Summary
Qui, presentiamo una pipeline standard per ottenere tumori ATC murini da modelli murini di topi geneticamente modificati. Inoltre, presentiamo dinamiche tumorali e informazioni patologiche sulle lesioni primarie e metastatizzate. Questo modello aiuterà i ricercatori a comprendere la tumorigenesi e facilitare le scoperte di farmaci.
Abstract
Il carcinoma anaplastico della tiroide (ATC) è un tumore maligno raro ma letale con una prognosi infausta. Vi è un urgente bisogno di ricerche più approfondite sulla cancerogenesi e lo sviluppo dell'ATC, nonché sui metodi terapeutici, poiché i trattamenti standard sono essenzialmente esauriti nei pazienti con ATC. Tuttavia, la bassa prevalenza ha ostacolato studi clinici approfonditi e la raccolta di campioni di tessuto, quindi sono stati raggiunti pochi progressi nella creazione di trattamenti efficaci. Abbiamo usato l'ingegneria genetica per creare un modello murino ATC condizionatamente inducibile (mATC) in uno sfondo C57BL / 6. Il modello murino ATC è stato genotipizzato mediante TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Trp53 ex2-10/ex2-10 e indotto mediante iniezione intraperitoneale con tamoxifene. Con il modello murino, abbiamo studiato la dinamica del tumore (la dimensione del tumore variava da 12,4 mm 2 a 32,5 mm2 dopo 4 mesi di induzione), la sopravvivenza (il periodo di sopravvivenza mediano era di 130 giorni) e le metastasi (metastasi polmonari si sono verificate nel 91,6% dei topi) le curve e le caratteristiche patologiche (caratterizzate da Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67 e Caspasi-3 colorazione immunoistochimica). I risultati hanno indicato che il mATC spontaneo possiede dinamiche tumorali e microambiente immunologico altamente simili ai tumori ATC umani. In conclusione, con un'elevata somiglianza nelle caratteristiche fisiopatologiche e nei genotipi unificati, il modello mATC ha risolto in una certa misura la carenza di tessuto ATC clinico e l'eterogeneità del campione. Pertanto, faciliterebbe il meccanismo e gli studi traslazionali dell'ATC e fornirebbe un approccio per studiare il potenziale di trattamento di piccoli farmaci molecolari e agenti immunoterapici per ATC.
Introduction
Il cancro della tiroide è una delle neoplasie endocrine più comuni1, originata dall'epitelio tiroideo. Negli ultimi anni, l'incidenza del cancro alla tiroide è aumentata rapidamente in tutto il mondo2. Il cancro della tiroide può essere suddiviso in tipi distinti in base al grado di differenziazione delle cellule tumorali. Sulla base del comportamento clinico e dell'istologia, i carcinomi tiroidei si dividono in carcinomi ben differenziati, tra cui carcinoma papillare della tiroide (PTC) e carcinoma follicolare della tiroide (FTC), carcinoma scarsamente differenziato (PDTC) e carcinoma indifferenziato o anaplastico della tiroide (ATC)3. A differenza del PTC, che è un tipo comune con comportamento lieve e prognosi migliore4, l'ATC è un tumore maligno raro e altamente aggressivo che rappresenta dal 2% al 3% di tutti i tumori della tiroide5. Sebbene l'ATC sia raro, è responsabile di circa il 50% dei decessi correlati al cancro della tiroide, con una triste sopravvivenza (6-8 mesi)6,7. Oltre il 50% dei casi di ATC viene diagnosticato come metastasi polmonare8. Oltre alla natura aggressiva dell'ATC, nella clinica è stato sviluppato un trattamento efficace limitato. Pertanto, i pazienti ATC hanno una prognosi infausta 9,10,11. Ciò suggerisce che sono urgentemente necessari ulteriori studi approfonditi sui meccanismi molecolari alla base dello sviluppo dell'ATC e del trattamento.
