Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Modèle murin spontané de cancer anaplasique de la thyroïde

Published: February 3, 2023 doi: 10.3791/64607
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 2, 4, 5, 1,6, 2,6
1State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, Sichuan University and Collaborative Innovation Center, 2Division of Thyroid Surgery, Laboratory of Thyroid and Parathyroid Disease, Frontiers Science Center for Disease-Related Molecular Network, Department of General Surgery, West China Hospital, Sichuan University, 3Department of Ultrasound, West China Hospital of Sichuan University, Sichuan University, 4Department of Otolaryngology-Head & Neck Surgery and University of Arizona Cancer Center, University of Arizona, 5Center for Translational Medicine, Shenzhen Bay Laboratory, 6Division of Laboratory Medicine/Research Centre of Clinical Laboratory Medicine, West China Hospital, Sichuan University

Summary

Ici, nous présentons un pipeline standard pour obtenir des tumeurs ATC murines par des modèles murins spontanés génétiquement modifiés. En outre, nous présentons la dynamique tumorale et des informations pathologiques sur les lésions primaires et métastasées. Ce modèle aidera les chercheurs à comprendre la tumorigenèse et facilitera la découverte de médicaments.

Abstract

Le cancer anaplasique de la thyroïde (CTA) est une tumeur maligne rare mais mortelle dont le pronostic est sombre. Il est urgent de mener des recherches plus approfondies sur la cancérogenèse et le développement de l’ATC, ainsi que sur les méthodes thérapeutiques, car les traitements standard sont essentiellement épuisés chez les patients atteints d’ATC. Cependant, la faible prévalence a entravé les études cliniques approfondies et la collecte d’échantillons de tissus, de sorte que peu de progrès ont été réalisés dans la création de traitements efficaces. Nous avons utilisé le génie génétique pour créer un modèle murin ATC inductible conditionnellement (mATC) dans un arrière-plan C57BL/6. Le modèle murin ATC a été génotypé par TPO-cre/ERT2; BrafCA/poids; Trp53 ex2-10/ex2-10 et induit par injection intrapéritonéale de tamoxifène. Avec le modèle murin, nous avons étudié la dynamique tumorale (la taille de la tumeur variait de 12,4 mm 2 à 32,5 mm2 après 4 mois d’induction), la survie (la période de survie médiane était de 130 jours) et les métastases (métastases pulmonaires survenues chez 91,6% des souris) courbes et caractéristiques pathologiques (caractérisées par une coloration immunohistochimique Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67 et Caspase-3). Les résultats ont indiqué que le mATC spontané possède une dynamique tumorale et un microenvironnement immunologique très similaires aux tumeurs ATC humaines. En conclusion, avec une grande similitude dans les caractéristiques physiopathologiques et les génotypes unifiés, le modèle mATC a résolu la pénurie de tissu ATC clinique et l’hétérogénéité des échantillons dans une certaine mesure. Par conséquent, il faciliterait le mécanisme et les études translationnelles de l’ATC et fournirait une approche pour étudier le potentiel de traitement des médicaments à petits molécules et des agents d’immunothérapie pour l’ATC.

Introduction

Le cancer de la thyroïde est l’une des tumeurs malignes endocriniennes les plus courantes1, provenant de l’épithélium thyroïdien. Ces dernières années, l’incidence du cancer de la thyroïde a augmenté rapidement dans le mondeentier 2. Le cancer de la thyroïde peut être divisé en types distincts en fonction du degré de différenciation des cellules tumorales. Sur la base du comportement clinique et de l’histologie, les carcinomes thyroïdiens sont divisés en carcinomes bien différenciés, y compris le carcinome papillaire de la thyroïde (PTC) et le carcinome folliculaire de la thyroïde (FTC), le carcinome peu différencié (PDTC) et le carcinome indifférencié ou anaplasique de la thyroïde (ATC)3. Contrairement au PTC, qui est un type commun avec un comportement doux et un meilleur pronostic4, l’ATC est une tumeur maligne rare et très agressive qui représente 2% à 3% de toutes les tumeurs thyroïdiennes5. Bien que l’ATC soit rare, il est responsable d’environ 50 % des décès liés au cancer de la thyroïde, avec une survie lamentable (6 à 8 mois)6,7. Plus de 50 % des cas d’ATC sont diagnostiqués comme des métastases pulmonaires8. En plus de la nature agressive de l’ATC, un traitement efficace limité a été développé en clinique. Par conséquent, les patients ATC ont un pronostic sombre 9,10,11. Cela suggère que d’autres études approfondies sont nécessaires de toute urgence sur les mécanismes moléculaires sous-jacents au développement de l’ATC et du traitement.

