Summary
نحن نصف بروتوكولا لإنتاج وثقافة وتصور السرطانات البشرية ، والتي انتشرت إلى الأسطح البريتونية. يتم قطع عينات الورم المقطوعة باستخدام اهتزاز وزراعتها على إدخالات منفذة لزيادة الأوكسجين والقدرة على البقاء ، تليها تحليلات التصوير والمصب باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر وقياس التدفق الخلوي.
Abstract
الورم المخاطي الصفاق الكاذب (PMP) هو حالة نادرة تنتج عن انتشار ورم أولي مخاطي وما ينتج عن ذلك من تراكم الخلايا السرطانية التي تفرز الميوسين في التجويف البريتوني. يمكن أن ينشأ PMP من أنواع مختلفة من السرطانات ، بما في ذلك الزائدة الدودية والمبيض والقولون والمستقيم ، على الرغم من أن أورام الزائدة الدودية هي إلى حد بعيد المسببات الأكثر شيوعا. من الصعب دراسة PMP بسبب (1) ندرته ، (2) نماذج الفئران المحدودة ، و (3) الأنسجة المخاطية اللاخلوية. تسمح الطريقة المعروضة هنا بالتصور والاستجواب في الوقت الفعلي لأنواع الأورام هذه باستخدام شرائح النمط العضوي خارج الجسم الحي المشتقة من المريض في إعداد تظل فيه البيئة المكروية للورم (TME) سليمة. في هذا البروتوكول ، نصف أولا تحضير شرائح الورم باستخدام الاهتزاز والثقافة اللاحقة طويلة الأجل. ثانيا ، نصف التصوير البؤري لشرائح الورم وكيفية مراقبة القراءات الوظيفية للحياة وتصوير الكالسيوم والانتشار المحلي. باختصار ، يتم تحميل الشرائح بأصباغ التصوير ويتم وضعها في غرفة تصوير يمكن تركيبها على مجهر متحد البؤر. يتم استخدام مقاطع الفيديو ذات الفاصل الزمني والصور متحدة البؤر لتقييم الجدوى الأولية والوظائف الخلوية. يستكشف هذا الإجراء أيضا الحركة الخلوية الانتقالية ، وتفاعلات إشارات paracrine في TME. أخيرا ، وصفنا بروتوكول تفكك لشرائح الورم لاستخدامها في تحليل التدفق الخلوي. يمكن استخدام تحليل قياس التدفق الخلوي الكمي للاختبار العلاجي من مقاعد البدلاء إلى السرير لتحديد التغييرات التي تحدث داخل المشهد المناعي ومحتوى الخلايا الظهارية.
Introduction
الورم المخاطي الصفاق الكاذب (PMP) هو متلازمة نادرة بمعدل حدوث 1 لكل مليون شخص في السنة1. تحدث معظم حالات PMP بسبب النقائل من الأورام الزائدة الدودية. بالنظر إلى أن الفئران ليس لديها ملحق شبيه بالإنسان ، فإن نمذجة هذا النوع من السرطان تظل صعبة للغاية. في حين أن المرض الأساسي غالبا ما يكون قابلا للشفاء عن طريق الاستئصال الجراحي ، فإن خيارات العلاج للمرض النقيلي محدودة. لذلك ، فإن الأساس المنطقي لتطوير نموذج الشريحة العضوية الجديد هذا هو دراسة البيولوجيا المرضية ل PMP. حتى الآن ، لا توجد نماذج عضوية ملحقة يمكن استزراعها بشكل دائم. ومع ذلك ، فقد ثبت أن النموذج الحديث مفيد للاختبار الدوائي للعوامل العلاجية والعلاج المناعي2. على هذا النحو ، قمنا بتكييف نظام زراعة شرائح النمط العضوي ، والذي تم استخدامه في أنواع أخرى من السرطانات البشرية ، مثل الدماغ والثدي والبنكرياس والرئة والمبيض وغيرها3،4،5،6.
بالإضافة إلى الأورام الزائدة الدودية ، ينتج PMP أحيانا عن أنواع أخرى من الأورام ، بما في ذلك سرطانات المبيض7 ، وفي ظروف نادرة ، الأورام المخاطية الحليمية داخل القناة8 وسرطان القولون9. بالإضافة إلى ذلك ، تميل هذه الأورام إلى النمو ببطء ، مع معدلات نقش ضعيفة في نماذج xenograft المشتقة من المريض (PDX)10,11. بالنظر إلى هذه التحديات ، هناك حاجة غير ملباة لتطوير نماذج لدراسة هذا المرض للبدء في فهم البيولوجيا المرضية ل PMP ، وكيف يتم تجنيد هذه الخلايا السرطانية على الأسطح البريتونية ، وتتكاثر ، وتهرب من المراقبة المناعية.
بينما يتم قطع شرائح الورم من الدورة الدموية الوعائية الجهازية ، فإنها تحتوي على مكونات خلوية وغير خلوية ، بما في ذلك المصفوفة خارج الخلية والخلايا اللحمية والخلايا المناعية والخلايا السرطانية والخلايا البطانية والأعصاب. تسمح هذه البيئة المكروية شبه السليمة بالتحقيق الوظيفي لأنواع الخلايا هذه ، وهو أمر مفيد بشكل فريد مقارنة بالثقافات العضوية ثلاثية الأبعاد ، والتي تتكون فقط من الخلايا السرطانية12. في حين أن ثقافات الشرائح العضوية مفيدة في بعض النواحي ، إلا أنها بطبيعتها نهج قائم على الإنتاجية المنخفضة ، مقارنة بالمواد العضوية ثلاثية الأبعاد ، والتي يمكن توسيعها ، وهي مناسبة لفحص الأدوية العلاجية التجريبية المتعددة13،14،15. في حالة PMP ، لم تكن هناك تقارير توثق إنشاء موثوق وتمرير دائم للعضويات المشتقة من PMP16. من المحتمل أن يكون هذا بسبب الطبيعة البطيئة النمو للخلايا السرطانية المشتقة من PMP ، فضلا عن انخفاض عدد الخلايا الظهارية الخبيثة الموجودة داخل هذه الأورام المخاطية. نظرا للحاجة إلى تطوير نماذج لدراسة PMP ، فإن شرائح النمط العضوي مناسبة بشكل فريد لدراسة هذا المرض. نقدم بروتوكولا لإعداد وتصوير وتحليل PMP من العينات البشرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء إزالة الهوية والحصول على جميع الأنسجة بموجب بروتوكول معتمد من IRB في جامعة كاليفورنيا ، سان دييغو.
