Summary
我们描述了一种用于人类癌症的生产，培养和可视化的方案，这些癌症已经转移到腹膜表面。使用振动切片机切割切除肿瘤标本，并在可渗透的插入物上培养以增加氧合和活力，然后使用共聚焦显微镜和流式细胞术进行成像和下游分析。
Abstract
腹膜假黏液瘤 （PMP） 是一种罕见的疾病，由粘液原发性肿瘤的播散和分泌粘蛋白的肿瘤细胞在腹膜腔中积累引起。PMP可由各种类型的癌症引起，包括阑尾癌，卵巢癌和结直肠癌，尽管阑尾肿瘤是迄今为止最常见的病因。PMP由于其（1）罕见性，（2）有限的小鼠模型和（3）粘液，无细胞组织学，研究具有挑战性。这里介绍的方法允许在肿瘤微环境（TME）保持完整的制剂中使用患者来源的 离体 器官型切片对这些肿瘤类型进行实时可视化和询问。在该协议中，我们首先描述使用振动切片机制备肿瘤切片并随后进行长期培养。其次，我们描述了肿瘤切片的共聚焦成像以及如何监测活力、钙成像和局部增殖的功能读数。简而言之，切片装有成像染料，并放置在可以安装在共聚焦显微镜上的成像室中。延时视频和共聚焦图像用于评估初始活力和细胞功能。该程序还探索TME中的平移细胞运动和旁分泌信号传导相互作用。最后，我们描述了用于流式细胞术分析的肿瘤切片的解离方案。定量流式细胞术分析可用于从实验室到床边的治疗测试，以确定免疫景观和上皮细胞含量内发生的变化。
Introduction
腹膜假黏液瘤 （PMP） 是一种罕见综合征，发病率为每年每百万人 1 例1。大多数PMP病例是由阑尾肿瘤转移引起的。鉴于小鼠没有类似人类的阑尾，对这种类型的癌症进行建模仍然极具挑战性。虽然原发性疾病通常可以通过手术切除治愈，但转移性疾病的治疗选择有限。因此，开发这种新型器官型切片模型的基本原理是研究PMP的病理生物学。迄今为止，还没有可以永久培养的阑尾类器官模型;然而，最近的模型被证明可用于治疗剂和免疫疗法的药理学测试2。因此，我们采用了一种器官型切片培养系统，该系统已用于其他类型的人类癌症，例如脑癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌等3，4，5，6。
除阑尾肿瘤外，PMP偶尔还由其他肿瘤类型引起，包括卵巢癌7，在极少数情况下，导管内状粘液肿瘤8 和结肠癌9。此外，这些肿瘤往往生长缓慢，在患者来源的异种移植（PDX）模型中移植率低10，11。鉴于这些挑战，开发模型来研究这种疾病的需求尚未得到满足，以开始了解PMP的病理生物学，以及这些癌细胞如何被招募到腹膜表面，增殖并逃避免疫监视。
虽然从体循环中切割出来，但肿瘤切片确实含有细胞和无细胞成分，包括细胞外基质、基质细胞、免疫细胞、癌细胞、内皮细胞和神经。这种半完整的微环境允许对这些细胞类型进行功能研究，与仅由癌细胞组成的3D类器官培养物相比，这是独特的优势12。虽然器官型切片培养在某些方面是有利的，但与可以扩增的3D类器官相比，它们本质上也是一种基于低通量的方法，适用于多重研究性治疗药物筛选13，14，15。就PMP而言，没有报告记录PMP衍生类器官的可靠建立和永久传代16。这可能是由于PMP衍生的肿瘤细胞生长缓慢，以及在这些粘液肿瘤中发现的恶性上皮细胞数量很少。鉴于需要开发模型来研究PMP，器官型切片特别适合研究这种疾病。我们提出了一种用于制备，成像和分析人类标本PMP的方案。
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Protocol
所有组织的去识别和采集均在加州大学圣地亚哥分校根据IRB批准的协议进行。
1. 制备用于组织处理和培养的人PMP组织
- 肿瘤组织的运输和显微切割
- 准备运输和培养基：完成 10% （v/v） Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM）、10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、1% 青霉素/链霉素（笔链球菌）。
