Summary
Мы описываем протокол производства, культивирования и визуализации рака человека, который метастазировал на поверхности брюшины. Резецированные образцы опухоли разрезают с помощью вибратома и культивируют на проницаемых вставках для повышения оксигенации и жизнеспособности, после чего следует визуализация и последующий анализ с использованием конфокальной микроскопии и проточной цитометрии.
Abstract
Псевдомиксома брюшины (ПМП) является редким заболеванием, которое возникает в результате распространения муцинозной первичной опухоли и, как следствие, накопления муцин-секретирующих опухолевых клеток в брюшной полости. ПМП может возникать при различных типах рака, включая аппендикулярный, яичниковый и колоректальный, хотя аппендикулярные новообразования на сегодняшний день являются наиболее распространенной этиологией. PMP сложно изучать из-за его (1) редкости, (2) ограниченных мышиных моделей и (3) муцинозной бесклеточной гистологии. Представленный здесь метод позволяет в режиме реального времени визуализировать и опрашивать эти типы опухолей с использованием органотипических срезов, полученных пациентом ex vivo , в препарате, где микроокружение опухоли (TME) остается нетронутым. В этом протоколе мы сначала описываем приготовление опухолевых срезов с использованием вибратома и последующего длительного посева. Во-вторых, мы описываем конфокальную визуализацию опухолевых срезов и способы мониторинга функциональных показаний жизнеспособности, визуализации кальция и локальной пролиферации. Короче говоря, срезы загружаются красителями для визуализации и помещаются в камеру визуализации, которая может быть установлена на конфокальный микроскоп. Покадровое видео и конфокальные изображения используются для оценки первоначальной жизнеспособности и клеточной функциональности. Эта процедура также исследует трансляционное клеточное движение и паракринные сигнальные взаимодействия в TME. Наконец, мы описываем протокол диссоциации опухолевых срезов, который будет использоваться для анализа проточной цитометрии. Количественный анализ проточной цитометрии может быть использован для терапевтического тестирования от скамьи до постели больного для определения изменений, происходящих в иммунном ландшафте и содержании эпителиальных клеток.
Introduction
Псевдомиксома брюшины (ПМП) является редким синдромом с частотой заболеваемости 1 на миллион человек в год1. Большинство случаев ПМП вызвано метастазами из аппендикулярных новообразований. Учитывая, что у мышей нет аппендикса, похожего на человеческий, моделирование этого типа рака остается чрезвычайно сложной задачей. В то время как первичное заболевание часто излечивается хирургической резекцией, варианты лечения метастатического заболевания ограничены. Таким образом, обоснование разработки этой новой органотипической модели среза заключается в изучении патобиологии PMP. На сегодняшний день не существует аппендикулярных моделей органоидов, которые можно было бы постоянно культивировать; Однако было показано, что недавняя модель полезна для фармакологического тестирования терапевтических агентов и иммунотерапии2. Таким образом, мы адаптировали органотипическую систему культивирования срезов, которая использовалась при других типах рака человека, таких как рак головного мозга, молочной железы, поджелудочной железы, легких, яичников и других 3,4,5,6.
В дополнение к аппендикулярным новообразованиям, ПМП иногда возникает при других типах опухолей, включая рак яичников7, а в редких случаях - внутрипротоковые папиллярные муцинозные новообразования8 и рак толстой кишки9. Кроме того, эти опухоли, как правило, растут медленно, с низкими показателями приживления в моделях ксенотрансплантата пациента (PDX)10,11. Учитывая эти проблемы, существует неудовлетворенная потребность в разработке моделей для изучения этого заболевания, чтобы начать понимать патобиологию PMP и то, как эти раковые клетки: рекрутируются на поверхности брюшины, размножаются и избегают иммунного надзора.
Несмотря на то, что опухолевые срезы вырезаны из системного сосудистого кровообращения, они содержат клеточные и бесклеточные компоненты, включая внеклеточный матрикс, стромальные клетки, иммунные клетки, раковые клетки, эндотелиальные клетки и нервы. Это полуинтактное микроокружение позволяет проводить функциональное исследование этих типов клеток, что является уникальным преимуществом по сравнению с 3D-органоидными культурами, которые состоят только из раковых клеток12. Хотя органотипические культуры срезов в некоторых отношениях являются преимуществами, они также по своей сути являются подходом, основанным на низкой пропускной способности, по сравнению с 3D-органоидами, которые могут быть расширены, и подходят для мультиплексного скрининга исследуемых терапевтических препаратов13,14,15. В случае ПМП не было никаких отчетов, документально подтверждающих надежное укоренение и постоянное прохождение органоидов, полученных из ПМП16. Вероятно, это связано с медленно растущей природой опухолевых клеток, полученных из PMP, а также с низким количеством злокачественных эпителиальных клеток, обнаруженных в этих муцинозных опухолях. Учитывая необходимость разработки моделей для изучения ПМП, органотипические срезы уникально подходят для изучения этого заболевания. Мы представляем протокол подготовки, визуализации и анализа PMP из образцов человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Деидентификация и приобретение всех тканей были выполнены в соответствии с протоколом, одобренным IRB в Калифорнийском университете в Сан-Диего.