La tumorigenesi dell'ATC è un processo dinamico dedifferenziato. La difficoltà di raccogliere campioni di tumore umano in ogni fase degli studi clinici ha ostacolato la comprensione del meccanismo di sviluppo dai carcinomi ben differenziati a quelli indifferenziati. Al contrario, l'uso di modelli ATC murini (mATC) favorisce la raccolta di campioni mATC nell'intero corso di tumorigenesi. Pertanto, possiamo comprendere meglio i meccanismi di formazione del tumore analizzando il processo dinamico dedifferenziato. Inoltre, l'eterogeneità dei campioni clinici di ATC ha anche contribuito alla difficoltà di comprensione del meccanismo molecolare. Tuttavia, i topi condividevano gli stessi background genetici e sono stati mantenuti in ambienti di vita simili, garantendo la consistenza di ciascun tumore. Ciò facilita l'esplorazione del ruolo generalizzato dello sviluppo ATC12,13,14. Inoltre, mATC è un modello tumorale in situ che può ripristinare l'influenza della posizione anatomica e del microambiente tessuto-specifico. Come tale, rispetto ai topi immunodeficienti comunemente usati, mATC è un modello murino spontaneo con un sistema immunitario intatto e un microambiente immunitario.
Pertanto, abbiamo costruito mATC indotto condizionatamente con il ceppo C57BL / 6, che è un modello murino in grado di riprodurre le caratteristiche patologiche del carcinoma tiroideo dedifferenziato. Sulla base di questo modello, abbiamo fornito una breve panoramica delle basi molecolari, delle idee costruttive, delle caratteristiche patologiche e delle applicazioni di mATC. Inoltre, abbiamo osservato e riportato la crescita tumorale, il tempo di sopravvivenza, le metastasi e le caratteristiche patologiche di mATC. Riteniamo che questa sarà una panoramica informatica per aiutare altri ricercatori a utilizzare questo modello più facilmente.
Abbiamo costruito un modello mATC inducibile condizionale, come riportato per la prima volta da McFadden15; inizialmente, abbiamo costruito topi: TPO-cre / ERT2, Braf flox / wt e Trp53flox / wt. In particolare, i topi TPO-cre / ERT2 includevano il promotore della perossidasi tiroidea umana (TPO) (un promotore specifico della tiroide), guidando l'espressione di un gene di fusione cre-ERT2 (una cre ricombinasi fusa a un dominio di legame del ligando del recettore degli estrogeni umano). Cre-ERT2 è solitamente confinato al citoplasma ed entra nel nucleo solo quando esposto al tamoxifene, che induce cre ad esercitare attività enzimatica ricombinante. Quando i topi sono incrociati con topi portatori di sequenze affiancate da loxP, dopo l'induzione del tamoxifene, la ricombinazione cre-mediata elimina le sequenze floxate nelle cellule tiroidee per raggiungere lo scopo di knocking out o knocking in geni specifici.
Inoltre, i topi Braf flox/wt sono un allele knock-in di Braf umano basato sul sistema cre-loxP. Il trascritto murino Brafflox/wt è codificato dagli esoni endogeni 1-14 e dagli esoni umani 15-18 fiancheggiati da loxP. Dopo l'escissione cre-mediata delle regioni floxate, l'esone mutante 15 (modificato con una sostituzione aminoacidica V600E legata a BrafV600E costitutivamente attivo nei tumori umani) e gli esoni endogeni 16-18 vengono utilizzati per generare i trascritti. Inoltre, i topi Trp53 flox/wt sono alleli knockout di Trp53 umano e hanno siti loxP che fiancheggiano gli esoni 2-10 di Trp53. Quando incrociata con topi con una cre ricombinasi, la ricombinazione cre-mediata elimina la sequenza floxata per mettere fuori combattimento Trp53. Quindi, i topi TPO-cre/ERT2, Braf flox/w e Trp53flox/wt sono stati incrociati per ottenere TB (TPO-cre/ERT2; Brafflox/wt) topi e TBP (TPO-cre/ERT2; Brafflox/wt; Trp53flox/wt) topi, che potrebbero essere utilizzati per generare PTC e ATC. Dopo circa 8 settimane, i topi sono stati indotti da una somministrazione intraperitoneale (i.p.) di 150 mg / kg di tamoxifene sciolto in olio di mais per due somministrazioni. La crescita del tumore potrebbe essere monitorata mediante ecografia ad alta frequenza (il primo punto temporale dell'ecografia è stato registrato come Giorno 0). L'ecografia iniziale è stata eseguita 40 giorni dopo l'introduzione del tamoxifene.
