Summary
在这里，我们提出了一种通过自发基因工程小鼠模型获得鼠ATC肿瘤的标准管道。此外，我们呈现有关原发性和转移性病变的肿瘤动力学和病理信息。该模型将帮助研究人员了解肿瘤发生并促进药物发现。
Abstract
间变性甲状腺癌（ATC）是一种罕见但致命的恶性肿瘤，预后令人沮丧。迫切需要对ATC的致癌作用和发展以及治疗方法进行更深入的研究，因为ATC患者的标准治疗基本上已经耗尽。然而，低患病率阻碍了彻底的临床研究和组织样本的收集，因此在创造有效治疗方法方面进展甚微。我们使用基因工程在C57BL / 6背景中创建条件诱导的ATC小鼠模型（mATC）。ATC小鼠模型通过TPO-cre/ERT2进行基因分型;布拉夫CA/wt;Trp53ex2-10 / ex2-10并通过腹腔注射他莫昔芬诱导。使用小鼠模型，我们研究了肿瘤动力学（诱导4个月后肿瘤大小范围为12.4mm 2至32.5mm2），生存（中位生存期为130天）和转移（91.6%的小鼠发生肺转移）曲线和病理特征（以Cd8，Foxp3，F4 / 80，Cd206，Ki67和Caspase-3免疫组织化学染色为特征）。结果表明，自发性mATC具有与人ATC肿瘤高度相似的肿瘤动力学和免疫微环境。综上所述，mATC模型具有较高的病理生理特征相似性和统一的基因型，在一定程度上解决了临床ATC组织和样本异质性的不足。因此，它将有助于ATC的机制和转化研究，并为研究ATC的小分子药物和免疫治疗剂的治疗潜力提供途径。
Introduction
甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤之一1，起源于甲状腺上皮。近年来，全球甲状腺癌的发病率迅速上升2。甲状腺癌根据肿瘤细胞分化程度可分为不同的类型。根据临床行为和组织学，甲状腺癌分为高分化癌，包括甲状腺状癌（PTC）和滤泡性甲状腺癌（FTC）、低分化癌（PDTC）和未分化或间变性甲状腺癌（ATC）3。PTC是一种行为温和、预后较好的常见类型4，而PTC是一种罕见且高度侵袭性的恶性肿瘤，占所有甲状腺肿瘤的2%至3%5。虽然ATC很少见，但它导致大约50%的甲状腺癌相关死亡，生存率低（6-8个月）6,7。超过 50% 的 ATC 病例被诊断为肺转移8.除了ATC的侵袭性外，临床上还开发了有限的有效治疗方法。因此，ATC患者的预后为9,10,11。这表明迫切需要对ATC发展和治疗的分子机制进行进一步深入研究。
ATC的肿瘤发生是一个动态的去分化过程。临床研究每个阶段收集人类肿瘤样本的困难阻碍了对从高分化到未分化癌的发展机制的理解。相比之下，小鼠ATC模型（mATC）的使用有利于在整个肿瘤发生过程中收集mATC样本。因此，通过分析动态去分化过程，我们可以更好地了解肿瘤形成的机制。此外，临床ATC样本的异质性也导致了分子机制理解的困难。然而，小鼠具有相同的遗传背景，并保持在相似的生活环境中，确保每个肿瘤的一致性。这有助于探索ATC发展的普遍作用12,13,14。此外，mATC是一种原位肿瘤模型，可以恢复解剖位置和组织特异性微环境的影响。因此，与常用的免疫缺陷小鼠相比，mATC是一种自发的小鼠模型，具有完整的免疫系统和免疫微环境。
因此，我们用C57BL / 6菌株构建了条件诱导的mATC，这是一种能够再现去分化甲状腺癌病理特征的小鼠模型。基于该模型，本文简要概述了mATC的分子基础、构建思路、病理特征和应用。此外，我们观察并报告了mATC的肿瘤生长，存活时间，转移和病理特征。我们相信这将是一个信息概述，以帮助其他研究人员更轻松地使用该模型。
我们构建了一个条件诱导mATC模型，如McFadden15首次报道的那样;最初，我们构建了小鼠：TPO-cre / ERT2，Braf flox / wt和Trp53flox / wt。 具体而言，TPO-cre / ERT2小鼠包括人甲状腺过氧化物酶（TPO）启动子（甲状腺特异性启动子），驱动cre-ERT2融合基因（融合到人雌激素受体配体结合域的cre重组酶）的表达。Cre-ERT2通常局限于细胞质中，只有在暴露于他莫昔芬时才进入细胞核，他莫昔芬诱导cre发挥重组酶活性。当小鼠与携带loxP侧翼序列的小鼠杂交时，他莫昔芬诱导后，cre介导的重组删除甲状腺细胞中的絮状序列，以达到敲除或敲除特定基因的目的。