La tumorigenèse de l’ATC est un processus dynamique dédifférencié. La difficulté de prélever des échantillons de tumeurs humaines à chaque étape des études cliniques a entravé la compréhension du mécanisme de développement des carcinomes bien différenciés aux carcinomes indifférenciés. En revanche, l’utilisation de modèles ATC murins (mATC) favorise la collecte d’échantillons de mATC dans l’ensemble du cours de tumorigenèse. Par conséquent, nous pouvons mieux comprendre les mécanismes de formation tumorale en analysant le processus dynamique dédifférencié. En outre, l’hétérogénéité des échantillons cliniques ATC a également contribué à la difficulté de comprendre le mécanisme moléculaire. Néanmoins, les souris partageaient les mêmes antécédents génétiques et étaient maintenues dans des environnements de vie similaires, assurant la cohérence de chaque tumeur. Cela facilite l’exploration du rôle généralisé du développement ATC12,13,14. De plus, le mATC est un modèle tumoral in situ qui peut restaurer l’influence de l’emplacement anatomique et du microenvironnement tissulaire spécifique. En tant que tel, comparé aux souris immunodéficientes couramment utilisées, le mATC est un modèle murin spontané avec un système immunitaire intact et un microenvironnement immunitaire.

Par conséquent, nous avons construit le mATC induit conditionnellement avec la souche C57BL/6, qui est un modèle murin capable de reproduire les caractéristiques pathologiques du carcinome thyroïdien dédifférencié. Sur la base de ce modèle, nous avons donné un bref aperçu de la base moléculaire, des idées de construction, des caractéristiques pathologiques et des applications du mATC. En outre, nous avons observé et rapporté la croissance tumorale, le temps de survie, les métastases et les caractéristiques pathologiques du mATC. Nous croyons qu’il s’agira d’un aperçu informatique pour aider d’autres chercheurs à utiliser ce modèle plus facilement.

Nous avons construit un modèle mATC inductible conditionnel, tel que rapporté pour la première fois par McFadden15 ; initialement, nous avons construit des souris : TPO-cre/ERT2, Braf flox/wt et Trp53flox/wt. Plus précisément, les souris TPO-cre / ERT2 incluaient le promoteur de la peroxydase thyroïdienne humaine (TPO) (un promoteur spécifique de la thyroïde), entraînant l’expression d’un gène de fusion cre-ERT2 (une cre recombinase fusionnée à un domaine de ligand du récepteur des œstrogènes humains). Cre-ERT2 est généralement confiné au cytoplasme et ne pénètre dans le noyau que lorsqu’il est exposé au tamoxifène, ce qui induit le cre à exercer une activité enzymatique recombinante. Lorsque les souris sont croisées avec des souris portant des séquences flanquées de loxP, après induction de tamoxifène, la recombinaison médiée par la cré supprime les séquences floxées dans les cellules thyroïdiennes pour atteindre le but d’assommer ou de frapper dans des gènes spécifiques.

De plus, les souris Braf flox / poids sont un allèle knock-in de Braf humain basé sur le système cre-loxP. Le transcrit murin Brafflox/wt est codé par les exons endogènes 1-14 et les exons humains flanqués de loxP 15-18. Après excision médiée par la cre des régions floxées, l’exon 15 mutant (modifié par une substitution d’acides aminés V600E liée à BrafV600E constitutifment actif dans les cancers humains) et les exons endogènes 16-18 sont utilisés pour générer les transcrits. De plus, les souris Trp53 flox/poids sont des allèles knockout de Trp53 humain et ont des sites loxP flanquant les exons 2-10 de Trp53. Lorsqu’elle est croisée avec des souris avec une cre recombinase, la recombinaison médiée par cre supprime la séquence floxed pour éliminer Trp53. Ensuite, des souris TPO-cre/ERT2, Braf flox/w et Trp53flox/poids ont été croisées pour obtenir la tuberculose (TPO-cre/ERT2; Brafflox/poids) souris et TBP (TPO-cre/ERT2; Brafflox/poids; Trp53flox/poids) souris, qui pourraient être utilisées pour générer PTC et ATC. Après environ 8 semaines, les souris ont été induites par une administration intrapéritonéale (i.p.) de 150 mg / kg de tamoxifène dissous dans de l’huile de maïs pendant deux administrations. La croissance tumorale a pu être surveillée par échographie à haute fréquence (le premier point temporel de l’échographie a été enregistré au jour 0). L’échographie initiale a été réalisée 40 jours après l’introduction du tamoxifène.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Les procédures animales décrites ici ont été effectuées avec l’approbation du Comité d’éthique animale de l’hôpital de Chine occidentale, Université du Sichuan, Chengdu, Sichuan, Chine.

