Summary
यहां, हम सहज आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल द्वारा मुराइन एटीसी ट्यूमर प्राप्त करने के लिए एक मानक पाइपलाइन प्रस्तुत करते हैं। इसके अलावा, हम प्राथमिक और मेटास्टेसाइज्ड घावों के बारे में ट्यूमर की गतिशीलता और पैथोलॉजिकल जानकारी प्रस्तुत करते हैं। यह मॉडल शोधकर्ताओं को ट्यूमरजेनिसिस को समझने और दवा खोजों की सुविधा प्रदान करने में मदद करेगा।
Abstract
एनाप्लास्टिक थायराइड कैंसर (एटीसी) एक निराशाजनक पूर्वानुमान के साथ एक दुर्लभ लेकिन घातक घातक बीमारी है। कार्सिनोजेनेसिस और एटीसी के विकास के साथ-साथ चिकित्सीय तरीकों पर अधिक गहन शोध की तत्काल आवश्यकता है, क्योंकि एटीसी रोगियों में मानक उपचार अनिवार्य रूप से समाप्त हो जाते हैं। हालांकि, कम प्रसार ने पूरी तरह से नैदानिक अध्ययन और ऊतक के नमूनों के संग्रह में बाधा डाली है, इसलिए प्रभावी उपचार बनाने में बहुत कम प्रगति हासिल की गई है। हमने सी 57बीएल / 6 पृष्ठभूमि में सशर्त रूप से इंड्यूसेबल एटीसी मुराइन मॉडल (एमएटीसी) बनाने के लिए जेनेटिक इंजीनियरिंग का उपयोग किया। एटीसी मुराइन मॉडल को टीपीओ-सीआरई / ईआरटी 2 द्वारा जीनोटाइप किया गया था; ब्रैफसीए / Trp53 ex2-10/ex2-10 और टैमोक्सीफेन के साथ इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा प्रेरित। मुराइन मॉडल के साथ, हमने ट्यूमर की गतिशीलता (प्रेरण के 4 महीने बाद ट्यूमर का आकार 12.4 मिमी 2 से 32.5 मिमी2 तक था), जीवित रहने (औसत जीवित रहने की अवधि 130 दिन थी), और मेटास्टेसिस (फेफड़ों के मेटास्टेस 91.6% चूहों में हुए) वक्र और पैथोलॉजिकल विशेषताओं (सीडी 8, फॉक्सपी 3, एफ 4/80, सीडी 206, केआई 67, और कैसपेस -3 इम्यूनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंग की विशेषता) की जांच की। परिणामों ने संकेत दिया कि सहज एमएटीसी में मानव एटीसी ट्यूमर के समान ट्यूमर गतिशीलता और इम्यूनोलॉजिकल माइक्रोएन्वायरमेंट होता है। निष्कर्ष में, पैथोफिजियोलॉजिकल विशेषताओं और एकीकृत जीनोटाइप में उच्च समानता के साथ, एमएटीसी मॉडल ने कुछ हद तक नैदानिक एटीसी ऊतक और नमूना विषमता की कमी को हल किया। इसलिए, यह एटीसी के तंत्र और अनुवाद संबंधी अध्ययन की सुविधा प्रदान करेगा और एटीसी के लिए छोटे आणविक दवाओं और इम्यूनोथेरेपी एजेंटों की उपचार क्षमता की जांच करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करेगा।
Introduction
थायराइड कैंसर सबसे आम अंतःस्रावी विकृतियों में से एक है,जो थायराइड एपिथेलियम से उत्पन्न होता है। हाल के वर्षों में, थायराइड कैंसर की घटनाओं में दुनिया भर में तेजी से वृद्धि हुईहै। थायराइड कैंसर को ट्यूमर सेल भेदभाव की डिग्री के अनुसार अलग-अलग प्रकारों में विभाजित किया जा सकता है। नैदानिक व्यवहार और हिस्टोलॉजी के आधार पर, थायराइड कार्सिनोमा को अच्छी तरह से विभेदित कार्सिनोमा में विभाजित किया जाता है, जिसमें पैपिलरी थायराइड कार्सिनोमा (पीटीसी) और कूपिक थायराइड कार्सिनोमा (एफटीसी), खराब विभेदित कार्सिनोमा (पीडीटीसी), और थायरॉयड (एटीसी) 3 के उदासीन या एनाप्लास्टिक कार्सिनोमा शामिल हैं। पीटीसी के विपरीत, जो हल्के व्यवहार और बेहतर रोग का निदान4 के साथ एक सामान्य प्रकार है, एटीसी एक दुर्लभ और अत्यधिक आक्रामक दुर्भावना है जो सभी थायराइड ट्यूमर5 के 2% से 3% के लिए जिम्मेदार है। हालांकि एटीसी दुर्लभ है, यह लगभग 50% थायराइड कैंसर से संबंधित मौतों के लिए जिम्मेदार है, निराशाजनक अस्तित्व (6-8 महीने) 6,7 के साथ। एटीसी के 50% से अधिक मामलों का निदान फेफड़ों के मेटास्टेसिस8 के रूप में किया जाता है। एटीसी की आक्रामक प्रकृति के अलावा, क्लिनिक में सीमित प्रभावी उपचार विकसित किया गया है। इसलिए, एटीसी रोगियों में 9,10,11 का निराशाजनक पूर्वानुमानहै। इससे पता चलता है कि एटीसी और उपचार के विकास में अंतर्निहित आणविक तंत्र पर आगे के गहन अध्ययन की तत्काल आवश्यकता है।
