Summary
Burada, spontan genetiği değiştirilmiş fare modelleri ile murin ATC tümörleri elde etmek için standart bir boru hattı sunuyoruz. Ayrıca, primer ve metastaz yapmış lezyonlar hakkında tümör dinamikleri ve patolojik bilgiler sunulmuştur. Bu model, araştırmacıların tümörigenezi anlamalarına ve ilaç keşiflerini kolaylaştırmalarına yardımcı olacaktır.
Abstract
Anaplastik tiroid kanseri (ATK) nadir görülen ancak ölümcül bir malignitedir ve kötü prognoza sahiptir. ATC'nin karsinogenezi ve gelişimi ile terapötik yöntemler hakkında daha derinlemesine araştırmalara acil ihtiyaç vardır, çünkü standart tedaviler ATC hastalarında esasen tükenmektedir. Bununla birlikte, düşük prevalansı kapsamlı klinik çalışmaları ve doku örneklerinin toplanmasını engellemiştir, bu nedenle etkili tedavilerin oluşturulmasında çok az ilerleme kaydedilmiştir. C57BL/6 arka planında koşullu olarak indüklenebilir bir ATC murin modeli (mATC) oluşturmak için genetik mühendisliğini kullandık. ATC murin modeli TPO-cre/ERT2 ile genotiplendirildi; BrafCA/wt; Trp53 ex2-10/ex2-10 ve tamoksifen ile intraperitoneal enjeksiyon ile indüklenir. Murin modeli ile tümör dinamikleri (tümör boyutu 4 aylık indüksiyondan sonra 12.4 mm2 ile 32.5mm2 arasında değişmiştir), sağkalım (medyan sağkalım süresi 130 gün idi) ve metastaz (akciğer metastazları farelerin %91.6'sında meydana geldi) eğrilerini ve patolojik özellikleri (Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67 ve Kaspaz-3 immünohistokimyasal boyama ile karakterize) araştırdık. Sonuçlar, spontan mATC'nin insan ATC tümörlerine oldukça benzer tümör dinamiklerine ve immünolojik mikroçevreye sahip olduğunu göstermiştir. Sonuç olarak, patofizyolojik özellikler ve birleşik genotiplerdeki yüksek benzerlik ile mATC modeli, klinik ATC dokusu ve örnek heterojenitesinin eksikliğini bir dereceye kadar çözmüştür. Bu nedenle, ATK'nın mekanizmasını ve translasyonel çalışmalarını kolaylaştıracak ve ATC için küçük moleküler ilaçların ve immünoterapi ajanlarının tedavi potansiyelini araştırmak için bir yaklaşım sağlayacaktır.
Introduction
Tiroid kanseri, tiroid epiteli kökenini en sık gören endokrin malignitelerden biridir1. Son yıllarda tiroid kanseri insidansı tüm dünyada hızla artmıştır2. Tiroid kanseri, tümör hücresi farklılaşma derecesine göre farklı tiplere ayrılabilir. Klinik davranış ve histoloji temelinde, tiroid karsinomları papiller tiroid karsinomu (PTC) ve foliküler tiroid karsinomu (FTC), kötü diferansiye karsinom (PDTC) ve tiroidin diferansiye edilmemiş veya anaplastik karsinomu (ATC)3 dahil olmak üzere iyi diferansiye karsinomlara ayrılır. Hafif davranışlı ve daha iyi prognozlu4 yaygın bir tip olan PTC'nin aksine, ATC tüm tiroid tümörlerinin %2 ila %3'ünü oluşturan, nadir ve oldukça agresif bir malignitedir5. ATK nadir olmasına rağmen, tiroid kanserine bağlı ölümlerin yaklaşık %50'sinden sorumludur ve kasvetli sağkalım (6-8 ay)6,7. ATC olgularının %50'sinden fazlası akciğer metastazı 8 olarak teşhisedilir. ATC'nin agresif doğasına ek olarak, klinikte sınırlı etkili tedavi geliştirilmiştir. Bu nedenle ATC hastalarının kasvetli prognozu 9,10,11'dir. Bu, ATK'nın gelişiminin ve tedavisinin altında yatan moleküler mekanizmalar hakkında acilen daha derinlemesine çalışmalara ihtiyaç duyulduğunu göstermektedir.
ATC'nin tümörigenezi dinamik bir farklılaşmamış süreçtir. Klinik çalışmaların her aşamasında insan tümör örneklerinin toplanmasındaki zorluk, iyi diferansiye karsinomlardan farklılaşmamış karsinomlara kadar gelişim mekanizmasının anlaşılmasını engellemiştir. Buna karşılık, murin ATC modellerinin (mATC) kullanımı, tüm tümörigenez seyrinde mATC örneklerinin toplanmasını desteklemektedir. Bu nedenle, dinamik farklılaşmamış süreci analiz ederek tümör oluşum mekanizmalarını daha iyi anlayabiliriz. Ek olarak, klinik ATC örneklerinin heterojenliği de moleküler mekanizmanın anlaşılmasındaki zorluğa katkıda bulunmuştur. Bununla birlikte, fareler aynı genetik geçmişleri paylaştılar ve benzer yaşam ortamlarında tutuldular ve her tümörün tutarlılığını sağladılar. Bu, ATC gelişiminin genelleştirilmiş rolünü keşfetmeyi kolaylaştırır12,13,14. Ek olarak, mATC, anatomik lokalizasyonun ve dokuya özgü mikro çevrenin etkisini geri kazanabilen in situ bir tümör modelidir. Bu nedenle, yaygın olarak kullanılan immün yetmezlikli farelerle karşılaştırıldığında, mATC, sağlam bir bağışıklık sistemi ve bağışıklık mikroçevresi olan spontan bir murin modelidir.