1. إعداد أنسجة PMP البشرية لمعالجة الأنسجة وزراعتها
- نقل أنسجة الورم والتشريح المجهري
- تحضير وسائط النقل والثقافة: أكمل 10٪ (v / v) وسائط النسر المعدلة من Dulbecco (DMEM) ، 10٪ FBS ، 2 mM L-Glutamine ، 1٪ Penicillin / Streptomycin (Pen Strep).
- عند وصول الأنسجة ووفقا لبروتوكول مؤسسي معتمد من IRB ، انقل أنسجة الورم PMP إلى 35 طبقا بقطر 6 سم يحتوي على DMEM كامل.
- تشريح المناطق الصلبة الدقيقة من الورم من أي ميوسين مسال باستخدام مشرط. بينما يمكن قطع عقيدات الميوسين المضمنة داخل الأجزاء الصلبة من الأنسجة ، قم بإزالة جميع المناطق المسالة من الورم. بالإضافة إلى إزالة أي موسين مسال ، أو مناطق أنسجة شديدة المخاطية ، قم بإزالة أي نسيج يصعب قطعه بمشرط. قطع عقيدات الأنسجة إلى قطع أصغر ، بحجم 1 سم3 تقريبا.
ملاحظة: سيكون الحصول على عقيدات الورم التي يتم تنظيفها من الميوسين و ECM الكثيف أمرا ضروريا للقطع الناجح باستخدام الاهتزاز. كمراقبة للجودة ، يتم قطع أنسجة الورم التي تصل إلى مختبر الأبحاث أولا بواسطة أخصائي علم الأمراض ، والذي يتم توزيعه لاحقا بواسطة المستودع الحيوي UCSD. المتبرعون بالأنسجة الذين يخضعون لإزالة الملطفة من كعكة omental هي الحالات المثلى لهذا البروتوكول نظرا لعبء المرض المرتفع ، مما يتيح إنتاج المزيد من الشرائح من الكتلة المتزايدة من توافر الأنسجة للبحث.
تنبيه: يتطلب العمل مع الأنسجة البشرية شهادة السلامة البيولوجية المستوى 2 (BSL2). تحقق مع المؤسسة للتدريب على إجراءات BSL2.
- إعداد الأغاروز وتضمين الأنسجة
- قم بإعداد محلول 5٪ من الأغاروز منخفض الذوبان في برنامج تلفزيوني بدون FBS في نفس يوم وصول الأنسجة. انتبه جيدا لمحلول الأغاروز لأنه يميل إلى الغليان بسرعة.
ملاحظة: الأغاروز منخفض الذوبان ضروري لتضمين قطع الأنسجة. سوف يتجمد الأغاروز عالي الذوبان في درجات حرارة أعلى ، مما يقلل من صلاحية شرائح الأنسجة إذا تم تضمينها. بالإضافة إلى ذلك ، سوف يتسبب FBS في محلول الذوبان في تكوين الرواسب. - ضع قطع الأنسجة التي تم الحصول عليها في أطباق 6 سم بدون سائل. لا تضع أكثر من 2-3 قطع لكل طبق 6 سم بحيث يمكن إزالتها كمكعبات أغاروز دون إزعاج أو لمس الأنسجة الأخرى.
- أضف محلول الأغاروز السائل 5٪ إلى أطباق 6 سم تحتوي على عينات الورم 1 سم3 . أضف ما يكفي من الأغاروز لتغطية العينة فقط. بمجرد إضافته ، ضع المناديل المدمجة في ثلاجة 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- قم بإعداد محلول 5٪ من الأغاروز منخفض الذوبان في برنامج تلفزيوني بدون FBS في نفس يوم وصول الأنسجة. انتبه جيدا لمحلول الأغاروز لأنه يميل إلى الغليان بسرعة.
- تركيب عينات الأنسجة على الاهتزاز
- أخرج الآجار المتصلب من الثلاجة وقطع مكعبات الأغاروز أكبر قليلا من عرض الأنسجة باستخدام مشرط.
- ضع الغراء الفائق على مرحلة الاهتزاز وضع مكعب الأغاروز برفق على الغراء الفائق. اترك 1-2 دقيقة حتى يتجمد الغراء. عند هذه النقطة ، يجب تثبيت مكعب الأغاروز مع الأنسجة على المسرح.
- ثبت الشفرة على الاهتزاز واضبط السماكة المطلوبة لقسم الأنسجة. للحصول على التصوير الأمثل باستخدام المجهر متحد البؤر ، يجب أن تكون المقاطع حوالي 150 إلى 250 ميكرون. اضغط على زر ابدأ واستمر في التنقل خلال قطع كتلة أنسجة الأغاروز حتى يتم قطع الأنسجة تماما.
ملاحظة: إذا لم يتم قطع الأنسجة أو إزاحتها من مكعب الأغاروز ، ففكر في تضمين الأنسجة في أغاروز عالي التركيز وقم بقص أي قطع أنسجة إضافية قد تكون كثيفة جدا بحيث لا يمكن قطعها أو تلتصق بشفرة الاهتزاز.
