Summary
Vi beskriver en protokol for produktion, kultur og visualisering af humane kræftformer, som har metastaseret til peritoneale overflader. Resected tumorprøver skæres ved hjælp af et vibratomt og dyrkes på permeable indsatser for øget iltning og levedygtighed, efterfulgt af billeddannelse og nedstrømsanalyser ved hjælp af konfokal mikroskopi og flowcytometri.
Abstract
Pseudomyxoma peritonei (PMP) er en sjælden tilstand, der skyldes spredning af en mucinøs primær tumor og den resulterende ophobning af mucinudskillende tumorceller i bughulen. PMP kan opstå fra forskellige typer kræftformer, herunder appendiceal, ovarie og kolorektal, selvom appendiceal neoplasmer er langt den mest almindelige ætiologi. PMP er udfordrende at studere på grund af dets (1) sjældenhed, (2) begrænsede murinmodeller og (3) mucinøs, acellulær histologi. Metoden, der præsenteres her, tillader visualisering og forhør i realtid af disse tumortyper ved hjælp af patientafledte ex vivo organotypiske skiver i et præparat, hvor tumormikromiljøet (TME) forbliver intakt. I denne protokol beskriver vi først forberedelsen af tumorskiver ved hjælp af et vibratomt og efterfølgende langsigtet kultur. For det andet beskriver vi konfokal billeddannelse af tumorskiver og hvordan man overvåger funktionelle aflæsninger af levedygtighed, calciumbilleddannelse og lokal spredning. Kort sagt er skiver fyldt med billedfarvestoffer og placeres i et billeddannelseskammer, der kan monteres på et konfokalmikroskop. Time-lapse-videoer og konfokale billeder bruges til at vurdere den oprindelige levedygtighed og cellulære funktionalitet. Denne procedure undersøger også translationel cellulær bevægelse og parakrin signalinteraktion i TME. Endelig beskriver vi en dissociationsprotokol for tumorskiver, der skal bruges til flowcytometrianalyse. Kvantitativ flowcytometrianalyse kan anvendes til terapeutisk test fra bænk til seng for at bestemme ændringer, der forekommer i immunlandskabet og epitelcelleindholdet.
Introduction
Pseudomyxoma peritonei (PMP) er sjældent syndrom med en forekomst på 1 pr. Million mennesker om året1. De fleste PMP-tilfælde er forårsaget af metastaser fra appendiceale neoplasmer. I betragtning af at mus ikke har et menneskelignende appendiks, er modellering af denne type kræft fortsat ekstremt udfordrende. Mens den primære sygdom ofte kan helbredes ved kirurgisk resektion, er behandlingsmulighederne for metastatisk sygdom begrænsede. Derfor er begrundelsen for at udvikle denne nye organotypiske skivemodel at studere patobiologien af PMP. Til dato er der ingen appendiceal organoidmodeller, der kan dyrkes evigt; Imidlertid viste en nylig model sig at være nyttig til farmakologisk test af terapeutiske midler og immunterapi2. Som sådan har vi tilpasset et organotypisk skivekultursystem, som er blevet brugt i andre typer humane kræftformer, såsom hjerne, bryst, bugspytkirtel, lunge, æggestokke og andre 3,4,5,6.
Ud over appendiceal neoplasmer skyldes PMP lejlighedsvis andre tumortyper, herunder kræft i æggestokkene7, og i sjældne tilfælde intraduktale papillære mucinøse neoplasmer8 og tyktarmskræft9. Derudover har disse tumorer tendens til at vokse langsomt med dårlige engrafthastigheder i patientafledte xenograft (PDX) modeller10,11. I betragtning af disse udfordringer er der et uopfyldt behov for at udvikle modeller til at studere denne sygdom for at begynde at forstå patobiologien af PMP, og hvordan disse kræftceller: rekrutteres til peritoneale overflader, spredes og undslipper immunovervågning.
Mens skåret fra den systemiske vaskulære cirkulation, tumorskiver indeholder cellulære og acellulære komponenter, herunder den ekstracellulære matrix, stromale celler, immunceller, kræftceller, endotelceller og nerver. Dette semi-intakte mikromiljø giver mulighed for funktionel undersøgelse af disse celletyper, hvilket er unikt fordelagtigt sammenlignet med 3D-organoidkulturer, som kun består af kræftceller12. Mens organotypiske skivekulturer er fordelagtige i nogle henseender, er de også i sagens natur en tilgang med lav gennemstrømning sammenlignet med 3D-organoider, som kan udvides og er egnede til multiplekset terapeutisk forsøgslægemiddelscreening13,14,15. I tilfældet PMP har der ikke været rapporter, der dokumenterer pålidelig etablering og evig overførsel af PMP-afledte organoider16. Dette skyldes sandsynligvis den langsomt voksende karakter af PMP-afledte tumorceller samt det lave antal maligne epitelceller, der findes inden for disse mucinøse tumorer. I betragtning af behovet for at udvikle modeller til undersøgelse af PMP er organotypiske skiver unikt egnet til at studere denne sygdom. Vi præsenterer en protokol til forberedelse, billeddannelse og analyse af PMP fra humane prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deidentifikation og erhvervelse af alt væv blev udført under en IRB-godkendt protokol ved University of California, San Diego.