1. Подготовка тканей ПМП человека к тканевой обработке и культивированию
- Транспорт опухолевых тканей и микродиссекция
- Подготовьте транспортную и культуральную среду: 10% (об./об.) модифицированной орлиной среды Дульбекко (DMEM), 10% FBS, 2 мМ L-глютамина, 1% пенициллина/стрептомицина (Pen-стрептококк).
- По прибытии ткани и в соответствии с протоколом, одобренным IRB, перенесите опухолевые ткани PMP в 35 чашек диаметром 6 см, содержащих полный DMEM.
- Микропрепарируют твердые участки опухоли от любого разжиженного муцина с помощью скальпеля. В то время как узелки муцина, встроенные в твердые части ткани, могут быть разрезаны, удалите все разжиженные области опухоли. В дополнение к удалению любого разжиженного муцина или областей высокомуцинозной ткани, удалите любую ткань, которую трудно разрезать скальпелем. Разрежьте тканевые узелки на более мелкие кусочки, размером примерно 1 см3 .
ПРИМЕЧАНИЕ: Получение опухолевых узелков, очищенных от муцина и плотного ECM, будет иметь важное значение для успешного разрезания с использованием вибратомы. В качестве контроля качества опухолевая ткань, поступающая в исследовательскую лабораторию, сначала разрезается патологоанатомом, который впоследствии распределяется биорепозиторием UCSD. Доноры тканей, которые подвергаются паллиативному удалению сальникового пирога, являются оптимальными случаями для этого протокола, учитывая высокое бремя болезни, что позволяет производить больше срезов за счет увеличения массы ткани, доступной для исследований.
ВНИМАНИЕ: Для работы с тканями человека требуется сертификация уровня биобезопасности 2 (BSL2). Обратитесь в учебное заведение для обучения процедурам BSL2.
- Приготовление агарозы и заделка тканей
- Готовят 5% раствор низкоплавкой агарозы в ПБС без ФБС в тот же день поступления ткани. Обратите пристальное внимание на раствор агарозы, так как он имеет тенденцию быстро кипеть.
ПРИМЕЧАНИЕ: Агароза с низким содержанием расплава необходима для встраивания кусочков ткани. Агароза с высоким расплавом затвердевает при более высоких температурах, снижая жизнеспособность срезов ткани при встраивании. Кроме того, FBS в растворяющем растворе вызывает образование осадков. - Поместите полученные кусочки ткани в 6-сантиметровую посуду без жидкости. Поместите не более 2-3 штук на 6-сантиметровую посуду, чтобы их можно было снять в виде кубиков агарозы, не нарушая и не касаясь других тканей.
- Добавьте жидкий 5% раствор агарозы в 6-сантиметровую посуду, содержащую 1 см3 опухолевых образца. Добавьте достаточное количество агарозы, чтобы покрыть образец. После добавления поместите встроенные салфетки в холодильник с температурой 4 °C на 30 минут.
- Готовят 5% раствор низкоплавкой агарозы в ПБС без ФБС в тот же день поступления ткани. Обратите пристальное внимание на раствор агарозы, так как он имеет тенденцию быстро кипеть.
- Монтаж образцов тканей на вибратоме
- Достаньте застывший агар из холодильника и нарежьте кубики агарозы чуть больше ширины ткани с помощью скальпеля.
- Нанесите суперклей на стадию вибратома и аккуратно поместите кубик агарозы на суперклей. Подождите 1-2 минуты, чтобы клей застыл. В этот момент агарозный кубик с тканью следует зафиксировать на этапе.
- Закрепите лезвие на вибратоме и установите нужную толщину участка ткани. Для оптимальной последующей визуализации с использованием конфокальной микроскопии срезы должны составлять примерно от 150 до 250 микрон. Нажмите кнопку «Пуск » и продолжайте циклически резать блок агарозной ткани, пока ткань не будет полностью разрезана.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если ткань не разрезается или выбивается из агарозного куба, рассмотрите возможность встраивания ткани в агарозу более высокой концентрации и обрежьте любые дополнительные кусочки ткани, которые могут быть слишком плотными для разрезания или прилипать к лезвию вибратомы.
- Культивирование срезов тканей на проницаемых вставках
- Подготовьте проницаемую вставную пластину для культивирования, добавив 2 мл полной среды DMEM над и 3 мл под проницаемой мембраной.
