Summary
Descriviamo un protocollo per la produzione, la coltura e la visualizzazione dei tumori umani, che hanno metastatizzato alle superfici peritoneali. I campioni tumorali resecati vengono tagliati utilizzando un vibratomo e coltivati su inserti permeabili per una maggiore ossigenazione e vitalità, seguiti da imaging e analisi a valle utilizzando microscopia confocale e citometria a flusso.
Abstract
Lo pseudomixoma peritonei (PMP) è una condizione rara che deriva dalla diffusione di un tumore primario mucinoso e dal conseguente accumulo di cellule tumorali che secernono mucina nella cavità peritoneale. La PMP può derivare da vari tipi di tumori, tra cui appendicolare, ovarico e colon-retto, sebbene le neoplasie appendicolari siano di gran lunga l'eziologia più comune. La PMP è difficile da studiare a causa della sua (1) rarità, (2) modelli murini limitati e (3) istologia mucinosa e acellulare. Il metodo qui presentato consente la visualizzazione e l'interrogazione in tempo reale di questi tipi di tumore utilizzando fette organotipiche ex vivo derivate dal paziente in una preparazione in cui il microambiente tumorale (TME) rimane intatto. In questo protocollo, descriviamo prima la preparazione delle fette tumorali usando un vibratomo e la successiva coltura a lungo termine. In secondo luogo, descriviamo l'imaging confocale delle fette tumorali e come monitorare le letture funzionali della vitalità, l'imaging del calcio e la proliferazione locale. In breve, le fette vengono caricate con coloranti di imaging e vengono poste in una camera di imaging che può essere montata su un microscopio confocale. I video time-lapse e le immagini confocali vengono utilizzati per valutare la fattibilità iniziale e la funzionalità cellulare. Questa procedura esplora anche il movimento cellulare traslazionale e le interazioni di segnalazione paracrina nella TME. Infine, descriviamo un protocollo di dissociazione per fette tumorali da utilizzare per l'analisi della citometria a flusso. L'analisi quantitativa della citometria a flusso può essere utilizzata per test terapeutici da banco a letto per determinare i cambiamenti che si verificano all'interno del panorama immunitario e del contenuto delle cellule epiteliali.
Introduction
Lo pseudomixoma peritonei (PMP) è una sindrome rara con un tasso di incidenza di 1 per milione di persone all'anno1. La maggior parte dei casi di PMP sono causati da metastasi da neoplasie appendicolari. Dato che i topi non hanno un'appendice simile a quella umana, modellare questo tipo di cancro rimane estremamente impegnativo. Mentre la malattia primaria è spesso curabile con la resezione chirurgica, le opzioni di trattamento per la malattia metastatica sono limitate. Pertanto, il razionale per lo sviluppo di questo nuovo modello di fetta organotipica è quello di studiare la patobiologia della PMP. Ad oggi, non esistono modelli di organoidi appendicolari che possano essere coltivati perpetuamente; Tuttavia, un modello recente si è dimostrato utile per la sperimentazione farmacologica di agenti terapeutici e immunoterapia2. Come tale, abbiamo adattato un sistema di coltura a fetta organotipica, che è stato utilizzato in altri tipi di tumori umani, come cervello, seno, pancreas, polmone, ovaio e altri 3,4,5,6.
Oltre alle neoplasie appendicolari, la PMP occasionalmente deriva da altri tipi di tumore, compresi i tumori ovarici7 e, in rare circostanze, neoplasie mucinose papillari intraduttali8 e cancro del colon9. Inoltre, questi tumori tendono a crescere lentamente, con bassi tassi di innesto nei modelli di xenotrapianto derivato dal paziente (PDX)10,11. Date queste sfide, c'è un bisogno insoddisfatto di sviluppare modelli per studiare questa malattia per iniziare a capire la patobiologia della PMP e come queste cellule tumorali: vengono reclutate sulle superfici peritoneali, proliferano e sfuggono alla sorveglianza immunitaria.
Mentre tagliate dalla circolazione vascolare sistemica, le fette tumorali contengono componenti cellulari e acellulari, tra cui la matrice extracellulare, le cellule stromali, le cellule immunitarie, le cellule tumorali, le cellule endoteliali e i nervi. Questo microambiente semi-intatto consente l'indagine funzionale di questi tipi di cellule, che è unicamente vantaggioso rispetto alle colture organoidi 3D, che consistono solo di cellule tumorali12. Mentre le colture organotipiche a fette sono vantaggiose sotto alcuni aspetti, sono anche intrinsecamente un approccio basato su basse entrate, rispetto agli organoidi 3D, che possono essere ampliati e sono adatti per lo screening terapeutico sperimentale multiplex13,14,15. Nel caso del PMP, non ci sono state segnalazioni che documentassero l'istituzione affidabile e il passaggio perpetuo di organoidi derivati da PMP16. Ciò è probabilmente dovuto alla natura a crescita lenta delle cellule tumorali derivate da PMP, nonché al basso numero di cellule epiteliali maligne presenti all'interno di questi tumori mucinosi. Data la necessità di sviluppare modelli per studiare la PMP, le fette organotipiche sono particolarmente adatte a studiare questa malattia. Presentiamo un protocollo per la preparazione, l'imaging e l'analisi di PMP da campioni umani.