1. Fremstilling af humant PMP-væv til vævsbehandling og -dyrkning
- Transport af tumorvæv og mikrodissektion
- Forbered transport- og kulturmediet: Udfyld 10% (v / v) Dulbeccos modificerede ørnemedier (DMEM), 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 1% penicillin / streptomycin (Pen Strep).
- Ved vævets ankomst og i henhold til en institutionel IRB-godkendt protokol overføres PMP-tumorvæv til 35 skåle med en diameter på 6 cm, der indeholder komplet DMEM.
- Mikrodissekerer faste områder af tumoren fra enhver flydende mucin ved hjælp af en skalpel. Mens mucinknuder indlejret i faste dele af vævet kan skæres, skal du fjerne alle flydende områder af tumoren. Ud over at fjerne flydende mucin eller stærkt mucinøse vævsområder skal du fjerne væv, der er vanskeligt at skære med en skalpel. Skær vævsknuder i mindre stykker, ca. 1 cm3 i størrelse.
BEMÆRK: Opnåelse af tumorknuder renset for mucin og tæt ECM vil være afgørende for vellykket skæring ved hjælp af et vibratom. Som kvalitetskontrol skæres tumorvæv, der ankommer til forskningslaboratoriet, først af en patolog, som efterfølgende distribueres af UCSD-biorepository. Vævsdonorer, der gennemgår palliativ debulking af omentalkagen, er optimale tilfælde for denne protokol givet en høj sygdomsbyrde, hvilket muliggør mere skiveproduktion fra den øgede masse af vævstilgængelighed til forskning.
FORSIGTIG: Arbejde med humant væv kræver certificering af biosikkerhedsniveau 2 (BSL2). Kontakt institutionen for træning i BSL2-procedurer.
- Agarosepræparation og vævsindlejring
- Forbered en 5% opløsning af lavsmelteagarose i PBS uden FBS samme dag som vævets ankomst. Vær meget opmærksom på agaroseopløsningen, da den har tendens til at koge hurtigt.
BEMÆRK: Lavsmelteagarose er afgørende for indlejring af vævsstykker. Agarose med høj smelte vil størkne ved højere temperaturer, hvilket reducerer levedygtigheden af vævsskiver, hvis de er indlejret. Derudover vil FBS i opløsningsopløsningen medføre, at der dannes bundfald. - Anbring vævsstykkerne opnået i 6 cm skåle uden væske. Anbring ikke mere end 2-3 stykker pr. 6 cm skål, så de kan fjernes som agaroseterninger uden at forstyrre eller røre ved andre væv.
- Tilsæt den flydende 5% agaroseopløsning til 6 cm skåle indeholdende 1 cm3 tumorprøverne. Tilsæt nok agarose til bare at dække prøven. Når det er tilsat, anbringes det indlejrede væv i et køleskab på 4 °C i 30 minutter.
- Forbered en 5% opløsning af lavsmelteagarose i PBS uden FBS samme dag som vævets ankomst. Vær meget opmærksom på agaroseopløsningen, da den har tendens til at koge hurtigt.
- Montering af vævsprøver på vibratomet
- Fjern den størknede agar fra køleskabet og skær agaroseterningerne lidt større end vævets bredde ved hjælp af en skalpel.
- Påfør superlim på vibratomstadiet og placer forsigtigt agaroseterningen på superlimen. Lad limen størkne 1-2 minutter. På dette tidspunkt skal agaroseterningen med væv fastgøres til scenen.
- Fastgør bladet til vibratomet og indstil den ønskede tykkelse af vævssektionen. For optimal downstream-billeddannelse ved hjælp af konfokal mikroskopi skal sektionerne være ca. 150 til 250 mikron. Tryk på Start-knappen , og fortsæt med at cykle gennem skæring af agarosevævsblokken, indtil vævet er helt skåret.
BEMÆRK: Hvis vævet ikke skærer eller løsner sig fra agaroseterningen, skal du overveje at indlejre vævet i en agarose med højere koncentration og trimme eventuelle yderligere vævsstykker, der kan være for tætte til at skære eller klæber til vibratombladet.
- Dyrkning af vævsskiver på permeable skær
- Forbered en permeabel skærplade til dyrkning ved at tilføje 2 ml komplet DMEM-medie over og 3 ml under den permeable membran.
