Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

في المختبر التحقيق في آثار المصفوفة خارج الخلية الغنية بالهيالورونان على هجرة خلايا القمة العصبية

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64749
Automatic Translation
1
1Department of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics, Osaka University Graduate School of Dentistry

Summary

يحدد هذا البروتوكول تجربة الهجرة في المختبر المناسبة للتحليل الوظيفي للجزيئات المشاركة في الهجرة في الجسم الحي لخلايا القمة العصبية إلى المصفوفة خارج الخلية الغنية بالهيالورونان.

Abstract

خلايا القمة العصبية (NCCs) هي خلايا شديدة الارتحال تنشأ من المنطقة الظهرية للأنبوب العصبي. تعد هجرة الخلايا الخيطية من الأنبوب العصبي عملية أساسية لإنتاج NCC وهجرتها اللاحقة نحو المواقع المستهدفة. يتضمن مسار هجرة NCCs ، بما في ذلك أنسجة الأنبوب العصبي المحيطة ، مصفوفة خارج الخلية غنية بالهيالورونان (HA). لنمذجة هجرة NCC إلى هذه الأنسجة المحيطة الغنية ب HA من الأنبوب العصبي ، تم إنشاء اختبار هجرة الركيزة المختلطة الذي يتكون من HA (متوسط الوزن الجزيئي: 1,200-1,400 kDa) والكولاجين من النوع الأول (Col1) في هذه الدراسة. يوضح اختبار الهجرة هذا أن خلايا خط خلايا NCC ، O9-1 ، مهاجرة للغاية على الركيزة المختلطة وأن طلاء HA يتحلل في موقع الالتصاقات البؤرية أثناء الهجرة. يمكن أن يكون هذا النموذج في المختبر مفيدا لمزيد من الاستكشاف للأساس الميكانيكي الذي ينطوي عليه هجرة NCC. ينطبق هذا البروتوكول أيضا على تقييم ركائز مختلفة كسقالات لدراسة هجرة NCC.

Introduction

خلايا القمة العصبية (NCCs) هي مجموعة خلايا متعددة القدرات موجودة في الأجنة النامية ، وتنشأ من حدود الصفيحة العصبية أثناء العصبية. أنها تسهم في تشكيل مجموعة متنوعة من الأنسجة ، بما في ذلك الجهاز العصبي المحيطي ، ونظام القلب والأوعية الدموية ، والأنسجة القحفية الوجهية ، والهيكل العظمي1. بعد الحث ومواصفات NCC على حدود الصفيحة العصبية ، تهاجر NCCs من الظهارة العصبية وتهاجر نحو مواقع الأنسجة المشتقة من NCC1.

الهيالورونان (HA) هو جليكوزامينوجليكان غير كبريتي يتم توزيعه في مجموعة متنوعة من الأنسجة كمكون للمصفوفة خارج الخلية (ECM). تم إثبات أهمية HA في تطور الجنين في الأنظمة النموذجية من خلال استئصال الجينات المسؤولة عن استقلاب الهيالورونان. على سبيل المثال ، تم العثور على طفرات في جينات سينسيز الهيالورونان (Has1 و Has2) في Xenopus تؤدي إلى عيوب هجرة NCC والتشوه القحفيالوجهي 2. بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ عن أن البروتيوغليكان المرتبط ب HA ، aggrecan و versican ، يمارس تأثيرات مثبطة على هجرة NCC3. في الفئران ، يؤدي الاجتثاث Has2 إلى عيوب شديدة في تكوين وسادة الشغاف ، مما يؤدي إلى فتك منتصف الحمل (E9.5-10)4،5،6.