1. Induction de souris TBP

  1. Identifier le génotype des souris
    1. Vers 3 semaines, séparer les souris femelles des souris mâles. Dans le même temps, utilisez une pince d’étiquette d’oreille pour fixer une étiquette d’oreille. Placez les étiquettes d’oreille dans la moitié inférieure et sur le tiers moyen de l’oreille, en vous assurant d’éviter la zone avec la plus forte concentration de capillaires.
    2. Retenez doucement mais solidement les souris. Saisissez fermement à la base de la queue de la souris. Placez les souris sur une surface qui leur permettra de saisir.
    3. Placez doucement mais fermement la main libre sur les épaules, puis saisissez rapidement la peau du cou entre le pouce et l’index. Tenez la queue avec le petit doigt.
    4. Tamponnez la queue avec de l’alcool. Utilisez des ciseaux stériles pour couper l’échantillon de peau de <5 mm et le mettre dans un récipient d’échantillon propre avec une étiquette. Il n’est pas nécessaire d’enlever la fourrure des souris. Comprimez la queue avec des éponges stériles pour atteindre l’hémostase.
    5. Ensuite, lyser la queue murine et effectuer une réaction en chaîne de la polymérase (PCR) pour identifier le génotype.
      REMARQUE: Après avoir coupé une queue murine, la surface des ciseaux doit être essuyée avec du coton alcoolisé pour éviter la contamination mutuelle des gènes entre les queues murines. Après les avoir placées dans leur cage, les souris doivent être surveillées pendant 5 minutes pour rechercher tout signe de saignement sur le site de la plaie. Reportez-vous au tableau 1 pour la liste des amorces et les paramètres de PCR utilisés dans cette étude.
  2. Souris TBP induites par le tamoxifène
    1. Peser 0,3 g de tamoxifène et le dissoudre dans 15 mL d’huile de maïs par ultrasons (puissance = 20 %, durée = 20 min, température = 4 °C), à une concentration de 20 mg/mL. Conserver à 4 °C.
      REMARQUE: Le tamoxifène est sensible à la lumière et doit être placé dans un récipient brun.
    2. Vers 8 semaines, pesez les souris avec des balances électroniques et donnez-leur une injection intraveineuse de tamoxifène à une dose de 150 mg / kg, administrée deux fois avec un intervalle de 1 semaine.

2. Dissection et imagerie des tumeurs thyroïdiennes de souris et des tumeurs métastatiques

  1. Préparation
    1. Préparez les outils de dissection: ciseaux et pinces stériles, lame stérile, vaporisateur d’alcool à 75%, bord droit de 20 cm, étriers verniers, essuie-tout et coton alcoolisé.
    2. Solution de fixation de tissu de souris: préparer la solution de fixation de tissu paraformaldéhyde à 4%.
    3. Nettoyez un plat de 10 cm rempli d’environ 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS) pour un entreposage temporaire des tissus, et lavez le sang à la surface du tissu.
  2. Extraction thyroïdienne
    1. Euthanasier les souris avec du dioxyde de carbone à un débit de 2,0 L/min pendant 5 min. Retirez les souris de la cage et effectuez une luxation cervicale.
    2. Placez la souris sur la planche de dissection avec le côté ventral vers le haut et la tête éloignée de l’expérimentateur, et fixez les membres sur la planche de dissection avec des aiguilles de seringue stériles. Pour un retrait plus pratique du tissu thyroïdien, utilisez une autre aiguille de seringue stérile pour fixer la tête.
    3. Désinfectez le cou avec trois cycles alternés d’un gommage à la chlorhexidine ou à la povidone iodée suivi d’un gommage à 75 % d’alcool. Ensuite, faites une petite incision au-dessus du centre de la clavicule avec des ciseaux et des pinces stériles.
    4. Continuez l’incision à mi-chemin jusqu’à la bouche. Trouvez la glande sous-maxillaire et retirez-la pour exposer l’emplacement anatomique de la thyroïde, qui est placée près du cartilage thyroïdien et de la trachée.
    5. Trouvez la thyroïde, disséquez soigneusement la thyroïde du reste de la région du cou avec des ciseaux stériles, puis mettez la thyroïde retirée dans un plat de 10 cm rempli de 10 ml de PBS stérile.
      REMARQUE: Lors de l’ablation de la glande thyroïde, soyez doux et lent et évitez de couper les vaisseaux sanguins du cou. Si les vaisseaux du cou sont coupés, le cou sera immédiatement rempli de sang et le sang doit être rapidement retiré avec des éponges à alcool pour exposer l’emplacement anatomique de la thyroïde. Avant de retirer le tissu thyroïdien, observez attentivement les caractéristiques des lobes gauche et droit de la thyroïde (taille, forme, etc.) pour éviter de ne pas pouvoir distinguer les lobes gauche et droit de la thyroïde après le retrait.
    6. Dans le PBS stérile, retirez le sang de la surface du tissu thyroïdien avec des ciseaux stériles et coupez soigneusement la trachée. Ensuite, mettez le tissu thyroïdien sur un chiffon stérile et mesurez la taille des lobes gauche et droit de la glande thyroïde avec des étriers verniers.
    7. Divisez les lobes gauche et droit de la glande thyroïde en deux parties avec une lame stérile. Mettre une partie dans 2 mL de solution de paraformaldéhyde à 4% pour la fixation, et mettre l’autre partie dans de l’azote liquide pour la conservation.
  3. Extraction des poumons et du foie
    1. Désinfectez l’abdomen avec trois cycles alternés d’un gommage à la chlorhexidine ou à la povidone iodée et d’alcool à 75%. Ensuite, pincez juste au-dessus du pénis de la souris et faites une petite incision, coupez le long de la ligne médiane de l’abdomen jusqu’à l’os sous-clavier et exposez la cavité abdominale.
    2. Trouvez le foie dans la partie supérieure de l’abdomen et retirez-le soigneusement. Placez le foie dans du PBS stérile.
    3. Coupez soigneusement le diaphragme le long des côtes pour exposer la cavité thoracique. Ensuite, saisissez le sternum et tirez vers le haut pour élargir encore plus l’espace. Trouvez le poumon et retirez-le. Mettez le poumon enlevé dans PBS stérile.
    4. Observez grossièrement s’il y a des métastases dans le poumon et le foie. Comptez le nombre de métastases et prenez un enregistrement numérique. Après cela, utilisez une lame stérile pour diviser les tissus pulmonaires et hépatiques en deux parties. Mettre une partie dans 3 mL de solution de paraformaldéhyde à 4% pour la fixation et une autre partie dans de l’azote liquide pour la conservation.
    5. Déshydratation tissulaire
      1. Mettez les mouchoirs dans la boîte de déshydratation. Mettez la boîte de déshydratation dans le panier à gradient de déshydratation alcoolique comme suit: 70% d’alcool pendant 1 h; 80% d’alcool pendant 1 h; 95% d’alcool pendant 30 min; 95% d’alcool pendant 30 min; éthanol anhydre I pendant 30 min; éthanol anhydre II pendant 30 min; xylène I pendant 20 min; xylène II pendant 20 min; cire de paraffine I pendant 30 min; cire de paraffine II pendant 1 h; cire de paraffine III pendant 30 min.
    6. Incorporez les tissus imprégnés de cire dans la machine d’encastrement.
      1. Mettez d’abord la cire fondue dans le cadre d’encastrement. Avant que la cire ne se solidifie, retirez le tissu de la boîte de déshydratation et placez-le dans le cadre d’encastrement, puis fixez l’étiquette.
      2. Laisser refroidir la cire à -20 °C sur la table de congélation. Une fois la cire solidifiée, retirez le bloc de cire du cadre d’encastrement et coupez-le.
    7. Placer le bloc de cire taillé sur une trancheuse à paraffine, réglée sur une épaisseur de 5 μm et une taille de 2 cm x 2 cm. Après la section, laisser flotter les sections sur un épandeur avec de l’eau tiède à 45 °C pour aplatir le tissu. Ramasser le mouchoir avec une lame et cuire les tranches dans une étuve à 65 °C pendant 2 h.
    8. Une fois l’eau sèche et la cire fondue, retirez la lame avec le tissu et utilisez-la pour la coloration de l’hématoxyline et de l’éosine (HE) et immunohistochimique (IHC)16. Assurez-vous que les sections sont collées aux lames pour la coloration.