एटीसी का ट्यूमरजेनिसिस एक गतिशील विभेदित प्रक्रिया है। नैदानिक अध्ययनों में प्रत्येक चरण में मानव ट्यूमर के नमूने एकत्र करने में कठिनाई ने अच्छी तरह से विभेदित से अविभाजित कार्सिनोमा तक विकास के तंत्र की समझ में बाधा डाली है। इसके विपरीत, मुराइन एटीसी मॉडल (एमएटीसी) का उपयोग पूरे ट्यूमरजेनिसिस कोर्स में एमएटीसी नमूनों के संग्रह का पक्ष लेता है। इसलिए, हम गतिशील विभेदित प्रक्रिया का विश्लेषण करके ट्यूमर गठन के तंत्र को बेहतर ढंग से समझ सकते हैं। इसके अलावा, नैदानिक एटीसी नमूनों की विविधता ने आणविक तंत्र को समझने में कठिनाई में भी योगदान दिया है। फिर भी, चूहों ने एक ही आनुवंशिक पृष्ठभूमि साझा की और प्रत्येक ट्यूमर की स्थिरता सुनिश्चित करते हुए समान जीवित वातावरण में बनाए रखा गया। यह एटीसी विकास12,13,14 की सामान्यीकृत भूमिका की खोज की सुविधा प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, एमएटीसी एक सीटू ट्यूमर मॉडल है जो शारीरिक स्थान और ऊतक-विशिष्ट माइक्रोएन्वायरमेंट के प्रभाव को बहाल कर सकता है। जैसे, आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले इम्यूनोडेफिशिएंट चूहों की तुलना में, एमएटीसी एक बरकरार प्रतिरक्षा प्रणाली और प्रतिरक्षा माइक्रोएन्वायरमेंट के साथ एक सहज मुराइन मॉडल है।
इसलिए, हमने सी 57बीएल / 6 तनाव के साथ सशर्त रूप से प्रेरित एमएटीसी का निर्माण किया, जो एक मुराइन मॉडल है जो विभेदित थायरॉयड कार्सिनोमा की रोग संबंधी विशेषताओं को पुन: उत्पन्न करने में सक्षम है। इस मॉडल के आधार पर, हमने आणविक आधार, निर्माण विचारों, पैथोलॉजिकल विशेषताओं और एमएटीसी के अनुप्रयोगों का एक संक्षिप्त अवलोकन दिया। इसके अलावा, हमने ट्यूमर के विकास, जीवित रहने के समय, मेटास्टेसिस और एमएटीसी की पैथोलॉजिकल विशेषताओं को देखा और रिपोर्ट किया। हमारा मानना है कि यह इस मॉडल का उपयोग करने में अन्य शोधकर्ताओं की सहायता के लिए एक सूचना त्मक अवलोकन होगा।
हमने एक सशर्त इंड्यूसेबल एमएटीसी मॉडल का निर्माण किया, जैसा कि पहली बार मैकफैडेन15 द्वारा रिपोर्ट किया गया था; प्रारंभ में, हमने चूहों का निर्माण किया: टीपीओ-सीआरई / ईआरटी 2, ब्रैफ फ्लोक्स / डब्ल्यूटी, और टीआरपी 53फ्लोक्स / डब्ल्यूटी। विशेष रूप से, टीपीओ-सीआरई / ईआरटी 2 चूहों में मानव थायराइड पेरोक्सीडेज (टीपीओ) प्रमोटर (एक थायरॉयड-विशिष्ट प्रमोटर) शामिल थे, जो एक सीआरई-ईआरटी 2 फ्यूजन जीन (मानव एस्ट्रोजन रिसेप्टर लिगैंड बाइंडिंग डोमेन से जुड़ा एक क्रे रिकॉम्बिनेस) की अभिव्यक्ति को चलाते थे। क्रे-ईआरटी 2 आमतौर पर साइटोप्लाज्म तक ही सीमित होता है और केवल टैमोक्सीफेन के संपर्क में आने पर नाभिक में प्रवेश करता है, जो सीआरई को पुनः संयोजक एंजाइम गतिविधि को बढ़ाने के लिए प्रेरित करता है। जब चूहों को लोक्सपी-एलान्डेड अनुक्रमों को ले जाने वाले चूहों के साथ पार किया जाता है, तो टैमोक्सीफेन-प्रेरण के बाद, क्रे-मध्यस्थता पुनर्संयोजन विशिष्ट जीनों में दस्तक देने या दस्तक देने के उद्देश्य को प्राप्त करने के लिए थायरॉयड कोशिकाओं में फ्लोक्स्ड अनुक्रमों को हटा देता है।
इसके अलावा, ब्रैफफ्लोक्स / डब्ल्यूटी चूहे क्रे-लॉक्सपी प्रणाली के आधार पर मानव ब्राफ का एक नॉक-इन एलील हैं। डब्ल्यूटी मुराइन ट्रांसक्रिप्ट अंतर्जात एक्सॉन 1-14 और लॉक्सपी-एडेड मानव एक्सॉन 15-18 द्वारा एन्कोड किया गया है। फ्लोक्स्ड क्षेत्रों के क्रे-मध्यस्थता वाले छांटने के बाद, उत्परिवर्ती एक्सॉन 15 (मानव कैंसर में संवैधानिक रूप से सक्रिय ब्राफ वी 600 ई के साथ जुड़े वी 600 ई एमिनो एसिड प्रतिस्थापन के साथ संशोधित) और अंतर्जात एक्सॉन 16-18 का उपयोग प्रतिलेख उत्पन्न करने के लिए किया जाता है। इसके अलावा, Trp53 फ्लोक्स / डब्ल्यूटी चूहे मानव Trp53 के नॉकआउट एलील हैं और Trp53 के एक्सॉन 2-10 के साथ LoxP साइटें हैं। जब चूहों के साथ एक क्रे रिकॉम्बिनेस के साथ पार किया जाता है, तो क्रे-मध्यस्थता पुनर्संयोजन टीआरपी 53 को दस्तक देने के लिए फ्लोक्स्ड अनुक्रम को हटा देता है। फिर, टीपीओ-सीआरई / ईआरटी 2, ब्राफ फ्लोक्स / डब्ल्यू, और टीआरपी 53फ्लोक्स / डब्ल्यूटी चूहों को टीबी (टीपीओ-सीआरई/ ईआरटी 2) प्राप्त करने के लिए पार किया गया था। ब्राफफ्लोक्स / चूहों और टीबीपी (टीपीओ-सीआरई / ईआरटी 2; ब्राफफ्लोक्स / Trp53flox / wt) चूहे, जिसका उपयोग पीटीसी और एटीसी उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। लगभग 8 सप्ताह के बाद, चूहों को दो प्रशासनों के लिए मकई के तेल में घुलने वाले 150 मिलीग्राम / किग्रा टैमोक्सीफेन के इंट्रापरिटोनियल (यानी) प्रशासन द्वारा प्रेरित किया गया था। ट्यूमर के विकास की निगरानी उच्च आवृत्ति अल्ट्रासोनोग्राफी द्वारा की जा सकती है (अल्ट्रासोनोग्राफी का पहला समय बिंदु दिन 0 के रूप में दर्ज किया गया था)। प्रारंभिक अल्ट्रासोनोग्राफी टैमोक्सीफेन परिचय के 40 दिन बाद की गई थी।