- Аккуратно извлеките кусочки ткани из режущей камеры вибратома с помощью тонкой кисти и поместите от двух до четырех ломтиков в проницаемые питательные чашки, содержащие полный носитель DMEM. Через 24 ч аспирируйте носитель с помощью пипетки и замените носитель свежими питательными средами.
- Культивируйте срезы до 7 дней при 37 °C/5% CO2, заменяя среду каждые 24 часа. В этот момент времени добавьте контроль за уничтожением клеток (бортезомиб) и тестируемую химиотерапию 5-фторурацил (5-FU) в питательную среду для выполнения фармакологического вмешательства.
- После 7 дней культивирования ожидайте потерю жизнеспособности примерно на 15-25% по сравнению с моментом времени 0 дня (сразу после срезки) в условиях, не обработанных лекарственными препаратами (полный DMEM). Измерьте жизнеспособность, используя живо-мертвые красители, такие как кальцеин AM (живой) и йодид пропидия (мертвый).
2. Конфокальная визуализация срезов тканей живого человека
ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как органотипические срезы опухоли были подготовлены, важно определить жизнеспособность тканей для проведения эффективного и оптимизированного последующего анализа. Учитывая, что образцы опухолей имеют толщину 150-250 мкм, настоятельно рекомендуется конфокальная или двухфотонная микроскопия для определения исследований in situ. Проточная цитометрия также может быть использована для определения жизнеспособности и клеточных популяций (методы приведены ниже). Однако пространственное разрешение теряется во время анализа проточной цитометрии, и жизнеспособность, вероятно, недооценивается, учитывая необходимость диссоциации опухолевых срезов механическими и химическими методами.
- Приготовление реагентов и экспериментальная установка
- Поместите срезы опухоли для анализа конфокальной визуализации в одну лунку 12-луночной чашки, содержащей PBS с 1% FBS. Для экспериментов по визуализации кальция вместо PBS инкубируют срезы во внеклеточном растворе кальция, приготовленном следующим образом: 125 мМ NaCl, 5,9 мМ KCl, 2,56 мМ CaCl 2, 1 мМ MgCl2, 25 мМ HEPES, 0,1% BSA, pH 7,4, 3 мМ глюкозы, стерильно отфильтрованный. Приготовьте этот раствор заранее и храните его до 1 месяца при температуре 4 °C (см. раздел 2.1.8).
- Следуя концентрациям и протоколам, рекомендованным производителем, окрашивайте образцы красителями для визуализации (см. Таблицу материалов) для определения жизнеспособности срезов тканей. Изображение в течение 10 мин-1 ч после добавления жизнеспособного красителя.
- После инкубации переложите ломтики в оптически прозрачную чашку Петри со стеклянным дном, содержащую PBS с 1% FBS, для использования для визуализации на конфокальном устройстве визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для конфокальной съемки использовалась конфокальная платформа Nikon A1R. - Откройте программное обеспечение для конфокальной визуализации. Начните визуализацию с 10x и выберите режим визуализации XYZ. Затем настройте параметры сбора данных следующим образом.
- Включите следующие лазеры: 488 нм и 561 нм. Отрегулируйте усиление до 100 с мощностью лазера 1%. Отрегулируйте мощность и усиление лазера по мере необходимости во время получения изображения. В зависимости от желаемого качества изображения выберите 512 x 512 пикселей или 1024 x 1024 пикселей для более высокого разрешения.
- Выберите "Удалить блокировку", а затем выберите "Сканировать", чтобы начать создание образа.
- Для визуализации кальция инкубируйте срезы тканей с помощью Fluo-4-AM в течение 1 часа в защищенном от света месте. Следуйте протоколу производителя для растворения Fluo-4-AM в ДМСО. Через 1 ч промойте ломтики 3 раза внеклеточным раствором кальция и следуйте протоколу визуализации на этапах 2.1.4-2.1.5.
- Для экспериментов по визуализации кальция с использованием Fluo-4-AM выберите XYZT и снимите выбор с лазера 561 нм, чтобы увеличить скорость захвата. Кроме того, используйте резонансный сканер для дальнейшего увеличения скорости визуализации.
3. Диссоциация живых срезов для проточной цитометрии
ПРИМЕЧАНИЕ: Диссоциация срезов живой ткани может быть использована для нескольких последующих применений, включая иммунотипирование, оценку жизнеспособности и опрос изменений в клеточных популяциях после фармакологического вмешательства. Следует предпринять шаги для обеспечения того, чтобы качество тканей и жизнеспособность клеток поддерживались во время процесса диссоциации.
- Отрежьте небольшой кусочек от конца наконечника пипетки объемом 1 мл, чтобы расширить отверстие, чтобы обеспечить энергичную механическую диссоциацию путем пипетки в течение 1 минуты.