3. Coloration HE de la tumeur primaire et du poumon

  1. Déparaffinage
    1. Mettez les lames avec les sections dans du xylène pendant 10 min.
    2. Passer à l’alcool anhydre (100%) (deux bouteilles) pendant environ 3 minutes chacune.
    3. Passer à 95% d’alcool (deux bouteilles) pendant environ 3 minutes chacune.
    4. Passer à 80% d’alcool pendant environ 3 min.
    5. Passer à 50% d’alcool pendant environ 3 min.
    6. Déplacez-vous dans l’eau du robinet et lavez l’alcool pendant environ 1 min.
  2. Coloration
    1. Déplacer les lames dans l’hématoxyline pendant 8 min.
    2. Déplacez les lames dans l’eau pendant 1 min pour éliminer l’hématoxyline; Le tissu passe du bleu au rouge.
    3. Déplacer les lames dans de l’alcool d’acide chlorhydrique à 1% pendant environ 30 s.
    4. Déplacez les toboggans dans l’eau en les lavant pendant 5 min.
    5. Déplacez les lames dans l’éosine pendant 90 s, puis lavez-les à l’eau pendant 5 min.
    6. Déplacez les lames dans 50% d’alcool, 80% d’alcool, 95% d’alcool (deux bouteilles) et d’alcool anhydre (100%) (deux bouteilles), pendant 1 min chacune.
    7. Déplacer les lames dans le xylène pendant 5 min.
    8. Une fois les lames sèches, scellez-les avec de la résine neutre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nous avons induit mATC pour étudier la croissance tumorale, le temps de survie de la souris et les caractéristiques pathologiques. Après l’induction, les souris ont été immédiatement sacrifiées et des échantillons (thyroïde, poumon et foie) ont été prélevés une fois que l’une des conditions suivantes a été trouvée: 1) détresse respiratoire causée par la compression tumorale; 2) diminution de l’appétit et vocalisation anormale; 3) léthargie inhabituelle; et 4) perte de poids corporel de plus de 20%. Au cours du processus d’échantillonnage, nous avons constaté que toutes les souris (12/12) ont réussi à former des tumeurs après induction. Nous avons enregistré le temps de survie de la souris, les caractéristiques / taille de la tumeur et les lésions métastasées.