- زراعة شرائح الأنسجة على إدخالات نفاذية
- قم بإعداد لوحة إدخال قابلة للنفاذ للثقافة عن طريق إضافة 2 مل من وسائط DMEM الكاملة أعلاه و 3 مل أسفل الغشاء القابل للاختراق.
- ارفع شرائح الأنسجة برفق من حجرة القطع بالاهتزاز باستخدام فرشاة رسم رقيقة وضع شريحتين إلى أربع شرائح في أطباق استزراع قابلة للنفاذ تحتوي على وسائط DMEM كاملة. بعد 24 ساعة ، قم باستنشاق الوسائط باستخدام ماصة واستبدل الوسائط بوسائط ثقافية جديدة.
- استزرع الشرائح لمدة تصل إلى 7 أيام عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO2 ، مع استبدال الوسائط كل 24 ساعة. في هذه المرحلة الزمنية ، أضف عناصر تحكم لقتل الخلايا (bortezomib) والعلاجات الكيميائية القابلة للاختبار 5-fluoruracil (5-FU) إلى وسائط الثقافة لإجراء التدخل الدوائي.
- بعد 7 أيام من الزراعة ، توقع خسارة حوالي 15٪ -25٪ من الصلاحية مقارنة بالنقطة الزمنية لليوم 0 (مباشرة بعد القطع) في ظل ظروف غير معالجة بالعقاقير (DMEM كاملة). قم بقياس الصلاحية باستخدام أصباغ حيوية حية ميتة مثل الكالسيين AM (حي) وبروبيديوم يوديد (ميت).
2. التصوير البؤري لشرائح الأنسجة البشرية الحية
ملاحظة: بمجرد تحضير شرائح الورم العضوي ، من الضروري تحديد صلاحية الأنسجة لإجراء تحليل فعال ومحسن. بالنظر إلى أن عينات الورم يبلغ سمكها 150-250 ميكرومتر ، يوصى بشدة باستخدام المجهر البؤري أو ثنائي الفوتون على المجاهر واسعة المجال لتحديد الدراسات في الموقع. يمكن أيضا استخدام قياس التدفق الخلوي لتحديد الجدوى والسكان الخلويين (الطرق أدناه). ومع ذلك ، يتم فقدان الدقة المكانية أثناء تحليل قياس التدفق الخلوي ، ومن المحتمل أن يتم التقليل من الجدوى نظرا للحاجة إلى فصل شرائح الورم بالطرق الميكانيكية والكيميائية.
- إعداد الكاشف والإعداد التجريبي
- ضع شرائح الورم لتحليل التصوير متحد البؤر في بئر واحد من طبق مكون من 12 بئرا يحتوي على برنامج تلفزيوني مع 1٪ FBS. لتجارب تصوير الكالسيوم ، بدلا من PBS ، احتضان الشرائح في محلول الكالسيوم خارج الخلية أعدت على النحو التالي: 125 mM كلوريد الصوديوم ، 5.9 mM KCl ، 2.56 mM CaCl 2 ، 1 mM MgCl2 ، 25 mM HEPES ، 0.1 ٪ BSA ، درجة الحموضة 7.4 ، 3 mM الجلوكوز ، تصفيتها معقمة. قم بإعداد هذا الحل في وقت مبكر وتخزينه لمدة تصل إلى شهر واحد عند 4 درجات مئوية (انظر القسم 2.1.8).
- باتباع التركيزات والبروتوكولات الموصى بها من قبل الشركة المصنعة ، قم بأخذ عينات البقع بأصباغ التصوير (انظر جدول المواد) لتحديد صلاحية شرائح الأنسجة. صورة لمدة 10 دقائق -1 ساعة بعد إضافة صبغة الصلاحية.
- بعد الحضانة ، انقل الشرائح إلى طبق بتري زجاجي شفاف بصريا يحتوي على PBS مع 1٪ FBS لاستخدامه في التصوير على جهاز تصوير متحد البؤر.
ملاحظة: بالنسبة للتصوير متحد البؤر، تم استخدام منصة نيكون A1R متحدة البؤر. - افتح برنامج التصوير متحد البؤر. ابدأ التصوير بمعدل 10 أضعاف وحدد وضع التصوير XYZ. ثم قم بتكوين إعدادات الاستحواذ على النحو التالي.
- قم بتشغيل الليزر التالي: 488 نانومتر و 561 نانومتر. اضبط الكسب على 100 باستخدام طاقة الليزر بنسبة 1٪. اضبط طاقة الليزر واكتسابها حسب الحاجة أثناء التقاط الصورة. بناء على جودة الصورة المطلوبة، حدد 512 × 512 بكسل أو 1024 × 1024 بكسل للحصول على دقة أعلى.
- حدد إزالة التعشيق ، ثم حدد المسح الضوئي لبدء التصوير.
- لتصوير الكالسيوم ، احتضان شرائح الأنسجة مع Fluo-4-AM لمدة 1 ساعة محمية من الضوء. اتبع بروتوكول المصنع لإذابة Fluo-4-AM في DMSO. بعد ساعة واحدة ، اغسل الشرائح 3x بمحلول الكالسيوم خارج الخلية واتبع بروتوكول التصوير في الخطوات 2.1.4-2.1.5.
- لتجارب تصوير الكالسيوم باستخدام Fluo-4-AM ، حدد XYZT وقم بإلغاء تحديد ليزر 561 نانومتر لزيادة سرعة الاكتساب. بالإضافة إلى ذلك ، استخدم ماسح الرنين لزيادة سرعة التصوير.
3. تفكك الشرائح الحية لقياس التدفق الخلوي
ملاحظة: يمكن استخدام فصل شرائح الأنسجة الحية للعديد من التطبيقات النهائية ، بما في ذلك التنميط المناعي ، وتقييم الجدوى ، واستجواب التغييرات في مجموعات الخلايا بعد التدخل الدوائي. يجب اتخاذ خطوات لضمان الحفاظ على جودة الأنسجة وصلاحية الخلية أثناء عملية التفكك.