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Protocol
La deidentificazione e l'acquisizione di tutti i tessuti sono state eseguite secondo un protocollo approvato dall'IRB presso l'Università della California, San Diego.
1. Preparazione di tessuti PMP umani per la lavorazione e la coltura di tessuti
- Trasporto di tessuti tumorali e microdissezione
- Preparare i terreni di trasporto e coltura: completare il 10% (v/v) di Dulbecco Modified Eagle Media (DMEM), 10% FBS, 2 mM L-Glutammina, 1% Penicillina/Streptomycin (Pen Strep).
- All'arrivo del tessuto e secondo un protocollo istituzionale approvato dall'IRB, trasferire i tessuti tumorali PMP in 35 piatti con un diametro di 6 cm contenente DMEM completo.
- Micro-sezionare regioni solide del tumore da qualsiasi mucina liquefatta usando un bisturi. Mentre i noduli di mucina incorporati all'interno di porzioni solide del tessuto possono essere tagliati, rimuovere tutte le regioni liquefatte del tumore. Oltre a rimuovere qualsiasi mucina liquefatta o regioni di tessuto altamente mucinoso, rimuovere qualsiasi tessuto difficile da tagliare con un bisturi. Tagliare i noduli di tessuto in pezzi più piccoli, di circa 1 cm3 di dimensione.
NOTA: Ottenere noduli tumorali puliti da mucina e ECM densa sarà essenziale per il successo del taglio utilizzando un vibratomo. Come controllo di qualità, il tessuto tumorale che arriva all'interno del laboratorio di ricerca viene prima tagliato da un patologo, che viene successivamente distribuito dal biorepository UCSD. I donatori di tessuti sottoposti a debulking palliativo della torta omentale sono casi ottimali per questo protocollo dato un elevato carico di malattia, che consente una maggiore produzione di fette dalla maggiore massa di disponibilità di tessuto per la ricerca.
ATTENZIONE: Lavorare con tessuti umani richiede la certificazione di Biosicurezza Livello 2 (BSL2). Verificare con l'istituzione la formazione sulle procedure BSL2.
- Preparazione dell'agarosio e incorporazione dei tessuti
- Preparare una soluzione al 5% di agarosio a basso punto di fusione in PBS senza FBS lo stesso giorno dell'arrivo del tessuto. Prestare molta attenzione alla soluzione di agarosio in quanto tende a bollire rapidamente.
NOTA: L'agarosio a basso punto di fusione è essenziale per incorporare pezzi di tessuto. L'agarosio ad alto punto di fusione si solidifica a temperature più elevate, riducendo la vitalità delle fette di tessuto se incorporate. Inoltre, FBS nella soluzione di dissoluzione causerà la formazione di precipitati. - Posizionare i pezzi di tessuto ottenuti in piatti da 6 cm senza liquido. Posizionare non più di 2-3 pezzi per piatto da 6 cm in modo che possano essere rimossi come cubetti di agarosio senza disturbare o toccare altri tessuti.
- Aggiungere la soluzione liquida di agarosio al 5% in piatti da 6 cm contenenti i campioni tumorali da 1 cm3 . Aggiungi abbastanza agarosio per coprire solo il campione. Una volta aggiunto, posizionare i fazzoletti incorporati in un frigorifero a 4 °C per 30 minuti.
- Preparare una soluzione al 5% di agarosio a basso punto di fusione in PBS senza FBS lo stesso giorno dell'arrivo del tessuto. Prestare molta attenzione alla soluzione di agarosio in quanto tende a bollire rapidamente.
- Montaggio di campioni di tessuto sul vibratomo
- Togliere l'agar solidificato dal frigorifero e tagliare i cubetti di agarosio leggermente più grandi della larghezza del tessuto usando un bisturi.
- Applicare la super colla sullo stadio vibratomo e posizionare delicatamente il cubo di agarosio sulla super colla. Lasciare 1-2 minuti affinché la colla si solidifichi. A questo punto, il cubo di agarosio con tessuto dovrebbe essere fissato al palcoscenico.