- 组织到达后，根据机构IRB批准的方案，将PMP肿瘤组织转移到35个直径为6厘米的培养皿中，其中包含完整的DMEM。
- 使用手术刀从任何液化粘蛋白中显微解剖肿瘤的固体区域。虽然可以切割嵌入组织固体部分的粘蛋白结节，但去除肿瘤的所有液化区域。除了去除任何液化粘蛋白或高度粘液的组织区域外，还可以去除任何难以用手术刀切割的组织。将组织结节切成小块，大小约为 1 cm3 。
注意：获得清除粘蛋白和致密ECM的肿瘤结节对于使用振动切片机成功切割至关重要。作为质量控制，到达研究实验室的肿瘤组织首先由病理学家切割，随后由UCSD生物储存库分发。鉴于高疾病负担，接受网膜蛋糕姑息性减瘤术的组织供体是该方案的最佳案例，这使得从增加的组织可用性中产生更多的切片用于研究。
注意：使用人体组织需要生物安全2级（BSL2）认证。请与该机构联系以获取有关BSL2程序的培训。
- 琼脂糖制备和组织包埋
- 在组织到达的同一天，在不含FBS的PBS中制备5%的低熔点琼脂糖溶液。密切注意琼脂糖溶液，因为它往往会迅速沸腾。
注意：低熔点琼脂糖对于包埋组织碎片至关重要。高熔点琼脂糖会在较高温度下凝固，如果嵌入，会降低组织切片的活力。此外，溶解溶液中的FBS会导致沉淀物的形成。 - 将获得的组织片放入6厘米的培养皿中，没有液体。每6厘米培养皿放置不超过2-3件，以便它们可以作为琼脂糖立方体取出，而不会干扰或接触其他组织。
- 将液体5%琼脂糖溶液加入含有1cm3 肿瘤标本的6cm培养皿中。添加足够的琼脂糖以覆盖标本。加入后，将包埋的组织置于4°C冰箱中30分钟。
- 在组织到达的同一天，在不含FBS的PBS中制备5%的低熔点琼脂糖溶液。密切注意琼脂糖溶液，因为它往往会迅速沸腾。
- 在振动切片机上安装组织标本
- 从冰箱中取出凝固的琼脂，并使用手术刀切割略大于组织宽度的琼脂糖块。
- 将强力胶涂在振动切片机载物台上，然后将琼脂糖立方体轻轻地放在强力胶上。等待 1-2 分钟让胶水凝固。此时，应将带有组织的琼脂糖立方体固定在载物台上。
- 将刀片固定在振动切片机上，并设置组织切片的所需厚度。为了使用共聚焦显微镜进行最佳的下游成像，切片应约为150至250微米。点击 开始 按钮并继续循环切割琼脂糖组织块，直到组织完全切割。
注意：如果组织没有切割或从琼脂糖立方体上脱落，请考虑将组织嵌入更高浓度的琼脂糖中，并修剪掉任何可能太致密而无法切割或粘在振动切片机刀片上的额外组织碎片。
- 在渗透性插入物上培养组织切片
- 通过在渗透膜上方和下方添加 3 mL 的完整 DMEM 培养基来制备用于培养的渗透性插入板。
- 使用细画笔轻轻地将组织切片从振动切片机的切割室中取出，并将两到四个切片放入含有完整DMEM培养基的可渗透培养皿中。24小时后，使用移液管吸出培养基并用新鲜培养基替换培养基。
- 将切片在37°C / 5%CO2下培养长达7天，每24小时更换一次培养基。此时，向培养基中添加细胞杀伤对照（硼替佐米）和可测试的化疗5-氟尿嘧啶（5-FU）以进行药物干预。
- 培养 7 天后，在非药物治疗条件下（完全 DMEM），与第 0 天时间点（切割后立即）相比，预计活力损失约 15%-25%。使用活死活力染料（如钙黄绿素AM（活）和碘化丙啶（死））测量活性。
2. 活体人体组织切片的共聚焦成像
注意：一旦制备了器官型肿瘤切片，就必须确定组织活力以进行高效和优化的下游分析。鉴于肿瘤标本的厚度为 150-250 μm，强烈建议使用共聚焦或双光子显微镜而不是宽视场显微镜来确定 原位研究。流式细胞术也可用于确定活力和细胞群（方法如下）。然而，在流式细胞术分析过程中会失去空间分辨率，并且由于需要通过机械和化学方法分离肿瘤切片，因此活力可能被低估了。
- 试剂制备和实验设置
- 将肿瘤切片置于含有 1% FBS 的 PBS 的 12 孔培养皿的单孔中进行共聚焦成像分析。对于钙成像实验，代替PBS，将切片在细胞外钙溶液中孵育，制备如下：125mM NaCl，5.9mM KCl，2.56mM CaCl2，1mM MgCl2，25mM HEPES，0.1%BSA，pH 7.4，3mM葡萄糖，无菌过滤。提前准备该溶液，并在4°C下储存长达1个月（见第2.1.8节）。
- 按照制造商推荐的浓度和方案，用成像染料（参见 材料表）对样品进行染色，以确定组织切片的活力。添加活性染料后10分钟-1小时的图像。
- 孵育后，将切片转移到含有具有1%FBS的PBS的光学透明玻璃底培养皿中，用于共聚焦成像装置上的成像。
注意：对于共聚焦成像，使用了尼康A1R共聚焦平台。 - 打开共聚焦成像软件。以 10x 开始成像并选择 XYZ 成像模式。然后，按如下方式配置采集设置。
- 打开以下激光器：488 nm 和 561 nm。将增益调整为 100，激光功率为 1%。在图像采集过程中根据需要调整激光功率和增益。根据所需的图像质量，选择 512 x 512 像素或 1024 x 1024 像素以获得更高的分辨率。
- 选择“ 删除互锁”，然后选择“ 扫描 ”以启动映像。
- 对于钙成像，用Fluo-4-AM孵育组织切片避光1小时。遵循制造商在DMSO中溶解Fluo-4-AM的方案。1小时后，用细胞外钙溶液洗涤切片3x，并按照步骤2.1.4-2.1.5中的成像方案进行操作。
- 对于使用 Fluo-4-AM 的钙成像实验，请选择 XYZT 并取消选择 561 nm 激光器以提高采集速度。此外，使用共振扫描仪进一步提高成像速度。
3. 用于流式细胞术的活切片解离
注意：活组织切片的解离可用于多种下游应用，包括免疫分型、活力评估和询问药物干预后细胞群的变化。应采取措施确保在解离过程中保持组织质量和细胞活力。
- 从 1 mL 移液器吸头的末端切下一小块以扩大开口，以便通过移液 1 分钟进行剧烈的机械解离。
- 在 37 °C 下在 1 mL 消化缓冲液中孵育切片并旋转 5-15 分钟，该缓冲液由高葡萄糖 DMEM、10% 温和胶原酶/透明质酸酶 （GCH）、10% FBS 和 10% DNaseI（1 mg/mL 储备液）组成。
注意：经常发现胶原酶/透明质酸酶的批次依赖性变化。 - 在孵育期间使用机械解离2-3次对组织进行剧烈破坏。一定要每5分钟用肉眼检查一次消化，寻找完全消化的证据。如果需要，通过继续步骤3.1.4停止酶消化。
- 消化后，将切片和消化培养基移液到放置在 50 mL 锥形管顶部的 70 μm 过滤器顶部。使用无菌镊子或移液管挑选较大的碎片。
- 使用塑料 5 mL 注射器的钝后端，捣碎任何较大的未解离切片，并用含有 2% FBS 的 4 mL PBS 进一步洗涤。
- 将解离的细胞上清液放入50mL锥形管中，以300× g 离心5-10分钟。除去上清液，用含有 1% FBS 的 1 mL PBS 洗涤沉淀。
- 为了制备用于流式细胞术的样品，加入含有50μL人Fc封闭块的封闭缓冲液，并在室温下放置15分钟。在含有 2% FBS 的 50 μL PBS 中使用相应的抗体进行细胞外染色。
注意：有许多流式细胞术系统。准备好用于流式细胞术的样品后，请参阅制造商的规程以了解设备的操作。
4. 使用活组织切片进行活性和增殖分析的药物干预
注意：一旦制备了器官型肿瘤切片，就可以使用多种方法进行干预方法，包括药物测试，siRNA以及活组织切片的病毒感染。在这里，我们将讨论药物测试以及下游功能读数，其中包括使用局部增殖进行活力分析。
- 准备 10 mL 的 10% v/v 完整 DMEM，含 10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、1% 笔链球菌。
- 等分试样 5 mL 用于对照和处理条件的完整培养基。向剩余的 5 mL 培养基中加入硼替佐米 （2 μM） 以诱导肿瘤切片中的细胞死亡作为阳性对照。