En gros, nous avons observé ce qui suit : 1) les tumeurs étaient sensibles et la taille des tumeurs sur les côtés gauche et droit était incohérente ; 2) La plupart des souris (11/12) avaient des métastases pulmonaires, mais aucune n’avait de métastases hépatiques. Plus précisément, la taille de la tumeur a été surveillée par des systèmes d’imagerie photoacoustique et à ultrasons à haute fréquence animale (Vevo®3100) tout au long du processus17. Sur la base des données échographiques, la courbe de croissance tumorale (Figure 1A) a été tracée pour observer l’altération dynamique de la taille de la tumeur. En outre, les tumeurs se sont développées lentement au stade précoce (la taille moyenne de la tumeur variait de 9,47 mm 2 à 11,75 mm 2 du jour 0 au jour 60) et sont devenues considérablement plus rapides au stade avancé (la taille moyenne de la tumeur variait de 11,75 mm 2 à 23,95 mm 2 (du jour 60 au jour 100). La plupart des souris ont été sacrifiées à un stade avancé. En bref, le mATC avec une certaine période de latence tumorale doit être surveillé de près après 60 jours pour prévenir les décès liés à l’asphyxie.

D’autre part, le temps de survie des souris a été enregistré et une courbe de survie (Figure 1B) a été tracée. La survie médiane du CTAm était de 130 jours, allant de 56 à 166 jours. De plus, des métastases pulmonaires ont été observées dans la plupart des ATCm (environ 92 %) (figure 1C). Nous avons observé qu’une seule souris de cette cohorte ne présentait pas de métastases pulmonaires à l’examen macroscopique et que six souris présentaient plus d’une lésion métastatique pulmonaire. Aucune métastase hépatique n’a été trouvée. En bref, ces résultats étaient cohérents avec le comportement biologique des ATC, qui sont sujets aux métastases pulmonaires dans les cliniques.

De plus, pour mieux observer le processus dynamique du mATC, nous avons sacrifié les souris à deux moments (1 mois et 2 mois après l’induction). Nous avons effectué une coloration HE sur les tumeurs primaires et les tissus pulmonaires métastatiques du mATC (Figure 1D). En 1 mois de tissu inductible, nous avons observé des caractéristiques solidifiées incomplètes et la coexistence de structures folliculaires et de cellules malignes. Les structures folliculaires thyroïdiennes ont disparu et la tumeur s’est complètement solidifiée après une induction de 2 mois. La coloration HE de la tumeur primaire a révélé que les cellules tumorales étaient morphologiquement diverses, avec des cellules géantes pléomorphes (indiquées par une flèche rouge) et des cellules fusiformes (indiquées par une flèche jaune). Il a également montré une grande variété de taille nucléaire, et de nombreuses cellules contenaient plusieurs noyaux. Des foyers métastatiques clairs (indiqués par un cercle) ont été observés dans les poumons. La coloration des tissus pulmonaires métastatiques a montré que le tissu pulmonaire normal était une structure réticulaire avec des structures alvéolaires et des espaces aériens clairs. Néanmoins, les métastases pulmonaires ont montré une perte de la structure réticulaire normale, un épaississement de la cavité aérienne et un parenchyme pulmonaire.

Pendant ce temps, la coloration IHC a été réalisée pour caractériser davantage (Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67 et Caspase-3) les tumeurs mATC afin de quantifier la prolifération cellulaire et l’apoptose, et d’étudier l’infiltration des lymphocytes, des cellules T-régulières (Treg) et des cellules myéloïdes (Figure 2A-D). La coloration anti-Ki67 a été très positive, allant de 86,9% à 95,07%, démontrant un degré élevé de prolifération cellulaire. L’anticorps anti-caspase-3 activé a été utilisé pour tester le taux d’apoptose, allant de 5,2% à 51,9%. Plus précisément, le mATC présentait une infiltration évidente de lymphocytes T CD8+, dont le rapport variait de 0,47 % à 10,55 % (moyenne : 5,93 %). Cela indiquait que le mATC n’était pas une tumeur du désert immunitaire, ce qui était cohérent avec les échantillons d’ATC. En outre, la coloration Foxp3 a défini les cellules Treg, qui variaient de 0,45% à 25,8%. En plus des lymphocytes, F4/80 et Cd206 ont été utilisés pour définir les macrophages et les macrophages M2, respectivement. Nous avons constaté que les cellules myéloïdes infiltraient largement les tumeurs (taux cellulaire positif F4/80 de 86,6% à 94,6%; Cd206 taux cellulaire positif de 40,4 % à 67,7 %), ce qui était cohérent avec la littérature précédente16. En bref, nous avons trouvé des cellules tumorales hautement prolifératives, une infiltration lymphocytaire et une infiltration étendue de cellules myéloïdes dans le mATC, ce qui était cohérent avec les échantillons cliniques.

En conclusion, les échantillons de mATC ont montré une homogénéité dans la dynamique tumorale, les métastases et les caractéristiques pathologiques, compatibles avec les échantillons cliniques. Compte tenu du taux de formation de tumeurs, mATC était un modèle murin fiable.