- اقطع قطعة صغيرة من نهاية طرف ماصة سعة 1 مل لتوسيع الفتحة للسماح بالتفكك الميكانيكي القوي عن طريق السحب لمدة دقيقة واحدة.
- احتضان الشرائح على حرارة 37 درجة مئوية مع الدوران لمدة 5-15 دقيقة في 1 مل من محلول الهضم الذي يتكون من نسبة عالية من الجلوكوز DMEM ، 10٪ كولاجيناز لطيف / هيالورونيداز (GCH) ، 10٪ FBS ، و 10٪ DNaseI (1 مجم / مل مخزن).
ملاحظة: غالبا ما يتم العثور على تغييرات تعتمد على الدفعات من كولاجيناز / هيالورونيداز. - أداء اضطراب قوي للأنسجة باستخدام التفكك الميكانيكي 2-3 مرات أثناء الحضانة. تأكد من فحص الهضم ، بالعين ، كل 5 دقائق للحصول على دليل على الهضم الكامل. إذا لزم الأمر ، أوقف الهضم الأنزيمي بالانتقال إلى الخطوة 3.1.4.
- بمجرد هضمها ، ماصة الشرائح ووسائط الهضم فوق مرشح 70 ميكرومتر يوضع فوق أنبوب مخروطي سعة 50 مل. اختر قطعا أكبر باستخدام ملقط معقم أو ماصة.
- باستخدام الطرف الخلفي الحاد لحقنة بلاستيكية سعة 5 مل ، اهرس أي شرائح أكبر غير منفصلة واغسلها مرة أخرى ب 4 مل من PBS تحتوي على 2٪ FBS.
- خذ طاف الخلية المنفصل في أنبوب مخروطي سعة 50 مل وقم بتدويره عند 300 × جم لمدة 5-10 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية واغسل الحبيبات ب 1 مل من PBS تحتوي على 2٪ FBS.
- لتحضير العينة لقياس التدفق الخلوي ، أضف المخزن المؤقت المانع الذي يحتوي على 50 ميكرولتر من كتلة FC البشرية واتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. إجراء تلطيخ خارج الخلية باستخدام الأجسام المضادة المعنية في 50 ميكرولتر من PBS تحتوي على 2 ٪ FBS.
ملاحظة: هناك العديد من أنظمة قياس التدفق الخلوي. بمجرد تحضير العينة لقياس التدفق الخلوي ، راجع بروتوكول الشركة المصنعة لتشغيل الجهاز.
4. التدخل الدوائي باستخدام شرائح الأنسجة الحية لتحليل الجدوى والانتشار
ملاحظة: بمجرد تحضير شرائح الورم ذات النمط العضوي ، يمكن إجراء الأساليب التدخلية باستخدام عدة طرق ، بما في ذلك اختبار الأدوية ، siRNA ، وكذلك العدوى الفيروسية لشرائح الأنسجة الحية. سنناقش هنا اختبار المخدرات ، وكذلك القراءات الوظيفية النهائية ، والتي تشمل تحليل الجدوى باستخدام الانتشار المحلي.
- تحضير 10 مل من 10٪ v / v DMEM كاملة مع 10٪ FBS ، 2 mM L-Glutamine ، 1٪ Pen Strep.
- Aliquot 5 مل من الوسائط الكاملة لظروف التحكم والعلاج. إلى ال 5 مل المتبقية من الوسائط ، أضف بورتيزوميب (2 ميكرومتر) للحث على موت الخلايا في شرائح الورم كعنصر تحكم إيجابي.
ملاحظة: بورتيزوميب ، بتركيزات عالية ، هو دواء سام للخلايا يحفز موت الخلايا. يمكن استخدام الأدوية السامة للخلايا الأخرى كتحكم إيجابي لقتل الخلايا. - باستخدام شريحتين إلى أربع شرائح من الأنسجة ، والتي تم طلاؤها على الأطباق القابلة للنفاذ ، أضف الوسائط المحضرة في الخطوة 4.2 إلى الطبق ، بالإضافة إلى أي علاجات مركبة إضافية لاستخدامها في تحليل LIVE / DEAD الجدوى النهائية باستخدام المجهر متحد البؤر كما هو موضح في الخطوة 2.1.2 ، أو استخدم تحليل جدوى الإنارة التجارية باستخدام شرائح متطابقة بالتتابع.
ملاحظة: تعد مطابقة الشرائح المتسلسلة ضرورية لتحليل جدوى الإنارة ، نظرا لأن مقايسة صلاحية الإنارة تعتمد على محتوى ATP الخلوي. نظرا لفقدان عناصر التحكم الداخلية أثناء تحلل الخلية ، يلزم وجود شرائح متشابهة الحجم نظرا لأن النتائج تعتمد على عدد البداية للخلايا القابلة للحياة (أي أن الشرائح غير المتوازنة ستؤدي إلى نتائج غير متوازنة). إذا لم يحصل المستخدم على شرائح متسلسلة ، فلن يكون تحليل الجدوى الانارة ممكنا ، وعلى هذا النحو ستكون هناك حاجة إلى طريقة أخرى لتقييم الجدوى (قياس التدفق الخلوي أو تحليل الخلايا الحية القائم على التصوير متحد البؤر). - اترك شرائح الأنسجة في مزرعة تحتوي على DMEM الكامل لمدة 2-5 أيام ، وتغيير الوسائط وكذلك bortezomib و 5-FU كل يوم.
- لتحليل صلاحية الإنارة ، أضف 500 ميكرولتر من PBS إلى طبق مكون من 12 بئرا وانقل شرائح الأنسجة المتطابقة بالتتابع إلى محلول PBS باستخدام فرشاة رسم أو استخدم شفط ماصة سعة 1 مل برفق لنقلها.