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Protocol
Le procedure animali qui descritte sono state eseguite con l'approvazione del Comitato etico animale dell'ospedale della Cina occidentale, Università del Sichuan, Chengdu, Sichuan, Cina.
1. Induzione di topi TBP
- Identificare il genotipo dei topi
- A circa 3 settimane, separare i topi femmina dai topi maschi. Allo stesso tempo, utilizzare il morsetto del marchio auricolare per fissare un marchio auricolare. Posizionare i marchi auricolari nella metà inferiore e sul terzo centrale dell'orecchio, assicurandosi di evitare l'area con la più alta concentrazione di capillari.
- Trattenere delicatamente ma saldamente i topi. Afferrare saldamente alla base della coda del topo. Posiziona i topi su una superficie che permetta loro di afferrare.
- Posizionare delicatamente ma saldamente la mano libera sulle spalle, quindi afferrare rapidamente la collottola del collo tra il pollice e l'indice. Tieni la coda con il mignolo.
- Tamponare la coda con alcool. Utilizzare forbici sterili per tagliare il campione di pelle <5 mm e metterlo in un contenitore pulito con un'etichetta. Non è necessario rimuovere la pelliccia dei topi. Comprimi la coda con spugne sterili per ottenere l'emostasi.
- Successivamente, lisare la coda murina ed eseguire la reazione a catena della polimerasi (PCR) per identificare il genotipo.
NOTA: Dopo aver tagliato una coda murina, la superficie delle forbici deve essere pulita con cotone alcool per evitare la contaminazione reciproca dei geni tra le code murine. Dopo averli messi nella loro gabbia, i topi devono essere osservati per 5 minuti per cercare eventuali segni di sanguinamento nel sito della ferita. Fare riferimento alla Tabella 1 per l'elenco dei primer e le impostazioni PCR utilizzate in questo studio.
- Topi TBP indotti da tamoxifene
- Pesare 0,3 g di tamoxifene e scioglierlo in 15 ml di olio di mais mediante ultrasuoni (potenza = 20%, durata = 20 min, temperatura = 4 °C), ad una concentrazione di 20 mg/ml. Conservare a 4 °C.
NOTA: Il tamoxifene è sensibile alla luce e deve essere posto in un contenitore marrone. - A circa 8 settimane, pesare i topi con bilance elettroniche e somministrare loro un'iniezione endovenosa di tamoxifene alla dose di 150 mg / kg, somministrata due volte con un intervallo di 1 settimana.
- Pesare 0,3 g di tamoxifene e scioglierlo in 15 ml di olio di mais mediante ultrasuoni (potenza = 20%, durata = 20 min, temperatura = 4 °C), ad una concentrazione di 20 mg/ml. Conservare a 4 °C.
2. Dissezione e imaging di tumori tiroidei di topo e tumori metastatici
- Preparazione
- Preparare gli strumenti di dissezione: forbici e pinze sterili, lama sterile, flacone spray alcolico al 75%, 20 cm straightedge, calibri vernier, tovaglioli di carta e cotone alcolico.
- Soluzione di fissaggio del tessuto di topo: preparare la soluzione di fissaggio del tessuto paraformaldeide al 4%.
- Pulire un piatto di 10 cm riempito con circa 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS) per la conservazione temporanea dei tessuti e lavare il sangue sulla superficie del tessuto.
- Estrazione tiroidea
- Eutanasia dei topi con anidride carbonica ad una portata di 2,0 L/min per 5 minuti. Rimuovere i topi dalla gabbia ed eseguire la dislocazione cervicale.
- Posizionare il mouse sulla tavola da dissezione con il lato ventrale rivolto verso l'alto e la testa lontana dallo sperimentatore e fissare gli arti sulla tavola da dissezione con aghi sterili per siringhe. Per una rimozione più conveniente del tessuto tiroideo, utilizzare un altro ago da siringa sterile per fissare la testa.
- Disinfettare il collo con tre cicli alternati di uno scrub alla clorexidina o allo iodio povidone seguito da alcool al 75%. Quindi, fare una piccola incisione sopra il centro della clavicola con forbici sterili e pinze.