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Protocol
यहां वर्णित पशु प्रक्रियाओं को पश्चिम चीन अस्पताल, सिचुआन विश्वविद्यालय, चेंगदू, सिचुआन, चीन की पशु आचार समिति के अनुमोदन के साथ किया गया था।
1. टीबीपी चूहों का प्रेरण
- चूहों के जीनोटाइप की पहचान करें
- लगभग 3 सप्ताह में, मादा चूहों को नर चूहों से अलग करें। वहीं, एक ईयर टैग को ठीक करने के लिए ईयर टैग क्लैंप का इस्तेमाल करें। कान टैग को निचले आधे हिस्से में और कान के मध्य तिहाई पर रखें, जिससे केशिकाओं की उच्चतम सांद्रता वाले क्षेत्र से बचना सुनिश्चित करें।
- धीरे से लेकिन सुरक्षित रूप से चूहों को रोकें। माउस पूंछ के आधार पर मजबूती से पकड़ें। चूहों को एक सतह पर रखें जो उन्हें पकड़ने की अनुमति देगा।
- धीरे से लेकिन दृढ़ता से मुक्त हाथ को कंधों पर रखें, फिर जल्दी से अंगूठे और फोरफिंगर के बीच गर्दन के झुकाव को पकड़ें। छोटी उंगली से पूंछ पकड़ो।
- शराब के साथ पूंछ को स्वैब करें। त्वचा के नमूने को <5 मिमी स्निप करने के लिए बाँझ कैंची का उपयोग करें और इसे लेबल के साथ एक साफ नमूना कंटेनर में डालें। चूहों के फर को हटाना आवश्यक नहीं है। हेमोस्टेसिस प्राप्त करने के लिए बाँझ स्पंज के साथ पूंछ को संपीड़ित करें।
- इसके बाद, मुराइन पूंछ को लाइज़ करें और जीनोटाइप की पहचान करने के लिए पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) करें।
नोट: एक मुराइन पूंछ को काटने के बाद, कैंची की सतह को अल्कोहल कपास से पोंछदिया जाना चाहिए ताकि मुराइन पूंछ के बीच जीन के पारस्परिक संदूषण से बचा जा सके। उन्हें अपने पिंजरे में रखने के बाद, चूहों को घाव स्थल पर रक्तस्राव के किसी भी संकेत को देखने के लिए 5 मिनट तक देखा जाना चाहिए। प्राइमरों की सूची और इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली पीसीआर सेटिंग्स के लिए तालिका 1 देखें।
- टैमॉक्सिफेन-प्रेरित टीबीपी चूहे।
- टैमोक्सीफेन के 0.3 ग्राम वजन करें और इसे अल्ट्रासाउंड द्वारा मकई के तेल के 15 मिलीलीटर में घोलें (शक्ति = 20%, अवधि = 20 मिनट, तापमान = 4 डिग्री सेल्सियस), 20 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता पर। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
नोट: टैमोक्सीफेन प्रकाश के प्रति संवेदनशील है और इसे भूरे रंग के कंटेनर में रखा जाना चाहिए। - लगभग 8 सप्ताह में, इलेक्ट्रॉनिक तराजू के साथ चूहों का वजन करें और उन्हें 150 मिलीग्राम / किग्रा की खुराक पर टैमोक्सीफेन का आई.पी. इंजेक्शन दें, जो 1 सप्ताह के अंतराल के साथ दो बार प्रशासित किया जाता है।
- टैमोक्सीफेन के 0.3 ग्राम वजन करें और इसे अल्ट्रासाउंड द्वारा मकई के तेल के 15 मिलीलीटर में घोलें (शक्ति = 20%, अवधि = 20 मिनट, तापमान = 4 डिग्री सेल्सियस), 20 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता पर। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
2. माउस थायराइड ट्यूमर और मेटास्टैटिक ट्यूमर का विच्छेदन और इमेजिंग
- तैयारी
- विच्छेदन उपकरण तैयार करें: बाँझ कैंची और बल, बाँझ ब्लेड, 75% अल्कोहल स्प्रे बोतल, 20 सेमी स्ट्रेटेज, वर्नियर कैलिपर्स, पेपर तौलिए, और अल्कोहल कपास।
- माउस ऊतक फिक्सिंग समाधान: 4% पैराफॉर्मलडिहाइड ऊतक फिक्सिंग समाधान तैयार करें।
- अस्थायी ऊतक भंडारण के लिए लगभग 10 मिलीलीटर बाँझ फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) से भरे 10 सेमी पकवान को साफ करें, और ऊतक की सतह पर रक्त को धोएं।
- थायराइड निष्कर्षण
- 5 मिनट के लिए 2.0 एल / मिनट की प्रवाह दर पर कार्बन डाइऑक्साइड के साथ चूहों को इच्छामृत्यु करें। चूहों को पिंजरे से निकालें और ग्रीवा अव्यवस्था करें।
- माउस को विच्छेदन बोर्ड पर उदर पक्ष के साथ रखें और सिर को प्रयोगकर्ता से दूर रखें, और बाँझ सिरिंज सुइयों के साथ विच्छेदन बोर्ड पर अंगों को ठीक करें। थायराइड ऊतक के अधिक सुविधाजनक हटाने के लिए, सिर को ठीक करने के लिए एक और बाँझ सिरिंज सुई का उपयोग करें।
- क्लोरहेक्सिडाइन या पोविडोन-आयोडीन स्क्रब के तीन वैकल्पिक राउंड के साथ गर्दन को कीटाणुरहित करें, इसके बाद 75% अल्कोहल लें। फिर, बाँझ कैंची और बल के साथ क्लैविकल के केंद्र के ऊपर एक छोटा चीरा लगाएं।