- قم بإزالة PBS وإضافة حل تحليل الجدوى الانارة الذي تم إعداده. انظر دليل التعليمات لإعداد الكاشف.
- أضف 500 ميكرولتر من محلول الصلاحية المضيئة لكل حالة واحتضانها مع دوران بطيء على شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. قراءة التلألؤ باستخدام قارئ لوحة التلألؤ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باختصار ، يتم الحصول على عينات الورم البشري من PMP بموجب بروتوكول معتمد من IRB. يتم تحضير الأنسجة وتشريحها الدقيقة وتصلبها في قالب أغاروز ليتم قطعه باستخدام اهتزاز (الشكل 1 أ ؛ فيديو 1). بمجرد القطع ، يتم وضع شرائح الأنسجة واستزراعها على أغشية إدخال قابلة للاختراق (الشكل 1 ب) ، والتي يمكن استخدامها لفحوصات التصوير في الموقع ، وكذلك للاستجواب الخلوي والوظيفي باستخدام قياس التدفق الخلوي ، وتحليل التصوير متحد البؤر ، ومقايسات السمية الخلوية. يظهر سير عمل تمثيلي لثقافة ومعالجة شرائح أنسجة PMP البشرية في الشكل 1C. يمكن إجراء تحليل التصوير الأولي بواسطة المجهر الضوئي (الشكل 2A-B). تم تصور تلطيخ الميوسين في شرائح الأنسجة باستخدام تلطيخ حمض شيف الدوري (PAS) (الشكل 2C) وكذلك الأجسام المضادة الخاصة بالميوسين (الشكل 2D). لتقييم الصلاحية ، يتم تحضين الشرائح المقطوعة من مناطق مختلفة في الكالسيين AM ويوديد البروبيديوم لتحديد صحتها وصلاحيتها (الشكل 2E-F). معظم الخلايا (حوالي 85٪) قابلة للحياة (Calcein AM + ؛ أخضر) ، في حين أن بعض الخلايا ميتة (يوديد البروبيديوم ؛ أحمر) عند تصورها بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر بعد القطع الأولي. يمكن تصور المصفوفة خارج الخلية باستخدام ضوء أبيض عند موضع زاوي يبلغ 180 درجة. غالبا ما تظهر الأورام التي يتم علاجها بالعلاج الكيميائي قبل الجراحة المزيد من إشارات PI. يمكن تتبع انتشار شرائح الأنسجة باستخدام EdU المضافة في وسائط زراعة الشرائح. للكشف ، تم استخدام مجموعة مقايسة تكاثر الخلايا التجارية ، وتم إجراء الفحص على شرائح ثابتة بعد 72 ساعة من الثقافة. يمكن قياس الخلايا المتكاثرة بنشاط في الثقافة في قناة FITC (الخضراء). سوف تتداخل نوى الخلية (DAPI) مع الخلايا التي تكاثرت (EdU +) أثناء المزرعة (الشكل 2G). يتم تحديد هذه النتائج لتحديد عدد الخلايا المتكاثرة (نوى DAPI +) داخل شريحة الورم (الشكل 2H). تشير النتائج الموضحة هنا إلى أن الشرائح المستزرعة قابلة للحياة وتكاثرية أثناء زراعة الشرائح.
لتحديد وظائف الخلايا المناعية ، تم إجراء دراسات تصوير Ca2+ على شرائح الورم الحية (الشكل 3 ؛ فيديو 2). باستخدام هذا النهج ، يمكن تحديد آليات الإشارات المباشرة والباراكرين. لتسمية الخلايا المناعية المحلية ، تم إجراء وضع العلامات الخلوية في الموقع عن طريق احتضان شرائح بجسم مضاد مقترن CD11b-PE جنبا إلى جنب مع Fluo-4-AM (الشكل 3A). تسمح الصور ذات الألوان الزائفة التي تظهر مستويات Ca 2+ داخل الخلايا بشكل أفضل بتصور المستويات التفاضلية ل Ca2+ داخل الخلايا (الشكل 3B). تم تتبع النشاط التلقائي وتظهر صور الفاصل الزمني قبل (الشكل 3C) ، وأثناء (الشكل 3D) ، وبعد (الشكل 3E) استجابة Ca2+ داخل الخلايا داخل (مربع الدائرة المنقطة البيضاء ؛ الشكل 3 أ ، ب) خلية مناعية CD11b +. تظهر الآثار الأولية لاستجابات Ca2+ في الخلية المناعية CD11b (الحمراء) جنبا إلى جنب مع الخلايا المستجيبة الأخرى (السوداء) وغير المستجيبة (الزرقاء) (الشكل 3F). القياس الكمي للمنطقة الواقعة تحت منحنى الآثار الخام الموضحة من الخلية المناعية المستجيبة (CD11b + ؛ الشكل الأحمر 3F) مقارنة بالقياس الكمي للخلية غير المستجيبة (أزرق ؛ الشكل 3F) تم قياسها كميا (الشكل 3G). تشير هذه النتائج إلى أنه يمكن إجراء تتبع وظيفي للخلايا الحية باستخدام منصة شريحة الأنسجة الحية هذه.
يمكن استخدام تحليل المصب باستخدام قياس التدفق الخلوي للنمط المناعي وكذلك التحقيق في التغيرات في الملامح الخلوية استجابة للعوامل العلاجية. قد تكون النتائج بسبب الإشارات المباشرة أو الإشارات غير المباشرة (paracrine). تظهر النتائج التمثيلية للتنميط المناعي لعينة ورم المريض باستخدام PMP في الشكل 4A. تم تحديد الملف المناعي للورم ووجد أن عينة المتبرع 337 تحتوي على مستويات عالية من الضامة M2 (الأشكال 4B). تشير هذه النتائج إلى أن استخدام شرائح الأنسجة المشتقة من PMP يسمح للباحثين باستجواب المشهد الخلوي الفريد للمتبرع لعينات ورم المريض. هناك ما يبرر إجراء مزيد من التحليل والاستجواب للمشهد الجزيئي والخلوي والجينومي لوضع استراتيجية لنهج علاجي من مقاعد البدلاء إلى السرير قد يكون مفيدا لنتائج المرضى.