注意：高浓度的硼替佐米是一种诱导细胞死亡的细胞毒性药物。其他细胞毒性药物可用作细胞杀伤的阳性对照。 - 使用已铺在渗透性培养皿上的两到四个组织切片，将步骤4.2中制备的培养基添加到培养皿中，以及用于使用共聚焦显微镜进行下游活力LIVE/DEAD分析的任何其他组合疗法，如步骤2.1.2中所述，或使用顺序匹配切片进行商业发光活性分析。
注意：顺序切片匹配对于发光活力分析至关重要，因为发光活力测定依赖于细胞ATP含量。由于细胞裂解过程中内部对照丢失，因此需要相似大小的切片，因为结果取决于活细胞的起始数量（即，不平衡的切片将导致不平衡的结果）。如果用户没有获得连续切片，则无法进行发光活性分析，因此需要另一种活力评估方法（流式细胞术或基于共聚焦成像的活细胞分析）。 - 将组织切片留在含有完整DMEM的培养物中2-5天，每隔一天更换培养基以及硼替佐米和5-FU。
- 对于发光活性分析，将 500 μL PBS 加入 12 孔培养皿中，并使用画笔将顺序匹配的组织切片转移到 PBS 溶液中，或使用 1 mL 移液器轻轻抽吸以转移这些切片。
- 取出PBS并加入制备的发光活性分析溶液。请参阅试剂制备说明手册。
- 根据条件加入 500 μL 发光活性溶液，并在室温下在摇床上缓慢旋转孵育 30 分钟。使用发光读板器读取发光。
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Representative Results
简而言之，来自PMP的人肿瘤标本是根据IRB批准的方案获得的。制备组织，显微解剖并在琼脂糖模具中固化，以使用振动切片机切割（图1A;视频 1）。切割后，将组织切片放置在可渗透的插入膜上并培养（图1B），可用于原位成像测定，以及使用流式细胞术，共聚焦成像分析和细胞毒性测定进行细胞和功能检查。人PMP组织切片培养和处理的代表性工作流程如图1C所示。初始成像分析可以通过光学显微镜进行（图2A-B）。使用高碘酸-希夫（PAS）染色（图2C）以及粘蛋白特异性抗体（图2D）可视化组织切片中粘蛋白的染色。为了评估活性，将从不同区域切下的切片在钙黄绿素AM和碘化丙啶中孵育以确定其健康和活力（图2E-F）。大多数细胞（大约85%）是活的（钙黄绿素AM+;绿色），而一些细胞在初始切割后通过共聚焦显微镜观察时是死亡的（碘化丙啶;红色）。可以使用180°角位置的入射白光可视化细胞外基质。手术前接受化疗的肿瘤通常显示更多的PI信号。可以使用在切片培养基中添加的EdU来跟踪组织切片的增殖。为了检测，使用商业细胞增殖测定试剂盒，并在培养72小时后在固定切片上进行测定。培养物中活跃增殖的细胞可以在FITC通道（绿色）中测量。细胞核（DAPI）将与培养过程中增殖（EdU+）的细胞重叠（图2G）。量化这些结果以确定肿瘤切片内增殖细胞（DAPI +细胞核）的数量（图2H）。此处显示的结果表明，培养的切片在切片培养过程中是可行的和增殖的。
为了鉴定免疫细胞功能，对活肿瘤切片进行了Ca2+成像研究（图3;视频 2）。使用这种方法可以确定直接和旁分泌信号机制。为了标记局部免疫细胞，通过将切片与CD11b-PE偶联抗体与Fluo-4-AM一起孵育来进行原位细胞标记（图3A）。显示细胞内Ca 2+水平的伪彩色缩放图像可以更好地可视化细胞内Ca2+的差异水平（图3B）。跟踪自发活动，并在突出显示（白色虚线圆圈框;图3A，B）CD11b +免疫细胞。显示了CD11b免疫细胞（红色）以及其他反应性（黑色）和无反应细胞（蓝色）中Ca2 +反应的原始痕迹（图3F）。定量从反应免疫细胞（CD11b +;红色图3F）显示的原始迹线曲线下面积与无反应细胞的定量（蓝色;图 3F）被量化（图3G）。这些结果表明，可以利用该活组织切片平台进行活细胞功能跟踪。
