiamo anche confrontato la qualità dei sEV da tessuto fresco rispetto al tessuto congelato e abbiamo scoperto che i sEV isolati dal tessuto fresco avevano quantità totali più elevate di proteine (Figura 3 supplementare). Tuttavia, la purezza dei due tipi di EV non era significativamente diversa attraverso l'esperimento di rottura della membrana (trattamento con Triton X-100 all'1%), indicando che questo metodo è applicabile anche al tessuto neotetico del cancro. La concentrazione di particelle e il contenuto proteico dei veicoli elettrici ottenuti con questo metodo erano rispettivamente 3,28 × 10 10 ± 0,84 × 10 10 particelle/100 mg di tessuto e 11,62 μg ± 1,94 μg di proteine/100 mg di tessuto. Tuttavia, è difficile ottenere sEV da tessuti freschi in lotti nel lavoro clinico di routine; pertanto, questo metodo può fornire un metodo affidabile ed efficiente per la purificazione su larga scala dei sEV nel tessuto del cancro del fegato congelato.
In sintesi, questo protocollo descrive un metodo di arricchimento ottimizzato per i sEV, utilizzando l'ultracentrifugazione differenziale e la filtrazione per ottenere sEV ad alta purezza. Questi sEV tissutali sono adatti per analisi a valle, come la caratterizzazione della composizione biomolecolare, e altri studi volti a caratterizzare i loro ruoli fisiologici o fisiopatologici o potenziali applicazioni come marcatori di malattia.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il First Affiliated Hospital della Gannan Medical University per aver sostenuto questo lavoro. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (numero di sovvenzioni 82260422).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Membrane Filter Unit | Millex | SLGPR33RB | |
| 1 mL Sterile syringe | Hubei Xianming Medical Instrument Company | YL01329 | |
| 2% Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400-2 | |
| 4.7 mL Centrifuge Tube | Beckman Coulter | 361621 | |
| 6-well Cell cuture plate | LABSELECT | 11110 | |
| 50 mL Beaker | Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company | CF2100800 | |
| 70 µm Cell strainer | Biosharp | BS-70-XBS | |
| 100 mm Cell culture dish | CELL TER | CS016-0128 | |
| 600 µL Centrifuge tube | Axygen | MCT060C | |
| BCA protein quantification kit | Thermo Fisher | RJ240544 | |
| Beckman Coulter Optima-Max-TL | Beckman | A95761 | |
| BioRad Mini trans-blot | Bio-Rad | 1703930 | |
| BioRad Mini-Protean | Bio-Rad | 1645050 | |
| CD63 Antibody | Abcam | ab134045 | |
| CD9 Antibody | Abcam | ab263019 | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428HQ527333 | |
| Cleaning Solution | NanoFCM | C1801 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Copper net | Henan Zhongjingkeyi Technology Company | DJZCM-15-N1 | |
| Dry Thermostat | Hangzhou allsheng instruments company | AS-01030-00 | |
| FITC Anti Human CD9 Antibody | Elabscience | E-AB-F1086C | |
| Glycine | Solarbio | G8200 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody | Proteintech | SA00001-1 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody | Proteintech | SA00001-2 | |
| Methanol | Shanghai Zhenxing Chemical Company | ||
| Nanoparticle flow cytometer | NanoFCM INC | FNAN30E20112368 | |
| Phosphatase inhibitors(PhosSTOP) | Roche | 4906845001 | |
| Phosphate Buffered Saline(PBS) | Servicebio | G4202 | |
| Polyvinylidene Difluoride Membrane | Solarbio | ISEQ00010 | |
| QC Beads | NanoFCM | QS2502 | |
| RPMI-1640 basic medium | Biological Industries | C11875500BT | |
| Scalpel | Guangzhou Kehua Trading Company | NN-0623-1 | |
| Silica Nanospheres | NanoFCM | S16M-Exo | |
| Transference Decoloring Shaker TS-8 | Kylin-Bell | E0018 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Scientific | Talos L120C | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| TSG101 Antibody | Proteintech | 28283-1-AP | |
| Tweezer | Guangzhou Lige Technology Company | LG01-105-4X |
References
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