يعد التنميط الدوائي والتحليل النهائي لشرائح الأنسجة من الأنسجة البشرية PMP طريقة مباشرة لقياس المقاومة الكيميائية وحساسية الدواء (الشكل 5). تظهر النتائج قتل الخلايا لشرائح الورم كما أكده تحليل السمية الخلوية وكذلك التصوير البؤري TUNEL استجابة للعقار السام للخلايا bortezomib (2 μM) و 5-fluorouracil (5-FU ؛ 2 μM) (الشكل 5A-C). نظرا لأن استجابات قتل الورم غير متجانسة للغاية ، فمن المهم تقسيم البيانات إلى طبقات على أساس درجة الورم و HIPEC السابق ، حيث ثبت أن العلاج الكيميائي المتكرر طريقة غير فعالة لاستئصال الخلايا السرطانية في الجسم الحي وخارج الجسم الحي17,18. بالإضافة إلى تحليل TUNEL ، تم إجراء تحليل جدوى الإنارة باستخدام شرائح متطابقة بالتتابع (الشكل 5D). من الضروري استخدام شرائح الورم المتطابقة بالتتابع عند إجراء فحوصات السمية الخلوية ، لأن الشرائح غير المتطابقة ستؤدي إلى نتائج غير موثوقة.
الشكل 1: رسم تخطيطي لمنصة زراعة شرائح النمط العضوي خارج الجسم الحي مع شرائح الأنسجة التمثيلية. سير عمل تمثيلي لإعداد ثقافات شرائح النمط العضوي للتنميط المناعي والتحقيق في الخصائص الوظيفية لأورام الورم المخاطي الكاذب من أصل الزائدة الدودية. أ: صورة عقيدة ورم حية مركبة من ورم مخاطي كاذب (PMP). يتم تضمين عقيدة الورم في agarose ، والتي يتم تثبيتها على اهتزاز باستخدام الغراء الفائق. ب: التوزيع التمثيلي لقطع شرائح الورم وترتيبها في طبق استزراع عبر الآبار. (ج) المخطط الذي يمثل سير عمل زراعة الشرائح واستجواب شرائح الورم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التصوير البؤري والتحليل الوظيفي لشرائح الأنسجة الحية . (أ) صورة برايتفيلد 2x تكبير شريحة أنسجة تمثيلية مقطوعة من مريض مصاب بالورم المخاطي الصفاق الكاذب من أصل زائدي. (ب) تكبير 10 أضعاف شريحة الأنسجة التمثيلية الموضحة في أ. (ج) تلطيخ PAS لنسيج من مريض مصاب بالورم المخاطي الصفاق الكاذب. شريط المقياس 1 مم. (D) التصوير المناعي باستخدام الجسم المضاد MUC2 (الأخضر) و EPCAM (الأحمر) و DAPI (الأزرق). شريط مقياس 50 ميكرومتر. (ه) التصوير المناعي باستخدام الأصباغ الحية (الكالسيين AM؛ الأخضر) والميتة (يوديد البروبيديوم؛ الأحمر) من المتبرع 39. شريط مقياس 50 ميكرومتر. (F) القياس الكمي لتحليل الجدوى باستخدام ثلاث شرائح منفصلة من المتبرع 39 أثناء قطع الأنسجة الأولي. أشرطة الخطأ هي الخطأ القياسي للمتوسط. (ز) التصوير المناعي للانتشار باستخدام EdU (الأخضر). يتم تمييز نوى الخلية ب DAPI (أزرق). (ح) القياس الكمي لعدد الخلايا الموجبة ل EdU لكل 1000 خلية. N = 3 شرائح تمثيلية من المتبرع 39. أشرطة الخطأ هي الخطأ القياسي للمتوسط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تتبع الخلايا الحية باستخدام تصوير الكالسيوم لشرائح الأنسجة الحية. أ: الوسم الخلوي في الموقع لشريحة نسيج حي من المتبرع 292. CD11b المسمى البلاعم موضح باللون الأحمر. صبغة تصوير الكالسيوم Fluo-4-AM (خضراء). البلاعم تحمل علامة مشتركة مع CD11b و Fluo-4-AM مظللة باللون الأبيض. ب: مقياس اللون الكاذب لشريحة نسيج حي (كما هو موضح في الحرف (أ). البلاعم المميزة باللون الأبيض كما في شريط المقياس A. الذي يظهر 100 ميكرومتر ينطبق على شريط مقياس A. Pseudocolor الموضح كمتوسط قيم رمادية. (جيم - ه) صورة تكبير عالية ل Fluo-4-AM قبل (C) وأثناء (D) وبعد (E) تنشيط الكالسيوم. (و) القياس الكمي لمستويات الكالسيوم التي تظهرها الآثار الخام. يتم تمييز البلاعم CD11b + المميزة في A-E باللون الأحمر. يتم تمييز خلية غير مستجيبة باللون الأزرق. تظهر آثار الخلايا المستجيبة الأخرى باللون الأسود. (ز) التحديد الكمي للمنطقة الطبيعية تحت المنحنى الموضح بين بلاعم CD11b + وخلية غير مستجيبة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التنميط المناعي لشرائح الورم البشري الحي من الورم المخاطي الصفاق الكاذب . (أ) مخطط تمثيلي لإجراء توصيف قياس التدفق الخلوي لملامح الخلايا المناعية من أورام الورم المخاطي الكاذب ذات الأصل الزائدي. (ب) النسبة المئوية للمجموعات الفرعية للخلايا المناعية مشفرة بالألوان، بالإضافة إلى متوسط شريط المتبرع المرسوم. يتم توفير علامات الألوان أعلاه للمجموعات الفرعية للخلايا المناعية داخل المخططات الدائرية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تحليل تمثيلي للتدخل الدوائي باستخدام ثقافة الشرائح العضوية. (أ) التألق المناعي للصور التمثيلية من تحليل TUNEL على شرائح غير معالجة (العمود الأيسر) ، 5-FU (2 ميكرومتر ؛ العمود الأوسط) ، أو Bortezomib (2 ميكرومتر ؛ العمود الأيمن) شرائح معالجة. (ب) القياس الكمي للتألق المناعي TUNEL كنسبة مئوية من خلايا DAPI + الإيجابية TUNEL من المتبرع 339. (ج) القياس الكمي للتألق المناعي TUNEL كنسبة مئوية من خلايا PanCK + الإيجابية ل TUNEL من المتبرع 339. (د) التحديد الكمي للشرائح المعالجة بالعقاقير باستخدام تحليل الصلاحية الانارة من المتبرع 339 مجمعة من 2-3 مكررات بيولوجية متطابقة بالتتابع. CTL يدل على السيطرة. تركيز للتحكم ، 5-FU (2 ميكرومتر) ، وبورتيزوميب (2 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيديو 1: قطع شرائح الأنسجة البشرية الحية من عقيدات الورم المخاطي النقيلي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.