- चीरा मध्य रेखा को मुंह तक जारी रखें। सबमैंडिबुलर ग्रंथि का पता लगाएं और थायराइड के शारीरिक स्थान को उजागर करने के लिए इसे हटा दें, जो थायरॉयड उपास्थि और श्वासनली के पास रखा गया है।
- थायराइड का पता लगाएं, बाँझ कैंची के साथ गर्दन के बाकी क्षेत्र से थायराइड को सावधानीपूर्वक विच्छेदित करें, फिर हटाए गए थायराइड को 10 एमएल बाँझ पीबीएस से भरे 10 सेमी डिश में डालें।
नोट: थायरॉयड ग्रंथि को हटाने के दौरान, सौम्य और धीमी गति से रहें और गर्दन की रक्त वाहिकाओं को काटने से बचें। यदि गर्दन की वाहिकाओं को काट दिया जाता है, तो गर्दन तुरंत रक्त से भर जाएगी, और थायरॉयड के शारीरिक स्थान को उजागर करने के लिए रक्त को तुरंत शराब स्पंज के साथ हटा दिया जाना चाहिए। थायराइड ऊतक को हटाने से पहले, थायराइड के बाएं और दाएं लोब (आकार, आकार, आदि) की विशेषताओं का सावधानीपूर्वक निरीक्षण करें ताकि हटाने के बाद थायराइड के बाएं और दाएं लोब के बीच अंतर करने में असमर्थ न हों। - बाँझ पीबीएस में, बाँझ कैंची के साथ थायरॉयड ऊतक की सतह से रक्त निकालें और ध्यान से श्वासनली को काट दें। फिर, थायराइड ऊतक को बाँझ कपड़े पर रखें, और वर्नियर कैलिपर के साथ थायरॉयड ग्रंथि के बाएं और दाएं लोब के आकार को मापें।
- एक बाँझ ब्लेड के साथ थायराइड ग्रंथि के बाएं और दाएं लोब को दो भागों में विभाजित करें। निर्धारण के लिए एक भाग को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान के 2 मिलीलीटर में डालें, और दूसरे भाग को संरक्षण के लिए तरल नाइट्रोजन में डालें।
- फेफड़े और यकृत का निष्कर्षण
- पेट को क्लोरहेक्सिडाइन या पोविडोन-आयोडीन स्क्रब और 75% अल्कोहल के तीन वैकल्पिक राउंड के साथ कीटाणुरहित करें। फिर, माउस के लिंग के ठीक ऊपर चुटकी लें और एक छोटा सा चीरा लगाएं, पेट की मध्य रेखा के साथ सबक्लेवियन हड्डी तक काट लें, और पेट की गुहा को उजागर करें।
- पेट के ऊपरी हिस्से में जिगर का पता लगाएं और इसे सावधानी से हटा दें। यकृत को बाँझ पीबीएस में रखें।
- वक्ष गुहा को उजागर करने के लिए पसलियों के साथ डायाफ्राम को सावधानी से काटें। इसके बाद, उरोस्थि को पकड़ें और जगह को और भी चौड़ा करने के लिए खींचें। फेफड़े का पता लगाएं और इसे हटा दें। हटाए गए फेफड़े को बाँझ पीबीएस में डालें।
- मोटे तौर पर निरीक्षण करें कि फेफड़े और यकृत में मेटास्टेस हैं या नहीं। मेटास्टेस की संख्या की गणना करें और एक डिजिटल रिकॉर्ड लें। उसके बाद, फेफड़े और यकृत के ऊतकों को दो भागों में विभाजित करने के लिए एक बाँझ ब्लेड का उपयोग करें। एक भाग को निर्धारण के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान के 3 मिलीलीटर में और दूसरे भाग को संरक्षण के लिए तरल नाइट्रोजन में डालें।
- ऊतक निर्जलीकरण
- ऊतकों को निर्जलीकरण बॉक्स में रखें। निर्जलीकरण बॉक्स को ग्रेडिएंट अल्कोहल निर्जलीकरण पर टोकरी में निम्नानुसार रखें: 1 घंटे के लिए 70% शराब; 1 घंटे के लिए 80% शराब; 30 मिनट के लिए 95% शराब; 30 मिनट के लिए 95% शराब; 30 मिनट के लिए निर्जल इथेनॉल I; 30 मिनट के लिए निर्जल इथेनॉल II; 20 मिनट के लिए जाइलीन आई; 20 मिनट के लिए जाइलीन II; 30 मिनट के लिए पैराफिन मोम I; 1 घंटे के लिए पैराफिन मोम II; 30 मिनट के लिए पैराफिन मोम III।
- एम्बेडिंग मशीन में मोम-गर्भवती ऊतकों को एम्बेड करें।
- पिघले हुए मोम को पहले एम्बेडिंग फ्रेम में डालें। मोम जमने से पहले, निर्जलीकरण बॉक्स से ऊतक को हटा दें और इसे एम्बेडिंग फ्रेम में डालें, फिर लेबल संलग्न करें।
- मोम को फ्रीजिंग टेबल पर -20 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा होने दें। मोम जमने के बाद, एम्बेडिंग फ्रेम से मोम ब्लॉक को हटा दें और इसे ट्रिम करें।
- छंटनी किए गए मोम ब्लॉक को पैराफिन स्लाइसर पर रखें, जिसे 5 μm की मोटाई और 2 सेमी x 2 सेमी के आकार पर सेट किया गया है। सेक्शनिंग के बाद, ऊतकों को समतल करने के लिए अनुभागों को 45 डिग्री सेल्सियस पर गर्म पानी के साथ एक स्प्रेडर पर तैरने की अनुमति दें। एक स्लाइड के साथ ऊतक उठाएं, और स्लाइस को 2 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में बेक करें।
- पानी सूखने और मोम पिघलने के बाद, ऊतक के साथ स्लाइड को हटा दें और इसे हेमटोक्सीलिन और ईओसिन (एचई) और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल (आईएचसी) धुंधलाकरने के लिए उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि अनुभाग धुंधला होने के लिए स्लाइड्स का पालन कर रहे हैं.