ثبت مؤخرا أن البروتين عبر الغشاء 2 (Tmem2) ، وهو هيالورونيداز سطح الخلية ، يلعب دورا مهما في تعزيز التصاق الخلايا السرطانية بوساطة الأنتغرين وهجرتها عن طريق إزالة HA المرتبط بالمصفوفة في مواقع الالتصاق 7,8. في الآونة الأخيرة ، أظهر Inubushi et al.9 أن نقص Tmem2 يؤدي إلى عيوب قحفية وجهية شديدة بسبب تشوهات في هجرة / هجرة NCC والبقاء على قيد الحياة. في الدراسة السابقة9 ، تم تحليل تعبير Tmem2 أثناء تكوين NCC والهجرة. لوحظ تعبير Tmem2 في موقع تفريغ NCC وفي هجرة NCCs الإيجابية Sox9 (الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك ، باستخدام خلايا القمة العصبية للفأر المستنفد Tmem2 O9-1 ، أظهرت الدراسة أن التعبير في المختبر ل Tmem2 كان ضروريا لخلايا O9-1 لتشكيل التصاقات بؤرية وهجرتها إلى ركائز تحتوي على HA (الشكل 2 والشكل 3) 9.

تشير هذه النتائج بقوة إلى أن Tmem2 مهم أيضا لالتصاق NCC والانتقال من خلال ECM الغني ب HA. ومع ذلك ، فإن الآلية الجزيئية لالتصاق NCC والهجرة داخل ECM الغنية ب HA لا تزال غير واضحة. لذلك ، من الضروري إنشاء نظام تجريبي للثقافة في المختبر لاستكشاف التصاق NCC والهجرة بشكل كامل داخل ECM الغني ب HA.

من بين الأساليب العديدة المستخدمة في اختبار هجرة الخلايا ، فإن الفحص القائم على إغلاق جرح الخلية هو طريقة بسيطة تستخدم بشكل متكرر في مجالات علم وظائف الأعضاء والأورام10. هذا النهج مفيد بسبب صلته بالنمط الظاهري في الجسم الحي وهو فعال في تحديد أدوار الأدوية والجاذبات الكيميائية أثناء هجرة الخلايا11. من الممكن تقييم قدرة الهجرة لكل من كتل الخلايا الكاملة والخلايا الفردية عن طريق قياس مسافات فجوة الخلية بمرور الوقت11. في هذه المخطوطة ، تم تقديم اختبار معدل قائم على إغلاق الجروح في المختبر لنموذج هجرة NCC إلى الأنسجة الغنية ب HA المحيطة بالأنبوب العصبي. ينطبق هذا الإجراء أيضا على دراسة مكونات ECM المختلفة (مثل الكولاجين والفبرونيكتين واللامينين) لتحليل دور سقالة ECM في هجرة NCC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في كلية الدراسات العليا لطب الأسنان بجامعة أوساكا.

1. ثقافة خلايا قمة الجمجمة العصبية الفأر

ملاحظة: يتكون خط خلايا القمة العصبية المستخدم في هذه الدراسة من خلايا O9-1 ، المشتقة أصلا من Wnt1-Cre. الخلايا المعبرة عن R26R-GFP المعزولة من أجنة الفئران E8.512 (انظر المناقشة). تتبع الطريقة الموضحة هنا لزراعة خلايا O9-1 البروتوكول13 الذي تم إنشاؤه مسبقا.