- Fissare la lama alla vibratoma e impostare lo spessore desiderato della sezione di tessuto. Per un'imaging ottimale a valle mediante microscopia confocale, le sezioni dovrebbero essere di circa 150-250 micron. Premi il pulsante Start e continua a scorrere il taglio del blocco di tessuto di agarosio fino a quando il tessuto non viene completamente tagliato.
NOTA: Se il tessuto non sta tagliando o si stacca dal cubo di agarosio, prendere in considerazione l'incorporazione del tessuto in una concentrazione più elevata di agarosio e tagliare eventuali pezzi di tessuto aggiuntivi che potrebbero essere troppo densi per tagliare o attaccarsi alla lama del vibratomo.
- Coltura di fette di tessuto su inserti permeabili
- Preparare una piastra di inserimento permeabile per la coltura aggiungendo 2 ml di materiale DMEM completo sopra e 3 ml sotto la membrana permeabile.
- Sollevare delicatamente le fette di tessuto dalla camera di taglio del vibratomo usando un pennello sottile e posizionare da due a quattro fette in piatti di coltura permeabili contenenti supporti DMEM completi. Dopo 24 ore, aspirare il terreno con una pipetta e sostituire il terreno con terreni di coltura freschi.
- Coltivare le fette per un massimo di 7 giorni a 37 °C/5% CO2, sostituendo il terreno ogni 24 ore. A questo punto, aggiungere controlli per l'uccisione cellulare (bortezomib) e chemioterapie testabili 5-fluoruracile (5-FU) ai terreni di coltura per eseguire interventi farmacologici.
- Dopo 7 giorni di coltivazione, aspettatevi una perdita di vitalità del 15%-25% rispetto al punto temporale del giorno 0 (immediatamente dopo il taglio) in condizioni non trattate con farmaci (DMEM completo). Misurare la vitalità utilizzando coloranti vitali vivi morti come calceina AM (vivo) e ioduro di propidio (morto).
2. Imaging confocale di fette di tessuto umano vivente
NOTA: Una volta preparate le fette organotipiche del tumore, è essenziale determinare la vitalità del tessuto per eseguire un'analisi a valle efficiente e ottimizzata. Dato che i campioni tumorali hanno uno spessore di 150-250 μm, la microscopia confocale o a due fotoni è altamente raccomandata rispetto ai microscopi a campo largo per determinare gli studi in situ. La citometria a flusso può anche essere utilizzata per determinare la vitalità e le popolazioni cellulari (i metodi sono riportati di seguito). Tuttavia, la risoluzione spaziale viene persa durante l'analisi della citometria a flusso e la vitalità è probabilmente sottovalutata data la necessità di dissociare le fette tumorali con metodi meccanici e chimici.
- Preparazione del reagente e configurazione sperimentale
- Posizionare le fette tumorali per l'analisi di imaging confocale in un singolo pozzetto di un piatto a 12 pozzetti contenente PBS con FBS all'1%. Per gli esperimenti di imaging del calcio, invece di PBS, incubare le fette in soluzione di calcio extracellulare preparata come segue: 125 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,56 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 25 mM HEPES, 0,1% BSA, pH 7,4, 3 mM glucosio, sterile filtrato. Preparare questa soluzione in anticipo e conservarla per un massimo di 1 mese a 4 °C (vedere paragrafo 2.1.8).
- Seguendo le concentrazioni e i protocolli raccomandati dal produttore, colorare i campioni con coloranti di imaging (vedi Tabella dei materiali) per determinare la vitalità delle fette di tessuto. Immagine per 10 min-1 h dopo aver aggiunto il colorante di vitalità.
- Dopo l'incubazione, trasferire le fette in una capsula di Petri con fondo di vetro otticamente trasparente contenente PBS con FBS all'1% da utilizzare per l'imaging su un dispositivo di imaging confocale.
NOTA: per l'imaging confocale, è stata utilizzata la piattaforma confocale Nikon A1R. - Aprire il software di imaging confocale. Iniziare l'imaging a 10x e selezionare la modalità di imaging XYZ. Quindi, configurare le impostazioni di acquisizione come segue.
- Accendere i seguenti laser: 488 nm e 561 nm. Regola il guadagno a 100 con potenza laser all'1%. Regolare la potenza e il guadagno del laser secondo necessità durante l'acquisizione dell'immagine. A seconda della qualità dell'immagine desiderata, selezionare 512 x 512 pixel o 1024 x 1024 pixel per una risoluzione più elevata.
- Selezionare Rimuovi interblocco, quindi selezionare Scansione per avviare l'imaging.