3. प्राथमिक ट्यूमर और फेफड़े का धुंधला होना।
- Dewaxing
- 10 मिनट के लिए जाइलीन में अनुभागों के साथ स्लाइड रखें।
- निर्जल शराब (100%) (दो बोतलें) में लगभग 3 मिनट के लिए जाएं।
- प्रत्येक 3 मिनट के लिए 95% अल्कोहल (दो बोतलें) में जाएं।
- लगभग 3 मिनट के लिए 80% शराब में जाएं।
- लगभग 3 मिनट के लिए 50% अल्कोहल में जाएं।
- नल के पानी में जाएं, और लगभग 1 मिनट के लिए शराब को धो लें।
- धुंधला
- स्लाइड्स को 8 मिनट के लिए हेमटोक्सीलिन में ले जाएं।
- हेमटोक्सिलिन को धोने के लिए स्लाइड को 1 मिनट के लिए पानी में ले जाएं; ऊतक नीले से लाल रंग में बदल जाता है।
- स्लाइड्स को लगभग 30 सेकंड के लिए 1% हाइड्रोक्लोरिक एसिड अल्कोहल में ले जाएं।
- स्लाइड्स को पानी में ले जाएं, 5 मिनट के लिए धोएं।
- स्लाइड्स को 90 सेकंड के लिए ईओसिन में ले जाएं, फिर उन्हें 5 मिनट के लिए पानी से धो लें।
- स्लाइड्स को 1 मिनट के लिए 50% अल्कोहल, 80% अल्कोहल, 95% अल्कोहल (दो बोतलें), और निर्जल अल्कोहल (100%) (दो बोतलें) में ले जाएं।
- स्लाइड्स को 5 मिनट के लिए जाइलीन में ले जाएं।
- स्लाइड सूखने के बाद, उन्हें तटस्थ राल के साथ सील करें।
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Representative Results
हमने ट्यूमर के विकास, माउस के जीवित रहने के समय और पैथोलॉजिकल विशेषताओं की जांच करने के लिए एमएटीसी को प्रेरित किया। प्रेरण के बाद, चूहों को तुरंत बलिदान किया गया था, और निम्नलिखित स्थितियों में से एक पाए जाने के बाद नमूने (थायरॉयड, फेफड़े और यकृत) एकत्र किए गए थे: 1) ट्यूमर संपीड़न के कारण श्वसन संकट; 2) भूख में कमी और असामान्य मुखरता; 3) असामान्य रूप से सुस्ती; और 4) 20% से अधिक शरीर के वजन में कमी। नमूना प्रक्रिया के दौरान, हमने पाया कि सभी चूहों (12/12) ने प्रेरण के बाद सफलतापूर्वक ट्यूमर का गठन किया। हमने माउस के जीवित रहने का समय, ट्यूमर सुविधाओं / आकार, और मेटास्टेसाइज्ड घावों को रिकॉर्ड किया।
मोटे तौर पर, हमने निम्नलिखित देखा: 1) ट्यूमर कोमल थे, और बाईं और दाईं ओर ट्यूमर का आकार असंगत था; 2) अधिकांश चूहों (11/12) में फेफड़ों के मेटास्टेस थे, लेकिन किसी में भी यकृत मेटास्टेस नहीं था। विशेष रूप से, ट्यूमर के आकार की निगरानी पशु उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड और फोटोएकॉस्टिक इमेजिंग सिस्टम (वेवो®3100) द्वारा पूरी प्रक्रिया17 में की गई थी। अल्ट्रासाउंड डेटा के आधार पर, ट्यूमर के आकार के गतिशील परिवर्तन का निरीक्षण करने के लिए ट्यूमर विकास वक्र (चित्रा 1 ए) को प्लॉट किया गया था। इसके अलावा, ट्यूमर प्रारंभिक चरण में धीरे-धीरे बढ़े (औसत ट्यूमर का आकार दिन 0 से दिन 60 तक 9.47 मिमी 2 से 11.75 मिमी 2 तक भिन्न होता है), और बाद के चरण में नाटकीय रूप से तेज हो जाता है (औसत ट्यूमर का आकार 11.75 मिमी 2 से 23.95 मिमी 2 (दिन 60 से दिन 100 तक) से भिन्न होता है। अधिकांश चूहों को अंतिम चरण में बलिदान किया गया था। संक्षेप में, एक निश्चित ट्यूमर विलंबता अवधि के साथ एमएटीसी को श्वासावरोध से संबंधित मृत्यु को रोकने के लिए 60 दिनों के बाद बारीकी से निगरानी करने की आवश्यकता होती है।
दूसरी ओर, चूहों के जीवित रहने का समय दर्ज किया गया था, और एक जीवित वक्र (चित्रा 1 बी) प्लॉट किया गया था। एमटीसी का औसत अस्तित्व 130 दिन था, जो 56-166 दिनों तक था। इसके अलावा, फेफड़े का मेटास्टेसिस अधिकांश एमएटीसी (लगभग 92%) (चित्रा 1 सी) में पाया गया था। हमने देखा कि इस समूह में केवल एक माउस ने सकल परीक्षा पर फेफड़ों के मेटास्टेस नहीं दिखाए, और छह चूहों में एक से अधिक फेफड़ों के मेटास्टैटिक घाव थे। कोई यकृत मेटास्टेसिस नहीं पाया गया था। संक्षेप में, ये परिणाम एटीसी के जैविक व्यवहार के अनुरूप थे, जो क्लीनिकों में फेफड़ों के मेटास्टेसिस के लिए प्रवण हैं।