此外，Brafflox/wt小鼠是基于cre-loxP系统的人类Braf的敲入等位基因。Brafflox/wt 鼠转录本由内源性外显子 1-14 和 loxP 侧翼人外显子 15-18 编码。在Cre介导的絮状区域切除后，突变外显子15（用与人类癌症中组成活性Braf V600E连接的V600E氨基酸取代物修饰）和内源性外显子16-18用于生成转录本。此外，Trp53 flox/wt小鼠是人类Trp53的敲除等位基因，并且在Trp53的外显子2-10侧翼具有loxP位点。当与具有cre重组酶的小鼠杂交时，cre介导的重组删除絮状序列以敲除Trp53。然后，将TPO-cre/ERT2、Braf flox/w和Trp53flox/wt小鼠杂交以获得TB（TPO-cre/ERT2;布拉夫弗洛克斯/重量）小鼠和TBP（TPO-cre/ERT2;布拉夫絮絮/重量;Trp53flox/wt）小鼠，可用于产生PTC和ATC。大约8周后，通过腹膜内（ip）施用溶解在玉米油中的150mg / kg他莫昔芬诱导小鼠两次给药。肿瘤生长可以通过高频超声检查监测（超声检查的第一个时间点记录在第0天）。引入他莫昔芬后 40 天进行初始超声检查。
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Protocol
此处描述的动物程序是在四川大学华西医院动物伦理委员会（中国四川省成都）的批准下进行的。
1.诱导TBP小鼠
- 鉴定小鼠基因型
- 在大约3周时，将雌性小鼠与雄性小鼠分开。同时，使用耳标夹固定耳标。将耳标放在耳朵的下半部分和中间三分之一处，确保避开毛细血管浓度最高的区域。
- 轻柔但安全地约束小鼠。牢牢抓住鼠标尾巴的底部。将鼠标放在允许它们抓握的表面上。
- 轻轻但坚定地将空闲的手放在肩膀上，然后用拇指和食指快速抓住脖子的脖子。用小指握住尾巴。
- 用酒精擦拭尾巴。使用无菌剪刀剪下皮肤样品<5毫米，然后将其放入带有标签的干净样品容器中。没有必要去除小鼠的皮毛。用无菌海绵压缩尾巴以达到止血效果。
- 接下来，裂解鼠尾巴并进行聚合酶链反应（PCR）以鉴定基因型。
注意：剪下一条鼠尾巴后，必须用酒精棉擦拭剪刀表面，以避免鼠尾巴之间的基因相互污染。将它们放入笼子后，必须观察小鼠5分钟以寻找伤口部位的任何出血迹象。有关本研究中使用的引物列表和PCR设置，请参阅 表1 。
- 他莫昔芬诱导的TBP小鼠
- 称取0.3g他莫昔芬，并通过超声将其溶解在15mL玉米油中（功率= 20%，持续时间= 20分钟，温度= 4°C），浓度为20mg / mL。储存在4°C。
注意：他莫昔芬对光敏感，需要放在棕色容器中。 - 在大约8周时，用电子秤称量小鼠，并以150mg / kg的剂量腹膜注射他莫昔芬，间隔1周施用两次。
- 称取0.3g他莫昔芬，并通过超声将其溶解在15mL玉米油中（功率= 20%，持续时间= 20分钟，温度= 4°C），浓度为20mg / mL。储存在4°C。
2.小鼠甲状腺肿瘤和转移性肿瘤的解剖和成像
- 制备
- 准备解剖工具：无菌剪刀和镊子，无菌刀片，75%酒精喷雾瓶，20厘米直尺，游标卡尺，纸巾和酒精棉。
- 小鼠组织固定液：配制4%多聚甲醛组织固定液。
- 清洁装有约 10 mL 无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 的 10 厘米培养皿，用于临时组织储存，并清洗组织表面的血液。
- 甲状腺摘除术
- 用二氧化碳以2.0L / min的流速对小鼠实施安乐死5分钟。将小鼠从笼子中取出并进行颈椎脱位。