- Continuare l'incisione mediana fino alla bocca. Trova la ghiandola sottomandibolare e rimuoverla per esporre la posizione anatomica della tiroide, che è posizionata vicino alla cartilagine tiroidea e alla trachea.
- Trova la tiroide, seziona attentamente la tiroide dal resto della regione del collo con forbici sterili, quindi metti la tiroide rimossa in un piatto di 10 cm riempito con 10 ml di PBS sterile.
NOTA: Durante la rimozione della ghiandola tiroidea, essere delicati e lenti ed evitare di tagliare i vasi sanguigni del collo. Se i vasi del collo vengono tagliati, il collo sarà immediatamente riempito di sangue e il sangue deve essere prontamente rimosso con spugne alcoliche per esporre la posizione anatomica della tiroide. Prima di rimuovere il tessuto tiroideo, osservare attentamente le caratteristiche dei lobi sinistro e destro della tiroide (dimensioni, forma, ecc.) per evitare di non essere in grado di distinguere tra i lobi sinistro e destro della tiroide dopo la rimozione. - Nel PBS sterile, rimuovere il sangue dalla superficie del tessuto tiroideo con forbici sterili e tagliare con cura la trachea. Quindi, mettere il tessuto tiroideo su un panno sterile e misurare le dimensioni dei lobi sinistro e destro della ghiandola tiroidea con calibri vernier.
- Dividere i lobi sinistro e destro della ghiandola tiroidea in due parti con una lama sterile. Mettere una parte in 2 ml di soluzione di paraformaldeide al 4% per la fissazione e mettere l'altra parte in azoto liquido per la conservazione.
- Estrazione di polmone e fegato
- Disinfettare l'addome con tre cicli alternati di uno scrub alla clorexidina o povidone-iodio e alcool al 75%. Quindi, pizzicare appena sopra il pene del topo e fare una piccola incisione, tagliare lungo la linea mediana dell'addome fino all'osso succlavia ed esporre la cavità addominale.
- Trova il fegato nella parte superiore dell'addome e rimuovilo con cura. Posizionare il fegato in PBS sterile.
- Tagliare con cura il diaframma lungo le costole per esporre la cavità toracica. Quindi, afferrare lo sterno e tirare verso l'alto per allargare ancora di più lo spazio. Trova il polmone e rimuovilo. Mettere il polmone rimosso in PBS sterile.
- Osservare grossolanamente se ci sono metastasi nel polmone e nel fegato. Conta il numero di metastasi e prendi un record digitale. Successivamente, utilizzare una lama sterile per dividere i tessuti polmonari ed epatici in due parti. Mettere una parte in 3 ml di soluzione di paraformaldeide al 4% per la fissazione e un'altra parte in azoto liquido per la conservazione.
- Disidratazione dei tessuti
- Metti i fazzoletti nella scatola di disidratazione. Metti la scatola di disidratazione nel cestino a disidratazione alcolica gradiente come segue: 70% di alcol per 1 ora; 80% di alcol per 1 ora; 95% di alcol per 30 min; 95% di alcol per 30 min; etanolo anidro I per 30 min; etanolo anidro II per 30 min; xilene I per 20 min; xilene II per 20 min; cera di paraffina I per 30 min; cera di paraffina II per 1 ora; cera di paraffina III per 30 min.
- Incorporare i tessuti impregnati di cera nella macchina incorporatrice.
- Metti prima la cera fusa nella cornice di incorporazione. Prima che la cera si solidifichi, rimuovere il tessuto dalla scatola di disidratazione e inserirlo nel telaio incorporato, quindi attaccare l'etichetta.
- Lasciare raffreddare la cera a -20 °C sul tavolo da congelamento. Dopo che la cera si è solidificata, rimuovere il blocco di cera dal telaio incorporato e tagliarlo.
- Posizionare il blocco di cera tagliato su un'affettatrice di paraffina, impostata su uno spessore di 5 μm e una dimensione di 2 cm x 2 cm. Dopo il sezionamento, lasciare galleggiare le sezioni su uno spandiconcime con acqua calda a 45 °C per appiattire il tessuto. Raccogliere il fazzoletto con un vetrino e cuocere le fette in forno a 65 °C per 2 ore.