इसके अलावा, एमएटीसी की गतिशील प्रक्रिया का बेहतर निरीक्षण करने के लिए, हमने चूहों को दो समय बिंदुओं (प्रेरण के 1 महीने और 2 महीने बाद) पर बलिदान किया। हमने एमएटीसी (चित्रा 1 डी) के प्राथमिक ट्यूमर और मेटास्टैटिक फेफड़ों के ऊतकों पर एचई धुंधला प्रदर्शन किया। 1 महीने के इंड्यूसेबल ऊतक में, हमने अपूर्ण ठोस विशेषताओं और कूपिक संरचनाओं और घातक कोशिकाओं के सह-अस्तित्व को देखा। थायराइड कूपिक संरचनाएं गायब हो गईं, और ट्यूमर 2 महीने के प्रेरण के बाद पूरी तरह से जम गया। प्राथमिक ट्यूमर के धुंधला होने से पता चला कि ट्यूमर कोशिकाएं रूपात्मक रूप से विविध थीं, जिसमें प्लियोमोर्फिक विशाल कोशिकाएं (लाल तीर द्वारा इंगित) और स्पिंडल के आकार की कोशिकाएं (पीले तीर द्वारा इंगित) थीं। इसने परमाणु आकार में एक विस्तृत विविधता भी दिखाई, और कई कोशिकाओं में कई नाभिक थे। फेफड़े में स्पष्ट मेटास्टैटिक फॉसी (एक सर्कल द्वारा इंगित) देखा गया था। मेटास्टैटिक फेफड़ों के ऊतकों के एचई धुंधला होने से पता चला कि सामान्य फेफड़ों के ऊतक स्पष्ट वायुकोशीय संरचनाओं और हवाई क्षेत्र के साथ एक जालीदार संरचना थी। फिर भी, फेफड़ों के मेटास्टेस ने सामान्य जालीदार संरचना, वायु गुहा मोटा होना और फेफड़ों के पैरेन्काइमा का नुकसान दिखाया।
इस बीच, सेल प्रसार और एपोप्टोसिस को मापने और लिम्फोसाइटों, टी-रेगुलर (ट्रेग) कोशिकाओं और माइलॉयड कोशिकाओं (चित्रा 2 ए-डी) की घुसपैठ की जांच करने के लिए (सीडी 8, फॉक्सपी 3, एफ 4/80, सीडी 206, केआई 67, और कैसपेस -3) एमएटीसी ट्यूमर को और अधिक चिह्नित करने के लिए आईएचसी स्टेनिंग का प्रदर्शन किया गया था। एंटी-कि67 धुंधला अत्यधिक सकारात्मक था, 86.9% से 95.07% तक, सेल प्रसार की उच्च डिग्री का प्रदर्शन करता है। एपोप्टोसिस की दर का परीक्षण करने के लिए एंटी-एक्टिवेटेड कैसपेज़ -3 एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था, जो 5.2% से 51.9% तक था। विशेष रूप से, एमएटीसी ने स्पष्ट सीडी 8 + टी सेल घुसपैठ प्रस्तुत की, जिसका अनुपात 0.47% से 10.55% (मतलब: 5.93%) तक था। इससे संकेत मिलता है कि एमएटीसी एक प्रतिरक्षा-रेगिस्तान ट्यूमर नहीं था, जो एटीसी नमूनों के अनुरूप था। इसके अलावा, फॉक्सपी 3 धुंधला ट्रेग कोशिकाओं को परिभाषित करता है, जो 0.45% से 25.8% तक भिन्न होता है। लिम्फोसाइटों के अलावा, एफ 4/80 और सीडी 206 का उपयोग क्रमशः मैक्रोफेज और एम 2 मैक्रोफेज को परिभाषित करने के लिए किया गया था। हमने पाया कि माइलॉयड कोशिकाओं ने बड़े पैमाने पर ट्यूमर में घुसपैठ की (एफ 4/80 सकारात्मक सेल दर 86.6% से 94.6% तक; सीडी 206 पॉजिटिव सेल दर 40.4% से 67.7% तक, जो पिछले साहित्य16 के अनुरूप थी। संक्षेप में, हमने अत्यधिक प्रोलिफेरेटिव ट्यूमर कोशिकाओं, लिम्फोसाइट घुसपैठ, और एमएटीसी में माइलॉयड कोशिकाओं की व्यापक घुसपैठ पाई, जो नैदानिक नमूनों के अनुरूप थी।
निष्कर्ष में, एमएटीसी नमूनों ने नैदानिक नमूनों के अनुरूप ट्यूमर की गतिशीलता, मेटास्टेसिस और पैथोलॉजिकल विशेषताओं में एकरूपता दिखाई। ट्यूमर गठन दर को ध्यान में रखते हुए, एमएटीसी एक विश्वसनीय मुराइन मॉडल था।
चित्रा 1: ट्यूमर गतिशीलता और रोग संबंधी विशेषताएं। (ए) चूहों के ट्यूमर विकास वक्र (एन = 5)। प्रत्येक पंक्ति एक माउस का प्रतिनिधित्व करती है: प्रारंभिक चरण दिन 0 से दिन 60 तक होता है, और अंतिम चरण दिन 60 से दिन 100 तक होता है। (बी) चूहों के उत्तरजीविता वक्र (एन = 12)। एमएटीसी का औसत अस्तित्व 130 दिन था, जो 56 दिनों से 166 दिनों तक था। (सी) चूहों के फेफड़े मेटास्टेसिस वक्र (एन = 12)। थायराइड और फेफड़ों के मेटास्टेसिस की प्रतिनिधि विच्छेदन छवियां। लाल तीर थायराइड ट्यूमर को इंगित करता है, और सफेद सर्कल फेफड़ों में मेटास्टेसिस को इंगित करता है। (डी) प्राथमिक ट्यूमर (प्रेरण के 1 महीने और 2 महीने बाद) और फेफड़ों के मेटास्टेसिस का धुंधला होना। लाल तीर प्लियोमोर्फिक विशाल कोशिका को इंगित करता है, पीला तीर स्पिंडल के आकार की कोशिका को इंगित करता है, और वृत्ताकार क्षेत्र फेफड़ों में मेटास्टेसिस को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: एमएटीसी में प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ का संक्षिप्त विवरण। (ए) एंटीबॉडी (सीडी 8, फॉक्सपी 3) के साथ एटीसी मुराइन प्राथमिक ट्यूमर का इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधलापन। लाल तीर एक सीडी 8 सकारात्मक सेल को इंगित करता है, पीला तीर एक फॉक्सपी 3 पॉजिटिव सेल को इंगित करता है। (बी) एंटीबॉडी के साथ एटीसी मुराइन प्राथमिक ट्यूमर का इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला होना (केआई 67, कैसपेज़ -3)। (सी) एंटीबॉडी (एफ 4/80, सीडी 206) के साथ एटीसी मुराइन प्राथमिक ट्यूमर का इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधलापन। (डी) आईएचसी का परिमाणीकरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