- Инкубируйте ломтики при 37 ° C с вращением в течение 5-15 минут в 1 мл буфера для пищеварения, состоящего из DMEM с высоким содержанием глюкозы, 10% щадящей коллагеназы / гиалуронидазы (GCH), 10% FBS и 10% DNaseI (1 мг / мл).
ПРИМЕЧАНИЕ: Часто встречаются пакетозависимые изменения коллагеназы/гиалуронидазы. - Выполняют энергичное разрушение тканей с помощью механической диссоциации 2-3 раза во время инкубации. Обязательно проверяйте пищеварение на глаз каждые 5 минут на наличие признаков полного пищеварения. При необходимости остановите ферментативное пищеварение, перейдя к шагу 3.1.4.
- После переваривания срезы и среду для разложения пипеткой помещают поверх фильтра 70 мкм, помещенного поверх конической трубки объемом 50 мл. Собирайте более крупные кусочки с помощью стерильных щипцов или пипетки.
- Используя тупой задний конец пластикового шприца объемом 5 мл, разомните все более крупные недиссоциированные ломтики и дополнительно промойте 4 мл PBS, содержащего 2% FBS.
- Возьмите надосадочную жидкость диссоциированной клетки в конической пробирке объемом 50 мл и вращайте при 300 x g в течение 5-10 минут. Удалите надосадочную жидкость и промойте гранулы 1 мл PBS, содержащего 2% FBS.
- Чтобы подготовить образец к проточной цитометрии, добавьте блокирующий буфер, содержащий 50 мкл человеческого Fc-блока, и оставьте при комнатной температуре на 15 минут. Проведите внеклеточное окрашивание с использованием соответствующих антител в 50 мкл PBS, содержащего 2% FBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Существует множество систем проточной цитометрии. После того, как образец подготовлен к проточной цитометрии, обратитесь к протоколу производителя для работы устройства.
4. Фармакологическое вмешательство с использованием срезов живых тканей для анализа жизнеспособности и пролиферации
ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как органотипические срезы опухоли были подготовлены, интервенционные подходы могут быть выполнены с использованием нескольких методов, включая тестирование лекарств, миРНК, а также вирусную инфекцию срезов живых тканей. Здесь мы обсудим тестирование на наркотики, а также последующие функциональные показания, которые включают анализ жизнеспособности с использованием локальной пролиферации.
- Приготовьте 10 мл 10% v/v полного DMEM с 10% FBS, 2 мМ L-глютамина, 1% стрептококка.
- Aliquot 5 мл полной среды для контроля и условий лечения. К оставшимся 5 мл среды добавьте бортезомиб (2 мкМ), чтобы вызвать гибель клеток в опухолевых срезах в качестве положительного контроля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Бортезомиб в высоких концентрациях является цитотоксическим препаратом, вызывающим гибель клеток. Другие цитостатические препараты могут быть использованы в качестве положительного контроля для уничтожения клеток. - Используя от двух до четырех срезов ткани, которые были нанесены на проницаемую посуду, добавляют среду, приготовленную на шаге 4.2, в чашку, а также любые дополнительные комбинированные методы лечения, которые будут использоваться для последующего анализа жизнеспособности LIVE/DEAD с использованием конфокальной микроскопии, как описано на шаге 2.1.2, или используют коммерческий люминесцентный анализ жизнеспособности с использованием последовательно подобранных срезов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательное сопоставление срезов имеет важное значение для анализа люминесцентной жизнеспособности, учитывая, что анализ люминесцентной жизнеспособности основан на клеточном содержании АТФ. Поскольку внутренний контроль теряется во время лизиса клеток, требуются срезы одинакового размера, поскольку результаты зависят от начального количества жизнеспособных клеток (т. е. несбалансированные срезы приведут к несбалансированным результатам). Если пользователь не получает последовательные срезы, люминесцентный анализ жизнеспособности невозможен, и поэтому потребуется другой метод оценки жизнеспособности (проточная цитометрия или анализ живых клеток на основе конфокальной визуализации). - Срезы тканей оставляют в культуре, содержащей полный ДМЭМ, на 2-5 дней, меняя среду, а также бортезомиб и 5-ФУ через день.
- Для анализа люминесцентной жизнеспособности добавьте 500 мкл PBS в 12-луночную чашку и перенесите последовательно подобранные срезы ткани в раствор PBS с помощью кисти или осторожно используйте всасывание пипетки объемом 1 мл, чтобы перенести их.
- Удалите PBS и добавьте приготовленный люминесцентный раствор для анализа жизнеспособности. Смотрите инструкцию по приготовлению реагента.