- Per l'imaging del calcio, incubare fette di tessuto con Fluo-4-AM per 1 ora al riparo dalla luce. Seguire il protocollo del produttore per sciogliere Fluo-4-AM in DMSO. Dopo 1 ora, lavare le fette 3 volte con soluzione di calcio extracellulare e seguire il protocollo di imaging nei passaggi 2.1.4-2.1.5.
- Per gli esperimenti di imaging del calcio che utilizzano Fluo-4-AM, selezionare XYZT e deselezionare il laser a 561 nm per aumentare la velocità di acquisizione. Inoltre, utilizzare lo scanner di risonanza per aumentare ulteriormente la velocità di imaging.
3. Dissociazione di fette viventi per citometria a flusso
NOTA: La dissociazione delle fette di tessuto vivente può essere utilizzata per diverse applicazioni a valle, tra cui l'immunotipizzazione, la valutazione della vitalità e l'interrogazione dei cambiamenti nelle popolazioni cellulari dopo l'intervento farmacologico. Devono essere prese misure per garantire che la qualità dei tessuti e la vitalità cellulare siano mantenute durante il processo di dissociazione.
- Tagliare un piccolo pezzo dall'estremità di una punta di pipetta da 1 mL per allargare l'apertura in modo da consentire una vigorosa dissociazione meccanica mediante pipettaggio per 1 minuto.
- Incubare le fette a 37 °C con rotazione per 5-15 minuti in 1 mL di tampone digestivo costituito da DMEM ad alto contenuto di glucosio, 10% di collagenasi/ialuronidasi delicata (GCH), 10% FBS e 10% DNaseI (1 mg/mL di stock).
NOTA: Si riscontrano spesso cambiamenti batch-dipendenti di collagenasi/ialuronidasi. - Eseguire una vigorosa interruzione del tessuto utilizzando la dissociazione meccanica 2-3 volte durante l'incubazione. Assicurati di controllare la digestione, a occhio, ogni 5 minuti per la prova di una digestione completa. Se necessario, interrompere la digestione enzimatica procedendo al punto 3.1.4.
- Una volta digerite, pipettare le fette e il mezzo di digestione sopra un filtro da 70 μm posto sopra un tubo conico da 50 ml. Scegli pezzi più grandi usando una pinza sterile o una pipetta.
- Utilizzando l'estremità posteriore smussata di una siringa di plastica da 5 ml, schiacciare eventuali fette non dissociate più grandi e lavare ulteriormente con 4 ml di PBS contenente il 2% di FBS.
- Prendere il surnatante cellulare dissociato in un tubo conico da 50 mL e ruotare a 300 x g per 5-10 minuti. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet con 1 mL di PBS contenente il 2% di FBS.
- Per preparare il campione per la citometria a flusso, aggiungere il tampone bloccante contenente 50 μL di blocco FC umano e lasciare a temperatura ambiente per 15 minuti. Eseguire la colorazione extracellulare utilizzando i rispettivi anticorpi in 50 μL di PBS contenente il 2% di FBS.
NOTA: Esistono molti sistemi di citometria a flusso. Una volta preparato il campione per la citometria a flusso, fare riferimento al protocollo del produttore per il funzionamento del dispositivo.
4. Intervento farmacologico utilizzando fette di tessuto vivo per analisi di vitalità e proliferazione
NOTA: Una volta preparate le fette di tumore organotipico, gli approcci interventistici possono essere eseguiti utilizzando diversi metodi, tra cui test farmacologici, siRNA e infezione virale di fette di tessuto vivente. Qui discuteremo dei test antidroga, nonché delle letture funzionali a valle, che includono l'analisi della fattibilità utilizzando la proliferazione locale.
- Preparare 10 ml di DMEM completo al 10% v/v con FBS al 10%, 2 mM di L-Glutammina, 1% di Pen Strep.
- Aliquot 5 mL di terreno completo per il controllo e le condizioni di trattamento. Ai restanti 5 ml di media, aggiungere bortezomib (2 μM) per indurre la morte cellulare nelle fette tumorali come controllo positivo.
NOTA: Bortezomib, ad alte concentrazioni, è un farmaco citotossico che induce la morte cellulare. Gli altri farmaci citotossici possono essere utilizzati come controllo positivo per l'uccisione cellulare. - Utilizzando da due a quattro fette di tessuto, che sono state placcate sulle piastre permeabili, aggiungere i mezzi preparati nella fase 4.2 al piatto, nonché eventuali terapie combinate aggiuntive da utilizzare per l'analisi LIVE/DEAD di vitalità a valle mediante microscopia confocale come descritto nella fase 2.1.2, oppure utilizzare un'analisi di vitalità luminescente commerciale utilizzando fette abbinate sequenzialmente.