使用流式细胞术的下游分析可用于免疫分型以及研究细胞谱对治疗剂的反应变化。结果可能是由于直接信号传导或间接（旁分泌）信号传导。使用PMP对患者肿瘤样本进行免疫分型的代表性结果如图 4A所示。对肿瘤免疫谱进行定量，发现供体标本337具有高水平的M2巨噬细胞（图4B）。这些结果表明，利用PMP衍生的组织切片使研究人员能够询问患者肿瘤样本的独特供体细胞景观。有必要对分子、细胞和基因组景观进行进一步分析和询问，以制定可能对患者预后有益的从实验室到床边的治疗方法。
PMP人体组织切片的药物分型和下游分析是测量化学耐药性和药物敏感性的直接方法（图5）。结果显示细胞毒性分析以及TUNEL共聚焦成像响应细胞毒性药物硼替佐米（2μM）和5-氟尿嘧啶（5-FU; 2μM）证实的肿瘤切片的细胞杀伤（图5A-C）。由于肿瘤杀伤反应具有高度异质性，因此根据肿瘤分级和先前的HIPEC对数据进行分层非常重要，因为重复化疗已被证明是一种在体内和离体消融肿瘤细胞的无效方法17，18。除了TUNEL分析外，还使用顺序匹配的切片进行发光活性分析（图5D）。在进行细胞毒性测定时，必须使用顺序匹配的肿瘤切片，因为不匹配的切片将导致不可靠的结果。
图1：具有代表性组织切片的腹膜假粘液瘤离 体 器官型切片培养平台的示意图。 用于制备用于免疫分型的器官型切片培养物和研究阑尾起源的假粘液瘤肿瘤的功能特性的代表性工作流程。（A）来自腹膜假黏液瘤（PMP）肿瘤的活体安装肿瘤结节的图像。肿瘤结节嵌入琼脂糖中，琼脂糖使用强力胶固定在振动切片机上。（B）切割肿瘤切片的代表性分布和在反式孔培养皿中的排列。（C）表示切片培养和肿瘤切片询问工作流程的方案。 请点击此处查看此图的大图。
图2：活组织切片的共聚焦成像和功能分析 。 （A） 明场图像 从阑尾源性假粘液瘤腹膜患者身上切下的代表性组织切片的 2 倍放大倍数。（B）A所示代表性组织切片的10倍放大倍数。 （C）腹膜假粘液瘤患者的组织的PAS染色。比例尺 1 mm. （D） 使用 MUC2 抗体（绿色）、EPCAM（红色）和 DAPI（蓝色）进行免疫荧光成像。比例尺50μm。 （E）使用来自供体39的活（钙黄绿素AM;绿色）和死（碘化丙啶;红色）染料的免疫荧光成像。比例尺 50 μm。 （F）在初始组织切割期间使用来自供体39的三个独立切片进行活力分析的定量。误差线是平均值的标准误差。（G）使用EdU（绿色）对增殖进行免疫荧光成像。细胞核用DAPI（蓝色）标记。（H）每1，000个细胞中EdU阳性细胞数量的量化。N = 来自供体 39 的 3 个代表性切片。误差线是平均值的标准误差。 请点击此处查看此图的大图。
图3：使用活组织切片的钙成像进行活细胞跟踪。 （A）来自供体292的活组织切片的原位细胞标记。CD11b标记的巨噬细胞以红色显示。钙成像染料Fluo-4-AM（绿色）。巨噬细胞与CD11b和Fluo-4-AM共标记，以白色突出显示。（B）活组织切片的假色标度（如A所示）。巨噬细胞以白色突出显示，如A.显示100μm的比例尺适用于A.伪彩色比例尺显示为平均灰度值。（中欧）Fluo-4-AM在（C），期间（D）和（E）钙活化之后的高放大倍率图像。（F）原始痕量显示的钙水平的定量。在A-E中突出显示的CD11b +巨噬细胞以红色突出显示。无响应的单元格以蓝色突出显示。其他响应的单元格迹线以黑色显示。（G）定量CD11b +巨噬细胞和无反应细胞之间显示的曲线下的归一化区域。请点击此处查看此图的大图。
图 4：来自腹膜假粘 液瘤的活人肿瘤切片的免疫分型。 （A）对阑尾起源的假粘液瘤肿瘤的免疫细胞谱进行流式细胞术表征的代表性方案。（B）用颜色编码免疫细胞亚群的百分比以及绘制的供体平均条形图。上面的颜色标记是为饼图中的免疫细胞亚群提供的。 请点击此处查看此图的大图。