Figure 1
Figure 1 : Dynamique tumorale et caractéristiques pathologiques. (A) Courbe de croissance tumorale des souris (n = 5). Chaque ligne représente une souris : le stade précoce va du jour 0 au jour 60, et le stade tardif va du jour 60 au jour 100. (B) Courbes de survie des souris (n = 12). La survie médiane du CTAm était de 130 jours, allant de 56 jours à 166 jours. (C) Courbes des métastases pulmonaires des souris (n = 12). Images de dissection représentatives de métastases thyroïdiennes et pulmonaires. La flèche rouge indique la tumeur thyroïdienne et le cercle blanc indique les métastases dans le poumon. (D) Coloration HE de la tumeur primaire (1 mois et 2 mois après l’induction) et métastases pulmonaires. La flèche rouge indique la cellule géante pléomorphe, la flèche jaune indique la cellule fusiforme et la zone encerclée indique une métastase dans le poumon. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Brève description de l’infiltration des cellules immunitaires dans le CTAm. (A) Coloration immunohistochimique des tumeurs primaires murines ATC avec des anticorps (Cd8, Foxp3). La flèche rouge indique une cellule CD8 positive, la flèche jaune indique une cellule Foxp3 positive. (B) Coloration immunohistochimique des tumeurs primaires murines ATC avec des anticorps (Ki67, Caspase-3). (C) Coloration immunohistochimique des tumeurs primaires murines ATC avec des anticorps (F4/80, Cd206). D) La quantification du CSI Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Liste des amorces et paramètres de PCR utilisés dans cette étude. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Étapes critiques du protocole de dissection tumorale thyroïdienne
Pendant la dissection, l’emplacement anatomique de la glande thyroïde doit être correctement compris. La glande thyroïde est une glande en forme de papillon située sur la face dorsale de la glande sous-maxillaire près du cartilage thyroïdien et de la trachée. Pendant la procédure, la sectionnement des artères sanguines des deux côtés du cou a été soigneusement évité.

Modification et dépannage de la race mATC
L’ATC est une tumeur maligne rare et très agressive. Les caractéristiques cliniques des patients atteints de mATC et d’ATC présentent certaines similitudes. Plus précisément, la principale cause de décès dans le mATC est l’asphyxie, ce qui est compatible avec les patients ATC. Par conséquent, au cours de l’expérience, il convient de noter ce qui suit: 1) saisir doucement les souris et faire attention à leur respiration pendant l’opération; 2) surveiller de près à un stade avancé afin d’éviter la mort subite et l’impossibilité d’obtenir des échantillons à temps; 3) Les tissus thyroïdiens et pulmonaires sont facilement affectés par le sang à la surface des tissus pour l’observation et la photographie, de sorte que le volume sanguin des souris peut être réduit par énucléation du globe oculaire.

Limites de l’utilisation du mATC
L’apparition et le développement de l’ATC humain sont complexes et changeants, mais le fond génétique du mATC est relativement simple, ce qui ne peut simuler qu’une partie de l’ATC humain. Par exemple, certains tissus ATC présentaient des mutations TERT et BRAF, la variante 18 du nombre de copies NOTCH2NL, au lieu de mutations P53, qui peuvent avoir des mécanismes tumorigéniques et des caractéristiques pathologiques cliniquesdifférents 7,19,20. De plus, l’ATC a généralement une longue évolution avant le diagnostic, mais le mATC obtient un diagnostic après une induction de 2 mois. Par conséquent, il existe des distinctions inhérentes entre le mATC et le cancer de la thyroïde humaine, les modèles animaux ne peuvent pas imiter complètement toutes les caractéristiques du cancer de la thyroïde humaine, et de nombreuses thérapies qui sont limitées aux humains ne peuvent pas être évaluées sur mATC. De plus, bien que le mATC puisse être utilisé pour étudier les effets thérapeutiques de divers médicaments à petites molécules, plusieurs produits biologiques (p. ex. anticorps ou médicaments apparentés) devraient être conçus spécifiquement pour les souris. En outre, l’ensemble du processus de construction de souris knockout conditionnelles, puis d’obtention du génotype cible des souris par croisement prend beaucoup de temps et nécessite certaines conditions de culture de souris et coûte21,22.

Importance de l’utilisation du mATC dans la recherche sur le cancer de la thyroïde
L’hétérogénéité de la population humaine et la rareté de l’ATC humain entravent l’exploration des mécanismes potentiels et des options thérapeutiques pour l’ATC. En tant que modèle murin fiable, le mATC facilite la collecte des tissus ATC et enrichit le pool d’échantillons de tissus ATC. Le mATC peut également être utilisé pour étudier les effets de fonctions génétiques spécifiques sur l’ATC, étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires du développement de l’ATC, comprendre les mécanismes de progression des tumeurs thyroïdiennes et de résistance aux médicaments et, finalement, améliorer le pronostic des patients ATC16.