- Dopo che l'acqua si asciuga e la cera si scioglie, rimuovere il vetrino con il tessuto e utilizzarlo per la colorazione di ematossilina ed eosina (HE) e immunoistochimica (IHC)16. Assicurarsi che le sezioni siano aderenti alle diapositive per la colorazione.
3. Colorazione HE del tumore primario e del polmone
- Sparaffinante
- Mettere le diapositive con le sezioni in xilene per 10 min.
- Passare in alcool anidro (100%) (due bottiglie) per circa 3 minuti ciascuna.
- Passare all'alcool al 95% (due bottiglie) per circa 3 minuti ciascuna.
- Passare all'alcol all'80% per circa 3 minuti.
- Passare all'alcool al 50% per circa 3 minuti.
- Passare all'acqua del rubinetto e lavare via l'alcol per circa 1 minuto.
- Macchiatura
- Spostare i vetrini in ematossilina per 8 minuti.
- Spostare i vetrini nell'acqua per 1 minuto per lavare via l'ematossilina; Il tessuto cambia da blu a rosso.
- Spostare i vetrini in alcool cloridrico all'1% per circa 30 s.
- Spostare gli scivoli in acqua, lavando per 5 minuti.
- Spostare i vetrini in eosina per 90 secondi, quindi lavarli con acqua per 5 minuti.
- Spostare le diapositive in alcool al 50%, alcol all'80%, alcol al 95% (due bottiglie) e alcol anidro (100%) (due bottiglie), per 1 minuto ciascuna.
- Spostare i vetrini in xilene per 5 minuti.
- Dopo che i vetrini sono asciutti, sigillarli con resina neutra.
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Representative Results
Abbiamo indotto mATC a studiare la crescita del tumore, il tempo di sopravvivenza del topo e le caratteristiche patologiche. Dopo l'induzione, i topi sono stati immediatamente sacrificati e sono stati raccolti campioni (tiroide, polmone e fegato) una volta trovata una delle seguenti condizioni: 1) distress respiratorio causato dalla compressione tumorale; 2) diminuzione dell'appetito e vocalizzazione anormale; 3) insolitamente letargia; e 4) perdita di peso corporeo superiore al 20%. Durante il processo di campionamento, abbiamo scoperto che tutti i topi (12/12) hanno formato con successo tumori dopo l'induzione. Abbiamo registrato il tempo di sopravvivenza del topo, le caratteristiche / dimensioni del tumore e le lesioni metastatizzate.
Grossolanamente, abbiamo osservato quanto segue: 1) i tumori erano teneri e le dimensioni dei tumori sui lati sinistro e destro erano incoerenti; 2) La maggior parte dei topi (11/12) aveva metastasi polmonari, ma nessuno aveva metastasi epatiche. In particolare, la dimensione del tumore è stata monitorata da sistemi di imaging ecografico e fotoacustico ad alta frequenza animale (Vevo®3100) durante l'intero processo17. Sulla base dei dati ecografici, la curva di crescita tumorale (Figura 1A) è stata tracciata per osservare l'alterazione dinamica delle dimensioni del tumore. Inoltre, i tumori sono cresciuti lentamente nella fase iniziale (la dimensione media del tumore variava da 9,47 mm 2 a 11,75 mm 2 dal giorno 0 al giorno 60) e sono diventati drammaticamente più veloci nella fase avanzata (la dimensione media del tumore variava da 11,75 mm 2 a 23,95 mm 2 (dal giorno 60 al giorno 100). La maggior parte dei topi sono stati sacrificati nella fase avanzata. In breve, mATC con un certo periodo di latenza tumorale deve essere attentamente monitorato dopo 60 giorni per prevenire la morte correlata all'asfissia.
D'altra parte, è stato registrato il tempo di sopravvivenza dei topi ed è stata tracciata una curva di sopravvivenza (Figura 1B). La sopravvivenza mediana di mATC è stata di 130 giorni, compresa tra 56 e 166 giorni. Inoltre, metastasi polmonari sono state trovate nella maggior parte dei mATC (circa il 92%) (Figura 1C). Abbiamo osservato che solo un topo in questa coorte non mostrava metastasi polmonari all'esame grossolano e sei topi avevano più di una lesione metastatica polmonare. Non sono state riscontrate metastasi epatiche. In breve, questi risultati erano coerenti con il comportamento biologico degli ATC, che sono inclini a metastasi polmonari nelle cliniche.