  1. تحضير لوحة مصفوفة الغشاء القاعدي.
    1. قم بإذابة مصفوفة الغشاء القاعدي (انظر جدول المواد) على الجليد. تمييع المصفوفة 1:50 في 1x PBS المبردة ، والحفاظ على الجليد.
    2. قم بتغطية صفيحة استزراع 10 سم ب 10 مل من محلول مصفوفة الغشاء القاعدي المخفف. احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة ، ونضح المصفوفة قبل الاستخدام.
    3. اغسل الطبق 3x مع 2 مل من PBS.
  2. ثقافة خلايا O9-1 على لوحة مغلفة بمصفوفة الغشاء القاعدي.
    1. قم بتسخين وسط الخلية الجذعية الجنينية الكاملة (انظر جدول المواد) في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
    2. امزج تعليق الخلية O9-1 برفق (انظر جدول المواد) واحسب عدد الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي (انظر جدول المواد). اضبط تركيز الخلية على 1.1 × 106 / مل باستخدام وسيط خلية ES كامل.
    3. أضف 8 مل من وسط الخلايا الجذعية الجنينية الكامل الذي تم تسخينه مسبقا إلى صفيحة الاستزراع 10 سم المطلية بالمصفوفة ، وقم بزرع خلايا O9-1 عند 1.1 × 106 خلايا / لوحة. احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة 5٪ CO2 .
    4. في اليوم التالي ، استبدل الوسط بوسط خلية ES كامل جديد (تم تسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية). استبدله بوسط طازج كل 2-3 أيام بعد ذلك.
      ملاحظة: عندما تكون الخلايا متقاربة بنسبة 80٪ تقريبا (3-4 أيام بعد الطلاء) ، يمكن فصلها بنسبة 0.25٪ من التربسين-EDTA وتمريرها أكثر أو تجميدها لاستخدامها لاحقا. يوضح الشكل 1 صورا تمثيلية لخلايا O9-1.
    5. اغسل طبق الاستزراع ب 2 مل من 1x PBS قبل التربسين. يضاف 2 مل من التربسين-EDTA المسخن مسبقا بنسبة 0.25٪ ويحتضن لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. تحقق من انفصال الخلية الكامل ؛ اضغط برفق على جانب اللوحة عدة مرات إذا لزم الأمر.
    6. أضف 2 مل من وسط الخلايا الجذعية الجنينية الكامل الذي تم تسخينه مسبقا إلى لوحة المزرعة وانقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
    7. تخلص من المادة الطافية دون إزعاج حبيبات الخلية. بعد ذلك ، أضف 2 مل من وسط الخلايا الجذعية الجنينية الكامل الذي تم تسخينه مسبقا إلى الأنبوب ، وأعد تعليق الخلايا تماما عن طريق الماصة. زرع الخلايا على لوحة استزراع جديدة بكثافة الخلية المطلوبة.
    8. بدلا من ذلك ، قم بإعداد مخزون الخلايا المجمدة عن طريق إضافة 1 مل من وسط تجميد الخلايا الذي يحتوي على 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى الأنبوب بدلا من وسط الخلايا الجذعية الجنينية الكامل وإعادة تعليق الخلايا تماما. انقل تعليق الخلية إلى أنابيب التبريد ، واحفظه في درجة حرارة -80 درجة مئوية.

2. تحضير الطبق المطلي ب HA / Col1

ملاحظة: تم اقتراح الطريقة الأصلية لطلاء HA / Col1 على أطباق ذات قاع زجاجي بواسطة Irie et al.7.

  1. أضف بعناية 50 ميكرولتر من ثلاثي إيثوكسيسيلان غير المخفف إلى طبق ذو قاع زجاجي 3.5 سم (انظر جدول المواد). احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) وحفظه بعيدا عن الضوء.
    ملاحظة: يجب ألا تتجاوز الحضانة مع ثلاثي إيثوكسيسيلان 5 دقائق. قد يؤثر ذلك على كفاءة الطلاء وينتج منتجات غير مرغوب فيها.
  2. اغسل الطبق بسرعة 3 مرات مع 2 مل من الماء المقطر. أضف 50 ميكرولتر من 0.25٪ جلوتارالدهيد ، مخفف 100x في برنامج تلفزيوني ، لكل طبق ، واحتضانه في RT لمدة 30 دقيقة.
  3. اغسل بسرعة 4x مع 2 مل من برنامج تلفزيوني. ثم قم بتغطية الأطباق ب 300 ميكرولتر من الكولاجين من النوع الأول في 0.2 N حمض الخليك في RT لمدة 1 ساعة.
  4. يغسل بسرعة 3x مع 2 مل من PBS. أضف 300 ميكرولتر من 200 ميكروغرام / مل من هيالورونات الصوديوم H2 (FAHA-H2) المسمى بالفلوريسينامين (المخفف في PBS) إلى كل طبق واحتضانه طوال الليل في RT. اغسل مرة أخرى 3x مع 2 مل من PBS. بعد استنشاق برنامج تلفزيوني ، جفف اللوحة بالهواء لمدة 5 دقائق على مقعد نظيف.
    ملاحظة: FAHA-H2 عبارة عن هيالورونات الصوديوم المسمى بالفلورسينامين بمتوسط وزن جزيئي يتراوح بين 1200-1600 كيلو فولت أمبير. يمكن استخدام HA ذو الوزن الجزيئي المناسب وفقا لتصميم البحث.