فيديو 2: تصوير الكالسيوم لشرائح الورم العضوي الحي من الورم المخاطي الصفاق الكاذب. صور بالألوان الزائفة لأقصى إسقاط من صور متحدة البؤر لشريحة أنسجة حية محملة ب Fluo-4-AM في نقطة زمنية 00:00. شريط المقياس هو 50 ميكرومتر (أسفل اليمين). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تصف هذه المخطوطة تقنية يمكن استخدامها لاستزراع عينات الورم المخاطي الكاذب الصفاق (PMP) البشرية واستجوابها وتحليلها. لقد استخدمنا العديد من المقايسات الوظيفية النهائية لاستجواب البيئة المكروية المناعية للورم ومنصة للاختبار من مقاعد البدلاء إلى السرير.
في حين أن الطريقة عالية الكفاءة في أيدينا ، إلا أنها تتطلب بعض الممارسة لقطع عينات الورم باستخدام الاهتزاز. وبالتحديد ، واجهنا مشاكل ناتجة عن عينات شديدة المخاطية ، وكذلك العينات التي تم تشريحها بشكل غير صحيح لإزالة السقالات غير القابلة للقطع (جدار البطن ، الاستسقاء ، بروتينات ECM المختلفة). على هذا النحو ، يعد التشريح المجهري لأنسجة PMP لإزالة الميوسين الزائد خطوة حاسمة في هذا البروتوكول. أبلغنا عن معدل نجاح بنسبة 80٪ في المرضى الذين يعانون من عقيدات صلبة كما تم الإبلاغ عنه سابقا. كانت العينات عالية الجودة أقل صعوبة من الناحية الفنية لقطع18. علاوة على ذلك ، فإن تحضير الأغاروز (بدون FBS) وتصلب الأنسجة في الأغاروز مهم أيضا لهذا البروتوكول من أجل إنتاج شرائح الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، سيكون من الضروري أن يكون الباحث على دراية بالمعلومات المتعلقة بظروف الأنسجة والمعلمات الجراحية للعينة (موقع ورم خبيث ، عينات معالجة مسبقا) ، حيث ستساعد هذه الأفكار الجديدة ، فضلا عن المساعدة في حل مشكلات استكشاف الأخطاء وإصلاحها المحتملة. خطوة أخرى حاسمة في هذا البروتوكول هي في التحليل الوظيفي للخلايا السرطانية. هنا ، من الضروري استخدام علامة ظهارية (مثل تلطيخ السيتوكيراتين) مع قراءة وظيفية (موت الخلايا المبرمج ، الانتشار) لتقييم الفعالية. هذا ضروري في هذا النوع المعين من الورم ، لأن العديد من أورام PMP لديها أقل من 10 ٪ من التركيب الخلوي مثل الخلايا السرطانية18. على هذا النحو ، فإن قياس التدفق الخلوي ، أو التصوير متحد البؤر هو الطريقة المفضلة للتحليل. ومع ذلك ، قد تكون المقايسات عالية الإنتاجية باستخدام التصوير القائم على التلألؤ مناسبة في الأورام ذات المحتوى العالي من الخلايا السرطانية ، أو في حالة تقييم دور العلاجات في TME.
على الرغم من كونها أداة قوية ، إلا أن ثقافة الشرائح العضوية لها قيود معينة. على سبيل المثال ، يتمثل التحدي الذي تواجهه هذه التقنية في عدم التجانس الخلوي داخل الأورام. لحساب عدم تجانس الورم ، يجب مطابقة الشرائح المقطوعة بالتتابع من مناطق الورم المماثلة بين المجموعات للعلاج وتحليل صلاحية الخلية. يتطلب قطع الشرائح وتحضيرها ممارسة لتشريح سقالات الورم غير القابلة للقطع. هذه المهارات مطلوبة لنجاح قطع وتحسين شرائح الأنسجة للحد من التحيزات التجريبية. قيد آخر هو صلاحية الأنسجة أثناء زراعة الشرائح. في حين أنه من الممكن الحفاظ على شرائح الدماغ أو القلب لعدة أشهر في الثقافات19،20 ، فقد تم اختبار مزارع الشرائح من PMP حاليا لمدة أسبوع واحد تقريبا في الثقافة18 ، مما يمنع التحقيق التجريبي على المدى الطويل ، بما في ذلك العلاج الدوائي المزمن والتلاعب الجيني. قد تكون التحسينات في طرق الاستزراع مثل إضافة المكملات الغذائية وعوامل النمو ضرورية لإطالة عمر مزارع شرائح PMP.