तालिका 1: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्राइमरों और पीसीआर सेटिंग्स की सूची। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
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Discussion
थायराइड ट्यूमर विच्छेदन के लिए प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम
विच्छेदन के दौरान, थायरॉयड ग्रंथि के शारीरिक स्थान को सही ढंग से समझने की आवश्यकता होती है। थायरॉयड ग्रंथि एक तितली के आकार की ग्रंथि है जो थायरॉयड उपास्थि और श्वासनली के पास सबमैंडिबुलर ग्रंथि के पृष्ठीय पक्ष पर स्थित है। प्रक्रिया के दौरान, गर्दन के दोनों किनारों पर रक्त धमनियों को अलग करने से सावधानीपूर्वक बचा गया था।
एमएटीसी नस्ल का संशोधन और समस्या निवारण
एटीसी एक दुर्लभ और अत्यधिक आक्रामक दुर्भावना है। एमएटीसी और एटीसी रोगियों की नैदानिक विशेषताओं में कुछ समानताएं हैं। विशेष रूप से, एमएटीसी में मृत्यु का प्रमुख कारण श्वासावरोध है, जो एटीसी रोगियों के अनुरूप है। इसलिए, प्रयोग के दौरान, निम्नलिखित पर ध्यान दिया जाना चाहिए: 1) चूहों को धीरे से पकड़ें और ऑपरेशन के दौरान उनके श्वसन पर ध्यान दें; 2) अचानक मौत और समय पर नमूने प्राप्त करने में विफलता को रोकने के लिए देर से चरण के दौरान बारीकी से निगरानी; 3) थायरॉयड और फेफड़ों के ऊतक अवलोकन और फोटोग्राफी के लिए ऊतकों की सतह पर रक्त से आसानी से प्रभावित होते हैं, इसलिए चूहों के रक्त की मात्रा को नेत्रगोलक न्यूक्लियेशन द्वारा कम किया जा सकता है।
mATC का उपयोग करने की सीमाएँ
मानव एटीसी की घटना और विकास जटिल और परिवर्तनीय है, लेकिन एमएटीसी की आनुवंशिक पृष्ठभूमि अपेक्षाकृत सरल है, जो केवल मानव एटीसी के एक हिस्से का अनुकरण कर सकती है। उदाहरण के लिए, कुछ एटीसी ऊतकों ने पी 53 म्यूटेशन के बजाय टीआरटी और बीआरएएफ उत्परिवर्तन, NOTCH2NL कॉपी नंबर वेरिएंट 18 को आश्रय दिया, जिसमें अलग-अलग ट्यूमरजेनिसिस तंत्र और नैदानिक रोग संबंधी विशेषताएं 7,19,20 हो सकती हैं। इसके अतिरिक्त, एटीसी में आमतौर पर निदान से पहले एक लंबा समय-कोर्स होता है, लेकिन एमएटीसी 2 महीने के प्रेरण के बाद निदान प्राप्त करता है। इसलिए, एमएटीसी और मानव थायराइड कैंसर के बीच अंतर्निहित अंतर हैं, पशु मॉडल मानव थायराइड कैंसर की सभी विशेषताओं की पूरी तरह से नकल नहीं कर सकते हैं, और कई उपचार जो मनुष्यों तक सीमित हैं, उनका मूल्यांकन एमएटीसी पर नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, हालांकि एमएटीसी का उपयोग विभिन्न छोटे अणु दवाओं के चिकित्सीय प्रभावों पर शोध करने के लिए किया जा सकता है, कई जीवविज्ञान (जैसे, एंटीबॉडी या एंटीबॉडी से संबंधित दवाएं) विशेष रूप से चूहों के लिए डिज़ाइन किए जाने चाहिए। इसके अलावा, सशर्त नॉकआउट चूहों के निर्माण और फिर क्रॉसब्रीडिंग द्वारा चूहों के लक्ष्य जीनोटाइप को प्राप्त करने की पूरी प्रक्रिया में लंबा समय लगता है और इसके लिए कुछ माउस कल्चर स्थितियों की आवश्यकता होती है औरलागत 21,22 होती है।
थायराइड कैंसर अनुसंधान में एमएटीसी का उपयोग करने का महत्व
मानव आबादी की विविधता और मानव एटीसी की दुर्लभता एटीसी के लिए संभावित तंत्र और चिकित्सीय विकल्पों की खोज में बाधा डालती है। एक विश्वसनीय माउस मॉडल के रूप में, एमएटीसी एटीसी ऊतकों के संग्रह की सुविधा प्रदान करता है और एटीसी ऊतक नमूना पूल को समृद्ध करता है। एमएटीसी का उपयोग एटीसी पर विशिष्ट जीन कार्यों के प्रभावों का अध्ययन करने, एटीसी विकास के सेलुलर और आणविक तंत्र का अध्ययन करने, थायराइड ट्यूमर की प्रगति और दवा प्रतिरोध के तंत्र को समझने और अंततः एटीसीरोगियों के पूर्वानुमान में सुधार करने के लिए भी किया जा सकता है।
एमएटीसी के भविष्य के अनुप्रयोग