Applications futures du mATC
Le mATC peut être utilisé pour la recherche sur divers aspects de la radiothérapie, de la chimiothérapie, de la thérapie génique, de l’immunothérapie et de la thérapie ciblée. mATC peut également être utilisé pour explorer les effets thérapeutiques et les effets indésirables des régimes, tels que les combinaisons entre différents médicaments ou avec la radiothérapie. Nous avons ensuite utilisé le mATC pour étudier les effets thérapeutiques de la radiothérapie combinée à l’immunothérapie et aux médicaments inhibiteurs de petites molécules sur l’ATC. En outre, mATC peut être utilisé pour étudier les effets de diverses modalités ou voies d’administration sur les effets antitumoraux des médicaments afin de développer des systèmes d’administration de médicaments avec une activité antitumorale améliorée. Dans les applications cliniques futures, nous espérons minimiser le taux de récidive et le taux de mortalité des patients atteints d’un cancer de la thyroïde et ainsi améliorer le taux de survie des patients.

Nous nous attendons à ce que davantage de modèles murins ATC soient développés à l’avenir, ainsi que des analyses plus approfondies de l’ATC dans différents contextes génétiques, tels que PTEN et P13K23. Ceux-ci révéleront de manière plus complète le mécanisme moléculaire de la tumorigenèse et de la progression de l’ATC, prédiront le résultat du traitement ATC et pourraient fournir aux patients des cibles thérapeutiques potentielles 24,25,26,27,28. Nous espérons que grâce à une exploration plus expérimentale, nous pourrons améliorer la méthode de modélisation du modèle murin et raccourcir le temps de modélisation pour apporter davantage de contributions à la recherche fondamentale.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le Programme national de développement de la recherche clé de la Chine (2021YFA1301203); la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82103031, 82103918, 81973408, 82272933); le projet d’incubation de recherche clinique, West China Hospital, Université du Sichuan (22HXFH019); le projet de coopération internationale du Bureau municipal de la science et de la technologie de Chengdu (2020-GH02-00017-HZ); Fondation des sciences naturelles du Sichuan, 2022NSFSC1314; le « Projet 1.3.5 pour les disciplines d’excellence, Hôpital de Chine occidentale, Université du Sichuan » (ZYJC18035, ZYJC18025, ZYYC20003, ZYJC18003); et Programme des sciences et technologies du Sichuan (2023YFS0098).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x Citrate antigen retrieval solution (PH 6.0) MXB Cat# MVS-0101
50x EDTA antigen retrieval solution(pH 9.5) ZSGB-GIO Cat# ZLI-9071
Brafflox/wt mice Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Caspase-3 Beyotime Cat# AC033
CD8 Cell Signaling Technology Cat# 98941; RRID:AB_2756376
CD206 Cell Signaling Technology Cat# 24595; RRID:AB_2892682
Chamber for anesthesia induction RWDlifescience
Enhanced DAB chromogenic kit MXB Cat# DAB-2031
Eosin staining solution ZSGB-GIO Cat# ZLI-9613
F4/80 Abcam Cat# 100790; RRID:AB_10675322
Foxp3 Cell Signaling Technology Cat# 12653; RRID:AB_2797979
Fully enclosed tissue dehydrator Leica Biosystems ASP300S
Hematoxylin staining solution ZSGB-GIO Cat# ZLI-9610
HistoCore Arcadia fully automatic tissue embedding machine Leica Biosystems
Ki67 Beyotime Cat# AF1738
Rotating Slicer RWDlifescience  Minux S700
SPlink detection kits (Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems) ZSGB-GIO Cat# SP-9001
TPO-cre/ERT2 mice Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Trp53flox/wt mice Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Ultrasonic cell crusher Ningbo Xinyi Ultrasound Equipment Co., Ltd JY92-IIN
Ultrasound gel Keppler KL-250
Ultrasound system VisualSonics Vevo 3100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
  2. Parenti, R., Salvatorelli, L., Magro, G. Anaplastic thyroid carcinoma: Current treatments and potential new therapeutic options with emphasis on TfR1/CD71. International Journal of Endocrinology. 2014, 685396 (2014).
  3. Baldini, E., et al. In vitro and in vivo effects of the urokinase plasminogen activator inhibitor WX-340 on anaplastic thyroid cancer cell lines. International Journal of Molecular Sciences. 23 (7), 3724 (2022).
  4. Haugen, B. R. American Thyroid Association Management guidelines for adult patients with thyroid nodules and differentiated thyroid cancer: what is new and what has changed. Cancer. 123 (3), 372-381 (2015).
  5. O'Neill, J. P., Shaha, A. R. Anaplastic thyroid cancer. Oral Oncology. 49 (7), 702-706 (2013).