- Добавляют 500 мкл люминесцентного жизнеспособного раствора в каждом условии и инкубируют при медленном вращении на шейкере при комнатной температуре в течение 30 мин. Считывание люминесценции с помощью считывателя люминесцентных пластин.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Короче говоря, образцы опухолей человека из PMP получают в соответствии с протоколом, одобренным IRB. Ткань подготавливают, микропрепарируют и затвердевают в агарозной форме для разрезания с помощью вибратома (рис. 1А; Видео 1). После разрезания срезы ткани помещают и культивируют на проницаемых вставных мембранах (рис. 1B), которые можно использовать для визуализационных анализов in situ, а также для клеточного и функционального опроса с использованием проточной цитометрии, анализа конфокальной визуализации и анализов цитотоксичности. Репрезентативный рабочий процесс культивирования и обработки срезов тканей PMP человека показан на рисунке 1C. Первичный визуальный анализ может быть выполнен с помощью световой микроскопии (рис. 2A-B). Окрашивание муцина в срезах тканей визуализировали с помощью периодического окрашивания кислотой Шиффа (PAS) (рис. 2C), а также муцин-специфических антител (рис. 2D). Для оценки жизнеспособности срезы, срезанные из разных регионов, инкубируют в кальцеине AM и йодиде пропидия для определения их здоровья и жизнеспособности (рис. 2E-F). Большинство клеток (примерно 85%) жизнеспособны (кальцеин AM+; зеленый), в то время как некоторые клетки мертвы (йодид пропидия; красный) при визуализации с помощью конфокальной микроскопии после первоначального разреза. Внеклеточный матрикс можно визуализировать с помощью падающего белого света в угловом положении 180°. Опухоли, обработанные химиотерапией до операции, часто показывают больше PI-сигнала. Пролиферацию срезов тканей можно отследить с помощью EdU, добавленного в питательную среду для срезов. Для обнаружения использовался коммерческий набор для анализа пролиферации клеток, и анализ проводился на фиксированных срезах после 72 часов культивирования. Активно пролиферирующие клетки в культуре можно измерить в канале FITC (зеленый). Ядра клеток (DAPI) будут перекрываться с клетками, которые размножились (EdU+) во время культивирования (рис. 2G). Эти результаты количественно оцениваются для определения количества пролиферирующих клеток (ядер DAPI+) в опухолевом срезе (рис. 2H). Результаты, показанные здесь, показывают, что культивируемые срезы жизнеспособны и пролиферативны во время культивирования срезов.
Для определения функциональности иммунных клеток были проведены визуализирующие исследования Ca2+ на срезах живых опухолей (рис. 3; Видео 2). Используя этот подход, можно идентифицировать прямые и паракринные сигнальные механизмы. Для маркировки местных иммунных клеток цитомечение in situ проводили путем инкубации срезов с конъюгированным антителом CD11b-PE вместе с Fluo-4-AM (рис. 3A). Псевдоцветные масштабированные изображения, показывающие внутриклеточные уровни Ca 2+, лучше позволяют визуализировать дифференциальные уровни внутриклеточного Ca2+ (рис. 3B). Спонтанная активность была отслежена, и покадровые изображения показаны до (рис. 3C), во время (рис. 3D) и после (рис. 3E) внутриклеточного ответа Ca2+ в выделенном (белая пунктирная рамка; Рисунок 3A,B) CD11b+ иммунная клетка. Показаны необработанные следы ответов Ca2+ в иммунной клетке CD11b (красный) вместе с другими чувствительными (черный) и нечувствительными клетками (синий) (рис. 3F). Количественная оценка площади под кривой необработанных следов, показанных от реагирующей иммунной клетки (CD11b+; красный рисунок 3F), по сравнению с количественной оценкой неотвечающей клетки (синий; Рисунок 3F) были количественно оценены (рис. 3G). Эти результаты показывают, что функциональное отслеживание живых клеток может быть выполнено с использованием этой платформы для среза живой ткани.
Последующий анализ с использованием проточной цитометрии может быть использован для иммунотипа, а также для исследования изменений клеточных профилей в ответ на терапевтические агенты. Результаты могут быть обусловлены прямой передачей сигналов или косвенной (паракринной) сигнализацией. Репрезентативные результаты иммунотипирования образца опухоли пациента с помощью ПМП показаны на рисунке 4А. Иммунопрофиль опухоли был количественно определен, и в донорском образце 337 было обнаружено высокое содержание М2-макрофагов (рис. 4B). Эти результаты показывают, что использование срезов тканей, полученных из PMP, позволяет исследователям исследовать уникальный донорский клеточный ландшафт образцов опухоли пациента. Дальнейший анализ и исследование молекулярного, клеточного и геномного ландшафта необходимы для разработки стратегии терапевтического подхода «от скамейки к постели больного», который может быть полезен для результатов лечения пациентов.