- Løft forsigtigt vævsskiverne ud af vibratomens skærekammer med en tynd pensel og læg to til fire skiver i permeable kulturskåle, der indeholder komplette DMEM-medier. Efter 24 timer aspireres mediet ved hjælp af en pipette og erstattes af medier med friske kulturmedier.
- Skiverne dyrkes i op til 7 dage ved 37 °C/5% CO2, og mediet udskiftes hver 24. time. På dette tidspunkt tilføjes kontroller til celledrab (bortezomib) og testbare kemoterapier 5-fluoruracil (5-FU) til dyrkningsmediet for at udføre farmakologisk intervention.
- Efter 7 dages dyrkning skal du forvente et tab af levedygtighed på 15% -25% sammenlignet med dag 0-tidspunktet (umiddelbart efter skæring) under ikke-lægemiddelbehandlede tilstande (komplet DMEM). Mål levedygtigheden ved hjælp af levende døde levedygtighedsfarvestoffer såsom calcein AM (levende) og propidiumiodid (død).
2. Konfokal billeddannelse af levende humane vævsskiver
BEMÆRK: Når de organotypiske tumorskiver er blevet forberedt, er det vigtigt at bestemme vævets levedygtighed for at udføre en effektiv og optimeret nedstrømsanalyse. I betragtning af at tumorprøver er 150-250 μm tykke, anbefales konfok eller to-fotonmikroskopi stærkt over bredfeltmikroskoper til bestemmelse af undersøgelser in situ. Flowcytometri kan også anvendes til bestemmelse af levedygtighed og cellulære populationer (metoder er nedenfor). Imidlertid går den rumlige opløsning tabt under flowcytometrianalyse, og levedygtigheden undervurderes sandsynligvis i betragtning af behovet for at adskille tumorskiver ved mekaniske og kemiske metoder.
- Reagensforberedelse og eksperimentel opsætning
- Placer tumorskiver til konfokal billeddannelsesanalyse i en enkelt brønd i en 12-brøndskål indeholdende PBS med 1% FBS. Til calciumbilleddannelsesforsøg inkuberes skiverne i ekstracellulær calciumopløsning i stedet for PBS fremstillet som følger: 125 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,56 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 25 mM HEPES, 0,1% BSA, pH 7,4, 3 mM glucose, sterilfiltreret. Forbered denne opløsning på forhånd, og opbevar den i op til 1 måned ved 4 °C (se pkt. 2.1.8).
- Efter de koncentrationer og protokoller, der anbefales af producenten, pletter prøver med billeddannende farvestoffer (se materialetabel) for at bestemme levedygtigheden af vævsskiver. Billede i 10 min-1 time efter tilsætning af levedygtighedsfarvestoffet.
- Efter inkubation overføres skiverne til en optisk klar, glasbundet petriskål indeholdende PBS med 1% FBS, der skal bruges til billeddannelse på en konfokal billeddannelsesenhed.
BEMÆRK: Til konfokal billeddannelse blev Nikon A1R Confocal platformen brugt. - Åbn den konfokale billedbehandlingssoftware. Begynd billeddannelsen ved 10x, og vælg XYZ-billedtilstand. Konfigurer derefter anskaffelsesindstillingerne som følger.
- Tænd følgende lasere: 488 nm og 561 nm. Juster forstærkningen til 100 med lasereffekt på 1%. Juster lasereffekten og forstærkningen efter behov under billedoptagelse. Afhængigt af den ønskede billedkvalitet skal du vælge 512 x 512 pixels eller 1024 x 1024 pixels for højere opløsning.
- Vælg Fjern låsning, og vælg derefter Scan for at starte billedbehandling.
- Til calciumbilleddannelse inkuberes vævsskiver med Fluo-4-AM i 1 time beskyttet mod lys. Følg producentens protokol for opløsning af Fluo-4-AM i DMSO. Efter 1 time vaskes skiverne 3x med ekstracellulær calciumopløsning, og billeddannelsesprotokollen i trin 2.1.4-2.1.5 følges.
- For calciumbilleddannelseseksperimenter ved hjælp af Fluo-4-AM skal du vælge XYZT og fravælge 561 nm-laseren for at øge anskaffelseshastigheden. Brug desuden resonansscanneren til yderligere at øge billeddannelseshastigheden.
3. Disassociation af levende skiver til flowcytometri
BEMÆRK: Disassociation af levende vævsskiver kan anvendes til flere downstream-applikationer, herunder immuntypning, vurdering af levedygtighed og undersøgelse af ændringer i cellepopulationer efter farmakologisk intervention. Der bør tages skridt til at sikre, at vævskvalitet og cellelevedygtighed opretholdes under adskillelsesprocessen.
- Skær et lille stykke fra enden af en 1 ml pipettespids for at udvide åbningen for at tillade kraftig mekanisk dissociation ved pipettering i 1 min.