- 将鼠标放在解剖板上，腹侧朝上，头部远离实验者，并用无菌注射器针将四肢固定在解剖板上。为了更方便地切除甲状腺组织，请使用另一根无菌注射器针头固定头部。
- 用三轮交替的洗必泰或聚维酮碘磨砂膏消毒颈部，然后用 75% 的酒精消毒。然后，用无菌剪刀和镊子在锁骨中心上方做一个小切口。
- 继续切口中线直到嘴巴。找到下颌下腺并将其切除以暴露甲状腺的解剖位置，该位置位于甲状腺软骨和气管附近。
- 找到甲状腺，用无菌剪刀小心地将甲状腺与颈部的其余部分解剖，然后将切除的甲状腺放入装有 10 mL 无菌 PBS 的 10 厘米培养皿中。
注意：在切除甲状腺时，要轻柔缓慢，避免割伤颈部血管。如果颈部血管被切断，颈部会立即充满血液，必须及时用酒精海绵去除血液，以暴露甲状腺的解剖位置。在切除甲状腺组织之前，请仔细观察甲状腺左右叶的特征（大小、形状等），以免切除后无法区分甲状腺的左右叶。 - 在无菌PBS中，用无菌剪刀从甲状腺组织表面取出血液，并小心地切断气管。然后，将甲状腺组织放在无菌布上，并用游标卡尺测量甲状腺左右叶的大小。
- 用无菌刀片将甲状腺的左叶和右叶分成两部分。将一部分放入2 mL的4%多聚甲醛溶液中固定，另一部分放入液氮中保存。
- 提取肺和肝
- 用三轮交替的洗必泰或聚维酮碘磨砂膏和75%酒精对腹部进行消毒。然后，捏住小鼠阴茎上方并做一个小切口，沿着腹部中线切到锁骨下骨，并露出腹腔。
- 找到腹部上部的肝脏并小心地将其取出。将肝脏放入无菌PBS中。
- 小心地沿着肋骨切割横膈膜以露出胸腔。接下来，抓住胸骨并向上拉以进一步扩大空间。找到肺并将其取出。将取出的肺放入无菌PBS中。
- 粗略观察肺和肝是否有转移。计算转移的数量并记录数字记录。之后，使用无菌刀片将肺和肝组织分成两部分。将一部分放入 3 mL 的 4% 多聚甲醛溶液中进行固定，另一部分放入液氮中保存。
- 组织脱水
- 将纸巾放入脱水盒中。将脱水盒以渐变酒精脱水的方式放入篮子中，如下所示：70%酒精1小时;80%酒精1小时;95%酒精30分钟;95%酒精30分钟;无水乙醇I30分钟;无水乙醇II30分钟;二甲苯I20分钟;二甲苯II20分钟;石蜡I30分钟;石蜡II1小时;石蜡III30分钟。
- 将蜡浸渍的组织嵌入包埋机中。
- 首先将融化的蜡放入包埋框架中。在蜡凝固之前，从脱水盒中取出组织并将其放入包埋架中，然后贴上标签。
- 让蜡在冷冻台上冷却至-20°C。蜡凝固后，从嵌入框架上取下蜡块并修剪它。
- 将修剪好的蜡块放在石蜡切片机上，厚度设置为5μm，尺寸为2cm x 2cm。切片后，让切片漂浮在45°C的温水吊具上以使组织变平。用载玻片拿起纸巾，在65°C的烤箱中烘烤切片2小时。
- 水干燥并且蜡融化后，用组织取出载玻片，并将其用于苏木精和伊红（HE）和免疫组织化学（IHC）染色16。确保切片粘附在载玻片上进行染色。
3.原发肿瘤和肺部HE染色
- 脱 蜡
- 将切片放入二甲苯中10分钟。
- 移入无水酒精（100%）（两瓶）中，每瓶约3分钟。
- 放入95%酒精（两瓶）中，每瓶约3分钟。
- 放入80%酒精中约3分钟。
- 放入50%酒精中约3分钟。
- 放入自来水中，洗去酒精约1分钟。
- 染色
- 将载玻片移入苏木精中8分钟。
- 将载玻片移入水中1分钟以洗去苏木精;组织从蓝色变为红色。
- 将载玻片放入1%盐酸醇中约30秒。
- 将载玻片移入水中，洗涤5分钟。
- 将载玻片放入伊红中90秒，然后用水洗涤5分钟。
- 将载玻片放入50%酒精，80%酒精，95%酒精（两瓶）和无水酒精（100%）（两瓶）中，每次1分钟。
- 将载玻片移入二甲苯中5分钟。
- 载玻片干燥后，用中性树脂密封。
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Representative Results
