Nye strategier til trofast modellering af somatiske mutationer i hæmatopoietiske stam- og stamceller (HSPC’er) er nødvendige for bedre at studere hæmatopoietisk stamcellebiologi og hæmatologiske maligniteter. Her beskrives en protokol til modellering af heterozygote gain-of-function-mutationer i HSPC’er ved at kombinere brugen af CRISPR/Cas9 og dual rAAV donortransduktion.
Gennem hele deres levetid erhverver hæmatopoietiske stamceller og stamceller (HSPC’er) somatiske mutationer. Nogle af disse mutationer ændrer HSPC’s funktionelle egenskaber såsom proliferation og differentiering og fremmer derved udviklingen af hæmatologiske maligniteter. Effektiv og præcis genetisk manipulation af HSPC’er er nødvendig for at modellere, karakterisere og bedre forstå de funktionelle konsekvenser af tilbagevendende somatiske mutationer. Mutationer kan have en skadelig virkning på et gen og resultere i tab af funktion (LOF) eller, i skarp kontrast, kan forbedre funktionen eller endda føre til nye egenskaber ved et bestemt gen, kaldet gain-of-function (GOF). I modsætning til LOF-mutationer forekommer GOF-mutationer næsten udelukkende på en heterozygot måde. Nuværende genomredigeringsprotokoller tillader ikke selektiv målretning af individuelle alleler, hvilket hæmmer evnen til at modellere heterozygote GOF-mutationer. Her giver vi en detaljeret protokol om, hvordan man konstruerer heterozygote GOF hotspotmutationer i humane HSPC’er ved at kombinere CRISPR / Cas9-medieret homologi-rettet reparation og rekombinant AAV6-teknologi til effektiv DNA-donorskabelonoverførsel. Det er vigtigt, at denne strategi gør brug af et dobbelt fluorescerende reportersystem for at muliggøre sporing og oprensning af succesfuldt heterozygt redigerede HSPC’er. Denne strategi kan anvendes til præcist at undersøge, hvordan GOF-mutationer påvirker HSPC-funktionen og deres progression mod hæmatologiske maligniteter.
Med udviklingen af den klyngede regelmæssigt interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9-teknologi er et nyt og ekstremt kraftfuldt instrument blevet tilføjet til forskernes værktøjskasse. Denne teknologi giver mulighed for præcis konstruktion af genomet og har vist sig at være yderst nyttig ikke kun til forskningsformål (gennemgået i Hsu et al.1), men for nylig er også blevet oversat med succes til den kliniske indstilling 2,3,4. CRISPR/Cas9-redigeringsstrategier er afhængige af aktiviteten af et Cas9-protein og et enkeltguide-RNA (sgRNA)5,6,7. I værtscellen ledes Cas9-proteinet til et specifikt sted i DNA’et, der er komplementært til sgRNA-sekvensen og vil introducere et DNA-dobbeltstrengsbrud (DSB). Når en DSB er genereret, er der to primære og konkurrerende reparationsmekanismer, der kan forekomme: ikke-homolog endesammenføjning (NHEJ) og homologistyret reparation (HDR). NHEJ er en fejlbehæftet, overvejende anvendt reparationsmekanisme, der fører til indsættelser og sletninger (indels), mens HDR ved at bruge søsterkromatid som reparationsskabelon er meget præcis, men begrænset til S- eller G2-fasen af cellecyklussen8. I genomteknik kan HDR bruges til målrettet modifikation af DNA ved at tilvejebringe en donorskabelon, der flankeres af homologiarme, der er identiske med begge DNA-ender af Cas9-induceret DSB (figur 1). Den type donorskabelon, der bruges til HDR, kan i høj grad påvirke redigeringseffektiviteten. For genteknologi i humane HSPC’er er adeno-associeret virus serotype 6 (AAV6) for nylig blevet beskrevet som et fremragende middel til levering af enkeltstrengede DNA-skabeloner 9,10.
CRISPR/Cas9 genomteknik kan anvendes terapeutisk til at korrigere skadelige mutationer11, men kan også bruges til at introducere patogene mutationer i DNA’et for at modellere kræftudvikling12. Blodkræft, såsom leukæmi, udvikler sig via sekventiel erhvervelse af somatiske mutationer i raske HSPC’er13,14. Tidlige genetiske hændelser fører til en klonal proliferativ fordel, hvilket resulterer i klonal hæmatopoiesis af ubestemt potentiale (CHIP)15,16. Yderligere erhvervelse af mutationer vil i sidste ende føre til leukæmisk transformation og udvikling af sygdommen. Somatiske mutationer kan findes i gener, der styrer selvfornyelse, overlevelse, spredning og differentiering17.