Bu nedenle, dediferansiye tiroid karsinomunun patolojik özelliklerini yeniden üretebilen bir murin modeli olan C57BL/6 suşu ile şartlı olarak indüklenen mATC oluşturduk. Bu modele dayanarak, mATC'nin moleküler temeli, yapım fikirleri, patolojik özellikleri ve uygulamaları hakkında kısa bir genel bakış sunduk. Ayrıca tümör büyümesini, sağkalım süresini, metastazını ve mATC'nin patolojik özelliklerini gözlemledik ve raporladık. Bunun, diğer araştırmacıların bu modeli daha kolay kullanmalarına yardımcı olmak için bilgilendirici bir genel bakış olacağına inanıyoruz.
İlk olarak McFadden15 tarafından bildirildiği gibi koşullu indüklenebilir bir mATC modeli oluşturduk; Başlangıçta, fareler inşa ettik: TPO-cre / ERT2, Braf flox / wt ve Trp53flox / wt. Spesifik olarak, TPO-cre / ERT2 fareleri, bir cre-ERT2 füzyon geninin (bir insan östrojen reseptörü ligand bağlanma alanına kaynaşmış bir cre rekombinaz) ekspresyonunu yönlendiren insan tiroid peroksidaz (TPO) promotörünü (tiroide özgü bir promotör) içeriyordu. Cre-ERT2 genellikle sitoplazma ile sınırlıdır ve çekirdeğe sadece tamoksifene maruz kaldığında girer, bu da cre'yi rekombinant enzim aktivitesi göstermeye teşvik eder. Fareler, loxP kanatlı sekanslar taşıyan farelerle çaprazlandığında, tamoksifen indüksiyonundan sonra, kre aracılı rekombinasyon, spesifik genlerde nakavt veya nakavt etme amacına ulaşmak için tiroid hücrelerindeki flokslu dizileri siler.
Ek olarak, Braf flox / wt fareleri, cre-loxP sistemine dayanan insan Braf'ın bir knock-in aleli. Brafflox / wt murin transkripti, endojen ekzonlar 1-14 ve loxP kanatlı insan ekzonları 15-18 tarafından kodlanır. Flokslu bölgelerin kreasyona aracılı eksizyonundan sonra, mutant ekzon 15 (insan kanserlerinde yapısal olarak aktif Braf V600E ile bağlantılı birV600E amino asit ikamesi ile modifiye edilmiş) ve endojen ekzonlar 16-18 transkriptleri oluşturmak için kullanılır. Ayrıca, Trp53 flox / wt fareleri, insan Trp53'ün nakavt alelleridir ve Trp53'ün ekzonları 2-10'u çevreleyen loxP bölgelerine sahiptir. Bir cre rekombinaz ile farelerle çaprazlandığında, cre-mediated rekombinasyon, Trp53'ü nakavt etmek için flokslu diziyi siler. Daha sonra, TB elde etmek için TPO-cre / ERT2, Braf flox / w ve Trp53flox / wt fareleri çaprazlandı (TPO-cre/ ERT2; Braffloks/wt) fareler ve TBP (TPO-cre/ERT2; Braffloks/ağırlık; Trp53floks/ağırlık) PTC ve ATC üretmek için kullanılabilecek fareler. Yaklaşık 8 hafta sonra, fareler, iki uygulama için mısır yağında çözünmüş 150 mg / kg tamoksifenin intraperitoneal (i.p.) uygulaması ile indüklendi. Tümör büyümesi yüksek frekanslı ultrasonografi ile izlenebilir (ultrasonografinin ilk zaman noktası Gün 0 olarak kaydedildi). İlk ultrasonografi tamoksifen girişinden 40 gün sonra yapıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan hayvan prosedürleri, Batı Çin Hastanesi, Sichuan Üniversitesi, Chengdu, Sichuan, Çin Hayvan Etik Komitesi'nin onayı ile gerçekleştirilmiştir.
1. TBP farelerin indüksiyonu
- Farelerin genotipini tanımlayın
- Yaklaşık 3 haftada, dişi fareleri erkek farelerden ayırın. Aynı zamanda, bir kulak etiketini sabitlemek için kulak etiketi kelepçesini kullanın. Kulak etiketlerini kulağın alt yarısına ve orta üçte birine yerleştirin, en yüksek kılcal damar konsantrasyonuna sahip alandan kaçındığınızdan emin olun.
- Fareleri nazikçe ama güvenli bir şekilde kısıtlayın. Fare kuyruğunun tabanına sıkıca tutun. Fareleri kavramalarını sağlayacak bir yüzeye yerleştirin.
- Serbest eli nazikçe ama sıkıca omuzların üzerine yerleştirin, ardından boynun tırnağını başparmak ve işaret parmağı arasında hızlıca kavrayın. Kuyruğu serçe parmağınızla tutun.