我们诱导mATC研究肿瘤生长，小鼠存活时间和病理特征。诱导后立即处死小鼠，一旦发现以下情况之一，就收集样品（甲状腺，肺和肝脏）：1）肿瘤压迫引起的呼吸窘迫;2）食欲下降，发声异常;3）异常嗜睡;4）体重减轻20%以上。在采样过程中，我们发现所有小鼠（12/12）在诱导后成功形成肿瘤。我们记录了小鼠的存活时间、肿瘤特征/大小和转移病变。
大体上观察到以下情况：1）肿瘤触痛，左右两侧肿瘤大小不一致;2）大多数小鼠（11/12）有肺转移，但没有一只有肝转移。具体而言，在整个过程中通过动物高频超声和光声成像系统（Vevo®3100）监测肿瘤大小17。根据超声数据绘制肿瘤生长曲线（图1A）以观察肿瘤大小的动态变化。此外，肿瘤在早期生长缓慢（从第0天到第60天，平均肿瘤大小从9.47mm 2到11.75mm 2不等），并且在晚期变得显着加快（平均肿瘤大小从11.75mm 2到23.95mm 2（从第60天到第100天）。大多数小鼠在晚期被处死。总之，具有一定肿瘤潜伏期的mATC需要在60天后密切监测，以防止窒息相关的死亡。
另一方面，记录小鼠的存活时间，并绘制存活曲线（图1B）。mATC的中位生存期为130天，范围为56-166天。此外，在大多数mATC（约92%）中发现肺转移（图1C）。我们观察到，该队列中只有一只小鼠在大体检查中没有显示肺转移，六只小鼠有一个以上的肺转移病变。未发现肝转移。简而言之，这些结果与临床中容易发生肺转移的ATC的生物学行为一致。
此外，为了更好地观察mATC的动态过程，我们在两个时间点（诱导后1个月和2个月）处死小鼠。我们对mATC的原发性肿瘤和转移性肺组织进行了HE染色（图1D）。在1个月的诱导组织中，我们观察到不完整的凝固特征以及滤泡结构和恶性细胞的共存。甲状腺滤泡结构消失，诱导2个月后肿瘤完全固化。原发肿瘤HE染色显示肿瘤细胞形态多样，具有多形性巨细胞（用红色箭头表示）和纺锤形细胞（用黄色箭头表示）。它还显示出多种多样的核大小，许多细胞含有多个细胞核。在肺中可见明显的转移灶（用圆圈表示）。转移性肺组织的HE染色显示，正常肺组织为网状结构，肺泡结构和气腔清晰。然而，肺转移显示正常网状结构丧失、气腔增厚和肺实质。
同时，进行IHC染色以进一步表征（Cd8，Foxp3，F4 / 80，Cd206，Ki67和Caspase-3）mATC肿瘤以量化细胞增殖和凋亡，并研究淋巴细胞，T规则（Treg）细胞和骨髓细胞的浸润（图2A-D）。抗Ki67染色呈高度阳性，范围为86.9%至95.07%，显示出高度的细胞增殖。使用抗活化的半胱天冬酶-3抗体测试细胞凋亡率，范围为5.2%至51.9%。具体而言，mATC呈现明显的CD8 + T细胞浸润，其比例范围为0.47%至10.55%（平均值：5.93%）。这表明mATC不是免疫沙漠肿瘤，这与ATC样本一致。此外，Foxp3染色定义了Treg细胞，其变化从0.45%到25.8%不等。除淋巴细胞外，F4/80和Cd206分别用于定义巨噬细胞和M2巨噬细胞。我们发现髓系细胞广泛浸润肿瘤（F4/80阳性细胞率从86.6%降至94.6%;Cd206阳性细胞率由40.4%提高到67.7%），这与以往文献16一致。简而言之，我们在mATC中发现了高度增殖的肿瘤细胞，淋巴细胞浸润和髓系细胞的广泛浸润，这与临床样本一致。
综上所述，mATC样本在肿瘤动力学、转移和病理特征方面表现出同质性，与临床样本一致。考虑到肿瘤形成速率，mATC是一种可靠的小鼠模型。
图1：肿瘤动力学和病理特征。 （A）小鼠肿瘤生长曲线（n = 5）。每条线代表一只老鼠：早期阶段从第 0 天到第 60 天，后期从第 60 天到第 100 天。（B）小鼠的存活曲线（n = 12）。mATC的中位生存期为130天，范围从56天到166天不等。（C）小鼠的肺转移曲线（n = 12）。甲状腺和肺转移的代表性解剖图像。红色箭头表示甲状腺肿瘤，白色圆圈表示肺转移。（D）原发肿瘤的HE染色（诱导后1个月和2个月）和肺转移。红色箭头表示多形性巨细胞，黄色箭头表示纺锤形细胞，圆圈区域表示肺转移。 请点击此处查看此图的大图。