3. مقايسة الهجرة على الطبق المطلي ب HA / Col1

ملاحظة: تم إجراء اختبار قائم على إغلاق الجرح باستخدام فجوات خالية من الخلايا 500 ميكرومتر محددة في ركائز Col1 / HA باستخدام إدخالات ثقافة بئرين (انظر جدول المواد). تعبر خلايا O9-1 عن Tmem2 ، وهو أمر مطلوب لالتصاق وتدهور HA في الفضاء خارج الخلية9 (الشكل 2 والشكل 3).

  1. بعد تجفيف الطبق ذو القاع الزجاجي المطلي ، قم بتوصيل إدخالات الثقافة 2-well بالأطباق ، واملأ الإدخالات خارجيا ب 1 مل من PBS.
  2. قم بزرع خلايا O9-1 في الآبار عند 1 × 104 خلايا في 100 ميكرولتر من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) الذي يحتوي على 2٪ مصل بقري جنيني (FBS) لكل إدخال. استزراع الخلايا لمدة يومين عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ CO2 .
  3. قم بإزالة الحشوات بعناية من الأطباق ذات القاع الزجاجي المطلي بالملاقط. اغسل الأطباق ذات القاع الزجاجي المطلي برفق باستخدام 2 مل من 1x PBS لإزالة الخلايا وحطام الخلايا. أضف 2 مل من DMEM الطازج الذي يحتوي على 2٪ FBS إلى أطباق الاستزراع.
  4. التقط صورا بتباين الطور الآن كنقطة زمنية للبدء باستخدام مجهر مضان الكل في واحد في وضع أحادي اللون مع إعدادات عالية الدقة (كسب عند 6 ديسيبل ، بدون تجميع). تم استخدام العدسات الموضوعية ذات التكبير من 4x إلى 20x للتصوير في هذه الدراسة (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: التقط صور تباين الطور باستخدام أشرطة المقياس المقابلة واحفظها بتنسيق TIFF.
  5. استزرع الخلايا لمدة 48 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. التقط صورا بتباين الطور عند 24 ساعة و 48 ساعة في الثقافة باستخدام مجهر مضان الكل في واحد.
  6. ثبت الخلايا عند 48 ساعة باستخدام 1 مل من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية. ثم اغسل الأطباق 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها 1 مل من برنامج تلفزيوني طازج.
  7. ضع غطاء مع وسيط تثبيت (انظر جدول المواد) لمزيد من المراقبة المورفولوجية.
    ملاحظة: يمكن تصوير الأطباق على الفور أو تخزينها لمدة تصل إلى 2 أشهر عند 4 درجات مئوية.
  8. اختياري: تسمية الخلايا المناعية للبروتينات ذات الأهمية.
    ملاحظة: يوصف هنا كمثال بروتوكول للكشف عن مركب الالتصاق البؤري (FA) باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة مشتق من الفأر (انظر جدول المواد).
    1. احتضن الأطباق (من الخطوة 3.6) ب 0.5 مل من العازلة المانعة (5٪ مصل الماعز العادي في برنامج تلفزيوني) لمدة 60 دقيقة.
      ملاحظة: اختر حاجزا مناسبا للحظر للجسم المضاد الأساسي. سيكون المخزن المؤقت النموذجي للحجب هو مصل طبيعي بنسبة 5٪ من نفس النوع مثل الجسم المضاد الثانوي المستخدم.
    2. تحضير الجسم المضاد الأولي المخفف في المخزن المؤقت لتخفيف الأجسام المضادة (1٪ مصل الماعز الطبيعي في برنامج تلفزيوني). احتضان الأطباق مع 0.5 مل من الأجسام المضادة الأولية المخففة طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: اختر المخزن المؤقت المناسب لتخفيف الأجسام المضادة. عادة ، يتم استخدام الجسم المضاد في تخفيف 1: 50-1: 200.
    3. شطف 3x لمدة 5 دقائق لكل منها مع 2 مل من PBS. قم بإعداد الجسم المضاد الثانوي المخفف المشتق من الماعز المضاد للفأر في المخزن المؤقت لتخفيف الأجسام المضادة (1٪ مصل الماعز الطبيعي في برنامج تلفزيوني). احتضان الأطباق مع 0.5 مل من الأجسام المضادة الثانوية المخففة لمدة 1-3 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: عادة ، يتم استخدام الجسم المضاد الثانوي عند تخفيف 1: 500-1: 1,000. يمكن استخدام DAPI لتلطيخ النوى.
    4. شطف 3x مع 2 مل من PBS لمدة 5 دقائق في كل مرة. ضع غطاء الغطاء مع 50 ميكرولتر من وسيط التثبيت.
      ملاحظة: يمكن تصوير الأطباق باستخدام المجهر الفلوري الكل في واحد مع مرشح GFP (الإثارة: 470/40 ، الانبعاث: 525/50) ومرشح TexasRed (الإثارة: 560/40 ، الانبعاث: 630/75) في وضع أحادي اللون مع إعدادات عالية الدقة (كسب عند 6 ديسيبل ، بدون تجميع). تم استخدام عدسات موضوعية ذات تكبير من 4x إلى 20x للتصوير في هذه الدراسة.
      ملاحظة: يمكن تخزين الشريحة لمدة تصل إلى 2 أشهر عند 4 درجات مئوية.