- Kuyruğu alkolle sürün. Cilt örneğini <5 mm kesmek için steril makas kullanın ve etiketli temiz bir numune kabına koyun. Farelerin kürkünü çıkarmak gerekli değildir. Hemostaz elde etmek için kuyruğu steril süngerlerle sıkıştırın.
- Daha sonra, murin kuyruğunu lize edin ve genotipi tanımlamak için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gerçekleştirin.
NOT: Bir murin kuyruğunu kestikten sonra, murin kuyrukları arasındaki genlerin karşılıklı kontaminasyonunu önlemek için makasın yüzeyi alkollü pamukla silinmelidir. Onları kafeslerine yerleştirdikten sonra, fareler yara bölgesinde herhangi bir kanama belirtisi aramak için 5 dakika boyunca izlenmelidir. Bu çalışmada kullanılan primerlerin listesi ve PCR ayarları için Tablo 1'e bakın.
- Tamoksifen kaynaklı TBP fareleri
- 0.3 g tamoksifen tartın ve ultrasonla 15 mL mısır yağı içinde çözün (güç =% 20, süre = 20 dakika, sıcaklık = 4 ° C), 20 mg / mL'lik bir konsantrasyonda. 4 °C'de saklayın.
NOT: Tamoksifen ışığa duyarlıdır ve kahverengi bir kaba yerleştirilmesi gerekir. - Yaklaşık 8 haftada, fareleri elektronik terazilerle tartın ve onlara 1 hafta arayla iki kez uygulanan 150 mg / kg'lık bir dozda bir i.p. tamoksifen enjeksiyonu yapın.
- 0.3 g tamoksifen tartın ve ultrasonla 15 mL mısır yağı içinde çözün (güç =% 20, süre = 20 dakika, sıcaklık = 4 ° C), 20 mg / mL'lik bir konsantrasyonda. 4 °C'de saklayın.
2. Fare tiroid tümörlerinin ve metastatik tümörlerin diseksiyonu ve görüntülenmesi
- Hazırlık
- Diseksiyon aletlerini hazırlayın: steril makas ve forseps, steril bıçak,% 75 alkol sprey şişesi, 20 cm düz kenar, vernier kaliperleri, kağıt havlular ve alkol pamuğu.
- Fare doku sabitleme çözeltisi:% 4 paraformaldehit doku sabitleme çözeltisi hazırlayın.
- Geçici doku depolaması için yaklaşık 10 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile doldurulmuş 10 cm'lik bir kabı temizleyin ve doku yüzeyindeki kanı yıkayın.
- Tiroid ekstraksiyonu
- Fareleri karbondioksit ile 5 dakika boyunca 2.0 L / dak akış hızında ötenazi yapın. Fareleri kafesten çıkarın ve servikal çıkık yapın.
- Fareyi diseksiyon tahtasına ventral tarafı yukarı bakacak ve başı deneyciden uzağa yerleştirin ve uzuvları steril şırınga iğneleriyle diseksiyon tahtasına sabitleyin. Tiroid dokusunun daha rahat bir şekilde çıkarılması için, kafayı sabitlemek için başka bir steril şırınga iğnesi kullanın.
- Boynu, bir klorheksidin veya povidon-iyot ovma ve ardından %75 alkol içeren üç alternatif turla dezenfekte edin. Daha sonra, klavikulanın merkezinin üzerinde steril makas ve forseps ile küçük bir kesi yapın.
- Kesi orta hattını ağza kadar devam ettirin. Submandibuler bezi bulun ve tiroid kıkırdak ve trakeanın yanına yerleştirilen tiroidin anatomik yerini ortaya çıkarmak için çıkarın.
- Tiroidi bulun, tiroidi boyun bölgesinin geri kalanından steril makasla dikkatlice diseke edin, ardından çıkarılan tiroidi 10 mL steril PBS ile doldurulmuş 10 cm'lik bir kaba koyun.
NOT: Tiroid bezinin çıkarılması sırasında nazik ve yavaş olun ve boyun kan damarlarını kesmekten kaçının. Boyun damarları kesilirse, boyun hemen kanla doldurulur ve tiroidin anatomik yerini ortaya çıkarmak için kan derhal alkol süngerleriyle çıkarılmalıdır. Tiroid dokusunu çıkarmadan önce, çıkarıldıktan sonra tiroidin sol ve sağ lobları arasında ayrım yapamamak için tiroidin sol ve sağ loblarının özelliklerini (boyut, şekil vb.) dikkatlice gözlemleyin. - Steril PBS'de, kanı tiroid dokusunun yüzeyinden steril makasla çıkarın ve trakeayı dikkatlice kesin. Ardından, tiroid dokusunu steril bir bez üzerine koyun ve tiroid bezinin sol ve sağ loblarının boyutunu vernier kumpaslarla ölçün.
- Tiroid bezinin sol ve sağ loblarını steril bir bıçakla iki parçaya bölün. Bir kısmı fiksasyon için 2 mL% 4 paraformaldehit çözeltisine koyun ve diğer kısmı korumak için sıvı azot içine koyun.