Inoltre, per osservare meglio il processo dinamico di mATC, abbiamo sacrificato i topi in due punti temporali (1 mese e 2 mesi dopo l'induzione). Abbiamo eseguito la colorazione HE sui tumori primari e sui tessuti polmonari metastatici di mATC (Figura 1D). Nel tessuto inducibile di 1 mese, abbiamo osservato caratteristiche solidificate incomplete e la coesistenza di strutture follicolari e cellule maligne. Le strutture follicolari tiroidee sono scomparse e il tumore si è solidificato completamente dopo un'induzione di 2 mesi. La colorazione HE del tumore primario ha rivelato che le cellule tumorali erano morfologicamente diverse, con cellule giganti pleomorfe (indicate da una freccia rossa) e cellule a forma di fuso (indicate da una freccia gialla). Ha anche mostrato un'ampia varietà di dimensioni nucleari e molte cellule contenevano nuclei multipli. Focolai metastatici chiari (indicati da un cerchio) sono stati osservati nel polmone. La colorazione HE dei tessuti polmonari metastatici ha mostrato che il tessuto polmonare normale era una struttura reticolare con strutture alveolari e spazi aerei chiari. Tuttavia, le metastasi polmonari hanno mostrato una perdita della normale struttura reticolare, ispessimento della cavità aerea e parenchima polmonare.
Nel frattempo, la colorazione IHC è stata eseguita per caratterizzare ulteriormente (Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67 e Caspase-3) i tumori mATC per quantificare la proliferazione cellulare e l'apoptosi e studiare l'infiltrazione di linfociti, cellule T-regolari (Treg) e cellule mieloidi (Figura 2A-D). La colorazione anti-Ki67 è stata altamente positiva, variando dall'86,9% al 95,07%, dimostrando un alto grado di proliferazione cellulare. L'anticorpo caspasi-3 anti-attivato è stato utilizzato per testare il tasso di apoptosi, compreso tra il 5,2% e il 51,9%. In particolare, mATC presentava un'evidente infiltrazione delle cellule T CD8+, il cui rapporto variava dallo 0,47% al 10,55% (media: 5,93%). Ciò indicava che mATC non era un tumore del deserto immunitario, che era coerente con i campioni ATC. Inoltre, la colorazione Foxp3 ha definito le cellule Treg, che variavano dallo 0,45% al 25,8%. Oltre ai linfociti, F4/80 e Cd206 sono stati utilizzati per definire rispettivamente i macrofagi e i macrofagi M2. Abbiamo scoperto che le cellule mieloidi si sono ampiamente infiltrate nei tumori (tasso di cellule positive F4/80 dall'86,6% al 94,6%; Cd206 tasso di cellule positive dal 40,4% al 67,7%), che era coerente con la letteratura precedente16. In breve, abbiamo trovato cellule tumorali altamente proliferative, infiltrazione linfocitaria e un'estesa infiltrazione di cellule mieloidi in mATC, che era coerente con i campioni clinici.
In conclusione, i campioni di mATC hanno mostrato omogeneità nella dinamica del tumore, metastasi e caratteristiche patologiche, coerenti con i campioni clinici. Considerando il tasso di formazione del tumore, mATC era un modello murino affidabile.