4. تحليل البيانات

  1. افتح برنامج ImageJ 1.51s. في نافذة ImageJ، حدد ملف > فتح من شريط القائمة لفتح ملف الصورة المحفوظ.
  2. لضبط مقياس القياس ، ارسم خطا بنفس مسافة شريط المقياس. انتقل إلى تحليل > تعيين مقياس واكتب المسافة والوحدات المعروفة للخط في المربعات المناسبة في نافذة تعيين المقياس .
  3. ارسم خطا مستقيما بين فجوة الخلية، واضغط على تحليل > قياس لنقل القيم إلى نافذة بيانات. قم بقياس خمسة مواضع مختلفة على الأقل في كل عينة ، وقم بحساب متوسط المسافات للحصول على بيانات العينة التمثيلية. إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام البرامج المناسبة (انظر جدول المواد).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم إجراء اختبار الهجرة على ركائز مختلطة تتكون من Col1 والوزن الجزيئي العالي HA (متوسط الوزن الجزيئي: 1,200-1,400 كيلو دالتون) باستخدام البروتوكول الموضح هنا. تم العثور على خلايا O9-1 عند حدود الفجوة تهاجر بسهولة إلى الفجوة الغنية ب HA (الشكل 4). أكد التلوين المناعي لعلامة FA ، vinculin14 ، أن خلايا O9-1 شكلت التصاقات بؤرية (FAs) في مواقع تدهور HA (الشكل 5).