- Akciğer ve karaciğer ekstraksiyonu
- Karnı üç alternatif tur klorheksidin veya povidon-iyot ovma ve% 75 alkol ile dezenfekte edin. Ardından, farenin penisinin hemen üstüne sıkıştırın ve küçük bir kesi yapın, karın orta çizgisi boyunca subklaviyen kemiğe kesin ve karın boşluğunu açığa çıkarın.
- Karaciğeri karnın üst kısmında bulun ve dikkatlice çıkarın. Karaciğeri steril PBS'ye yerleştirin.
- Göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için diyaframı kaburgalar boyunca dikkatlice kesin. Ardından, sternumu tutun ve alanı daha da genişletmek için yukarı çekin. Akciğeri bulun ve çıkarın. Çıkarılan akciğeri steril PBS'ye koyun.
- Akciğer ve karaciğerde metastaz olup olmadığını büyük ölçüde gözlemleyin. Metastaz sayısını sayın ve dijital bir kayıt alın. Bundan sonra, akciğer ve karaciğer dokularını iki parçaya bölmek için steril bir bıçak kullanın. Bir kısmı fiksasyon için 3 mL% 4 paraformaldehit çözeltisine ve diğer bir kısmı da muhafaza için sıvı azot içine koyun.
- Doku dehidrasyonu
- Dokuları dehidrasyon kutusuna koyun. Dehidrasyon kutusunu aşağıdaki gibi gradyan alkol dehidrasyonunda sepete koyun: 1 saat boyunca% 70 alkol; 1 saat boyunca% 80 alkol; 30 dakika boyunca% 95 alkol; 30 dakika boyunca% 95 alkol; 30 dakika boyunca susuz etanol I; 30 dakika boyunca susuz etanol II; 20 dakika boyunca ksilen I; 20 dakika boyunca ksilen II; 30 dakika boyunca parafin balmumu I; 1 saat boyunca parafin balmumu II; 30 dakika boyunca parafin balmumu III.
- Balmumu emdirilmiş dokuları gömme makinesine gömün.
- Erimiş balmumunu önce gömme çerçevesine koyun. Balmumu katılaşmadan önce, dokuyu dehidrasyon kutusundan çıkarın ve gömme çerçevesine koyun, ardından etiketi takın.
- Balmumunun dondurma masasında -20 ° C'de soğumasını bekleyin. Balmumu katılaştıktan sonra, balmumu bloğunu gömme çerçevesinden çıkarın ve kırpın.
- Kesilmiş balmumu bloğunu, 5 μm kalınlığında ve 2 cm x 2 cm boyutlarında ayarlanmış bir parafin dilimleyici üzerine yerleştirin. Kesitlemeden sonra, dokuyu düzleştirmek için bölümlerin 45 ° C'de ılık suyla bir yayıcı üzerinde yüzmesine izin verin. Dokuyu bir slaytla alın ve dilimleri 65 ° C'de bir fırında 2 saat pişirin.
- Su kuruduktan ve balmumu eridikten sonra, slaytı dokuyla birlikte çıkarın ve hematoksilin ve eozin (HE) ve immünohistokimyasal (IHC) boyama16 için kullanın. Bölümlerin boyama için slaytlara yapıştırıldığından emin olun.
3. Primer tümör ve akciğerin HE boyanması
- Mum Giderme
- Slaytları bölümlerle birlikte 10 dakika boyunca ksilen içine koyun.
- Her biri yaklaşık 3 dakika boyunca susuz alkole (% 100) (iki şişe) geçin.
- Her biri yaklaşık 3 dakika boyunca% 95 alkole (iki şişe) geçin.
- Yaklaşık 3 dakika boyunca% 80 alkole geçin.
- Yaklaşık 3 dakika boyunca% 50 alkole geçin.
- Musluk suyuna gidin ve alkolü yaklaşık 1 dakika yıkayın.
- Boy -ama
- Slaytları 8 dakika boyunca hematoksilin içine taşıyın.
- Hematoksilin'i yıkamak için slaytları 1 dakika suya taşıyın; doku maviden kırmızıya değişir.
- Slaytları yaklaşık 30 s boyunca% 1 hidroklorik asit alkolüne taşıyın.
- Slaytları suya taşıyın, 5 dakika yıkayın.
- Slaytları 90 saniye boyunca eozin'e taşıyın, ardından 5 dakika boyunca suyla yıkayın.
- Slaytları her biri 1 dakika boyunca %50 alkol, %80 alkol, %95 alkol (iki şişe) ve susuz alkol (%100) (iki şişe) olarak hareket ettirin.
- Slaytları 5 dakika boyunca ksilen içine taşıyın.
- Slaytlar kuruduktan sonra, nötr reçine ile kapatın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tümör büyümesini, fare sağkalım süresini ve patolojik özellikleri araştırmak için mATC'yi indükledik. İndüksiyondan sonra, fareler derhal kurban edildi ve aşağıdaki durumlardan biri bulunduğunda örnekler (tiroid, akciğer ve karaciğer) toplandı: 1) tümör kompresyonunun neden olduğu solunum sıkıntısı; 2) iştah azalması ve anormal seslendirme; 3) alışılmadık uyuşukluk; ve 4) %20'nin üzerinde vücut ağırlığı kaybı. Örnekleme işlemi sırasında, tüm farelerin (12/12) indüksiyondan sonra başarılı bir şekilde tümör oluşturduğunu bulduk. Farenin sağkalım süresini, tümör özelliklerini/boyutunu ve metastaz yapmış lezyonları kaydettik.