图5：使用器官型切片培养物进行药物干预的代表性分析。 （A）来自TUNEL分析的代表性图像的免疫荧光，用于未处理的切片（左列），5-FU（2μM;中间列）或硼替佐米（2μM;右列）处理的切片。（B）定量TUNEL免疫荧光作为来自供体339的TUNEL阳性DAPI +细胞的百分比。（C）定量TUNEL免疫荧光作为来自供体339的TUNEL阳性PanCK+细胞的百分比。（D）使用来自供体339的发光活力分析定量药物治疗切片，该分析从2-3个连续匹配的生物学重复中汇集。CTL 表示控制。对照浓度，5-FU （2 μM） 和硼替佐米 （2 μM）。 请点击此处查看此图的大图。
视频1：从转移性粘液性肿瘤结节中切割活体人体组织切片。请点击此处下载此视频。
视频2：腹膜假粘液瘤活体器官型肿瘤切片的钙成像。 在时间点00：00加载Fluo-4-AM的活组织切片的共聚焦图像的最大投影伪彩色图像。比例尺为 50 μm（右下角）。 请点击此处下载此视频。
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Discussion
本手稿描述了一种可用于培养、询问和分析人腹膜假黏液瘤 （PMP） 肿瘤标本的技术。我们利用了许多下游功能检测来询问肿瘤免疫微环境和从工作台到床边测试的平台。
虽然该方法在我们手中非常有效，但使用振动切片机切割肿瘤标本需要一些练习。也就是说，我们遇到了由于高度粘液的样品以及不正确地显微解剖以去除不可切割支架（腹壁，腹水，各种ECM蛋白）而导致的问题。因此，对PMP组织进行显微切割以去除多余的粘蛋白是该协议的关键步骤。我们报道，如之前报道的那样，实体结节患者的成功率为80%。高品位样品在技术上切割的挑战性较小18.此外，琼脂糖（不含FBS）的制备和琼脂糖中组织的固化对于该协议也很重要，以便产生组织切片。此外，研究人员必须了解有关标本的组织状况和手术参数（转移位置、预处理样本）的信息，因为这些将有助于获得新的见解，并有助于解决潜在的故障排除问题。该协议中的另一个关键步骤是肿瘤细胞功能分析。在这里，必须将上皮标志物（如细胞角蛋白染色）与功能读数（细胞凋亡、增殖）结合使用来评估疗效。这在这种特定类型的肿瘤中是必要的，因为许多PMP肿瘤具有不到10%的细胞组成作为肿瘤细胞18。因此，流式细胞术或共聚焦成像是首选的分析方法。然而，使用基于发光的成像的高通量测定可能适用于肿瘤细胞含量较高的肿瘤，或者如果评估治疗药物对TME的作用。
尽管是一种强大的工具，但器官型切片培养具有一定的局限性。例如，该技术的挑战是肿瘤内的细胞异质性。为了解释肿瘤异质性，组间应匹配来自相似肿瘤区域的顺序切片，以进行治疗和细胞活力分析。切割和制备切片需要练习对不可切割的肿瘤支架进行显微解剖。这些技能是成功切割和优化组织切片以限制实验偏差所必需的。另一个限制是切片培养过程中的组织活力。虽然可以在培养物19，20中保持脑或心脏切片数月，但PMP切片培养物目前仅在培养物18中测试了大约1周，这阻碍了长期的实验研究，包括慢性药物治疗和基因操作。可能需要改进培养方法，例如添加补充剂和生长因子，以延长PMP切片培养物的寿命。
器官型切片培养是一种广泛用于研究各种器官的技术，包括大脑、肾脏和肝脏。我们已经在PMP期间采用了这种技术，为我们提供了一种替代模型系统，据我们所知，这是第一个在半完整制剂中检查PMP肿瘤微环境的模型。结合3D患者来源的类器官和外植体培养物，该技术提供了一个强大而灵活的平台，可以快速评估治疗效果，并允许将新疗法从工作台立即转化为床边。
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Disclosures
提交人声明，他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