زراعة الشرائح العضوية هي تقنية مستخدمة على نطاق واسع لدراسة الأعضاء المختلفة ، بما في ذلك الدماغ والكلى والكبد. لقد اعتمدنا هذه التقنية للاستخدام أثناء PMP ، مما يوفر لنا نظاما نموذجيا بديلا ، على حد علمنا ، هو النموذج الأول لفحص البيئة المكروية للورم PMP في إعداد شبه سليم. بالاقتران مع المواد العضوية المشتقة من المريض 3D والثقافات النباتية ، توفر هذه التقنية منصة قوية ومرنة لتقييم فعالية العلاج بسرعة والسماح بالترجمة الفورية للعلاجات الجديدة من مقاعد البدلاء إلى السرير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
يود المؤلفون أن يشكروا Kersi Pestonjamasp من المرفق الأساسي للتصوير في مركز مورس للسرطان للمساعدة في منح المجاهر مركز دعم السرطان المتخصص UCSD P30 2P30CA023100. تم دعم هذا العمل أيضا من خلال منحة نشر JoVE (JRW) ، بالإضافة إلى هدايا سخية من ملكية إليزابيث و Ad Creemers ، ومؤسسة Euske Family Foundation ، وصندوق أبحاث سرطان الجهاز الهضمي ، وصندوق أبحاث ورم خبيث بريتوني (AML).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1 M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| 1 M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| 100 micron filter | ThermoFisher | 22-363-549 | |
| 22 x 40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| 3 M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 5 M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| ATPγS | Tocris | 4080 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | L3224 | |
| CD11b | Biolegend | 101228 | |
| CD206 | Biolegend | 321140 | |
| CD3 | Biolegend | 555333 | |
| CD4 | Biolegend | 357410 | |
| CD45 | Biolegend | 304006 | |
| CD8 | Biolegend | 344721 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G9681 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965084 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Fc-block | BD Biosciences | 564220 | |
| Fluo-4 | Thermo Fisher | F14201 | |
| Gentle Collagenase/Hyaluronidase | Stem Cell | 7912 | |
| Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Imaging Chamber Platform | Warner Instruments | PH-1 | |
| LD-Blue | Biolegend | L23105 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| LIVE/DEAD imaging dyes | Thermofisher | R37601 | |
| Nikon Ti microscope | Nikon | Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096x4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives. | |
| Peristaltic pump | Isamtec | ISM832C | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | L3224 | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA |
References
- Bevan, K. E., Mohamed, F., Moran, B. J.
- Votanopoulos, K. I., et al. Appendiceal cancer patient-specific tumor organoid model for predicting chemotherapy efficacy prior to initiation of treatment: A feasibility study. Annals of Surgical Oncology. 26 (1), 139-147 (2019).
- Holliday, D. L., et al. The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models. Journal of Clinical Pathology. 66 (3), 253-255 (2013).
- Koerfer, J., et al. Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer. Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).
- Misra, S., et al. Ex vivo organotypic culture system of precision-cut slices of human pancreatic ductal adenocarcinoma. Scientific Reports. 9 (1), 2133 (2019).
- Ohnishi, T., Matsumura, H., Izumoto, S., Hiraga, S., Hayakawa, T. A novel model of glioma cell invasion using organotypic brain slice culture. Cancer Research. 58 (14), 2935-2940 (1998).
- Seidman, J. D., Elsayed, A. M., Sobin, L. H., Tavassoli, F. A. Association of mucinous tumors of the ovary and appendix. A clinicopathologic study of 25 cases. The Amerian Journal of Surgical Pathology. 17 (1), 22-34 (1993).
- Mizuta, Y., et al. Pseudomyxoma peritonei accompanied by intraductal papillary mucinous neoplasm of the pancreas. Pancreatology. 5 (4-5), 470-474 (2005).
- Gong, Y., Wang, X., Zhu, Z. Pseudomyxoma peritonei originating from transverse colon mucinous adenocarcinoma: A case report and literature review. Gastroenterology Research and Practice. 2020, 5826214 (2020).
- Fleten, K. G., et al. Experimental treatment of mucinous peritoneal metastases using patient-derived xenograft models. Translational Oncology. 13 (8), 100793 (2020).
- Kuracha, M. R., Thomas, P., Loggie, B. W., Govindarajan, V. Patient-derived xenograft mouse models of pseudomyxoma peritonei recapitulate the human inflammatory tumor microenvironment. Cancer Medicine. 5 (4), 711-719 (2016).
- Jiang, X., et al. Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment. Oncoimmunology. 6 (7), 1333210 (2017).
- Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).
- Liu, L., Yu, L., Li, Z., Li, W., Huang, W. Patient-derived organoid (PDO) platforms to facilitate clinical decision making. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 40 (2021).
- Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 45 (2019).
- Carr, N. J. New insights in the pathology of peritoneal surface malignancy. Journal of Gastrointestinal Oncology. 12, 216-229 (2021).
- Votanopoulos, K. I., et al. Outcomes of repeat cytoreductive surgery with hyperthermic intraperitoneal chemotherapy for the treatment of peritoneal surface malignancy. Journal of the American College of Surgeons. 215 (3), 412-417 (2012).
- Weitz, J., et al. An ex-vivo organotypic culture platform for functional interrogation of human appendiceal cancer reveals a prominent and heterogenous immunological landscape. Clinical Cancer Research. 28 (21), 4793-4806 (2022).
- Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research. Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).
- Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies. Organogenesis. 5 (2), 62-66 (2009).