Brüt olarak, aşağıdakileri gözlemledik: 1) tümörler hassastı ve sol ve sağ taraftaki tümörlerin büyüklüğü tutarsızdı; 2) Çoğu farede (11/12) akciğer metastazı vardı, ancak hiçbirinde karaciğer metastazı yoktu. Spesifik olarak, tümör boyutu tüm süreç boyunca hayvan yüksek frekanslı ultrason ve fotoakustik görüntüleme sistemleri (Vevo®3100) tarafından izlendi17. Ultrason verilerine dayanarak, tümör boyutunun dinamik değişimini gözlemlemek için tümör büyüme eğrisi (Şekil 1A) çizildi. Ayrıca, tümörler erken evrede yavaş yavaş büyüdü (ortalama tümör boyutu 0. Günden 60. Güne kadar 9.47mm2 ila 11.75 mm 2 arasında değişiyordu) ve geç evrede önemli ölçüde daha hızlı hale geldi (ortalama tümör boyutu 11.75 mm 2 ila 23.95 mm2 arasında değişiyordu (60. Günden 100. Güne). Çoğu fare geç aşamada kurban edildi. Kısacası, belirli bir tümör gecikme süresine sahip mATC'nin, boğulmaya bağlı ölümü önlemek için 60 gün sonra yakından izlenmesi gerekir.
Öte yandan, farelerin hayatta kalma süresi kaydedildi ve bir hayatta kalma eğrisi (Şekil 1B) çizildi. mATC'nin medyan sağkalımı 56-166 gün arasında değişen 130 gündü. Ek olarak, çoğu mATC'de (yaklaşık% 92) akciğer metastazı bulundu (Şekil 1C). Bu kohortta sadece bir farenin brüt muayenede akciğer metastazı göstermediğini ve altı farede birden fazla akciğer metastatik lezyonu olduğunu gözlemledik. Karaciğer metastazı saptanmadı. Kısacası, bu sonuçlar kliniklerde akciğer metastazı eğilimli olan ATC'nin biyolojik davranışı ile tutarlıydı.
Ayrıca, mATC'nin dinamik sürecini daha iyi gözlemlemek için, fareleri iki zaman noktasında (indüksiyondan 1 ay ve 2 ay sonra) feda ettik. mATK'nın primer tümörleri ve metastatik akciğer dokularında HE boyama uyguladık (Şekil 1D). 1 aylık indüklenebilir dokuda eksik katılaşmış özellikler ve foliküler yapılar ile malign hücrelerin bir arada varlığını gözlemledik. Tiroid foliküler yapıları kayboldu ve tümör 2 aylık bir indüksiyondan sonra tamamen katılaştı. Primer tümörün HE boyaması, tümör hücrelerinin morfolojik olarak farklı olduğunu, pleomorfik dev hücrelerin (kırmızı bir okla gösterilir) ve iğ şeklindeki hücrelerin (sarı bir okla gösterilir) olduğunu ortaya koymuştur. Aynı zamanda nükleer boyutta çok çeşitli gösterdi ve birçok hücre birden fazla çekirdek içeriyordu. Akciğerde açık metastatik odaklar (daire ile gösterilen) görüldü. Metastatik akciğer dokularının HE boyanması, normal akciğer dokusunun berrak alveoler yapılara ve hava boşluklarına sahip retiküler bir yapı olduğunu gösterdi. Bununla birlikte, akciğer metastazları normal retiküler yapı kaybı, hava boşluğu kalınlaşması ve akciğer parankimini gösterdi.
Bu arada, hücre proliferasyonunu ve apoptozu ölçmek ve lenfositlerin, T-düzenli (Treg) hücrelerin ve miyeloid hücrelerin infiltrasyonunu araştırmak için mATC tümörlerini (Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67 ve Caspase-3) daha da karakterize etmek ve lenfositlerin, T-düzenli (Treg) hücrelerin ve miyeloid hücrelerin infiltrasyonunu araştırmak için IHC boyama yapıldı (Şekil 2A-D). Anti-Ki67 boyaması,% 86.9 ila% 95.07 arasında değişen ve yüksek derecede hücre proliferasyonu gösteren oldukça pozitifti. Anti-aktive kaspaz-3 antikoru, %5.2 ile %51.9 arasında değişen apoptoz oranını test etmek için kullanıldı. Spesifik olarak, mATC, oranı% 0.47 ila% 10.55 arasında değişen belirgin CD8 + T hücre infiltrasyonu sundu (ortalama: % 5.93). Bu, mATC'nin ATC örnekleriyle tutarlı bir immün çöl tümörü olmadığını gösterdi. Ayrıca, Foxp3 boyaması,% 0.45 ila% 25.8 arasında değişen Treg hücrelerini tanımladı. Lenfositlere ek olarak, makrofajları ve M2 makrofajlarını tanımlamak için sırasıyla F4/80 ve Cd206 kullanıldı. Miyeloid hücrelerin tümörlere yaygın olarak sızdığını bulduk (F4/80 pozitif hücre oranı% 86.6'dan% 94.6'ya; Cd206 pozitif hücre oranı% 40.4'ten% 67.7'ye), önceki literatürle tutarlı olan16. Kısacası, mATC'de klinik örneklerle tutarlı olan oldukça proliferatif tümör hücreleri, lenfosit infiltrasyonu ve miyeloid hücrelerin yaygın infiltrasyonunu bulduk.