Figure 1
الشكل 1: تعبير TMEM2 في NCCs. المقاطع المستعرضة للأنبوب العصبي لأجنة Tmem2-FLAGKI عند E9.0. (أ) تم تسمية المقاطع الموجودة على مستوى الجمجمة والجذع للأنبوب العصبي بعلامة مزدوجة لبروتين TMEM2-FLAG و HA. لوحظ تعبير TMEM2 في الصفيحة العصبية والمنطقة الحدودية للأنبوب العصبي (رؤوس الأسهم المملوءة) ، في حين كانت هذه المواقع خالية من تلطيخ HA (رؤوس الأسهم المفتوحة). (ب) وضع العلامات المزدوجة على خلايا القمة العصبية ل TMEM2-FLAG و Sox9. تم تلطيخ المقاطع المستعرضة للأنبوب العصبي E9.0 ل TMEM2-FLAG و Sox9. Sox9-إيجابية قبل الهجرة والهجرة NCCs على حافة الأنبوب العصبي أعرب عن TMEM2 للغاية. اختصار: nt = الأنبوب العصبي. قضبان المقياس: (أ) 300 ميكرومتر ؛ ب: 100 ميكرومتر. مقتبس بإذن من Inubushi et al.9. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تحلل حمض الهيالورونيك بواسطة TMEM2 في خلايا O9-1. (أ) صور تمثيلية لخلايا O9-1 المستنفدة من Tmem2 وخلايا التحكم المزروعة على طبق استزراع عادي (يسار). (B) تم تقييم التعبير عن Tmem2 في هذه الخلايا بواسطة qPCR ، مع Gapdh كعنصر تحكم داخلي للتطبيع (الرسم البياني الشريطي). يتم عرض الوسائل ± SD (n = 5) كأشرطة أفقية. p < 0.001 بواسطة اختبار t للطالب غير المقترن. شريط المقياس ، 5.0 ميكرومتر. (ج) مقايسة الهيالورونيداز القائمة على الخلايا. تم استزراع خلايا O9-1 المستنفدة ل Tmem2 والتحكم لمدة 48 ساعة على أغطية زجاجية مطلية ب HA المفلور (FA-HA). تم الكشف عن نشاط تدهور HA كمناطق مظلمة في الخلفية الفلورية. كما تمت مقارنة مستوى تحلل حمض الهيالورونيك كميا بين الخلايا المستنفدة ل Tmem2 والخلايا الضابطة O9-1 كما هو موضح في المواد والطرق (الرسم البياني). تمثل البيانات متوسط ± SD لشدة التألق تحت الخلية بالنسبة لتلك الموجودة في المنطقة الخالية من الخلايا (n > 50 خلية لكل حالة مجمعة من ثلاث تجارب مستقلة). p < 0.001 بواسطة اختبار t للطالب غير المقترن. اعتمد بإذن من Inubushi et al.9. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تدهور حمض الهيالورونيك المرتبط بالركيزة عند FAs في خلايا O9-1. تم إجراء فحوصات الهيالورونيداز القائمة على الخلايا لمدة 16 ساعة وتم تلطيخ الخلايا للفينكولين. في خلايا التحكم O9-1 ، يحدث تدهور HA في FAs إيجابية vinculin. في خلايا O9-1 المستنفدة Tmem2 ، يتضاءل تدهور HA وتكوين FA بشكل كبير. تمت مقارنة عدد FAs لكل خلية كميا بين الخلايا المستنفدة Tmem2 وخلايا التحكم O9-1 (الرسم البياني الشريطي). تمثل البيانات متوسط ± SD (n >30 خلية لكل حالة مجمعة من ثلاث تجارب مستقلة). p < 0.001 بواسطة اختبار t للطالب غير المقترن. اعتمد بإذن من Inubushi et al.9. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: صور تمثيلية لهجرة الخلايا O9-1 إلى فجوة خالية من الخلايا على ركائز Col1 / HA مختلطة. (أ) توضح اللوحة العلوية الفجوات في بداية التجربة (اليوم 0). تظهر اللوحات السفلية صور الفجوة بعد حضانة 24 ساعة (اليوم 1) أو 48 ساعة (اليوم 2). شريط المقياس = 150 ميكرومتر. (ب) رسم بياني شريطي يوضح التحليل الكمي لهجرة الخلايا. تمثل البيانات متوسط ± SD لمنطقة الفجوة التي تغطيها الخلايا المهاجرة بالنسبة إلى مساحة الفجوة الأصلية (n = 5 لكل حالة). * p < 0.05 ، ** p < 0.01 ، ***p < 0.001 بواسطة اختبار t للطالب غير المزاوج. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تدهور HA في ركائز Col1 / HA المختلطة في FAs في خلايا O9-1. تم تصنيف خلايا O9-1 المزروعة على ركائز مختلطة تتكون من Col1 / HA مناعيا بجسم مضاد للفينكولين (أحمر). تمثل البقع / الخطوط الداكنة نشاط تحلل حمض الهيالورونيك في ركيزة FAHA-H2 (خضراء). تم تحديد مواقع تدهور HA والالتصاقات البؤرية (vinculin) على الركائز المختلطة (رؤوس الأسهم). شريط المقياس = 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تنظم مكونات ECM المختلفة الهجرة / الهجرة NCC. على سبيل المثال ، ينظم HA بشكل إيجابي ترحيل NCC 2,15. ومن المثير للاهتمام ، أن دراسة تستند إلى نماذج الفئران الجينية ل Tmem2 ، وهو هيالورونيداز سطح الخلية ، أوضحت متطلبات تدهور HA في هجرة NCC9. الكولاجين وفير أيضا في ECM المحيط بالأنبوب العصبي16. ثبت أن Decorin ، وهو بروتيوغليكان صغير غني بالليوسين ، ينظم هجرة NCC أثناء التطور العصبي17. تؤثر مكونات ECM الأخرى ، بما في ذلك اللامينين والفبرونيكتين ، على التصاق NCC والهجرة18. ومع ذلك ، لا تزال الأدوار المحددة لمكونات ECM في ترحيل NCC غير معروفة.