Introduktion af individuelle mutationer via genomteknik i sunde HSPC’er giver mulighed for præcist modellering af denne trinvise leukemogene proces. Det begrænsede antal tilbagevendende mutationer, der findes i myeloide neoplasmer, såsom akut myeloid leukæmi (AML)18,19, gør denne sygdom særlig modtagelig for at blive rekapituleret ved hjælp af genomtekniske værktøjer.
Somatiske mutationer kan kun opstå på en allel (monoalleliske / heterozygote mutationer) eller på begge alleler (bialleliske / homozygote mutationer) og kan have dybe virkninger på genets funktion, hvilket kan forårsage et funktionstab (LOF) eller en gain-of-function (GOF). LOF-mutationer fører til en reduceret (hvis en allel påvirkes) eller komplet (hvis begge alleler påvirkes) LOF af genet, mens GOF-mutationer fører til en øget aktivering eller ny funktion af genet. GOF-mutationer er typisk heterozygote20.
Det er vigtigt, at zygositeten (hetero- vs. homozygot) har store konsekvenser for forsøget på trofast modellering af en mutation; derfor er den målrettede manipulation af kun en allel af et gen nødvendig for at konstruere heterozygote hotspot GOF-mutationer. Fejlbehæftet NHEJ fører til indels af forskellig længde21, der kan føre til varierende, uforudsigelige biologiske konsekvenser. Men da NHEJ er det dominerende reparationsprogram, der anvendes af celler efter introduktionen af en DSB, tillader de fleste CRISPR / Cas9-platforme, der i øjeblikket bruges til at manipulere HSPC’er, ikke præcist at forudsige det genetiske resultat22,23. I modsætning hertil muliggør introduktionen af et CRISPR/Cas9-medieret dobbeltstrengsbrud (DSB’er) kombineret med brugen af rekombinante adenoassocierede virus (rAAV) vektorbaserede DNA-donorskabeloner til genomteknik via HDR allelspecifik indsættelse af mutationer i humane HSPC’er11,24. Den samtidige integration af en mutant og en vildtypesekvens (WT) kombineret med forskellige fluorescerende reportere på de enkelte alleler kan udføres for at vælge en heterozygot genotype (figur 2). Denne strategi kan udnyttes som et kraftfuldt værktøj til præcist at karakterisere virkningerne af tilbagevendende, leukæmiske, heterozygote GOF hotspot-mutationer på HSPC-funktion, sygdomsinitiering og progression.
I denne artikel gives en detaljeret protokol for effektiv konstruktion af tilbagevendende muterede heterozygote GOF-mutationer i primære humane HSPC’er. Denne strategi kombinerer brugen af CRISPR/Cas9 og en dobbelt AAV6-transduktion for at tilvejebringe WT- og mutante DNA-donorskabeloner til den potentielle generering af den heterozygote GOF-mutation. Som et eksempel vil engineering af de tilbagevendende type 1-mutationer (52 bp-deletion) i calreticulin (CALR) -genet blive vist25. Den heterozygote GOF-mutation i exon 9 af CALR findes gentagne gange i myeloproliferative lidelser såsom essentiel trombocytæmi (ET) og primær myelofibrose (PMF)26. CALR er et endoplasmatisk retikulum-beboerprotein, der primært har en kvalitetskontrolfunktion i foldeprocessen af nyligt syntetiserede proteiner. Dens struktur kan opdeles i tre hoveddomæner: et amino-(N)-terminalt domæne og et prolinrigt P-domæne, som er involveret i proteinets chaperonfunktion, og et C-domæne, som er involveret i calciumlagring og regulering27,28. CALR-mutationer forårsager en +1 frameshift, hvilket fører til transkription af en ny udvidet C-terminal ende og tabet af det endoplasmatiske retikulum (ER) -retentionssignal (KDEL). Mutant CALR har vist sig at binde trombopoietin (TPO) receptoren, hvilket fører til TPO-uafhængig signalering med øget proliferation29.