作者要感谢摩尔斯癌症中心成像核心设施的Kersi Pestonjamasp对显微镜的帮助UCSD专业癌症支持中心P30资助2P30CA023100。这项工作还得到了JoVE出版补助金（JRW）的支持，以及伊丽莎白和Ad Creemers遗产，Euske家庭基金会，胃肠道癌症研究基金和腹膜转移研究基金（AML）的慷慨捐赠。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1 M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| 1 M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| 100 micron filter | ThermoFisher | 22-363-549 | |
| 22 x 40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| 3 M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 5 M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| ATPγS | Tocris | 4080 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | L3224 | |
| CD11b | Biolegend | 101228 | |
| CD206 | Biolegend | 321140 | |
| CD3 | Biolegend | 555333 | |
| CD4 | Biolegend | 357410 | |
| CD45 | Biolegend | 304006 | |
| CD8 | Biolegend | 344721 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G9681 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965084 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Fc-block | BD Biosciences | 564220 | |
| Fluo-4 | Thermo Fisher | F14201 | |
| Gentle Collagenase/Hyaluronidase | Stem Cell | 7912 | |
| Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Imaging Chamber Platform | Warner Instruments | PH-1 | |
| LD-Blue | Biolegend | L23105 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| LIVE/DEAD imaging dyes | Thermofisher | R37601 | |
| Nikon Ti microscope | Nikon | Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096x4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives. | |
| Peristaltic pump | Isamtec | ISM832C | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | L3224 | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA |
References
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