Sonuç olarak, mATC örnekleri tümör dinamikleri, metastaz ve patolojik özelliklerde klinik örneklerle uyumlu homojenlik göstermiştir. Tümör oluşum hızı göz önüne alındığında mATC güvenilir bir murin modeliydi.
Resim 1: Tümör dinamiği ve patolojik özellikleri. (A) Farelerin tümör büyüme eğrisi (n = 5). Her satır bir fareyi temsil eder: erken aşama 0. Gün ile 60. Gün arasında değişir ve geç aşama 60. Gün ile 100. Gün arasında değişir. (B) Farelerin hayatta kalma eğrileri (n = 12). mATC'nin medyan sağkalımı 56 gün ile 166 gün arasında değişen 130 gün idi. (C) Farelerin akciğer metastazı eğrileri (n = 12). Tiroid ve akciğer metastazlarının temsili diseksiyon görüntüleri. Kırmızı ok tiroid tümörünü gösterir ve beyaz daire akciğerdeki metastazı gösterir. (D) Primer tümörün HE boyaması (indüksiyondan 1 ay ve 2 ay sonra) ve akciğer metastazı. Kırmızı ok pleomorfik dev hücreyi, sarı ok iğ şeklindeki hücreyi ve daire içine alınmış alan akciğerde bir metastazı gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: mATC'de immün hücre infiltrasyonunun kısa açıklaması. (A) ATC murin primer tümörlerinin antikorlarla immünohistokimyasal boyanması (Cd8, Foxp3). Kırmızı ok CD8 pozitif hücreyi, sarı ok ise Foxp3 pozitif hücreyi gösterir. (B) ATC murin primer tümörlerinin antikorlarla immünohistokimyasal boyanması (Ki67, Kaspaz-3). (C) ATC murin primer tümörlerinin antikorlarla immünohistokimyasal boyanması (F4/80, Cd206). (D) İHK'nın nicelleştirilmesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan primerlerin listesi ve PCR ayarları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tiroid tümörü diseksiyonu için protokol dahilinde kritik adımlar
Diseksiyon sırasında, tiroid bezinin anatomik yerinin doğru anlaşılması gerekir. Tiroid bezi, submandibuler bezin dorsal tarafında, tiroid kıkırdağı ve trakeaya yakın bir yerde bulunan kelebek şeklinde bir bezdir. İşlem sırasında, boynun her iki tarafındaki kan arterlerinin kesilmesinden dikkatlice kaçınıldı.
mATC ırkının değiştirilmesi ve sorun giderilmesi
ATC nadir görülen ve oldukça agresif bir malignitedir. mATC ve ATC hastalarının klinik özellikleri bazı benzerliklere sahiptir. Spesifik olarak, mATC'de başlıca ölüm nedeni, ATC hastalarıyla tutarlı olan boğulmadır. Bu nedenle, deney sırasında, aşağıdakilere dikkat edilmelidir: 1) fareleri nazikçe kavrayın ve operasyon sırasında solunumlarına dikkat edin; 2) ani ölümü ve numunelerin zamanında alınamaması için geç aşamada yakından izlemek; 3) Tiroid ve akciğer dokuları, gözlem ve fotoğraf için dokuların yüzeyindeki kandan kolayca etkilenir, bu nedenle farelerin kan hacmi göz küresi enükleasyonu ile azaltılabilir.
mATC kullanımının sınırlamaları
İnsan ATC'sinin oluşumu ve gelişimi karmaşık ve değişkendir, ancak mATC'nin genetik arka planı nispeten basittir, bu da insan ATC'sinin yalnızca bir bölümünü simüle edebilir. Örneğin, bazı ATC dokuları, farklı tümörigenez mekanizmalarına ve klinik patolojik özelliklere sahip olabilen P53 mutasyonları yerine, NOTCH2NL kopya sayısı varyantı 18 olan TERT ve BRAF mutasyonlarını barındırmıştır 7,19,20. Ek olarak, ATC genellikle tanıdan önce uzun bir zaman seyrine sahiptir, ancak mATC 2 aylık bir indüksiyondan sonra tanı alır. Bu nedenle, mATC ve insan tiroid kanseri arasında doğal farklılıklar vardır, hayvan modelleri insan tiroid kanserinin tüm özelliklerini tam olarak taklit edemez ve insanlarla sınırlı olan birçok tedavi mATC üzerinde değerlendirilemez. Ayrıca, mATC, çeşitli küçük moleküllü ilaçların terapötik etkilerini araştırmak için kullanılabilse de, özellikle fareler için çeşitli biyolojikler (örneğin, antikor veya antikorla ilgili ilaçlar) tasarlanmalıdır. Ek olarak, koşullu nakavt fareleri oluşturma ve daha sonra melezleme yoluyla farelerin hedef genotipini elde etme sürecinin tamamı uzun zaman alır ve belirli fare kültürü koşulları gerektirir ve21,22 maliyetlidir.