Figur 1: NHEJ og HDR reparation. Forenklet skematisk repræsentation af NHEJ- og HDR-reparationsmekanismer efter introduktionen af et dobbeltstrenget brud i DNA’et. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Skematisk oversigt over biallelisk HDR-redigeringsstrategi. Skematisk repræsentation, der viser integrationen af donorskabelonerne i de målrettede alleler efterfulgt af deres oversættelse til fungerende mRNA’er. De orange stiplede felter angiver de områder, der svarer til venstre homologiarm (LHA) og højre homologiarm (RHA). Den ideelle størrelse af HA’erne er 400 bp hver. Den grønne stiplede boks repræsenterer det område, der svarer til SA-sekvensen. SA’s størrelse er 150 bp. Klik her for at se en større version af dette tal.
Den effektive og præcise genetiske manipulation af humane primære HSPC’er repræsenterer en fantastisk mulighed for at udforske og forstå de processer, der påvirker normal hæmatopoiese, og vigtigst af alt, leukæmisk transformation af hæmatopoietiske celler.
I denne protokol blev der beskrevet en effektiv strategi til at konstruere humane HSPC’er til at udtrykke tilbagevendende heterozygote GOF-mutationer. Denne procedure udnyttede CRISPR/Cas9-teknologi og rAAV6-vektorer som donorer til DNA-skabeloner til præcist at indsætte WT- og mutante DNA-sekvenser i deres endogene gen-loci. Kobling af de konstruerede cDNA’er (WT og mutant) med separerede fluorescerende reporterproteiner muliggør berigelse og sporing af celler med en endelig heterozygot tilstand.
Denne strategi giver flere fordele i forhold til de ofte anvendte lentivirale (LV) -baserede metoder. En af de største fordele er, at det CRISPR/Cas9-baserede system giver mulighed for præcis redigering i de endogene loci, hvilket resulterer i bevarelse af de endogene promotorer og reguleringselementer. Dette fører til homogenitet i ekspressionen af det redigerede gen i cellerne, et mål, der næppe kan opnås, når en LV-baseret metode anvendes. Genoverførsel med LV-vektorer fører til semi-tilfældig integration af genet med præference for transkriptionelt aktive steder34. Dette kan oversættes til overekspression af det overførte gen og heterogenitet mellem de redigerede celler, hvilket i sidste ende resulterer i vanskeligheder med at undersøge og analysere mutationers og geninteraktioners rolle. En anden fordel er, at det beskrevne system, som er et stedspecifikt redigeringssystem, eliminerer risikoen for mutagenese35.
Den dobbelte fluorescerende reporterstrategi giver mulighed for præcis berigelse og sporing af celler, der med succes blev redigeret på begge alleler, hvor den ene allel integrerer WT cDNA og den anden allel integrerer de muterede cDNA-sekvenser. Celler, der kun udtrykker en enkelt reporter, repræsenterer enten kun monoallelisk integration eller biallelisk integration af HDR-skabeloner med den samme fluorescerende reporter. Begge scenarier kan kun skelnes præcist, hvis enkeltcelleafledte kloner produceres og analyseres individuelt. HSPC’er har imidlertid kun begrænset proliferativ kapacitet in vitro, og når HSPC’er holdes i kultur i længere perioder, begynder HSPC’er at differentiere sig til mere modne afkom og mister deres selvfornyelses- og indkapslingskapacitet. Dette gør udvælgelse og udvidelse af enkeltcellekloner, der huser den ønskede heterozygote mutation, umulig. Anvendelsen af strategien med dobbelt fluorescerende protein og berigelse ved flowcytometri for celler, der bærer den heterozygote mutation, gør det muligt at omgå de problemer, der induceres af udvidet in vitro-kultur .
I dette specifikke eksempel blev det med succes demonstreret, at HSPC’er effektivt kunne konstrueres og sorteres for at opnå rene populationer af HSPC’er, der bærer den heterozygote CALRDEL / WT-mutation.