Figura 1: Dinamica tumorale e caratteristiche patologiche. (A) Curva di crescita tumorale dei topi (n = 5). Ogni linea rappresenta un topo: la fase iniziale va dal giorno 0 al giorno 60 e la fase finale va dal giorno 60 al giorno 100. (B) Curve di sopravvivenza dei topi (n = 12). La sopravvivenza mediana di mATC è stata di 130 giorni, compresi tra 56 giorni e 166 giorni. (C) Curve delle metastasi polmonari dei topi (n = 12). Immagini rappresentative di dissezione di metastasi tiroidee e polmonari. La freccia rossa indica il tumore della tiroide e il cerchio bianco indica metastasi nel polmone. (D) Colorazione HE del tumore primario (1 mese e 2 mesi dopo l'induzione) e metastasi polmonari. La freccia rossa indica la cellula gigante pleomorfa, la freccia gialla indica la cellula a forma di fuso e l'area cerchiata indica una metastasi nel polmone. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Breve descrizione dell'infiltrazione delle cellule immunitarie in mATC. (A) Colorazione immunoistochimica di tumori primari murini ATC con anticorpi (Cd8, Foxp3). La freccia rossa indica una cella CD8 positiva, la freccia gialla indica una cella positiva Foxp3. (B) Colorazione immunoistochimica di tumori primari murini ATC con anticorpi (Ki67, Caspasi-3). (C) Colorazione immunoistochimica di tumori primari murini ATC con anticorpi (F4/80, Cd206). D) La quantificazione dell'IHC. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Tabella 1: L'elenco dei primer e le impostazioni PCR utilizzate in questo studio. Clicca qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Passaggi critici all'interno del protocollo per la dissezione del tumore tiroideo
Durante la dissezione, la posizione anatomica della ghiandola tiroidea deve essere compresa correttamente. La ghiandola tiroidea è una ghiandola a forma di farfalla situata sul lato dorsale della ghiandola sottomandibolare vicino alla cartilagine tiroidea e alla trachea. Durante la procedura, recidere le arterie del sangue su entrambi i lati del collo è stato accuratamente evitato.
Modifica e risoluzione dei problemi della razza mATC
L'ATC è un tumore maligno raro e altamente aggressivo. Le caratteristiche cliniche dei pazienti con mATC e ATC hanno alcune somiglianze. In particolare, la principale causa di morte nella mATC è l'asfissia, che è coerente con i pazienti ATC. Pertanto, durante l'esperimento, si dovrebbe notare quanto segue: 1) afferrare delicatamente i topi e prestare attenzione alla loro respirazione durante l'operazione; 2) monitorare attentamente durante la fase avanzata per prevenire la morte improvvisa e il mancato ottenimento dei campioni in tempo; 3) I tessuti tiroidei e polmonari sono facilmente influenzati dal sangue sulla superficie dei tessuti per l'osservazione e la fotografia, quindi il volume del sangue dei topi può essere ridotto dall'enucleazione del bulbo oculare.
Limitazioni dell'utilizzo di mATC
La presenza e lo sviluppo dell'ATC umano sono complessi e mutevoli, ma il background genetico di mATC è relativamente semplice, che può simulare solo una parte dell'ATC umano. Ad esempio, alcuni tessuti ATC ospitavano mutazioni TERT e BRAF, la variante18 del numero di copie NOTCH2NL, invece delle mutazioni P53, che possono avere diversi meccanismi di tumorigenesi e caratteristiche patologiche cliniche 7,19,20. Inoltre, l'ATC di solito ha un lungo decorso temporale prima della diagnosi, ma mATC ottiene una diagnosi dopo un'induzione di 2 mesi. Pertanto, ci sono distinzioni intrinseche tra mATC e cancro della tiroide umano, i modelli animali non possono imitare completamente tutte le caratteristiche del cancro della tiroide umano e molte terapie che sono limitate agli esseri umani non possono essere valutate su mATC. Inoltre, sebbene mATC possa essere utilizzato per ricercare gli effetti terapeutici di vari farmaci a piccole molecole, diversi farmaci biologici (ad esempio, anticorpi o farmaci correlati agli anticorpi) dovrebbero essere progettati specificamente per i topi. Inoltre, l'intero processo di costruzione di topi knockout condizionali e quindi di ottenimento del genotipo target di topi mediante incrocio richiede molto tempo e richiede determinate condizioni di coltura del topo e costa21,22.
Significato dell'uso di mATC nella ricerca sul cancro della tiroide
L'eterogeneità della popolazione umana e la rarità dell'ATC umano ostacolano l'esplorazione di potenziali meccanismi e opzioni terapeutiche per l'ATC. Come modello murino affidabile, mATC facilita la raccolta di tessuti ATC e arricchisce il pool di campioni di tessuto ATC. mATC può anche essere usato per studiare gli effetti di specifiche funzioni geniche sull'ATC, studiare i meccanismi cellulari e molecolari dello sviluppo dell'ATC, comprendere i meccanismi di progressione del tumore tiroideo e la resistenza ai farmaci e, infine, migliorare la prognosi dei pazienti ATC16.