图2：mATC中免疫细胞浸润的简要说明。 （A）用抗体对ATC鼠原发性肿瘤进行免疫组织化学染色（Cd8，Foxp3）。红色箭头表示CD8阳性细胞，黄色箭头表示Foxp3阳性细胞。（B）用抗体对ATC鼠原发性肿瘤进行免疫组织化学染色（Ki67，半胱天冬酶-3）。（C）用抗体对ATC鼠原发性肿瘤进行免疫组织化学染色（F4 / 80，Cd206）。（D） IHC的量化。 请点击此处查看此图的大图。
表1：本研究中使用的引物列表和PCR设置。请按此下载此表格。
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Discussion
甲状腺肿瘤清扫方案中的关键步骤
在解剖过程中，需要正确了解甲状腺的解剖位置。甲状腺是位于下颌下腺背侧靠近甲状腺软骨和气管的蝴蝶状腺体。在手术过程中，小心翼翼地避免切断颈部两侧的血动脉。
mATC品种的修改和故障排除
ATC是一种罕见且高度侵袭性的恶性肿瘤。mATC和ATC患者的临床特征有一定的相似之处。具体而言，mATC死亡的主要原因是窒息，这与ATC患者一致。因此，在实验过程中应注意以下几点：1）轻轻抓住小鼠，并在操作过程中注意它们的呼吸;2）后期密切监测，防止猝死和未能及时取样;3）甲状腺和肺组织容易受到组织表面血液的影响进行观察和摄影，因此可以通过眼球摘除术减少小鼠的血容量。
使用mATC的限制
人类ATC的发生和发展复杂多变，但mATC的遗传背景相对简单，只能模拟一部分人类ATC。例如，一些ATC组织携带TERT和BRAF突变，NOTCH2NL拷贝数变异18，而不是P53突变，其可能具有不同的肿瘤发生机制和临床病理特征7,19,20。此外，ATC 在诊断前通常具有较长的病程，但 mATC 在诱导 2 个月后获得诊断。因此，mATC与人类甲状腺癌之间存在固有的区别，动物模型无法完全模仿人类甲状腺癌的所有特征，许多仅限于人类的疗法无法在mATC上进行评估。此外，尽管mATC可用于研究各种小分子药物的治疗效果，但应专门为小鼠设计几种生物制剂（例如抗体或抗体相关药物）。此外，构建条件基因敲除小鼠，然后通过杂交获得小鼠靶基因型的整个过程需要很长时间，并且需要一定的小鼠培养条件和成本21,22。
在甲状腺癌研究中使用mATC的意义
人群的异质性和人类ATC的罕见性阻碍了对ATC潜在机制和治疗选择的探索。作为一种可靠的小鼠模型，mATC有助于收集ATC组织并丰富ATC组织样本库。mATC还可用于研究特定基因功能对ATC的影响，研究ATC发展的细胞和分子机制，了解甲状腺肿瘤进展和耐药的机制，最终改善ATC患者的预后16。
mATC的未来应用
mATC可用于放疗、化疗、基因治疗、免疫治疗和靶向治疗的各个方面的研究。mATC也可用于探索方案的治疗效果和不良反应，例如不同药物之间的组合或与放疗的组合。随后，我们利用mATC研究了放疗联合免疫治疗和小分子抑制剂药物对ATC的治疗效果。此外，mATC可用于研究各种递送方式或途径对药物抗肿瘤作用的影响，以开发具有增强抗肿瘤活性的药物递送系统。在未来的临床应用中，我们希望最大限度地降低甲状腺癌患者的复发率和死亡率，从而提高患者的生存率。
我们预计未来将开发更多的ATC小鼠模型，以及对不同遗传背景（如PTEN和P13K23）的ATC进行更深入的分析。这些将更全面地揭示ATC肿瘤发生和进展的分子机制，预测ATC治疗的结果，并可为患者提供潜在的治疗靶点24,25,26,27,28。我们希望通过更多的实验探索，改进小鼠模型的建模方法，缩短建模时间，为基础研究做出更多贡献。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要声明。
Acknowledgments