Dette system er imidlertid ikke begrænset til at konstruere heterozygote frameshift-mutationer, men kan også let vedtages for at skabe andre mutationstyper, herunder missense og nonsensmutationer. Ved at anvende forskellige kombinationer af AAV’er, der indeholder WT eller muterede sekvenser med forskellige fluorescerende reporterproteiner, kan dette system også bruges til introduktion af homozygote mutationer (samtidig transduktion med to rAAV’er, der begge bærer mutant cDNA, men forskellige fluorescerende reportere) eller endda korrektion af mutationer (samtidig transduktion med to AAV’er, der begge bærer WT cDNA, men forskellige fluorescerende reportere). Derudover er det vigtigt at nævne, at denne strategi ikke er begrænset til introduktion af onkogene GOF-mutationer. Faktisk kan den beskrevne protokol bruges til flere alternative strategier, herunder gen-knock-out, genudskiftning 36,37, målrettet knock-in af transgener (dvs. kimære antigenreceptorer)38 og endda til korrektion af sygdomsfremkaldende mutationer 11,39.
Strategien med at kombinere CRISPR / Cas9 og AAV6 med flere fluorescerende reportere har også vist sig at være anvendelig i mange andre celletyper, herunder T-celler, plasmacytoid dendritiske celler, inducerede pluripotente stamceller, neuronale stamceller og luftvejsstamceller 24,38,40,41,42,43,44 . Denne strategi kan implementeres til produktion af overlegne kimære antigenreceptor (CAR) T-celler. For eksempel blev det for nylig offentliggjort, at CRISPR / Cas9-medieret knock-out af TGFBR2-genet i CAR T-celler i høj grad øger deres funktion i det suppressive TGF-β rige tumormikromiljø45. En sådan tilgang kunne give en et-trins protokol til både at konstruere T-cellerne til at udtrykke CAR og til at slå TGFBR2-genet ud efter sted, der specifikt indsætter CAR i begge alleler af TGFBR2-genet. Desuden kan denne tilgang også være nyttig til at generere universelle CAR T-celler ved at integrere CAR i T-cellereceptorens alfakonstantgen (TRAC)46,47.
For at øge reproducerbarheden og garantere effektiv redigering af cellerne skal der tages nogle vigtige overvejelser. De vigtigste kritiske punkter for at sikre vellykket redigering af cellerne ligger i (i) udvælgelsen af sgRNA’et, (ii) designet af HDR-skabelonen og (iii) rAAV6-produktionen.
Valget af et velfungerende sgRNA er afgørende, da det vil bestemme det maksimale antal alleler, hvori HDR-skabelonen kan integreres. På grund af adskillige software, der nu er tilgængelige, er søgningen efter kandidat-sgRNA’er blevet forenklet. Ved at vælge det interessante område kan softwaren foreslå en række sgRNA’er med en on-target score og en off-target score, der angiver chancerne for redigering på henholdsvis det ønskede locus og uønskede loci. Disse scorer er beregnet ud fra tidligere offentliggjorte scoringsmodeller48,49. Selvom dette er et godt udgangspunkt for at vælge et godt fungerende sgRNA, skal sgRNA’ets ydeevne bekræftes, da dets forudsagte ydeevne i silico ikke altid svarer til et effektivt sgRNA in vitro. Derfor anbefales det stærkt at designe og teste mindst tre sgRNA’er for at øge chancerne for at finde det bedste sgRNA. Når et ægte godt fungerende sgRNA er blevet identificeret, foreslås det at fortsætte med designet af HDR-skabelonen.
Der skal tages forholdsregler ved design af HDR-skabelonen. Venstre og højre homologiarm (henholdsvis LHA og RHA) skal hver spænde over henholdsvis 400 bp opstrøms og nedstrøms for sgRNA-snitstedet, da kortere HA’er kan resultere i reducerede HDR-frekvenser. Størrelsen af cDNA, der kan introduceres via HDR, afhænger af AAV’ernes emballeringsevne, som er ca. 4,7 kb. På grund af de mange elementer, der er obligatoriske i HDR-skabelonen (LHA, RHA, SA, PolyA, promotor og fluorescerende reportersekvens), er den resterende plads til det muterede eller WT cDNA begrænset. Dette er uproblematisk, hvis den ønskede mutation er placeret nær 3′-enden af et gen eller i gener med en samlet kort CDS. I tilfælde, hvor mutationen er placeret nær transkriptionel startside (TSS) af generne med en lang CDS (overstiger den resterende pakningsplads i AAV), er denne beskrevne fremgangsmåde muligvis ikke mulig. For at omgå dette problem er en strategi, der er afhængig af at opdele HDR-skabelonen i to AAV’er, for nylig blevet udviklet af Bak og kolleger. Denne strategi er afhængig af to separate HDR-medierede integrationer for at opnå den endelige sømløse integration af et stort gen50.