NOTA: La corrispondenza sequenziale delle fette è essenziale per l'analisi della vitalità luminescente, dato che il saggio di vitalità luminescente si basa sul contenuto di ATP cellulare. Poiché i controlli interni vengono persi durante la lisi cellulare, sono necessarie fette di dimensioni simili poiché i risultati dipendono dal numero iniziale di cellule vitali (cioè, fette sbilanciate si tradurranno in risultati sbilanciati). Se l'utente non ottiene fette sequenziali, l'analisi della vitalità luminescente non è possibile e come tale sarà richiesto un altro metodo di valutazione della vitalità (citometria a flusso o analisi di cellule vive basate sull'imaging confocale). - Lasciare le fette di tessuto in coltura contenente DMEM completo per 2-5 giorni, cambiando terreno e bortezomib e 5-FU a giorni alterni.
- Per l'analisi della vitalità luminescente, aggiungere 500 μL di PBS in un piatto da 12 pozzetti e trasferire le fette di tessuto abbinate in sequenza alla soluzione PBS usando un pennello o utilizzare l'aspirazione di una pipetta da 1 mL delicatamente per trasferirle.
- Rimuovere il PBS e aggiungere la soluzione di analisi della fattibilità luminescente che è stata preparata. Vedere il manuale di istruzioni per la preparazione del reagente.
- Aggiungere 500 μL della soluzione di vitalità luminescente per condizione e incubare con una rotazione lenta sullo shaker a temperatura ambiente per 30 minuti. Leggere la luminescenza utilizzando un lettore di piastre a luminescenza.
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Representative Results
In breve, i campioni di tumore umano da PMP sono ottenuti secondo un protocollo approvato dall'IRB. Il tessuto viene preparato, micro-sezionato e solidificato in uno stampo di agarosio per essere tagliato usando un vibratomo (Figura 1A; Video 1). Una volta tagliate, le fette di tessuto vengono posizionate e coltivate su membrane di inserto permeabili (Figura 1B), che possono essere utilizzate per saggi di imaging in situ, nonché per interrogazioni cellulari e funzionali utilizzando citometria a flusso, analisi di imaging confocale e saggi di citotossicità. Un flusso di lavoro rappresentativo della coltura e della lavorazione di fette di tessuto PMP umano è mostrato nella Figura 1C. L'analisi iniziale per immagini può essere eseguita al microscopio ottico (Figura 2A-B). La colorazione della mucina nelle fette di tessuto è stata visualizzata utilizzando la colorazione periodica acido-Schiff (PAS) (Figura 2C) e anticorpi specifici della mucina (Figura 2D). Per valutare la vitalità, fette tagliate da diverse regioni vengono incubate in calceina AM e ioduro di propidio per determinarne la salute e la vitalità (Figura 2E-F). La maggior parte delle cellule (circa l'85%) sono vitali (calceina AM+; verde), mentre alcune cellule sono morte (ioduro di propidio; rosso) quando visualizzate al microscopio confocale dopo il taglio iniziale. La matrice extracellulare può essere visualizzata utilizzando una luce bianca di incidenza ad una posizione angolare di 180°. I tumori trattati con chemioterapia prima dell'intervento chirurgico spesso mostrano più segnale PI. La proliferazione delle fette di tessuto può essere monitorata utilizzando EdU aggiunto nei terreni di coltura delle fette. Per il rilevamento, è stato utilizzato un kit di test di proliferazione cellulare commerciale e il test è stato eseguito su fette fisse dopo 72 ore di coltura. Le cellule che proliferano attivamente in coltura possono essere misurate nel canale FITC (verde). I nuclei cellulari (DAPI) si sovrapporranno alle cellule che hanno proliferato (EdU+) durante la coltura (Figura 2G). Questi risultati sono quantificati per determinare il numero di cellule proliferanti (nuclei DAPI+) all'interno della fetta tumorale (Figura 2H). I risultati mostrati qui indicano che le fette coltivate sono vitali e proliferative durante la coltura delle fette.