एमएटीसी का उपयोग रेडियोथेरेपी, कीमोथेरेपी, जीन थेरेपी, इम्यूनोथेरेपी और लक्षित चिकित्सा के विभिन्न पहलुओं पर शोध के लिए किया जा सकता है। एमएटीसी का उपयोग चिकित्सीय प्रभावों और आहार के प्रतिकूल प्रभावों का पता लगाने के लिए भी किया जा सकता है, जैसे कि विभिन्न दवाओं के बीच या रेडियोथेरेपी के साथ संयोजन। हमने बाद में एटीसी पर इम्यूनोथेरेपी और छोटे अणु अवरोधक दवाओं के साथ संयुक्त रेडियोथेरेपी के चिकित्सीय प्रभावों की जांच करने के लिए एमएटीसी का उपयोग किया। इसके अलावा, एमएटीसी का उपयोग उन्नत एंटीट्यूमर गतिविधि के साथ दवा वितरण प्रणाली विकसित करने के लिए दवाओं के एंटीट्यूमर प्रभावों पर विभिन्न वितरण तौर-तरीकों या मार्गों के प्रभावों की जांच करने के लिए किया जा सकता है। भविष्य के नैदानिक अनुप्रयोगों में, हम थायराइड कैंसर रोगियों की पुनरावृत्ति दर और मृत्यु दर को कम करने की उम्मीद करते हैं और इस प्रकार रोगियों की जीवित रहने की दर में सुधार करते हैं।
हम उम्मीद करते हैं कि भविष्य में अधिक एटीसी मुराइन मॉडल विकसित किए जाएंगे, साथ ही पीटीईएन और पी 13 के23 जैसे विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि में एटीसी के अधिक गहन विश्लेषण होंगे। ये एटीसी ट्यूमरजेनिसिस और प्रगति के आणविक तंत्र को अधिक व्यापक रूप से प्रकट करेंगे, एटीसी उपचार के परिणाम की भविष्यवाणी करेंगे, और रोगियों को संभावित चिकित्सीय लक्ष्य 24,25,26,27,28 प्रदान कर सकते हैं। हमें उम्मीद है कि अधिक प्रयोगात्मक अन्वेषण के माध्यम से, हम माउस मॉडल की मॉडलिंग विधि में सुधार कर सकते हैं और बुनियादी अनुसंधान में अधिक योगदान देने के लिए मॉडलिंग समय को कम कर सकते हैं।
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Disclosures
लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
यह काम चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान विकास कार्यक्रम (2021वाईएफए 1301203) द्वारा समर्थित था; चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (82103031, 82103918, 81973408, 82272933); क्लिनिकल रिसर्च इनक्यूबेशन प्रोजेक्ट, वेस्ट चाइना हॉस्पिटल, सिचुआन विश्वविद्यालय (22एचएक्सएफएच019); चेंगदू नगरपालिका विज्ञान और प्रौद्योगिकी ब्यूरो की अंतर्राष्ट्रीय सहयोग परियोजना (2020-जीएच02-00017-एचजेड); सिचुआन के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन, 2022 एनएसएफएससी 1314; "उत्कृष्टता के विषयों के लिए 1.3.5 परियोजना, पश्चिम चीन अस्पताल, सिचुआन विश्वविद्यालय" (ZYJC18035, ZYJC18025, ZYYC20003, ZYJC18003); और सिचुआन विज्ञान और प्रौद्योगिकी कार्यक्रम (2023 वाईएफएस0098)।
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
100x Citrate antigen retrieval solution (PH 6.0) | MXB | Cat# MVS-0101 | |
50x EDTA antigen retrieval solution(pH 9.5) | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9071 | |
Brafflox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
Caspase-3 | Beyotime | Cat# AC033 | |
CD8 | Cell Signaling Technology | Cat# 98941; RRID:AB_2756376 | |
CD206 | Cell Signaling Technology | Cat# 24595; RRID:AB_2892682 | |
Chamber for anesthesia induction | RWDlifescience | ||
Enhanced DAB chromogenic kit | MXB | Cat# DAB-2031 | |
Eosin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9613 | |
F4/80 | Abcam | Cat# 100790; RRID:AB_10675322 | |
Foxp3 | Cell Signaling Technology | Cat# 12653; RRID:AB_2797979 | |
Fully enclosed tissue dehydrator | Leica Biosystems | ASP300S | |
Hematoxylin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9610 | |
HistoCore Arcadia fully automatic tissue embedding machine | Leica Biosystems | ||
Ki67 | Beyotime | Cat# AF1738 | |
Rotating Slicer | RWDlifescience | Minux S700 | |
SPlink detection kits (Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems) | ZSGB-GIO | Cat# SP-9001 | |
TPO-cre/ERT2 mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
Trp53flox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
Ultrasonic cell crusher | Ningbo Xinyi Ultrasound Equipment Co., Ltd | JY92-IIN | |
Ultrasound gel | Keppler | KL-250 | |
Ultrasound system | VisualSonics | Vevo 3100 |
References
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