这项工作得到了国家重点研究发展计划（2021YFA1301203）的支持;国家自然科学基金（82103031,82103918,81973408,82272933）;四川大学华西医院临床研究孵化项目（22HXFH019）;成都市科技局国际合作项目（2020-GH02-00017-HZ）;四川省自然科学基金， 2022NSFSC1314;“四川大学华西医院优秀学科1.3.5项目”（ZYJC18035、ZYJC18025、ZYYC20003、ZYJC18003）;四川省科技计划（2023YFS0098）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x Citrate antigen retrieval solution (PH 6.0) | MXB | Cat# MVS-0101 | |
| 50x EDTA antigen retrieval solution(pH 9.5) | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9071 | |
| Brafflox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Caspase-3 | Beyotime | Cat# AC033 | |
| CD8 | Cell Signaling Technology | Cat# 98941; RRID:AB_2756376 | |
| CD206 | Cell Signaling Technology | Cat# 24595; RRID:AB_2892682 | |
| Chamber for anesthesia induction | RWDlifescience | ||
| Enhanced DAB chromogenic kit | MXB | Cat# DAB-2031 | |
| Eosin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9613 | |
| F4/80 | Abcam | Cat# 100790; RRID:AB_10675322 | |
| Foxp3 | Cell Signaling Technology | Cat# 12653; RRID:AB_2797979 | |
| Fully enclosed tissue dehydrator | Leica Biosystems | ASP300S | |
| Hematoxylin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9610 | |
| HistoCore Arcadia fully automatic tissue embedding machine | Leica Biosystems | ||
| Ki67 | Beyotime | Cat# AF1738 | |
| Rotating Slicer | RWDlifescience | Minux S700 | |
| SPlink detection kits (Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems) | ZSGB-GIO | Cat# SP-9001 | |
| TPO-cre/ERT2 mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Trp53flox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Ultrasonic cell crusher | Ningbo Xinyi Ultrasound Equipment Co., Ltd | JY92-IIN | |
| Ultrasound gel | Keppler | KL-250 | |
| Ultrasound system | VisualSonics | Vevo 3100 |
References
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