- Inkuber skiver ved 37 °C med rotation i 5-15 minutter i 1 ml fordøjelsesbuffer bestående af DMEM med højt glukoseindhold, 10% blid collagenase/hyaluronidase (GCH), 10% FBS og 10% DNaseI (1 mg/ml lager).
BEMÆRK: Batchafhængige ændringer af collagenase/hyaluronidase findes ofte. - Udfør kraftig forstyrrelse af vævet ved hjælp af mekanisk dissociation 2-3 gange under inkubation. Sørg for at kontrollere fordøjelsen med øjet hvert 5. minut for tegn på fuldstændig fordøjelse. Stop om nødvendigt den enzymatiske fordøjelse ved at fortsætte til trin 3.1.4.
- Når de er fordøjet, pipetteres skiverne og fordøjelsesmediet oven på et 70 μm filter placeret oven på et 50 ml konisk rør. Vælg større stykker ved hjælp af steril tang eller en pipette.
- Brug den stumpe bagende af en plastik 5 ml sprøjte, mos eventuelle større ikke-dissocierede skiver og vask yderligere med 4 ml PBS indeholdende 2% FBS.
- Den dissocierede cellesupernatant tages i et 50 ml konisk rør og centrifugeres ved 300 x g i 5-10 minutter. Supernatanten fjernes og pellets vaskes med 1 ml PBS indeholdende 2% FBS.
- For at forberede prøven til flowcytometri tilsættes blokeringsbufferen indeholdende 50 μL human Fc-blok og lades stå ved stuetemperatur i 15 minutter. Udfør ekstracellulær farvning ved hjælp af de respektive antistoffer i 50 μL PBS indeholdende 2% FBS.
BEMÆRK: Der er mange flowcytometrisystemer. Når prøven er forberedt til flowcytometri, henvises til producentens protokol for betjening af enheden.
4. Farmakologisk intervention med levende vævsskiver til analyse af levedygtighed og spredning
BEMÆRK: Når de organotypiske tumorskiver er blevet fremstillet, kan interventionelle tilgange udføres ved hjælp af flere metoder, herunder lægemiddeltest, siRNA samt virusinfektion af levende vævsskiver. Her vil vi diskutere lægemiddeltest samt nedstrøms funktionelle aflæsninger, som omfatter levedygtighedsanalyse ved hjælp af lokal spredning.
- Forbered 10 ml 10% v / v komplet DMEM med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 1% Pen Strep.
- Aliquot 5 ml komplet medie til kontrol- og behandlingsbetingelser. Til de resterende 5 ml medier tilsættes bortezomib (2 μM) for at inducere celledød i tumorskiver som en positiv kontrol.
BEMÆRK: Bortezomib i høje koncentrationer er et cytotoksisk lægemiddel, der inducerer celledød. De andre cytotoksiske lægemidler kan anvendes som positiv kontrol for celledrab. - Brug to til fire vævsskiver, der er blevet belagt på de permeable retter, til at tilføje mediet tilberedt i trin 4.2 til skålen samt eventuelle yderligere kombinationsbehandlinger, der skal bruges til downstream levedygtighed LIVE / DEAD analyse ved hjælp af konfokal mikroskopi som beskrevet i trin 2.1.2, eller brug en kommerciel selvlysende levedygtighedsanalyse ved hjælp af sekventielt matchede skiver.
BEMÆRK: Sekventiel skivematchning er afgørende for selvlysende levedygtighedsanalyse, da selvlysende levedygtighedsanalyse er afhængig af cellulært ATP-indhold. Da interne kontroller går tabt under cellelyse, kræves skiver af samme størrelse, da resultaterne er afhængige af startantallet af levedygtige celler (dvs. ubalancerede skiver vil resultere i ubalancerede resultater). Hvis brugeren ikke opnår sekventielle skiver, er selvlysende levedygtighedsanalyse ikke mulig, og som sådan kræves en anden levedygtighedsvurderingsmetode (flowcytometri eller konfokal billeddannelse baseret levende celleanalyse). - Lad vævsskiver blive i kultur, der indeholder komplet DMEM, i 2-5 dage, skift af medie samt bortezomib og 5-FU hver anden dag.
- Til selvlysende levedygtighedsanalyse tilsættes 500 μL PBS i en skål med 12 huller, og de sekventielt matchede vævsskiver overføres til PBS-opløsningen ved hjælp af en pensel, eller der suges forsigtigt en 1 ml pipette til at overføre disse.
- PBS fjernes, og der tilsættes den selvlysende levedygtighedsanalyseopløsning, der blev fremstillet. Se brugsanvisningen for fremstilling af reagenset.
- Der tilsættes 500 μL af den selvlysende levedygtighedsopløsning pr. tilstand, og der inkuberes med langsom rotation på rysteapparatet ved stuetemperatur i 30 minutter. Aflæs luminescens ved hjælp af en luminescenspladelæser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kort sagt opnås humane tumorprøver fra PMP under en IRB-godkendt protokol. Vævet fremstilles, mikrodissekeres og størkner i en agaroseform, der skal skæres ved hjælp af et vibratomt (figur 1A; Video 1). Når de er skåret, placeres vævsskiver og dyrkes på permeable indsatsmembraner (figur 1B), som kan bruges til billeddannelsesassays in situ såvel som til cellulære og funktionelle forhør ved hjælp af flowcytometri, konfokal billeddannelsesanalyse og cytotoksicitetsassays. Figur 1C viser en repræsentativ arbejdsgang for dyrkning og forarbejdning af humane PMP-vævsskiver. Indledende billeddannelse analyse kan udføres ved lysmikroskopi (figur 2A-B). Farvningen af mucin i vævsskiver blev visualiseret ved anvendelse af periodisk syre-Schiff (PAS) farvning (figur 2C) såvel som mucinspecifikke antistoffer (figur 2D). For at vurdere levedygtigheden inkuberes skiver skåret fra forskellige regioner i calcein AM og propidiumiodid for at bestemme deres sundhed og levedygtighed (figur 2E-F). De fleste celler (ca. 85%) er levedygtige (calcein AM +; grøn), mens nogle celler er døde (propidiumiodid; rød), når de visualiseres ved konfokal mikroskopi efter første skæring. Den ekstracellulære matrix kan visualiseres ved hjælp af et incidenshvidt lys i en vinkelposition på 180 °. Tumorer behandlet med kemoterapi før operationen viser ofte mere PI-signal. Spredningen af vævsskiver kan spores ved hjælp af EdU tilsat i skivekulturmediet. Til påvisning blev der anvendt et kommercielt celleproliferationsanalysesæt, og analysen blev udført på faste skiver efter 72 timers kultur. Aktivt prolifererende celler i kultur kan måles i FITC-kanalen (grøn). Cellekernerne (DAPI) overlapper med celler, der har spredt sig (EdU +) under dyrkning (figur 2G). Disse resultater kvantificeres for at bestemme antallet af prolifererende celler (DAPI+ kerner) i tumorskiven (figur 2H). Resultaterne vist her indikerer, at dyrkede skiver er levedygtige og proliferative under skivekultur.
For at identificere immuncellefunktionalitet blev Ca2+ billeddannelsesundersøgelser udført på levende tumorskiver (figur 3; Video 2). Ved hjælp af denne tilgang kan direkte og parakrin signalmekanismer identificeres. For at mærke lokale immunceller blev in situ cytolabeling udført ved at inkubere skiver med et CD11b-PE konjugeret antistof sammen med Fluo-4-AM (figur 3A). Pseudofarvede skalerede billeder, der viser intracellulære Ca 2+-niveauer, giver bedre mulighed for at visualisere differentielle niveauer af intracellulær Ca2+ (figur 3B). Spontan aktivitet blev sporet, og tidsforløbsbilleder vises for før (figur 3C), under (figur 3D) og efter (figur 3E) et intracellulært Ca2+-respons inden for den fremhævede (hvid stiplet cirkelboks; Figur 3A, B) CD11b + immuncelle. De rå spor af Ca2+ responser i CD11b immuncellen (rød) sammen med andre responsive (sorte) og ikke-responsive celler (blå) er vist (figur 3F). Kvantificering af arealet under kurven af de rå spor vist fra den responderende immuncelle (CD11b+; rød figur 3F) sammenlignet med kvantificeringen af den ikke-responderende celle (blå; Figur 3F) blev kvantificeret (figur 3G). Disse resultater indikerer, at funktionel sporing af levende celler kan udføres ved hjælp af denne levende vævsskiveplatform.
Downstream-analyse ved hjælp af flowcytometri kan bruges til immuntype samt undersøge ændringer i cellulære profiler som reaktion på terapeutiske midler. Resultaterne kan skyldes direkte signalering eller indirekte (parakrine) signalering. Repræsentative resultater af immuntypning af en patienttumorprøve med PMP er vist i figur 4A. Tumorimmunprofilen blev kvantificeret, og donorprøven 337 viste sig at have høje niveauer af M2-makrofager (figur 4B). Disse resultater indikerer, at anvendelse af PMP-afledte vævsskiver giver forskere mulighed for at forhøre det unikke donorcellulære landskab af patientens tumorprøver. Yderligere analyse og forhør af det molekylære, cellulære og genomiske landskab er berettiget til at strategisere en bench-to-bedside terapeutisk tilgang, der kan være gavnlig for patientresultater.
Farmakotypning og downstream-analyse af vævsskiver fra PMP-humant væv er en direkte metode til måling af kemoresistens og lægemiddelfølsomhed (figur 5). Resultaterne viser celledrab af tumorskiver som bekræftet ved cytotoksicitetsanalyse samt TUNEL konfokal billeddannelse som reaktion på det cytotoksiske lægemiddel bortezomib (2 μM) og 5-fluorouracil (5-FU; 2 μM) (figur 5A-C). Da tumordræbende responser er meget heterogene, er det vigtigt at stratificere data på basis af tumorkvalitet og tidligere HIPEC, da gentagen kemoterapi har vist sig at være en ineffektiv metode til at ablate tumorceller in vivo og ex vivo17,18. Ud over TUNEL-analyse blev selvlysende levedygtighedsanalyse udført ved hjælp af sekventielt matchede skiver (figur 5D). Det er vigtigt at bruge sekventielt matchede tumorskiver, når der udføres cytotoksicitetsanalyser, da uovertrufne skiver vil føre til upålidelige resultater.
Figur 1: Skematisk illustration af pseudomyxoma peritonei ex vivo organotypisk skivekulturplatform med repræsentative vævsskiver. En repræsentativ arbejdsgang til fremstilling af organotypiske skivekulturer til immuntypning og til undersøgelse af funktionelle egenskaber af pseudomyxomatumorer af appendiceal oprindelse. (A) Billedet af en levende monteret tumorknude fra en pseudomyxoma peritonei (PMP) neoplasma. Tumorknuden er indlejret i agarose, som er fastgjort til et vibratomt ved hjælp af superlim. (B) Den repræsentative fordeling af skæretumorskiver og arrangement i en trans-well kultur skål. (C) Skemaet, der repræsenterer arbejdsgang for skivekultur og forhør af tumorskiver. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Konfokal billeddannelse og funktionel analyse af levende vævsskiver . (A) Brightfield-billede 2x forstørrelse af en repræsentativ vævsskive skåret fra en patient med pseudomyxoma peritonei af appendiceal oprindelse. (B) En 10x forstørrelse af den repræsentative vævsskive vist i A. (C) PAS-farvning af et væv fra en patient med pseudomyxoma peritonei. Skalabjælke 1 mm. (D) Immunfluorescensbilleddannelse ved hjælp af MUC2-antistof (grøn), EPCAM (rød) og DAPI (blå). Skalabjælke 50 μm. (E) Immunfluorescensbilleddannelse ved anvendelse af levende (calcein AM; grøn) og døde (propidiumiodid; røde) farvestoffer fra donor 39. Skalastang 50 μm. (F) Kvantificering af levedygtighedsanalyse ved hjælp af tre separate skiver fra donor 39 under indledende vævsskæring. Fejlbjælker er standardfejlen i middelværdien. G) Immunfluorescensbilleddannelse af proliferation ved hjælp af EdU (grøn). Cellekerner er mærket med DAPI (blå). (H) Kvantificering af antallet af EDU-positive celler pr. 1 000 celler. N = 3 repræsentative skiver fra donor 39. Fejlbjælker er standardfejlen i middelværdien. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Sporing af levende celler ved hjælp af calciumbilleddannelse af levende vævsskiver. (A) In situ cytomærkning af en levende vævsskive fra donor 292. CD11b mærket makrofager vist med rødt. Calciumbilleddannende farvestof Fluo-4-AM (grøn). Macrophage co-mærket med CD11b og Fluo-4-AM fremhævet med hvidt. (B) Pseudofarveskala for en levende vævsskive (vist i A). Makrofag fremhævet med hvidt som i A. Skalalinje, der viser 100 μm, gælder for A. Pseudofarveskalabjælke vist som gennemsnitlige grå værdier. (C-E) Billede med høj forstørrelse af Fluo-4-AM før (C), under (D) og efter (E) calciumaktivering. (F) Kvantificering af calciumindholdet vist ved råspor. CD11b + makrofagen fremhævet i A-E er fremhævet med rødt. En celle, der ikke reagerer, fremhæves med blåt. De andre reagerende cellespor vises med sort. (G) Kvantificering af det normaliserede areal under kurven vist mellem CD11b + makrofag og en ikke-responderende celle. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Immunotypning af levende humane tumorskiver fra pseudomyxoma peritonei . (A) Repræsentativt skema til udførelse af flowcytometrikarakterisering af immuncelleprofiler fra pseudomyxomatumorer af appendiceal oprindelse. (B) Procentdelen af immuncelleundergrupper er farvekodet såvel som donorens gennemsnitlige bjælke plottet. Farvemarkørerne ovenfor findes for immuncelleundergrupper i cirkeldiagrammer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Repræsentativ analyse for farmakologisk intervention ved anvendelse af organotypisk skivekultur. (A) Immunofluorescens af repræsentative billeder fra TUNEL-analyse på ubehandlede skiver (venstre kolonne), 5-FU (2 μM; midterste kolonne) eller Bortezomib (2 μM; højre kolonne) behandlede skiver. (B) Kvantificering af TUNEL immunofluorescens som en procentdel af TUNEL positive DAPI+ celler fra donor 339. C) Kvantificering af TUNEL-immunfluorescens som en procentdel af TUNEL-positive PanCK+-celler fra donor 339. (D) Kvantificering af lægemiddelbehandlede skiver ved hjælp af selvlysende levedygtighedsanalyse fra donor 339 poolet fra 2-3 sekventielt matchede biologiske replikater. CTL betegner kontrol. Koncentration til kontrol, 5-FU (2 μM) og bortezomib (2 μM). Klik her for at se en større version af denne figur.
Video 1: Skæring af levende humane vævsskiver fra metastatiske mucinøse tumorknuder. Klik her for at downloade denne video.
Video 2: Calciumbilleddannelse af levende organotypiske tumorskiver fra pseudomyxoma peritonei. Pseudofarvebilleder af maksimal projektion fra konfokale billeder af en levende vævsskive fyldt med Fluo-4-AM på tidspunktet 00:00. Skalabjælken er 50 μm (nederst til højre). Klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette manuskript beskriver en teknik, der kan bruges til at dyrke, forhøre og analysere humane pseudomyxoma peritonei (PMP) tumorprøver. Vi har brugt adskillige downstream funktionelle assays til at forhøre tumorimmunmikromiljøet og en platform til bench-to-bedside test.
Mens metoden er yderst effektiv i vores hænder, vil det kræve en vis øvelse at skære tumorprøver ved hjælp af et vibraatom. Vi stødte nemlig på problemer, der skyldtes meget mucinøse prøver, samt prøver, der fejlagtigt blev mikrodissekeret for at fjerne uudskærelige stilladser (abdominalvæg, ascites, forskellige ECM-proteiner). Som sådan er mikrodissektion af PMP-vævet for at fjerne overskydende mucin et kritisk trin i denne protokol. Vi rapporterer en succesrate på 80% hos patienter med solide knuder som tidligere rapporteret. Højkvalitetsprøver var teknisk mindre udfordrende at skære18. Desuden er fremstillingen af agarose (uden FBS) og størkning af vævet i agarose også vigtig for denne protokol for at producere vævsskiver. Derudover vil det være vigtigt for forskeren at være opmærksom på oplysninger om vævsforhold og kirurgiske parametre for prøven (placering af metastasen, forbehandlede prøver), da disse vil hjælpe med ny indsigt samt hjælpe med at løse potentielle fejlfindingsproblemer. Et andet kritisk trin i denne protokol er i tumorcellefunktionsanalysen. Her er det vigtigt at anvende en epitelmarkør (såsom cytokeratinfarvning) i kombination med en funktionel aflæsning (apoptose, proliferation) for at vurdere effektiviteten. Dette er nødvendigt i denne særlige type tumor, fordi mange PMP-tumorer har mindre end 10% af den cellulære sammensætning som tumorceller18. Som sådan er flowcytometri eller konfokal billeddannelse den foretrukne analysemetode. Imidlertid kan analyser med høj kapacitet ved hjælp af luminescensbaseret billeddannelse være passende i tumorer med højere tumorcelleindhold, eller hvis terapeutiske rolle vurderes på TME.
På trods af at det er et kraftfuldt værktøj, har den organotypiske skivekultur visse begrænsninger. For eksempel er en udfordring ved denne teknik den cellulære heterogenitet inden for tumorer. For at tage højde for tumorheterogenitet bør sekventielt skårne skiver fra lignende tumorregioner matches mellem grupper til behandling og analyse af cellelevedygtighed. Skæring og forberedelse af skiver kræver øvelse til at mikrodissekere uudskærelige tumorstilladser. Disse færdigheder er nødvendige for vellykket skæring og optimering af vævsskiver for at begrænse eksperimentelle forstyrrelser. En anden begrænsning er vævets levedygtighed under skivekultur. Mens det er muligt at opretholde hjerne- eller hjerteskiver i flere måneder i kulturer 19,20, er skivekulturer fra PMP i øjeblikket kun testet i ca. 1 uge i kultur 18, hvilket forhindrer langvarig eksperimentel undersøgelse, herunder kronisk lægemiddelbehandling og genetisk manipulation. Forbedringer i dyrkningsmetoder såsom tilsætning af kosttilskud og vækstfaktorer kan være nødvendige for at forlænge levetiden for PMP-skivekulturer.
Organotypisk skivekultur er en meget anvendt teknik til at studere forskellige organer, herunder hjernen, nyrerne og leveren. Vi har vedtaget denne teknik til brug under PMP, hvilket giver os et alternativt modelsystem, der efter vores bedste overbevisning er den første model til at undersøge PMP-tumormikromiljøet i et semi-intakt præparat. I forbindelse med 3D-patientafledte organoider og eksplantatkulturer tilbyder denne teknik en robust og fleksibel platform til hurtigt at vurdere behandlingseffektiviteten og muliggøre øjeblikkelig oversættelse af nye terapier fra bænk til sengekant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Kersi Pestonjamasp fra Moores Cancer Center imaging kernefacilitet for hjælp med mikroskoperne UCSD Specialized Cancer Support Center P30 tilskud 2P30CA023100. Dette arbejde blev desuden støttet af et JoVE-publikationstilskud (JRW) samt generøse gaver fra boet efter Elisabeth og Ad Creemers, Euske Family Foundation, Gastrointestinal Cancer Research Fund og Peritoneal Metastasis Research Fund (AML).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1 M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| 1 M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| 100 micron filter | ThermoFisher | 22-363-549 | |
| 22 x 40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| 3 M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 5 M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| ATPγS | Tocris | 4080 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | L3224 | |
| CD11b | Biolegend | 101228 | |
| CD206 | Biolegend | 321140 | |
| CD3 | Biolegend | 555333 | |
| CD4 | Biolegend | 357410 | |
| CD45 | Biolegend | 304006 | |
| CD8 | Biolegend | 344721 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G9681 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965084 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Fc-block | BD Biosciences | 564220 | |
| Fluo-4 | Thermo Fisher | F14201 | |
| Gentle Collagenase/Hyaluronidase | Stem Cell | 7912 | |
| Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Imaging Chamber Platform | Warner Instruments | PH-1 | |
| LD-Blue | Biolegend | L23105 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| LIVE/DEAD imaging dyes | Thermofisher | R37601 | |
| Nikon Ti microscope | Nikon | Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096x4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives. | |
| Peristaltic pump | Isamtec | ISM832C | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | L3224 | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA |
References
- Bevan, K. E., Mohamed, F., Moran, B. J.
- Votanopoulos, K. I., et al. Appendiceal cancer patient-specific tumor organoid model for predicting chemotherapy efficacy prior to initiation of treatment: A feasibility study. Annals of Surgical Oncology. 26 (1), 139-147 (2019).
- Holliday, D. L., et al. The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models. Journal of Clinical Pathology. 66 (3), 253-255 (2013).
- Koerfer, J., et al. Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer. Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).
- Misra, S., et al. Ex vivo organotypic culture system of precision-cut slices of human pancreatic ductal adenocarcinoma. Scientific Reports. 9 (1), 2133 (2019).
- Ohnishi, T., Matsumura, H., Izumoto, S., Hiraga, S., Hayakawa, T. A novel model of glioma cell invasion using organotypic brain slice culture. Cancer Research. 58 (14), 2935-2940 (1998).
- Seidman, J. D., Elsayed, A. M., Sobin, L. H., Tavassoli, F. A. Association of mucinous tumors of the ovary and appendix. A clinicopathologic study of 25 cases. The Amerian Journal of Surgical Pathology. 17 (1), 22-34 (1993).
- Mizuta, Y., et al. Pseudomyxoma peritonei accompanied by intraductal papillary mucinous neoplasm of the pancreas. Pancreatology. 5 (4-5), 470-474 (2005).
- Gong, Y., Wang, X., Zhu, Z. Pseudomyxoma peritonei originating from transverse colon mucinous adenocarcinoma: A case report and literature review. Gastroenterology Research and Practice. 2020, 5826214 (2020).
- Fleten, K. G., et al. Experimental treatment of mucinous peritoneal metastases using patient-derived xenograft models. Translational Oncology. 13 (8), 100793 (2020).
- Kuracha, M. R., Thomas, P., Loggie, B. W., Govindarajan, V. Patient-derived xenograft mouse models of pseudomyxoma peritonei recapitulate the human inflammatory tumor microenvironment. Cancer Medicine. 5 (4), 711-719 (2016).
- Jiang, X., et al. Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment. Oncoimmunology. 6 (7), 1333210 (2017).
- Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).
- Liu, L., Yu, L., Li, Z., Li, W., Huang, W. Patient-derived organoid (PDO) platforms to facilitate clinical decision making. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 40 (2021).
- Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 45 (2019).
- Carr, N. J. New insights in the pathology of peritoneal surface malignancy. Journal of Gastrointestinal Oncology. 12, 216-229 (2021).
- Votanopoulos, K. I., et al. Outcomes of repeat cytoreductive surgery with hyperthermic intraperitoneal chemotherapy for the treatment of peritoneal surface malignancy. Journal of the American College of Surgeons. 215 (3), 412-417 (2012).
- Weitz, J., et al. An ex-vivo organotypic culture platform for functional interrogation of human appendiceal cancer reveals a prominent and heterogenous immunological landscape. Clinical Cancer Research. 28 (21), 4793-4806 (2022).
- Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research. Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).
- Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies. Organogenesis. 5 (2), 62-66 (2009).