Applicazioni future di mATC
mATC può essere utilizzato per la ricerca su vari aspetti della radioterapia, chemioterapia, terapia genica, immunoterapia e terapia mirata. mATC può anche essere utilizzato per esplorare gli effetti terapeutici e gli effetti avversi dei regimi, come combinazioni tra diversi farmaci o con la radioterapia. Successivamente abbiamo utilizzato mATC per studiare gli effetti terapeutici della radioterapia combinata con immunoterapia e farmaci inibitori di piccole molecole sull'ATC. Inoltre, mATC può essere utilizzato per studiare gli effetti di varie modalità o vie di somministrazione sugli effetti antitumorali dei farmaci per sviluppare sistemi di somministrazione di farmaci con attività antitumorale potenziata. Nelle future applicazioni cliniche, speriamo di ridurre al minimo il tasso di recidiva e il tasso di mortalità dei pazienti con cancro alla tiroide e quindi migliorare il tasso di sopravvivenza dei pazienti.
Ci aspettiamo che in futuro vengano sviluppati più modelli murini di ATC, nonché analisi più approfondite dell'ATC in diversi background genetici, come PTEN e P13K23. Questi riveleranno in modo più completo il meccanismo molecolare della tumorigenesi e della progressione dell'ATC, prediranno l'esito del trattamento con ATC e potrebbero fornire ai pazienti potenziali bersagli terapeutici 24,25,26,27,28. Speriamo che attraverso un'esplorazione più sperimentale, possiamo migliorare il metodo di modellazione del modello murino e ridurre il tempo di modellazione per dare maggiori contributi alla ricerca di base.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Key Research Development Program of China (2021YFA1301203); la National Natural Science Foundation of China (82103031, 82103918, 81973408, 82272933); il Clinical Research Incubation Project, West China Hospital, Sichuan University (22HXFH019); il progetto di cooperazione internazionale dell'Ufficio municipale di scienza e tecnologia di Chengdu (2020-GH02-00017-HZ); Fondazione di Scienze Naturali del Sichuan, 2022NSFSC1314; il "Progetto 1.3.5 per discipline di eccellenza, West China Hospital, Sichuan University" (ZYJC18035, ZYJC18025, ZYYC20003, ZYJC18003); e Programma di scienza e tecnologia del Sichuan (2023YFS0098).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x Citrate antigen retrieval solution (PH 6.0) | MXB | Cat# MVS-0101 | |
| 50x EDTA antigen retrieval solution(pH 9.5) | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9071 | |
| Brafflox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Caspase-3 | Beyotime | Cat# AC033 | |
| CD8 | Cell Signaling Technology | Cat# 98941; RRID:AB_2756376 | |
| CD206 | Cell Signaling Technology | Cat# 24595; RRID:AB_2892682 | |
| Chamber for anesthesia induction | RWDlifescience | ||
| Enhanced DAB chromogenic kit | MXB | Cat# DAB-2031 | |
| Eosin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9613 | |
| F4/80 | Abcam | Cat# 100790; RRID:AB_10675322 | |
| Foxp3 | Cell Signaling Technology | Cat# 12653; RRID:AB_2797979 | |
| Fully enclosed tissue dehydrator | Leica Biosystems | ASP300S | |
| Hematoxylin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9610 | |
| HistoCore Arcadia fully automatic tissue embedding machine | Leica Biosystems | ||
| Ki67 | Beyotime | Cat# AF1738 | |
| Rotating Slicer | RWDlifescience | Minux S700 | |
| SPlink detection kits (Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems) | ZSGB-GIO | Cat# SP-9001 | |
| TPO-cre/ERT2 mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Trp53flox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Ultrasonic cell crusher | Ningbo Xinyi Ultrasound Equipment Co., Ltd | JY92-IIN | |
| Ultrasound gel | Keppler | KL-250 | |
| Ultrasound system | VisualSonics | Vevo 3100 |
References
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