Per identificare la funzionalità delle cellule immunitarie, sono stati condotti studi di imaging Ca2+ su fette di tumore viventi (Figura 3; Video 2). Utilizzando questo approccio è possibile identificare meccanismi di segnalazione diretti e paracrini. Per marcare le cellule immunitarie locali, la citomarcatura in situ è stata eseguita incubando fette con un anticorpo coniugato CD11b-PE insieme a Fluo-4-AM (Figura 3A). Le immagini in scala pseudocolorata che mostrano i livelli intracellulari di Ca 2+ consentono di visualizzare meglio i livelli differenziali di Ca2+ intracellulare (Figura 3B). L'attività spontanea è stata tracciata e le immagini time lapse sono mostrate per prima (Figura 3C), durante (Figura 3D) e dopo (Figura 3E) una risposta intracellulare Ca2+ all'interno dell'evidenziata (riquadro cerchio tratteggiato bianco; Figura 3A,B) Cellula immunitaria CD11b+. Le tracce grezze delle risposte di Ca2+ nella cellula immunitaria CD11b (rosso) insieme ad altre cellule reattive (nere) e non reattive (blu) sono mostrate (Figura 3F). Quantificazione dell'area sotto la curva delle tracce grezze mostrate dalla cellula immunitaria rispondente (CD11b+; rosso Figura 3F) rispetto alla quantificazione della cellula non rispondente (blu; Figura 3F) sono stati quantificati (Figura 3G). Questi risultati indicano che il monitoraggio funzionale delle cellule vive può essere eseguito utilizzando questa piattaforma di fette di tessuto vivente.
L'analisi a valle mediante citometria a flusso può essere utilizzata per immunotipizzare e studiare i cambiamenti nei profili cellulari in risposta agli agenti terapeutici. I risultati possono essere dovuti a segnalazioni dirette o indirette (paracrine). I risultati rappresentativi dell'immunotipizzazione di un campione tumorale di un paziente con PMP sono mostrati nella Figura 4A. Il profilo immunologico del tumore è stato quantificato e il campione donatore 337 è risultato avere alti livelli di M2-macrofagi (Figure 4B). Questi risultati indicano che l'utilizzo di fette di tessuto derivate da PMP consente ai ricercatori di interrogare il panorama cellulare unico del donatore dei campioni tumorali dei pazienti. Ulteriori analisi e interrogazioni del panorama molecolare, cellulare e genomico sono garantite per strategizzare un approccio terapeutico da banco a letto che possa essere utile per i risultati dei pazienti.
La farmacotipizzazione e l'analisi a valle di fette di tessuto da tessuti umani PMP sono un metodo diretto per misurare la chemioresistenza e la sensibilità ai farmaci (Figura 5). I risultati mostrano l'uccisione cellulare delle fette tumorali come confermato dall'analisi di citotossicità e dall'imaging confocale TUNEL in risposta al farmaco citotossico bortezomib (2 μM) e 5-fluorouracile (5-FU; 2 μM) (Figura 5A-C). Poiché le risposte di uccisione del tumore sono altamente eterogenee, è importante stratificare i dati sulla base del grado tumorale e dell'HIPEC precedente, poiché la chemioterapia ripetuta ha dimostrato di essere un metodo inefficace per ablare le cellule tumorali in vivo ed ex vivo17,18. Oltre all'analisi TUNEL, è stata eseguita l'analisi di vitalità luminescente utilizzando fette sequenzialmente abbinate (Figura 5D). È essenziale utilizzare fette tumorali sequenzialmente abbinate quando si eseguono saggi di citotossicità, poiché fette non abbinate porteranno a risultati inaffidabili.
Figura 1: Illustrazione schematica della piattaforma di coltura di fette organotipiche ex vivo di pseudomixoma peritonei con fette di tessuto rappresentative. Un flusso di lavoro rappresentativo per la preparazione di colture organotipiche per l'immunotipizzazione e per studiare le proprietà funzionali dei tumori pseudomixoma di origine appendicolare. (A) L'immagine di un nodulo tumorale vivo montato da una neoplasia da pseudomixoma peritonei (PMP). Il nodulo tumorale è incorporato nell'agarosio, che viene fissato a un vibratomo usando una super colla. (B) La distribuzione rappresentativa delle fette tumorali da taglio e la disposizione in un piatto di coltura trans-well. (C) Lo schema che rappresenta il flusso di lavoro della coltura delle fette e l'interrogazione delle fette tumorali. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Imaging confocale e analisi funzionale di fette di tessuto vivente . (A) Immagine in campo chiaro Ingrandimento 2x di una fetta di tessuto rappresentativa tagliata da un paziente con pseudomixoma peritonei di origine appendicolare. (B) Un ingrandimento 10x della fetta di tessuto rappresentativa mostrata in A. (C) Colorazione PAS di un tessuto di un paziente con pseudomixoma peritonei. Barra della scala 1 mm. (D) Imaging a immunofluorescenza con anticorpi MUC2 (verde), EPCAM (rosso) e DAPI (blu). Barra della scala 50 μm. (E) Imaging immunofluorescenza dell'uso di coloranti vivi (calceina AM; verde) e morti (ioduro di propidio; rosso) da donatore 39. Barra della scala 50 μm. (F) Quantificazione dell'analisi di vitalità utilizzando tre fette separate dal donatore 39 durante il taglio iniziale del tessuto. Le barre di errore sono l'errore standard della media. (G) Imaging immunofluorescenza della proliferazione mediante EdU (verde). I nuclei cellulari sono etichettati con DAPI (blu). (H) Quantificazione del numero di cellule EdU positive per 1.000 cellule. N = 3 fette rappresentative del donatore 39. Le barre di errore sono l'errore standard della media. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Tracciamento di cellule vive mediante imaging di calcio di fette di tessuto vivente. (A) Citomarcatura in situ di una fetta di tessuto vivente da donatore 292. Macrofagi marcati con CD11b mostrati in rosso. Colorante per imaging del calcio Fluo-4-AM (verde). Macrofago co-marcato con CD11b e Fluo-4-AM evidenziati in bianco. (B) Scala pseudocromatica di una fetta di tessuto vivente (mostrata in A). Macrofago evidenziato in bianco come in A. La barra della scala che mostra 100 μm si applica ad A. La barra della scala pseudocolore mostrata come valori medi di grigio. (C-E) Immagine ad alto ingrandimento di Fluo-4-AM prima (C), durante (D) e dopo (E) l'attivazione del calcio. (F) Quantificazione dei livelli di calcio mostrati da tracce grezze. Il macrofago CD11b+ evidenziato in A-E è evidenziato in rosso. Una cella che non risponde è evidenziata in blu. Le altre tracce cellulari che rispondono sono mostrate in nero. (G) Quantificazione dell'area normalizzata sotto la curva mostrata tra il macrofago CD11b+ e una cellula non rispondente. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Immunotipizzazione di fette di tumore umano vivente da pseudomixoma peritonei. (A) Schema rappresentativo per la caratterizzazione citometrica a flusso di profili di cellule immunitarie da tumori da pseudomixoma di origine appendicolare. (B) La percentuale di sottogruppi di cellule immunitarie è codificata a colori così come la barra media del donatore tracciata. I marcatori di colore sopra riportati sono forniti per sottoinsiemi di cellule immunitarie all'interno di grafici a torta. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Analisi rappresentativa per interventi farmacologici mediante coltura organotipica di fette. (A) Immunofluorescenza di immagini rappresentative dall'analisi TUNEL su fette trattate non trattate (colonna sinistra), 5-FU (2 μM; colonna centrale) o Bortezomib (2 μM; colonna destra). (B) Quantificazione dell'immunofluorescenza di TUNEL come percentuale di cellule DAPI+ TUNEL positive da donatore 339. (C) Quantificazione dell'immunofluorescenza di TUNEL come percentuale di cellule PanCK+ positive al TUNEL da donatore 339. (D) Quantificazione di fette trattate con farmaci utilizzando l'analisi di vitalità luminescente del donatore 339 aggregato da 2-3 repliche biologiche sequenzialmente abbinate. CTL indica il controllo. Concentrazione per il controllo, 5-FU (2 μM) e bortezomib (2 μM). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Video 1: Taglio di fette di tessuto umano vivente da noduli tumorali mucinosi metastatici. Clicca qui per scaricare questo video.
Video 2: Imaging del calcio di fette di tumore organotipico vivente da pseudomixoma peritonei. Immagini pseudocolorate di massima proiezione da immagini confocali di una fetta di tessuto vivente caricata con Fluo-4-AM al punto 00:00. La barra della scala è di 50 μm (in basso a destra). Clicca qui per scaricare questo video.
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Discussion
Questo manoscritto descrive una tecnica che può essere utilizzata per coltivare, interrogare e analizzare campioni di tumore umano di pseudomixoma peritonei (PMP). Abbiamo utilizzato numerosi saggi funzionali a valle per interrogare il microambiente immunitario del tumore e una piattaforma per i test da banco a letto.
Mentre il metodo è altamente efficiente nelle nostre mani, richiederà una certa pratica per tagliare campioni tumorali usando un vibratomo. Vale a dire, abbiamo riscontrato problemi dovuti a campioni altamente mucinosi, nonché campioni che sono stati microdiscutibili in modo improprio per rimuovere scaffold non tagliabili (parete addominale, ascite, varie proteine ECM). Pertanto, la microdissezione del tessuto PMP per rimuovere la mucina in eccesso è un passo fondamentale di questo protocollo. Riportiamo un tasso di successo dell'80% nei pazienti con noduli solidi come riportato in precedenza. I campioni di alta qualità erano tecnicamente meno difficili da tagliare18. Inoltre, la preparazione dell'agarosio (senza FBS) e la solidificazione del tessuto nell'agarosio sono importanti anche per questo protocollo al fine di produrre fette di tessuto. Inoltre, sarà essenziale che il ricercatore sia a conoscenza delle informazioni relative alle condizioni dei tessuti e ai parametri chirurgici del campione (posizione delle metastasi, campioni pretrattati), in quanto questi aiuteranno nuove intuizioni, oltre a aiutare a risolvere potenziali problemi di risoluzione dei problemi. Un altro passo critico in questo protocollo è l'analisi funzionale delle cellule tumorali. Qui, è essenziale utilizzare un marcatore epiteliale (come la colorazione della citocheratina) in combinazione con una lettura funzionale (apoptosi, proliferazione) per valutare l'efficacia. Questo è necessario in questo particolare tipo di tumore, perché molti tumori PMP hanno meno del 10% della composizione cellulare come cellule tumorali18. Pertanto, la citometria a flusso o l'imaging confocale è il metodo di analisi preferito. Tuttavia, i saggi ad alto rendimento che utilizzano l'imaging basato sulla luminescenza possono essere appropriati nei tumori con un contenuto di cellule tumorali più elevato, o se si valuta il ruolo delle terapie sulla TME.
Nonostante sia uno strumento potente, la cultura organotipica della fetta ha alcuni limiti. Ad esempio, una sfida di questa tecnica è l'eterogeneità cellulare all'interno dei tumori. Per tenere conto dell'eterogeneità del tumore, le fette tagliate sequenzialmente da regioni tumorali simili dovrebbero essere abbinate tra i gruppi per il trattamento e l'analisi della vitalità cellulare. Tagliare e preparare le fette richiede pratica per microdissezionare scaffold tumorali non tagliabili. Queste abilità sono necessarie per il successo del taglio e dell'ottimizzazione delle fette di tessuto per limitare i pregiudizi sperimentali. Un'altra limitazione è la vitalità dei tessuti durante la coltura a fette. Mentre è possibile mantenere fette di cervello o cardiache per mesi nelle colture 19,20, le colture di fette di PMP sono state attualmente testate solo per circa 1 settimana nella coltura 18, il che impedisce indagini sperimentali a lungo termine, incluso il trattamento farmacologico cronico e la manipolazione genetica. Miglioramenti nei metodi di coltura come l'aggiunta di integratori e fattori di crescita possono essere necessari per prolungare la durata della vita delle colture di fette PMP.
La coltura organotipica della fetta è una tecnica ampiamente utilizzata per studiare vari organi, tra cui cervello, reni e fegato. Abbiamo adottato questa tecnica per l'uso durante la PMP, fornendoci un sistema modello alternativo che, per quanto ne sappiamo, è il primo modello per esaminare il microambiente tumorale PMP in una preparazione semi-intatta. In combinazione con organoidi 3D derivati da pazienti e colture di espianto, questa tecnica offre una piattaforma robusta e flessibile per valutare rapidamente l'efficacia del trattamento e consentire la traduzione immediata di nuove terapie dal banco al letto del paziente.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Kersi Pestonjamasp del Moores Cancer Center imaging core facility per l'aiuto con i microscopi UCSD Specialized Cancer Support Center P30 grant 2P30CA023100. Questo lavoro è stato inoltre supportato da una sovvenzione di pubblicazione JoVE (JRW), nonché da generose donazioni dalla tenuta di Elisabeth e Ad Creemers, dalla Euske Family Foundation, dal Gastrointestinal Cancer Research Fund e dal Peritoneal Metastasis Research Fund (AML).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1 M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| 1 M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| 100 micron filter | ThermoFisher | 22-363-549 | |
| 22 x 40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| 3 M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 5 M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| ATPγS | Tocris | 4080 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | L3224 | |
| CD11b | Biolegend | 101228 | |
| CD206 | Biolegend | 321140 | |
| CD3 | Biolegend | 555333 | |
| CD4 | Biolegend | 357410 | |
| CD45 | Biolegend | 304006 | |
| CD8 | Biolegend | 344721 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G9681 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965084 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Fc-block | BD Biosciences | 564220 | |
| Fluo-4 | Thermo Fisher | F14201 | |
| Gentle Collagenase/Hyaluronidase | Stem Cell | 7912 | |
| Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Imaging Chamber Platform | Warner Instruments | PH-1 | |
| LD-Blue | Biolegend | L23105 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| LIVE/DEAD imaging dyes | Thermofisher | R37601 | |
| Nikon Ti microscope | Nikon | Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096x4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives. | |
| Peristaltic pump | Isamtec | ISM832C | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | L3224 | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA |
References
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