Kvaliteten af virussen og dens titer er yderligere faktorer, der kan gøre eller bryde den vellykkede genomteknik af cellerne. For et optimalt udbytte er det vigtigt ikke at lade HEK293T nå fuld sammenløb, mens den opretholdes i kultur. Ideelt set bør HEK293T-cellerne opdeles, når 70% -80% sammenløb er nået. Derudover bør HEK293T ikke dyrkes i lange perioder, da dette kan nedsætte deres evne til at producere virus. Nye HEK293T-celler skal optøes efter 20 passager. Det er vigtigt at opnå høje virustitre for at øge eksperimenternes effektivitet og reproducerbarhed. Lave virale titere vil oversætte til store mængder rAAV-opløsning, der kræves til transduktion af HSPC’erne. Som hovedregel bør rAAV-opløsningen, der tilsættes til de nukleofekterede celler, ikke overstige 20% af det samlede volumen af HSPC-retentionsmediet. Højere volumener af AAV-opløsning kan føre til øget celledød, lavere proliferation og nedsat transduktionseffektivitet. I tilfælde af lave virustitre anbefales det derfor at koncentrere virussen yderligere.
Sammenfattende tilbyder denne protokol en reproducerbar tilgang til at manipulere humane HSPC’er præcist og effektivt gennem samtidig brug af CRIPSR / Cas9 og rAAV6 donorskabeloner med yderligere dobbelt fluorescerende reportere. Denne tilgang har vist sig at være et godt værktøj til at studere normal hæmatopoietisk stamcellebiologi og de bidrag, som mutationer yder til leukemogenese.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde støttes af tilskud fra den østrigske videnskabsfond (FWF; nummer P32783 og I5021) til A.R. Yderligere finansiering til A.R. ydes også af det østrigske samfund for intern medicin (Joseph Skoda Fellowship), det østrigske samfund for hæmatologi og onkologi (OeGHO; Klinisk forskningsbevilling), og MEFOgraz. T.K. er en særlig stipendiat af Leukæmi & Lymfom Society.
175 cm2 Cell Culture Flask, Vent Cap, TC-treated | Corning | 431080 | |
150 mm x 25 mm dishes | Corning | 430599 | |
293T | DSMZ | ACC 635 | https://www.dsmz.de/collection/catalogue/details/culture/ACC-635 |
4D Nucleofector Core Unit | Lonza | – | For nucleofection of human HSPCs use the DZ-100 program. |
4D Nucleofector X Unit | Lonza | – | |
500 ml Centrifuge Tube | Corning | 431123 | |
7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
AAVpro Purification Kit | Takara | 6666 | |
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 1081058 | |
Avanti JXN-30 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | – | |
Benchling sgRNA design tool | Online tool for sgRNA design: http://www.benchling.com/crispr | ||
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | – | |
Chemically modified synthetic sgRNA | Synthego | Website: https://www.synthego.com/products/crispr-kits/synthetic-sgrna Sequence for the sgRNA targeting intron 7 of CALR: 5’-CGCCTGTAATCCTCGCCCAG-3’ An 80 nucleotide SpCas9 scaffold is added to the 20 nucleotide RNA sequence to complete the sgRNA. Chemical modifications of 2'-O-Methyl are added to the first and last 3 bases and 3' phosphorothioate bonds are added in the first 3 and last 2 bases. *Alternatively chemically modified synthetic sgRNAs can be acquired from IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/oligoentry/index/crispr) and Trilink (https://www.trilinkbiotech.com/custom-oligos) | |
CHOPCHOP sgRNA design tool | Online tool for sgRNA design: http://chopchop.cbu.uib.no | ||
Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning | 3526 | |
CRISPick sgRNA design tool | Online tool for sgRNA design: https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public | ||
CRISPOR sgRNA design tool | Online tool for sgRNA design: http://crispor.tefor.net | ||
ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad | 12001925 | |
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863024 | |
DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864008 | |
DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio-Rad | 1863009 | |
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad | 1863005 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-6X500ML | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
FACSAria Fusion | BD Biosciences | – | |
Falcon 5 mL Round Bottom | Corning | 352054 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) Good Forte (heat inactivated), 500 ml | Pan Biotech | P40-47500 | |