Фармакотипирование и последующий анализ срезов тканей из тканей человека PMP являются прямым методом измерения химиорезистентности и чувствительности к лекарственным средствам (рис. 5). Результаты показывают гибель клеток опухолевых срезов, что подтверждается анализом цитотоксичности, а также конфокальной визуализацией TUNEL в ответ на цитотоксический препарат бортезомиб (2 мкМ) и 5-фторурацил (5-FU; 2 мкМ) (рис. 5A-C). Поскольку реакции на уничтожение опухолей очень неоднородны, важно стратифицировать данные на основе степени опухоли и предшествующего HIPEC, поскольку было показано, что повторная химиотерапия является неэффективным методом удаления опухолевых клеток in vivo и ex vivo17,18. В дополнение к анализу TUNEL был проведен анализ люминесцентной жизнеспособности с использованием последовательно согласованных срезов (рис. 5D). При проведении анализов цитотоксичности важно использовать последовательно подобранные опухолевые срезы, так как несовпадающие срезы приведут к ненадежным результатам.
Рисунок 1: Схематическая иллюстрация органотипической платформы культуры срезов pseudomyxoma peritonei ex vivo с репрезентативными срезами тканей. Репрезентативный рабочий процесс подготовки органотипических срезовых культур для иммунотипирования и исследования функциональных свойств опухолей псевдомиксомы аппендикулярного происхождения. (A) Изображение живого опухолевого узла из новообразования псевдомиксомы брюшины (ПМП). Опухолевый узелок встраивается в агарозу, которая фиксируется к вибратому с помощью суперклея. (B) Репрезентативное распределение разрезающих опухолевых срезов и их расположение в транс-лунальной чашке для культивирования. (C) Схема, представляющая рабочий процесс культивирования срезов и опроса опухолевых срезов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Конфокальная визуализация и функциональный анализ срезов живой ткани. (A) Изображение светлого поля 2-кратное увеличение репрезентативного среза ткани, вырезанного у пациента с псевдомиксомой брюшины аппендикулярного происхождения. (B) 10-кратное увеличение репрезентативного среза ткани, показанного в A. (C) PAS-окрашивание ткани пациента с псевдомиксомой брюшины. Масштабная линейка 1 мм. (D) Иммунофлуоресцентная визуализация с использованием антител MUC2 (зеленый), EPCAM (красный) и DAPI (синий). Масштабная линейка 50 мкм. (E) Иммунофлуоресцентная визуализация с использованием живых (кальцеин AM; зеленый) и мертвых (йодид пропидия; красный) красителей от донора 39. Масштабная линейка 50 мкм. (F) Количественная оценка анализа жизнеспособности с использованием трех отдельных срезов донора 39 во время первоначального разреза ткани. Полосы погрешности - это стандартная погрешность среднего значения. (G) Иммунофлуоресцентная визуализация пролиферации с использованием EdU (зеленый). Ядра клеток помечены DAPI (синий). (H) Количественная оценка количества EdU-положительных клеток на 1 000 клеток. N = 3 репрезентативных среза от донора 39. Полосы погрешности - это стандартная погрешность среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Отслеживание живых клеток с использованием кальциевой визуализации срезов живой ткани. (A) Цитомечение in situ среза живой ткани от донора 292. Меченые CD11b макрофаги показаны красным цветом. Кальциевый краситель для визуализации Флуо-4-АМ (зеленый). Макрофаг, меченный совместно с CD11b и Fluo-4-AM, выделен белым цветом. (B) Псевдоцветная шкала среза живой ткани (показана на рисунке A). Макрофаг выделен белым цветом, как в A. Масштабная линейка, показывающая 100 мкм, относится к A. Псевдоцветная шкала отображается как средние серые значения. (С-Е) Изображение Fluo-4-AM с большим увеличением до (C), во время (D) и после (E) активации кальция. (F) Количественная оценка уровней кальция, показанная необработанными следами. Макрофаг CD11b+, выделенный в A-E, выделен красным цветом. Ячейка, не отвечающая на запросы, подсвечивается синим цветом. Другие следы реагирующих клеток показаны черным цветом. (G) Количественная оценка нормализованной площади под кривой, показанной между макрофагом CD11b + и неотвечающей клеткой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Иммунотипирование живых опухолевых срезов человека из псевдомиксомы брюшины. (A) Репрезентативная схема для выполнения характеристики проточной цитометрии профилей иммунных клеток из опухолей псевдомиксомы аппендикулярного происхождения. (B) Процент подмножеств иммунных клеток имеет цветовую маркировку, а также график среднего показателя донора. Приведенные выше цветовые маркеры предназначены для подмножеств иммунных клеток в круговых диаграммах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Репрезентативный анализ фармакологического вмешательства с использованием органотипической культуры срезов. (A) Иммунофлуоресценция репрезентативных изображений из анализа TUNEL на необработанных срезах (левый столбец), 5-FU (2 мкМ; средний столбец) или бортезомиб (2 мкМ; правый столбец). (B) Количественная оценка иммунофлуоресценции TUNEL в процентах от TUNEL-положительных DAPI+ клеток от донора 339. (C) Количественная оценка иммунофлуоресценции TUNEL в процентах от TUNEL-положительных клеток PanCK+ от донора 339. (D) Количественная оценка обработанных лекарственными препаратами срезов с использованием люминесцентного анализа жизнеспособности донора 339, объединенного из 2-3 последовательно совпадающих биологических реплик. CTL обозначает контроль. Концентрация для контроля, 5-FU (2 мкМ) и бортезомиб (2 мкМ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Видео 1: Вырезание срезов живых тканей человека из метастатических муцинозных опухолевых узелков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Видео 2: Кальциевая визуализация живых органотипических опухолевых срезов псевдомиксомы брюшины. Псевдоцветные изображения максимальной проекции из конфокальных изображений среза живой ткани, загруженного Fluo-4-AM в момент времени 00:00. Масштабная линейка составляет 50 мкм (внизу справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой рукописи описывается метод, который может быть использован для культивирования, опроса и анализа образцов опухолей псевдомиксомы брюшины человека (ПМП). Мы использовали многочисленные последующие функциональные анализы для опроса иммунного микроокружения опухоли и платформу для тестирования от стенда до постели больного.
Несмотря на то, что этот метод очень эффективен в наших руках, он потребует некоторой практики, чтобы вырезать образцы опухолей с помощью вибратомы. А именно, мы столкнулись с проблемами, которые были связаны с высокомуцинозными образцами, а также образцами, которые были неправильно микрорассечены для удаления неразрезаемых каркасов (брюшная стенка, асцит, различные белки ECM). Таким образом, микродиссекция ткани PMP для удаления избытка муцина является важным шагом этого протокола. Мы сообщаем о 80% успешности у пациентов с твердыми узелками, как сообщалось ранее. Образцы высокого качества были технически менее сложными для резки18. Кроме того, приготовление агарозы (без FBS) и затвердевание ткани в агарозе также важны для этого протокола для получения срезов ткани. Кроме того, для исследователя будет важно знать информацию о состоянии тканей и хирургических параметрах образца (расположение метастазов, предварительно обработанные образцы), поскольку это поможет получить новые идеи, а также поможет решить потенциальные проблемы с устранением неполадок. Еще одним важным шагом в этом протоколе является функциональный анализ опухолевых клеток. Здесь важно использовать эпителиальный маркер (например, окрашивание цитокератином) в сочетании с функциональным считыванием (апоптоз, пролиферация) для оценки эффективности. Это необходимо при данном конкретном типе опухоли, потому что многие опухоли ПМП имеют менее 10% клеточного состава в виде опухолевых клеток18. Таким образом, проточная цитометрия или конфокальная визуализация является предпочтительным методом анализа. Тем не менее, высокопроизводительные анализы с использованием визуализации на основе люминесценции могут быть уместны при опухолях с более высоким содержанием опухолевых клеток или при оценке роли терапевтических средств в TME.
Несмотря на то, что органотипическая культура срезов является мощным инструментом, она имеет определенные ограничения. Например, проблемой этого метода является клеточная гетерогенность в опухолях. Чтобы учесть гетерогенность опухоли, последовательно вырезанные срезы из аналогичных областей опухоли должны быть сопоставлены между группами для лечения и анализа жизнеспособности клеток. Нарезка и подготовка срезов требует практики микрорассечения неразрезаемых опухолевых каркасов. Эти навыки необходимы для успешной резки и оптимизации срезов тканей, чтобы ограничить экспериментальные предубеждения. Еще одним ограничением является жизнеспособность тканей во время культивирования срезов. В то время как в культурах 19,20 можно сохранять срезы мозга или сердца в течение нескольких месяцев, культуры срезов из PMP в настоящее время тестируются только в течение примерно 1 недели в культуре18, что предотвращает долгосрочные экспериментальные исследования, включая хроническое медикаментозное лечение и генетические манипуляции. Для продления срока службы культур срезов PMP могут потребоваться усовершенствования методов культивирования, такие как добавление добавок и факторов роста.