  6. Simoes-Pereira, J., Capitao, R., Limbert, E., Leite, V. Anaplastic thyroid cancer: Clinical picture of the last two decades at a single oncology referral centre and novel therapeutic options. Cancers. 11 (8), 1188 (2019).
  7. Fagin, J. A., Wells, S. A. Biologic and clinical perspectives on thyroid cancer. The New England Journal of Medicine. 375 (11), 1054-1067 (2016).
  8. Neff, R. L., Farrar, W. B., Kloos, R. T., Burman, K. D. Anaplastic thyroid cancer. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 37 (2), 525-538 (2008).
  9. Lareau, C. A., et al. Droplet-based combinatorial indexing for massive-scale single-cell chromatin accessibility. Nature Biotechnology. 37 (8), 916-924 (2019).
  10. Guo, H., et al. Single-cell methylome landscapes of mouse embryonic stem cells and early embryos analyzed using reduced representation bisulfite sequencing. Genome Research. 23 (12), 2126-2135 (2013).
  11. Mooijman, D., Dey, S. S., Boisset, J. -C., Crosetto, N., van Oudenaarden, A. Single-cell 5hmC sequencing reveals chromosome-wide cell-to-cell variability and enables lineage reconstruction. Nature Biotechnology. 34 (8), 852-856 (2016).
  12. Smallridge, R. C., Marlow, L. A., Copland, J. A. Anaplastic thyroid cancer: molecular pathogenesis and emerging therapies. Endocrine-Related Cancer. 16 (1), 17-44 (2009).
  13. Charles, R. -P. Overview of genetically engineered mouse models of papillary and anaplastic thyroid cancers: enabling translational biology for patient care improvement. Current Protocols in Pharmacology. 69, 1-14 (2015).
  14. Tuttle, R. M., Haugen, B., Perrier, N. D. Updated American joint committee on cancer/tumor-nodemetastasis staging system for differentiated and anaplastic thyroid cancer (8th Edition): What changed and why. Thyroid. 27 (6), 751-756 (2017).
  15. McFadden, D. G., et al. p53 constrains progression to anaplastic thyroid carcinoma in a Braf-mutant mouse model of papillary thyroid cancer. Protocols of the National Academy of Sciences. 111 (16), 1600-1609 (2014).
  16. Gunda, V., et al. Combinations of BRAF inhibitor and anti-PD-1/PD-L1 antibody improve survival and tumour immunity in an immunocompetent model of orthotopic murine anaplastic thyroid cancer. British Journal of Cancer. 119 (10), 1223-1232 (2018).
  17. He, Y., et al. High-resolution ultrasonography for the analysis of orthotopic ATC tumors in a genetically engineered mouse model. Journal of Visualized Experiments. (188), e64615 (2022).
  18. Zhang, L., et al. Novel recurrent altered genes in Chinese patients with anaplastic thyroid cancer. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (4), 988-998 (2021).
  19. Luo, H., et al. Pan-cancer single-cell analysis reveals the heterogeneity and plasticity of cancer-associated fibroblasts in the tumor microenvironment. Nature Communications. 13 (1), 6619 (2022).
  20. Luo, H., et al. Characterizing dedifferentiation of thyroid cancer by integrated analysis. Science Advances. 7 (31), (2021).
  21. Knostman, K. A. B., Jhiang, S. M., Capen, C. C. Genetic alterations in thyroid cancer: the role of mouse models. Veterinary Pathology. 44 (1), 1-14 (2007).
  22. Kim, C. S., Zhu, X. Lessons from mouse models of thyroid cancer. Thyroid. 19 (12), 1317-1331 (2009).
  23. Champa, D., Di Cristofano, A. Modeling anaplastic thyroid carcinoma in the mouse. Hormones and Cancer. 6 (1), 37-44 (2015).
  24. Cabanillas, M. E., Ryder, M., Jimenez, C. Targeted therapy for advanced thyroid cancer: kinase inhibitors and beyond. Endocrine Reviews. 40 (6), 1573-1604 (2019).
  25. Ljubas, J., Ovesen, T., Rusan, M. A systematic review of phase II targeted therapy clinical trials in anaplastic thyroid cancer. Cancers. 11 (7), 943 (2019).
  26. Huang, N. -S., et al. An update of the appropriate treatment strategies in anaplastic thyroid cancer: a population-based study of 735 patients. International Journal of Endocrinology. 2019, 8428547 (2019).
  27. Subbiah, V., et al. Dabrafenib and trametinib treatment in patients with locally advanced or metastatic BRAF V600-mutant anaplastic thyroid cancer. Journal of Clinical Oncology. 36 (1), 7-13 (2018).
  28. Baldini, E., et al. Effects of selective inhibitors of Aurora kinases on anaplastic thyroid carcinoma cell lines. Endocrine-Related Cancer. 21 (5), 797-811 (2014).

Tags

Recherche sur le cancer numéro 192
Modèle murin spontané de cancer anaplasique de la thyroïde
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yan, H., Ma, Y., Zhou, X., He, Y.,… More

Yan, H., Ma, Y., Zhou, X., He, Y., Liu, Y., Caulin, C., Wang, L., Xu, H., Luo, H. Spontaneous Murine Model of Anaplastic Thyroid Cancer. J. Vis. Exp. (192), e64607, doi:10.3791/64607 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter