Summary
Her præsenterer vi en standard pipeline til opnåelse af murine ATC-tumorer ved spontane genetisk manipulerede musemodeller. Endvidere præsenterer vi tumordynamik og patologisk information om de primære og metastaserede læsioner. Denne model vil hjælpe forskere med at forstå tumorigenese og lette lægemiddelopdagelser.
Abstract
Anaplastisk kræft i skjoldbruskkirtlen (ATC) er en sjælden, men dødelig malignitet med en dyster prognose. Der er et presserende behov for mere dybtgående forskning i kræftfremkaldende virkning og udvikling af ATC samt terapeutiske metoder, da standardbehandlinger i det væsentlige er udtømt hos ATC-patienter. Den lave prævalens har imidlertid hæmmet grundige kliniske undersøgelser og indsamling af vævsprøver, så der er kun gjort få fremskridt med at skabe effektive behandlinger. Vi brugte genteknologi til at skabe en betinget inducerbar ATC-murinmodel (mATC) i en C57BL/6-baggrund. ATC-murinmodellen blev genotypet af TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Trp53 ex2-10/ex2-10 og induceret ved intraperitoneal injektion med tamoxifen. Med murinmodellen undersøgte vi tumordynamikken (tumorstørrelse varierede fra 12,4 mm 2 til 32,5 mm2 efter 4 måneders induktion), overlevelse (medianoverlevelsesperioden var 130 dage) og metastaser (lungemetastaser forekom hos 91,6% af musene) kurver og patologiske træk (karakteriseret ved Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67 og Caspase-3 immunhistokemisk farvning). Resultaterne viste, at spontan mATC besidder meget lignende tumordynamik og immunologisk mikromiljø til humane ATC-tumorer. Afslutningsvis, med høj lighed i patofysiologiske træk og forenede genotyper, løste mATC-modellen manglen på klinisk ATC-væv og prøveheterogenitet til en vis grad. Det vil derfor lette mekanismen og translationelle undersøgelser af ATC og give en tilgang til undersøgelse af behandlingspotentialet for små molekylære lægemidler og immunterapimidler til ATC.
Introduction
Kræft i skjoldbruskkirtlen er en af de mest almindelige endokrine maligniteter1, der stammer fra skjoldbruskkirtelepitelet. I de senere år er forekomsten af kræft i skjoldbruskkirtlen steget hurtigt på verdensplan2. Kræft i skjoldbruskkirtlen kan opdeles i forskellige typer i henhold til graden af tumorcelledifferentiering. På basis af klinisk adfærd og histologi er skjoldbruskkirtelkarcinomer opdelt i veldifferentierede karcinomer, herunder papillært skjoldbruskkirtelkarcinom (PTC) og follikulært skjoldbruskkirtelkarcinom (FTC), dårligt differentieret karcinom (PDTC) og udifferentieret eller anaplastisk karcinom i skjoldbruskkirtlen (ATC)3. I modsætning til PTC, som er en almindelig type med mild adfærd og bedre prognose4, er ATC en sjælden og meget aggressiv malignitet, der tegner sig for 2% til 3% af alle skjoldbruskkirteltumorer5. Selvom ATC er sjælden, er den ansvarlig for ca. 50% af skjoldbruskkirtelkræftrelaterede dødsfald med dyster overlevelse (6-8 måneder)6,7. Over 50% af ATC tilfælde diagnosticeres som lungemetastase8. Ud over ATC's aggressive karakter er der udviklet begrænset effektiv behandling i klinikken. Derfor har ATC-patienter en dyster prognose 9,10,11. Dette tyder på, at der er et presserende behov for yderligere dybtgående undersøgelser af de molekylære mekanismer, der ligger til grund for udviklingen af ATC og behandling.
Tumorigenesen af ATC er en dynamisk dedifferentieret proces. Vanskeligheden ved at indsamle humane tumorprøver på hvert trin i kliniske undersøgelser har hindret forståelsen af udviklingsmekanismen fra veldifferentierede til udifferentierede karcinomer. I modsætning hertil favoriserer brugen af murine ATC-modeller (mATC) indsamlingen af mATC-prøver i hele tumorigeneseforløbet. Derfor kan vi bedre forstå mekanismerne for tumordannelse ved at analysere den dynamiske dedifferentierede proces. Derudover har heterogeniteten af kliniske ATC-prøver også bidraget til vanskeligheden ved at forstå den molekylære mekanisme. Ikke desto mindre delte mus den samme genetiske baggrund og blev opretholdt i lignende levende miljøer, hvilket sikrede hver tumors konsistens. Dette letter udforskningen af ATC-udviklingens generaliserede rolle12,13,14. Derudover er mATC en in situ tumormodel, der kan genoprette indflydelsen af den anatomiske placering og vævsspecifikke mikromiljø. Som sådan, sammenlignet med almindeligt anvendte immundefekte mus, er mATC en spontan murinmodel med et intakt immunsystem og immunmikromiljø.
Derfor konstruerede vi betinget induceret mATC med C57BL/6-stammen, som er en murinmodel, der er i stand til at reproducere de patologiske træk ved dedifferentieret skjoldbruskkirtelkarcinom. Baseret på denne model gav vi et kort overblik over det molekylære grundlag, konstruktionsideer, patologiske træk og anvendelser af mATC. Derudover observerede og rapporterede vi tumorvækst, overlevelsestid, metastase og patologiske træk ved mATC. Vi mener, at dette vil være et informatisk overblik for at hjælpe andre forskere med at bruge denne model lettere.
Vi konstruerede en betinget inducerbar mATC-model, som først rapporteret af McFadden15; oprindeligt konstruerede vi mus: TPO-cre/ERT2, Braf flox/wt og Trp53flox/wt. Specifikt inkluderede TPO-cre / ERT2-mus den humane thyroidperoxidase (TPO) promotor (en skjoldbruskkirtelspecifik promotor), der drev ekspressionen af et cre-ERT2-fusionsgen (en cre-rekombinase, der er smeltet sammen med et humant østrogenreceptorligandbindingsdomæne). Cre-ERT2 er normalt begrænset til cytoplasmaet og kommer kun ind i kernen, når den udsættes for tamoxifen, hvilket inducerer cre til at udøve rekombinant enzymaktivitet. Når musene krydses med mus, der bærer loxP-flankerede sekvenser, sletter cre-medieret rekombination efter tamoxifen-induktion de floxede sekvenser i skjoldbruskkirtelcellerne for at opnå formålet med at slå ud eller banke specifikke gener ind.
Derudover er Braf flox/wt-mus en knock-in-allel af human Braf baseret på cre-loxP-systemet. Brafflox/wt murine transkript er kodet af endogene exons 1-14 og loxP-flankeret humane exons 15-18. Efter cre-medieret excision af de floxede regioner anvendes den mutante exon 15 (modificeret med en V600E-aminosyresubstitution forbundet med konstitutivt aktiv BrafV600E i humane kræftformer) og de endogene exoner 16-18 til at generere transkripterne. Desuden er Trp53 floks / wt-mus knockout-alleler af human Trp53 og har loxP-steder, der flankerer exons 2-10 af Trp53. Når den krydses med mus med en cre-rekombinase, sletter cre-medieret rekombination den floxede sekvens for at slå Trp53 ud. Derefter blev TPO-cre/ERT2, Braf flox/w og Trp53flox/wt mus krydset for at opnå TB (TPO-cre/ERT2; Braffloks/vægt) mus og TBP (TPO-cre/ERT2; Brafflok/vægt; Trp53flox/vægt) mus, som kunne bruges til at generere PTC og ATC. Efter ca. 8 uger blev musene induceret ved en intraperitoneal (i.p.) administration af 150 mg/kg tamoxifen opløst i majsolie til to administrationer. Tumorvækst kunne overvåges ved højfrekvent ultralyd (det første tidspunkt for ultralyd blev registreret som dag 0). Indledende ultralyd blev udført 40 dage efter tamoxifen introduktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De dyreforsøg, der er beskrevet her, blev udført med godkendelse fra Animal Ethics Committee of West China Hospital, Sichuan University, Chengdu, Sichuan, Kina.
1. Induktion af TBP-mus
- Identificer mus genotype
- Omkring 3 uger adskilles hunmusene fra hanmusene. Brug samtidig øremærkeklemme til at fastgøre et øremærke. Placer øremærkerne i den nederste halvdel og på den midterste tredjedel af øret, og sørg for at undgå området med den højeste koncentration af kapillærer.
- Hold musene forsigtigt, men sikkert fast. Tag godt fat i bunden af musehalen. Placer musene på en overflade, der giver dem mulighed for at gribe.
- Placer forsigtigt men fast den frie hånd over skuldrene, og tag derefter hurtigt fat i halsen mellem tommelfingeren og pegefingeren. Hold halen med lillefingeren.
- Swab halen med alkohol. Brug en steril saks til at klippe hudprøven <5 mm og læg den i en ren prøvebeholder med en etiket. Det er ikke nødvendigt at fjerne musens pels. Komprimer halen med sterile svampe for at opnå hæmostase.
- Derefter lyser murinhalen og udfører polymerasekædereaktion (PCR) for at identificere genotypen.
BEMÆRK: Efter at have skåret en murinhale skal saksens overflade tørres af med alkoholbomuld for at undgå gensidig forurening af gener mellem murinhaler. Efter at have placeret dem i deres bur, skal musene overvåges i 5 minutter for at se efter tegn på blødning på sårstedet. Se tabel 1 for listen over primere og de PCR-indstillinger, der blev brugt i denne undersøgelse.
- Tamoxifen-inducerede TBP-mus
- Væg 0,3 g tamoxifen og opløs det i 15 ml majsolie ved ultralyd (effekt = 20%, varighed = 20 min, temperatur = 4 ° C) i en koncentration på 20 mg / ml. Opbevares ved 4 °C.
BEMÆRK: Tamoxifen er lysfølsomt og skal placeres i en brun beholder. - Omkring 8 uger vejes musene med elektroniske vægte og gives en IP-injektion af tamoxifen i en dosis på 150 mg/kg, administreret to gange med 1 uges interval.
- Væg 0,3 g tamoxifen og opløs det i 15 ml majsolie ved ultralyd (effekt = 20%, varighed = 20 min, temperatur = 4 ° C) i en koncentration på 20 mg / ml. Opbevares ved 4 °C.
2. Dissektion og billeddannelse af mus skjoldbruskkirtlen tumorer og metastatiske tumorer
- Præparation
- Forbered dissektionsværktøjerne: steril saks og tang, sterilt blad, 75% alkoholsprayflaske, 20 cm lige kant, vernierkalibre, papirhåndklæder og alkoholbomuld.
- Opløsning til fiksering af musevæv: Forbered 4% paraformaldehydvævsfikseringsopløsning.
- Rengør en 10 cm skål fyldt med ca. 10 ml sterilt fosfatbufret saltvand (PBS) til midlertidig opbevaring af væv, og vask blodet på overfladen af vævet.
- Ekstraktion af skjoldbruskkirtlen
- Aflive musene med kuldioxid med en strømningshastighed på 2,0 l / min i 5 min. Fjern musene fra buret og udfør cervikal dislokation.
- Placer musen på dissekeringsbrættet med den ventrale side opad og hovedet væk fra eksperimentatoren, og fastgør lemmerne på dissekeringsbrættet med sterile sprøjtenåle. For en mere bekvem fjernelse af skjoldbruskkirtelvæv, brug en anden steril sprøjtenål til at fastgøre hovedet.
- Desinficer halsen med tre vekslende runder af en chlorhexidin- eller povidon-jodskrubbe efterfulgt af 75% alkohol. Lav derefter et lille snit over midten af kravebenet med steril saks og tang.
- Fortsæt snittets midterlinje op til munden. Find den submandibulære kirtel og fjern den for at udsætte skjoldbruskkirtlens anatomiske placering, som er placeret nær skjoldbruskkirtlen brusk og luftrør.
- Find skjoldbruskkirtlen, disseker forsigtigt skjoldbruskkirtlen fra resten af halsområdet med steril saks, og læg derefter den fjernede skjoldbruskkirtel i en 10 cm skål fyldt med 10 ml steril PBS.
BEMÆRK: Under fjernelse af skjoldbruskkirtlen, være blid og langsom og undgå at skære halsen blodkar. Hvis nakkekarrene skæres, bliver nakken straks fyldt med blod, og blodet skal straks fjernes med alkoholsvampe for at udsætte skjoldbruskkirtlens anatomiske placering. Før du fjerner skjoldbruskkirtelvævet, skal du nøje observere egenskaberne ved venstre og højre lobes i skjoldbruskkirtlen (størrelse, form osv.) for at undgå at være ude af stand til at skelne mellem venstre og højre lobes i skjoldbruskkirtlen efter fjernelse. - I steril PBS fjernes blodet fra overfladen af skjoldbruskkirtlen med steril saks og skæres forsigtigt luftrøret af. Sæt derefter skjoldbruskkirtelvævet på en steril klud og mål størrelsen af venstre og højre lobes i skjoldbruskkirtlen med vernier kalibre.
- Opdel venstre og højre lobes af skjoldbruskkirtlen i to dele med et sterilt blad. Sæt den ene del i 2 ml 4% paraformaldehydopløsning til fiksering, og sæt den anden del i flydende nitrogen til konservering.
- Ekstraktion af lunge og lever
- Desinficer maven med tre vekslende runder af en chlorhexidin- eller povidon-jodskrubbe og 75% alkohol. Klem derefter lige over musens penis og lav et lille snit, skær langs midterlinjen af maven til den subklaviske knogle og udsæt bughulen.
- Find leveren i den øverste del af maven og fjern den forsigtigt. Placer leveren i steril PBS.
- Skær forsigtigt membranen langs ribbenene for at udsætte brysthulen. Tag derefter fat i brystbenet og træk op for at udvide rummet endnu mere. Find lungen og fjern den. Sæt den fjernede lunge i steril PBS.
- Overhold groft, om der er metastaser i lungen og leveren. Tæl antallet af metastaser og tag en digital post. Brug derefter et sterilt blad til at opdele lunge- og levervæv i to dele. Sæt en del i 3 ml 4% paraformaldehydopløsning til fiksering og en anden del i flydende nitrogen til konservering.
- Dehydrering af væv
- Sæt vævene i dehydreringsboksen. Sæt dehydreringsboksen i kurven ved gradientalkoholdehydrering som følger: 70% alkohol i 1 time; 80% alkohol i 1 time; 95% alkohol i 30 minutter; 95% alkohol i 30 minutter; vandfri ethanol I i 30 min; vandfri ethanol II i 30 minutter; xylen I i 20 minutter; xylen II i 20 minutter; paraffinvoks I i 30 min; paraffinvoks II i 1 time; paraffinvoks III i 30 min.
- Integrer det voksimprægnerede væv i indlejringsmaskinen.
- Sæt først den smeltede voks i indlejringsrammen. Før voksen størkner, skal du fjerne vævet fra dehydreringsboksen og sætte det i indlejringsrammen og derefter fastgøre etiketten.
- Lad voksen køle af ved -20 °C på frysebordet. Når voksen størkner, skal du fjerne voksblokken fra indlejringsrammen og trimme den.
- Placer den trimmede voksblok på en paraffinskiver, indstillet til en tykkelse på 5 μm og en størrelse på 2 cm x 2 cm. Efter sektionering lades sektionerne flyde på en spreder med varmt vand ved 45 °C for at flade vævet ud. Tag vævet op med et objektglas, og bag skiverne i en ovn ved 65 °C i 2 timer.
- Når vandet tørrer og voksen smelter, skal du fjerne diaset med vævet og bruge det til hæmatoxylin og eosin (HE) og immunohistokemisk (IHC) farvning16. Sørg for, at sektionerne er klæbet til diasene til farvning.
3. HE-farvning af den primære tumor og lunge
- Afvoksning
- Sæt diasene med sektionerne i xylen i 10 min.
- Flyt ind i vandfri alkohol (100%) (to flasker) i ca. 3 minutter hver.
- Flyt ind i 95% alkohol (to flasker) i ca. 3 minutter hver.
- Flyt ind i 80% alkohol i ca. 3 min.
- Flyt ind i 50% alkohol i ca. 3 min.
- Flyt ind i postevandet, og vask alkoholen væk i ca. 1 min.
- Farvning
- Flyt diasene ind i hæmatoxylin i 8 min.
- Flyt gliderne i vandet i 1 minut for at vaske hæmatoxylinen væk; Vævet skifter fra blåt til rødt.
- Flyt diasene til 1% saltsyrealkohol i ca. 30 s.
- Flyt rutsjebanerne i vandet, vask i 5 min.
- Flyt diasene i eosin i 90 s, vask dem derefter med vand i 5 minutter.
- Flyt lysbillederne til 50% alkohol, 80% alkohol, 95% alkohol (to flasker) og vandfri alkohol (100%) (to flasker) i 1 min hver.
- Flyt diasene til xylen i 5 min.
- Når diasene er tørre, forsegles de med neutral harpiks.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi inducerede mATC til at undersøge tumorvækst, museoverlevelsestid og patologiske egenskaber. Efter induktion blev musene straks ofret, og prøver (skjoldbruskkirtel, lunge og lever) blev indsamlet, når en af følgende tilstande blev fundet: 1) åndedrætsbesvær forårsaget af tumorkompression; 2) nedsat appetit og unormal vokalisering; 3) usædvanlig sløvhed; og 4) vægttab på over 20%. Under prøvetagningsprocessen fandt vi, at alle mus (12/12) med succes dannede tumorer efter induktion. Vi registrerede musens overlevelsestid, tumorfunktioner / størrelse og metastaserede læsioner.
Groft observerede vi følgende: 1) tumorerne var ømme, og størrelsen af tumorerne på venstre og højre side var inkonsekvent; 2) De fleste mus (11/12) havde lungemetastaser, men ingen havde levermetastaser. Specifikt blev tumorstørrelsen overvåget af dyrehøjfrekvent ultralyd og fotoakustiske billeddannelsessystemer (Vevo®3100) gennem hele processen17. Baseret på ultralydsdataene blev tumorvækstkurven (figur 1A) plottet for at observere den dynamiske ændring af tumorstørrelsen. Desuden voksede tumorerne langsomt i det tidlige stadium (gennemsnitlig tumorstørrelse varierede fra 9,47 mm 2 til 11,75 mm 2 fra dag 0 til dag 60) og blev dramatisk hurtigere i det sene stadium (gennemsnitlig tumorstørrelse varierede fra 11,75 mm 2 til 23,95 mm 2 (fra dag 60 til dag 100). De fleste mus blev ofret i den sene fase. Kort sagt skal mATC med en bestemt tumorlatensperiode overvåges nøje efter 60 dage for at forhindre kvælningsrelateret død.
På den anden side blev musenes overlevelsestid registreret, og en overlevelseskurve (figur 1B) blev plottet. Den mediane overlevelse af mATC var 130 dage, varierende fra 56-166 dage. Derudover blev lungemetastaser fundet i de fleste mATC (ca. 92%) (figur 1C). Vi observerede, at kun én mus i denne kohorte ikke viste lungemetastaser ved grov undersøgelse, og seks mus havde mere end én lungemetastatisk læsion. Der blev ikke fundet levermetastaser. Kort sagt var disse resultater i overensstemmelse med den biologiske opførsel af ATC, som er tilbøjelige til lungemetastase i klinikker.
For bedre at observere den dynamiske proces med mATC ofrede vi musene på to tidspunkter (1 måned og 2 måneder efter induktion). Vi udførte HE-farvning på de primære tumorer og metastatisk lungevæv i mATC (figur 1D). I 1 måned inducerbart væv observerede vi ufuldstændige størknede træk og sameksistensen af follikulære strukturer og maligne celler. Skjoldbruskkirtlens follikulære strukturer forsvandt, og tumoren størknede fuldstændigt efter en 2 måneders induktion. HE-farvning af den primære tumor afslørede, at tumorcellerne var morfologisk forskellige med pleomorfe kæmpeceller (angivet med en rød pil) og spindelformede celler (angivet med en gul pil). Det viste også en bred vifte i nuklear størrelse, og mange celler indeholdt flere kerner. Klare metastatiske foci (angivet med en cirkel) blev set i lungen. HE-farvning af metastatisk lungevæv viste, at det normale lungevæv var en retikulær struktur med klare alveolære strukturer og luftrum. Ikke desto mindre viste lungemetastaser et tab af normal retikulær struktur, lufthulefortykkelse og lungeparenchyma.
I mellemtiden blev IHC-farvning udført for yderligere at karakterisere (Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67 og Caspase-3) mATC-tumorer for at kvantificere celleproliferation og apoptose og undersøge infiltrationen af lymfocytter, T-regelmæssige (Treg) celler og myeloide celler (figur 2A-D). Anti-Ki67-farvning var meget positiv og varierede fra 86,9% til 95,07%, hvilket viste en høj grad af celleproliferation. Antiaktiveret caspase-3-antistof blev anvendt til at teste apoptosehastigheden, der spænder fra 5,2% til 51,9%. Specifikt præsenterede mATC åbenlys CD8 + T-celleinfiltration, hvis forhold varierede fra 0,47% til 10,55% (gennemsnit: 5,93%). Dette indikerede, at mATC ikke var en immunørkentumor, hvilket var i overensstemmelse med ATC-prøver. Desuden definerede Foxp3-farvning Treg-celler, som varierede fra 0,45% til 25,8%. Ud over lymfocytter blev F4/80 og Cd206 anvendt til at definere henholdsvis makrofager og M2-makrofager. Vi fandt, at myeloide celler i vid udstrækning infiltrerede tumorer (F4/80 positiv cellehastighed fra 86,6% til 94,6%; Cd206 positiv cellerate fra 40,4% til 67,7%), hvilket var i overensstemmelse med den tidligere litteratur16. Kort fortalt fandt vi stærkt proliferative tumorceller, lymfocytinfiltration og omfattende infiltration af myeloide celler i mATC, hvilket var i overensstemmelse med kliniske prøver.
Afslutningsvis viste mATC-prøver homogenitet i tumordynamik, metastase og patologiske træk i overensstemmelse med de kliniske prøver. I betragtning af tumordannelseshastigheden var mATC en pålidelig murinmodel.
Figur 1: Tumordynamik og patologiske egenskaber. (A) Tumorvækstkurve hos mus (n = 5). Hver linje repræsenterer en mus: det tidlige stadium spænder fra dag 0 til dag 60, og det sene stadium spænder fra dag 60 til dag 100. (B) Mus' overlevelseskurver (n = 12). Den mediane overlevelse af mATC var 130 dage, varierende fra 56 dage til 166 dage. (C) Lungemetastasekurver hos mus (n = 12). Repræsentative dissektionsbilleder af skjoldbruskkirtlen og lungemetastaser. Den røde pil angiver skjoldbruskkirtlen tumor, og den hvide cirkel angiver metastase i lungen. (D) HE-farvning af den primære tumor (1 måned og 2 måneder efter induktion) og lungemetastase. Den røde pil angiver den pleomorfe kæmpecelle, den gule pil angiver den spindelformede celle, og det cirklede område indikerer en metastase i lungen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Kort beskrivelse af immuncelleinfiltration i mATC. (A) Immunohistokemisk farvning af ATC murin primære tumorer med antistoffer (Cd8, Foxp3). Den røde pil angiver en CD8-positiv celle, den gule pil angiver en Foxp3-positiv celle. (B) Immunohistokemisk farvning af ATC murine primære tumorer med antistoffer (Ki67, Caspase-3). (C) Immunohistokemisk farvning af ATC murine primære tumorer med antistoffer (F4/80, Cd206). D) Kvantificering af IHC. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Listen over primere og PCR-indstillinger, der blev brugt i denne undersøgelse. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trin inden for protokollen for dissektion af skjoldbruskkirteltumor
Under dissektion skal den anatomiske placering af skjoldbruskkirtlen forstås korrekt. Skjoldbruskkirtlen er en sommerfuglformet kirtel placeret på den dorsale side af den submandibulære kirtel nær skjoldbruskkirtlen brusk og luftrøret. Under proceduren blev det omhyggeligt undgået at skære blodarterierne på begge sider af halsen.
Ændring og fejlfinding af mATC-racen
ATC er en sjælden og meget aggressiv malignitet. De kliniske egenskaber hos mATC- og ATC-patienter har visse ligheder. Specifikt er den største dødsårsag i mATC kvælning, hvilket er i overensstemmelse med ATC-patienter. Derfor skal følgende bemærkes under eksperimentet: 1) tag forsigtigt fat i musene og vær opmærksom på deres åndedræt under operationen; 2) nøje overvåge i den sene fase for at forhindre pludselig død og manglende opnåelse af prøver i tide; 3) skjoldbruskkirtlen og lungevævet påvirkes let af blodet på overfladen af vævene til observation og fotografering, så blodvolumenet hos mus kan reduceres ved øjeæble enukleation.
Begrænsninger ved brug af mATC
Forekomsten og udviklingen af human ATC er kompleks og foranderlig, men den genetiske baggrund for mATC er relativt enkel, som kun kan simulere en del af human ATC. For eksempel indeholdt nogle ATC-væv TERT- og BRAF-mutationer, den NOTCH2NL kopinummervariant 18, i stedet for P53-mutationer, som kan have forskellige tumorigenesemekanismer og kliniske patologiske egenskaber 7,19,20. Derudover har ATC normalt et langt tidsforløb før diagnosen, men mATC får en diagnose efter en induktion på 2 måneder. Derfor er der iboende forskelle mellem mATC og human kræft i skjoldbruskkirtlen, dyremodeller kan ikke fuldt ud efterligne alle karakteristika ved human kræft i skjoldbruskkirtlen, og mange terapier, der er begrænset til mennesker, kan ikke evalueres på mATC. Selvom mATC kan bruges til at undersøge de terapeutiske virkninger af forskellige lægemidler med små molekyler, bør flere biologiske lægemidler (f.eks. Antistof eller antistofrelaterede lægemidler) designes specifikt til mus. Derudover tager hele processen med at konstruere betingede knockout-mus og derefter opnå målgenotypen for mus ved krydsning lang tid og kræver visse musekulturbetingelser og koster21,22.
Betydningen af at bruge mATC i forskning i kræft i skjoldbruskkirtlen
Den menneskelige befolknings heterogenitet og sjældenheden af menneskelig ATC hindrer udforskningen af potentielle mekanismer og terapeutiske muligheder for ATC. Som en pålidelig musemodel letter mATC indsamlingen af ATC-væv og beriger ATC-vævsprøvepuljen. mATC kan også bruges til at studere virkningerne af specifikke genfunktioner på ATC, studere de cellulære og molekylære mekanismer i ATC-udvikling, forstå mekanismerne for skjoldbruskkirteltumorprogression og lægemiddelresistens og i sidste ende forbedre prognosen for ATC-patienter16.
Fremtidige anvendelser af mATC
mATC kan bruges til forskning i forskellige aspekter af strålebehandling, kemoterapi, genterapi, immunterapi og målrettet terapi. mATC kan også bruges til at undersøge de terapeutiske virkninger og bivirkninger af regimer, såsom kombinationer mellem forskellige lægemidler eller med strålebehandling. Vi brugte efterfølgende mATC til at undersøge de terapeutiske effekter af strålebehandling kombineret med immunterapi og lægemidler med små molekyler på ATC. Derudover kan mATC bruges til at undersøge virkningerne af forskellige leveringsmetoder eller ruter på antitumorvirkningerne af medicin til at udvikle lægemiddelleveringssystemer med forbedret antitumoraktivitet. I fremtidige kliniske applikationer håber vi at minimere tilbagefaldsraten og dødeligheden hos patienter med kræft i skjoldbruskkirtlen og dermed forbedre patienternes overlevelsesrate.
Vi forventer, at der vil blive udviklet flere ATC-murinmodeller i fremtiden, samt mere dybdegående analyser af ATC i forskellige genetiske baggrunde, såsom PTEN og P13K23. Disse vil mere omfattende afsløre den molekylære mekanisme for ATC-tumorigenese og progression, forudsige resultatet af ATC-behandling og kunne give patienter potentielle terapeutiske mål 24,25,26,27,28. Vi håber, at vi gennem mere eksperimentel udforskning kan forbedre musemodellens modelleringsmetode og forkorte modelleringstiden for at yde flere bidrag til grundforskningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Key Research Development Program of China (2021YFA1301203); National Natural Science Foundation of China (82103031, 82103918, 81973408, 82272933); det kliniske forskningsinkubationsprojekt, West China Hospital, Sichuan University (22HXFH019); det internationale samarbejdsprojekt fra Chengdu Municipal Science and Technology Bureau (2020-GH02-00017-HZ); Naturvidenskabelig stiftelse af Sichuan, 2022NSFSC1314; "1.3.5-projektet for ekspertisediscipliner, West China Hospital, Sichuan University" (ZYJC18035, ZYJC18025, ZYYC20003, ZYJC18003); og Sichuan Science and Technology Program (2023YFS0098).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x Citrate antigen retrieval solution (PH 6.0) | MXB | Cat# MVS-0101 | |
| 50x EDTA antigen retrieval solution(pH 9.5) | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9071 | |
| Brafflox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Caspase-3 | Beyotime | Cat# AC033 | |
| CD8 | Cell Signaling Technology | Cat# 98941; RRID:AB_2756376 | |
| CD206 | Cell Signaling Technology | Cat# 24595; RRID:AB_2892682 | |
| Chamber for anesthesia induction | RWDlifescience | ||
| Enhanced DAB chromogenic kit | MXB | Cat# DAB-2031 | |
| Eosin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9613 | |
| F4/80 | Abcam | Cat# 100790; RRID:AB_10675322 | |
| Foxp3 | Cell Signaling Technology | Cat# 12653; RRID:AB_2797979 | |
| Fully enclosed tissue dehydrator | Leica Biosystems | ASP300S | |
| Hematoxylin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9610 | |
| HistoCore Arcadia fully automatic tissue embedding machine | Leica Biosystems | ||
| Ki67 | Beyotime | Cat# AF1738 | |
| Rotating Slicer | RWDlifescience | Minux S700 | |
| SPlink detection kits (Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems) | ZSGB-GIO | Cat# SP-9001 | |
| TPO-cre/ERT2 mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Trp53flox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Ultrasonic cell crusher | Ningbo Xinyi Ultrasound Equipment Co., Ltd | JY92-IIN | |
| Ultrasound gel | Keppler | KL-250 | |
| Ultrasound system | VisualSonics | Vevo 3100 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Parenti, R., Salvatorelli, L., Magro, G. Anaplastic thyroid carcinoma: Current treatments and potential new therapeutic options with emphasis on TfR1/CD71. International Journal of Endocrinology. 2014, 685396 (2014).
- Baldini, E., et al. In vitro and in vivo effects of the urokinase plasminogen activator inhibitor WX-340 on anaplastic thyroid cancer cell lines. International Journal of Molecular Sciences. 23 (7), 3724 (2022).
- Haugen, B. R. American Thyroid Association Management guidelines for adult patients with thyroid nodules and differentiated thyroid cancer: what is new and what has changed. Cancer. 123 (3), 372-381 (2015).
- O'Neill, J. P., Shaha, A. R.
- Simoes-Pereira, J., Capitao, R., Limbert, E., Leite, V. Anaplastic thyroid cancer: Clinical picture of the last two decades at a single oncology referral centre and novel therapeutic options. Cancers. 11 (8), 1188 (2019).
- Fagin, J. A., Wells, S. A. Biologic and clinical perspectives on thyroid cancer. The New England Journal of Medicine. 375 (11), 1054-1067 (2016).
- Neff, R. L., Farrar, W. B., Kloos, R. T., Burman, K. D.
- Lareau, C. A., et al. Droplet-based combinatorial indexing for massive-scale single-cell chromatin accessibility. Nature Biotechnology. 37 (8), 916-924 (2019).
- Guo, H., et al. Single-cell methylome landscapes of mouse embryonic stem cells and early embryos analyzed using reduced representation bisulfite sequencing. Genome Research. 23 (12), 2126-2135 (2013).
- Mooijman, D., Dey, S. S., Boisset, J. -C., Crosetto, N., van Oudenaarden, A. Single-cell 5hmC sequencing reveals chromosome-wide cell-to-cell variability and enables lineage reconstruction. Nature Biotechnology. 34 (8), 852-856 (2016).
- Smallridge, R. C., Marlow, L. A., Copland, J. A. Anaplastic thyroid cancer: molecular pathogenesis and emerging therapies. Endocrine-Related Cancer. 16 (1), 17-44 (2009).
- Charles, R. -P. Overview of genetically engineered mouse models of papillary and anaplastic thyroid cancers: enabling translational biology for patient care improvement. Current Protocols in Pharmacology. 69, 1-14 (2015).
- Tuttle, R. M., Haugen, B., Perrier, N. D. Updated American joint committee on cancer/tumor-nodemetastasis staging system for differentiated and anaplastic thyroid cancer (8th Edition): What changed and why. Thyroid. 27 (6), 751-756 (2017).
- McFadden, D. G., et al. p53 constrains progression to anaplastic thyroid carcinoma in a Braf-mutant mouse model of papillary thyroid cancer. Protocols of the National Academy of Sciences. 111 (16), 1600-1609 (2014).
- Gunda, V., et al. Combinations of BRAF inhibitor and anti-PD-1/PD-L1 antibody improve survival and tumour immunity in an immunocompetent model of orthotopic murine anaplastic thyroid cancer. British Journal of Cancer. 119 (10), 1223-1232 (2018).
- He, Y., et al. High-resolution ultrasonography for the analysis of orthotopic ATC tumors in a genetically engineered mouse model. Journal of Visualized Experiments. (188), e64615 (2022).
- Zhang, L., et al. Novel recurrent altered genes in Chinese patients with anaplastic thyroid cancer. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (4), 988-998 (2021).
- Luo, H., et al. Pan-cancer single-cell analysis reveals the heterogeneity and plasticity of cancer-associated fibroblasts in the tumor microenvironment. Nature Communications. 13 (1), 6619 (2022).
- Luo, H., et al. Characterizing dedifferentiation of thyroid cancer by integrated analysis. Science Advances. 7 (31), (2021).
- Knostman, K. A. B., Jhiang, S. M., Capen, C. C. Genetic alterations in thyroid cancer: the role of mouse models. Veterinary Pathology. 44 (1), 1-14 (2007).
- Kim, C. S., Zhu, X. Lessons from mouse models of thyroid cancer. Thyroid. 19 (12), 1317-1331 (2009).
- Champa, D., Di Cristofano, A. Modeling anaplastic thyroid carcinoma in the mouse. Hormones and Cancer. 6 (1), 37-44 (2015).
- Cabanillas, M. E., Ryder, M., Jimenez, C. Targeted therapy for advanced thyroid cancer: kinase inhibitors and beyond. Endocrine Reviews. 40 (6), 1573-1604 (2019).
- Ljubas, J., Ovesen, T., Rusan, M. A systematic review of phase II targeted therapy clinical trials in anaplastic thyroid cancer. Cancers. 11 (7), 943 (2019).
- Huang, N. -S., et al. An update of the appropriate treatment strategies in anaplastic thyroid cancer: a population-based study of 735 patients. International Journal of Endocrinology. 2019, 8428547 (2019).
- Subbiah, V., et al. Dabrafenib and trametinib treatment in patients with locally advanced or metastatic BRAF V600-mutant anaplastic thyroid cancer. Journal of Clinical Oncology. 36 (1), 7-13 (2018).
- Baldini, E., et al. Effects of selective inhibitors of Aurora kinases on anaplastic thyroid carcinoma cell lines. Endocrine-Related Cancer. 21 (5), 797-811 (2014).