Органотипическая культура срезов является широко используемым методом для изучения различных органов, включая мозг, почки и печень. Мы приняли эту технику для использования во время ПМП, предоставив нам альтернативную модельную систему, которая, насколько нам известно, является первой моделью для изучения микроокружения опухоли ПМП в полуинтактном препарате. В сочетании с 3D-органоидами, полученными от пациентов, и эксплантными культурами этот метод предлагает надежную и гибкую платформу для быстрой оценки эффективности лечения и позволяет немедленно переводить новые методы лечения со скамьи на кровать.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Керси Пестонджамасп из центра визуализации Онкологического центра Мура за помощь с микроскопами UCSD Специализированный центр поддержки рака P30 грант 2P30CA023100. Эта работа была дополнительно поддержана грантом на публикацию JoVE (JRW), а также щедрыми подарками от поместья Элизабет и Эд Кримерс, Фонда семьи Юске, Фонда исследований рака желудочно-кишечного тракта и Фонда исследований метастазов в брюшной полости (AML).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1 M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| 1 M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| 100 micron filter | ThermoFisher | 22-363-549 | |
| 22 x 40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| 3 M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 5 M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| ATPγS | Tocris | 4080 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | L3224 | |
| CD11b | Biolegend | 101228 | |
| CD206 | Biolegend | 321140 | |
| CD3 | Biolegend | 555333 | |
| CD4 | Biolegend | 357410 | |
| CD45 | Biolegend | 304006 | |
| CD8 | Biolegend | 344721 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G9681 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965084 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Fc-block | BD Biosciences | 564220 | |
| Fluo-4 | Thermo Fisher | F14201 | |
| Gentle Collagenase/Hyaluronidase | Stem Cell | 7912 | |
| Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Imaging Chamber Platform | Warner Instruments | PH-1 | |
| LD-Blue | Biolegend | L23105 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| LIVE/DEAD imaging dyes | Thermofisher | R37601 | |
| Nikon Ti microscope | Nikon | Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096x4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives. | |
| Peristaltic pump | Isamtec | ISM832C | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | L3224 | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA |
References
- Bevan, K. E., Mohamed, F., Moran, B. J.
- Votanopoulos, K. I., et al. Appendiceal cancer patient-specific tumor organoid model for predicting chemotherapy efficacy prior to initiation of treatment: A feasibility study. Annals of Surgical Oncology. 26 (1), 139-147 (2019).
- Holliday, D. L., et al. The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models. Journal of Clinical Pathology. 66 (3), 253-255 (2013).
- Koerfer, J., et al. Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer. Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).
- Misra, S., et al. Ex vivo organotypic culture system of precision-cut slices of human pancreatic ductal adenocarcinoma. Scientific Reports. 9 (1), 2133 (2019).
- Ohnishi, T., Matsumura, H., Izumoto, S., Hiraga, S., Hayakawa, T. A novel model of glioma cell invasion using organotypic brain slice culture. Cancer Research. 58 (14), 2935-2940 (1998).
- Seidman, J. D., Elsayed, A. M., Sobin, L. H., Tavassoli, F. A. Association of mucinous tumors of the ovary and appendix. A clinicopathologic study of 25 cases. The Amerian Journal of Surgical Pathology. 17 (1), 22-34 (1993).
- Mizuta, Y., et al. Pseudomyxoma peritonei accompanied by intraductal papillary mucinous neoplasm of the pancreas. Pancreatology. 5 (4-5), 470-474 (2005).
- Gong, Y., Wang, X., Zhu, Z. Pseudomyxoma peritonei originating from transverse colon mucinous adenocarcinoma: A case report and literature review. Gastroenterology Research and Practice. 2020, 5826214 (2020).
- Fleten, K. G., et al. Experimental treatment of mucinous peritoneal metastases using patient-derived xenograft models. Translational Oncology. 13 (8), 100793 (2020).
- Kuracha, M. R., Thomas, P., Loggie, B. W., Govindarajan, V. Patient-derived xenograft mouse models of pseudomyxoma peritonei recapitulate the human inflammatory tumor microenvironment. Cancer Medicine. 5 (4), 711-719 (2016).
- Jiang, X., et al. Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment. Oncoimmunology. 6 (7), 1333210 (2017).
- Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).
- Liu, L., Yu, L., Li, Z., Li, W., Huang, W. Patient-derived organoid (PDO) platforms to facilitate clinical decision making. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 40 (2021).
- Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 45 (2019).
- Carr, N. J. New insights in the pathology of peritoneal surface malignancy. Journal of Gastrointestinal Oncology. 12, 216-229 (2021).
- Votanopoulos, K. I., et al. Outcomes of repeat cytoreductive surgery with hyperthermic intraperitoneal chemotherapy for the treatment of peritoneal surface malignancy. Journal of the American College of Surgeons. 215 (3), 412-417 (2012).
- Weitz, J., et al. An ex-vivo organotypic culture platform for functional interrogation of human appendiceal cancer reveals a prominent and heterogenous immunological landscape. Clinical Cancer Research. 28 (21), 4793-4806 (2022).
- Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research. Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).
- Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies. Organogenesis. 5 (2), 62-66 (2009).