Tiroid kanseri araştırmalarında mATC kullanımının önemi
İnsan popülasyonunun heterojenliği ve insan ATC'sinin nadirliği, ATC için potansiyel mekanizmaların ve terapötik seçeneklerin araştırılmasını engellemektedir. Güvenilir bir fare modeli olarak mATC, ATC dokularının toplanmasını kolaylaştırır ve ATC doku örnek havuzunu zenginleştirir. mATC ayrıca spesifik gen fonksiyonlarının ATC üzerindeki etkilerini incelemek, ATC gelişiminin hücresel ve moleküler mekanizmalarını incelemek, tiroid tümörü progresyonu ve ilaç direnci mekanizmalarını anlamak ve sonuçta ATC hastalarının prognozunu iyileştirmek için de kullanılabilir16.
mATC'nin gelecekteki uygulamaları
mATC, radyoterapi, kemoterapi, gen tedavisi, immünoterapi ve hedefe yönelik tedavinin çeşitli yönleri üzerine araştırmalar yapmak için kullanılabilir. mATC, farklı ilaçlar arasındaki kombinasyonlar veya radyoterapi gibi rejimlerin terapötik etkilerini ve yan etkilerini araştırmak için de kullanılabilir. Daha sonra, immünoterapi ve küçük molekül inhibitörü ilaçlarla birlikte radyoterapinin ATC üzerindeki terapötik etkilerini araştırmak için mATC'yi kullandık. Ek olarak, mATC, çeşitli dağıtım yöntemlerinin veya yollarının ilaçların antitümör etkileri üzerindeki etkilerini araştırmak ve antitümör aktivitesini artırmış ilaç dağıtım sistemleri geliştirmek için kullanılabilir. Gelecekteki klinik uygulamalarda, tiroid kanseri hastalarının nüks oranını ve mortalite oranını en aza indirmeyi ve böylece hastaların sağkalım oranlarını iyileştirmeyi umuyoruz.
Gelecekte daha fazla ATC murin modelinin geliştirilmesini ve PTEN ve P13K23 gibi farklı genetik arka planlarda ATC'nin daha derinlemesine analizlerinin yapılmasını bekliyoruz. Bunlar, ATC tümörigenezinin ve progresyonunun moleküler mekanizmasını daha kapsamlı bir şekilde ortaya koyacak, ATC tedavisinin sonucunu tahmin edecek ve hastalara potansiyel terapötik hedefler sağlayabilir 24,25,26,27,28. Daha deneysel araştırmalarla, fare modelinin modelleme yöntemini geliştirebileceğimizi ve temel araştırmalara daha fazla katkıda bulunmak için modelleme süresini kısaltabileceğimizi umuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edecekleri çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma Çin Ulusal Anahtar Araştırma Geliştirme Programı (2021YFA1301203) tarafından desteklenmiştir; Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82103031, 82103918, 81973408, 82272933); Klinik Araştırma Kuluçka Projesi, Batı Çin Hastanesi, Sichuan Üniversitesi (22HXFH019); Chengdu Belediyesi Bilim ve Teknoloji Bürosu Uluslararası İşbirliği Projesi (2020-GH02-00017-HZ); Sichuan Doğa Bilimleri Vakfı, 2022NSFSC1314; "1.3.5 mükemmellik disiplinleri projesi, Batı Çin Hastanesi, Sichuan Üniversitesi" (ZYJC18035, ZYJC18025, ZYYC20003, ZYJC18003); ve Sichuan Bilim ve Teknoloji Programı (2023YFS0098).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x Citrate antigen retrieval solution (PH 6.0) | MXB | Cat# MVS-0101 | |
| 50x EDTA antigen retrieval solution(pH 9.5) | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9071 | |
| Brafflox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Caspase-3 | Beyotime | Cat# AC033 | |
| CD8 | Cell Signaling Technology | Cat# 98941; RRID:AB_2756376 | |
| CD206 | Cell Signaling Technology | Cat# 24595; RRID:AB_2892682 | |
| Chamber for anesthesia induction | RWDlifescience | ||
| Enhanced DAB chromogenic kit | MXB | Cat# DAB-2031 | |
| Eosin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9613 | |
| F4/80 | Abcam | Cat# 100790; RRID:AB_10675322 | |
| Foxp3 | Cell Signaling Technology | Cat# 12653; RRID:AB_2797979 | |
| Fully enclosed tissue dehydrator | Leica Biosystems | ASP300S | |
| Hematoxylin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9610 | |
| HistoCore Arcadia fully automatic tissue embedding machine | Leica Biosystems | ||
| Ki67 | Beyotime | Cat# AF1738 | |
| Rotating Slicer | RWDlifescience | Minux S700 | |
| SPlink detection kits (Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems) | ZSGB-GIO | Cat# SP-9001 | |
| TPO-cre/ERT2 mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Trp53flox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Ultrasonic cell crusher | Ningbo Xinyi Ultrasound Equipment Co., Ltd | JY92-IIN | |
| Ultrasound gel | Keppler | KL-250 | |
| Ultrasound system | VisualSonics | Vevo 3100 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Parenti, R., Salvatorelli, L., Magro, G. Anaplastic thyroid carcinoma: Current treatments and potential new therapeutic options with emphasis on TfR1/CD71. International Journal of Endocrinology. 2014, 685396 (2014).