FlowJo 10.8.0 | BD Biosciences | – | |
GenAgarose L.E. | Inno-train | GX04090 | |
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0321 | |
Gibson Assembly Master Mix | New England Biolabs Inc. (NEB) | E2611L | |
HEK293T | |||
HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | |
ICE | Synthego | https://ice.synthego.com | |
IDT codon optimization tool | IDT | https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool | |
IDT sgRNA design tool | Online tool for sgRNA design: https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM | ||
LB Broth (Lennox) EZMix powder microbial growth medium | Sigma-Aldrich | L7658-1KG | |
LB Broth with agar (Lennox) EZMix powder microbial growth medium | Sigma-Aldrich | L7533-1KG | |
Midori Green Advance | Nippon Genetics | MG04 | |
Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010L | |
Monarch DNA Gel Extraction Kit | NEB | T1020L | |
NEB 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987U | |
Nuclease-Free Water, 5X100 ml | Ambion | AM9939 | |
NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410 | |
Opti-MEM, Reduced Serum Medium, 500 ml | Gibco | 31985070 | |
P3 Primary Cell 4D-Nucleofetor X Kit L | Lonza | V4XP-3024 | The Lonza Primary P3 solution is supplied as a 2.25 mL P3 Primary Cell Nucleofector Solution and 0.5 mL Supplement 1. To reconstitute, add the Supplement 1 to the P3 Primary Cell Nucleofector Solution and mix. |
pAAV-MCS2 | Addgene | 46954 | |
PCR Plate Heat Seal Foil, pierceable | Bio-Rad | 1814040 | |
pDGM6 | Addgene | 110660 | |
Penicillin-Streptomycin (P/S) | Gibco | 15140122 | |
Polyethylenimine (PEI) | Polysciences | 23966 | Add 50 mL of PBS 4.5 pH (made with HCl) to 50 mg of PEI in a tube. Dissolve by placing the tube in a 70°C water bath and vortexing every 10 minutes until the solution is dissolved. After the solution has reached RT, filter sterilze through a 0.22 μm filter, make 1120 μL aliquots, and store at -80°C. |
Polystyrene Test Tube, with Snap Cap | |||
Primers | Eurofins | – | Primers were ordered from Eurofins (eurofinsgenomics.eu) as unmodified salt free custom oligos. The primers were designed by using PRIMER-Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) Primer 1 Fwd: AAGTGATCCGTTCGCCATGAC; Primer 2 Rev CALR WT specific: ACGTCCTCTTCCTCGTCCTC; Primer 2 Rev CALR DEL specific: CCAACCCTGGAGACACGCTTC |
PrimeTime qPCR Primer Assay | IDT | – | PrimeTime qPCR Probe Assays (1 probe/2 primers) that can be ordered from IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/qpcr/assayentry). Scale: Std – qPCR Assay 500 reactions; Primer 1 Forward (5'-3') : GGAACCCCTAGTGATGGAGTT; Primer 2 Reverse (5'-3'): CGGCCTCAGTGAGCGA; Probe (5'-3'): CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG; 5' Dye/3' Quencher: FAM/ZEN/IBFQ; Primer to probe ratio: 3.6 |
PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad | 1814000 | |
QuantaSoft Software | Bio-Rad | ||
Quick Extract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE0905T | |
QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864002 | |
QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | ||
Recombinant human Flt3-ligand | Peprotech | 300-19 | |
Recombinant human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
Recombinant Human SCF | Peprotech | 300-07 | |
Recombinant Human TPO | Peprotech | 300-18 | |
RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758-6X500ML | |
SnapGene | Dotmatics | Molecular cloning software https://www.snapgene.com *Alternatively also Benchling (https://www.benchling.com) and Geneious (https://www.geneious.com) can be used. | |
Soc outgrowth medium | NEB | B9020S | |
Sodium-butyrate | Sigma-Aldrich | B5887-1G | |
Stem Regenin 1 (SR1) | Biogems | 1224999 | |
StemSpan SFEM II | STEMCELL Technologies | 9655 | |
TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) 50X | Thermo Scientific | B49 | |
TIDE | http://shinyapps.datacurators.nl/tide/ | ||
Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
TrypLE (with phenol red), 500 ml | Thermo Scientific | 16605-028 | |
UltraPure 0.5: EDTA, pH 8.0, 100 ml | Thermo Scientific | 15575-038 | |
UM171 | STEMCELL Technologies | 72914 | |
Vector Builder codon optimization tool | Vector Builder | https://en.vectorbuilder.com/tool/codon-optimization.html |