- Baldini, E., et al. In vitro and in vivo effects of the urokinase plasminogen activator inhibitor WX-340 on anaplastic thyroid cancer cell lines. International Journal of Molecular Sciences. 23 (7), 3724 (2022).
- Haugen, B. R. American Thyroid Association Management guidelines for adult patients with thyroid nodules and differentiated thyroid cancer: what is new and what has changed. Cancer. 123 (3), 372-381 (2015).
- O'Neill, J. P., Shaha, A. R.
- Simoes-Pereira, J., Capitao, R., Limbert, E., Leite, V. Anaplastic thyroid cancer: Clinical picture of the last two decades at a single oncology referral centre and novel therapeutic options. Cancers. 11 (8), 1188 (2019).
- Fagin, J. A., Wells, S. A. Biologic and clinical perspectives on thyroid cancer. The New England Journal of Medicine. 375 (11), 1054-1067 (2016).
- Neff, R. L., Farrar, W. B., Kloos, R. T., Burman, K. D.
- Lareau, C. A., et al. Droplet-based combinatorial indexing for massive-scale single-cell chromatin accessibility. Nature Biotechnology. 37 (8), 916-924 (2019).
- Guo, H., et al. Single-cell methylome landscapes of mouse embryonic stem cells and early embryos analyzed using reduced representation bisulfite sequencing. Genome Research. 23 (12), 2126-2135 (2013).
- Mooijman, D., Dey, S. S., Boisset, J. -C., Crosetto, N., van Oudenaarden, A. Single-cell 5hmC sequencing reveals chromosome-wide cell-to-cell variability and enables lineage reconstruction. Nature Biotechnology. 34 (8), 852-856 (2016).
- Smallridge, R. C., Marlow, L. A., Copland, J. A. Anaplastic thyroid cancer: molecular pathogenesis and emerging therapies. Endocrine-Related Cancer. 16 (1), 17-44 (2009).
- Charles, R. -P. Overview of genetically engineered mouse models of papillary and anaplastic thyroid cancers: enabling translational biology for patient care improvement. Current Protocols in Pharmacology. 69, 1-14 (2015).
- Tuttle, R. M., Haugen, B., Perrier, N. D. Updated American joint committee on cancer/tumor-nodemetastasis staging system for differentiated and anaplastic thyroid cancer (8th Edition): What changed and why. Thyroid. 27 (6), 751-756 (2017).
- McFadden, D. G., et al. p53 constrains progression to anaplastic thyroid carcinoma in a Braf-mutant mouse model of papillary thyroid cancer. Protocols of the National Academy of Sciences. 111 (16), 1600-1609 (2014).
- Gunda, V., et al. Combinations of BRAF inhibitor and anti-PD-1/PD-L1 antibody improve survival and tumour immunity in an immunocompetent model of orthotopic murine anaplastic thyroid cancer. British Journal of Cancer. 119 (10), 1223-1232 (2018).
- He, Y., et al. High-resolution ultrasonography for the analysis of orthotopic ATC tumors in a genetically engineered mouse model. Journal of Visualized Experiments. (188), e64615 (2022).
- Zhang, L., et al. Novel recurrent altered genes in Chinese patients with anaplastic thyroid cancer. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (4), 988-998 (2021).
- Luo, H., et al. Pan-cancer single-cell analysis reveals the heterogeneity and plasticity of cancer-associated fibroblasts in the tumor microenvironment. Nature Communications. 13 (1), 6619 (2022).
- Luo, H., et al. Characterizing dedifferentiation of thyroid cancer by integrated analysis. Science Advances. 7 (31), (2021).
- Knostman, K. A. B., Jhiang, S. M., Capen, C. C. Genetic alterations in thyroid cancer: the role of mouse models. Veterinary Pathology. 44 (1), 1-14 (2007).
- Kim, C. S., Zhu, X. Lessons from mouse models of thyroid cancer. Thyroid. 19 (12), 1317-1331 (2009).
- Champa, D., Di Cristofano, A. Modeling anaplastic thyroid carcinoma in the mouse. Hormones and Cancer. 6 (1), 37-44 (2015).
- Cabanillas, M. E., Ryder, M., Jimenez, C. Targeted therapy for advanced thyroid cancer: kinase inhibitors and beyond. Endocrine Reviews. 40 (6), 1573-1604 (2019).
- Ljubas, J., Ovesen, T., Rusan, M. A systematic review of phase II targeted therapy clinical trials in anaplastic thyroid cancer. Cancers. 11 (7), 943 (2019).
- Huang, N. -S., et al. An update of the appropriate treatment strategies in anaplastic thyroid cancer: a population-based study of 735 patients. International Journal of Endocrinology. 2019, 8428547 (2019).
- Subbiah, V., et al. Dabrafenib and trametinib treatment in patients with locally advanced or metastatic BRAF V600-mutant anaplastic thyroid cancer. Journal of Clinical Oncology. 36 (1), 7-13 (2018).
- Baldini, E., et al. Effects of selective inhibitors of Aurora kinases on anaplastic thyroid carcinoma cell lines. Endocrine-Related Cancer. 21 (5), 797-811 (2014).