يهدف النموذج المختبري الموصوف هنا إلى فحص سلوك ناقلات الكربون الوطنية المهاجرة التي تواجه ECM الغنية ب HA. اخترنا ركائز 2D ، بدلا من 3D ، بسبب الصعوبات في إعداد المواد الهلامية الكولاجين HA المركبة مع خصائص الهلام موحدة. في نظام الثقافة 2D ، تختلف التدرجات المكانية لتركيزات العامل القابل للذوبان وصلابة ركائز المصفوفة خارج الخلية عن تلك الموجودة في الأنسجة الحية19. من وجهة النظر هذه ، يتمتع نظام الثقافة ثلاثية الأبعاد بمزايا كبيرة ويمكن أن يوفر رؤى أعمق لآليات هجرة الخلايا20,21. في هذا السياق ، يفضل إعداد نظام فحص 3D ، إن أمكن. قد يكون هذا النموذج التجريبي في المختبر قابلا للتطبيق على فحص سلوك ترحيل NCC استجابة لمكونات ECM المختلفة. وهذا من شأنه أن يمكن من فهم أفضل للأساس الميكانيكي لهجرة NCC ، الذي يحكم تكوين الجنين.

تعبر خلايا O9-1 المستخدمة في هذه الدراسة بثبات عن علامات الخلايا الجذعية (CD44 و Sca-1 و Bmi1) وعلامات القمة العصبية (AP-2a و Twist1 و Sox9 و Myc و Ets1 و Dlx1 و Dlx2 و Crabp1 و Epha2 و Itgb1). في ظل ظروف الاستزراع غير المتمايزة ، تحافظ خلايا O9-1 على خصائص تشبه الخلايا الجذعية متعددة القدرات. خلايا O9-1 لديها القدرة على التمايز إلى أنواع متعددة من الخلايا ، بما في ذلك بانيات العظم ، والخلايا الغضروفية ، وخلايا العضلات الملساء ، والخلايا الدبقية في ظل ظروف زراعة محددة12. لذلك ، تعد خلايا O9-1 أداة مفيدة للتحقيق في الخصائص الجزيئية لهجرة NCC الجمجمة والتمايز. ومع ذلك ، فإن استخدام NCCs الأولية (على سبيل المثال ، من الأنابيب العصبية الجنينية للدجاج أو الفأر) بدلا من خلايا O9-1 سيوفر بيانات أكثر تفصيلا لتسهيل فهم أفضل لطبيعة هجرة NCC.

في مقايسة الهجرة القائمة على إغلاق الجرح ، سوف تتكاثر NCC أيضا وستساهم الزيادة في عدد الخلايا أيضا في توسيع عدد الخلايا في منطقة الفجوة22. لتقليل الانتشار أثناء فحص التئام الجروح ، فإن تجويع المصل هو الطريقة الأكثر شيوعا بدلا من استخدام العوامل الدوائية23. ومع ذلك ، يجب اختبار آثار تجويع المصل في كل نوع من الخلايا.

الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هي إضافة الطلاء التساهمي ل HA إلى الأطباق ذات القاع الزجاجي. تستخدم معالجة سطح الزجاج باستخدام كواشف السيلان لتحليل الالتصاقات البؤرية لركائز ECM24. Triethoxysilane هو مركب سيليكون عضوي يحتوي على العديد من المجموعات الأمينية الحرة التي يمكن أن ترتبط بمجموعات الهيدروكسيل الحرة على الأسطح الزجاجية السيليكا25. تم تطوير تقنية وتحسينها في هذه الدراسة لإنتاج طبقة رقيقة ومستقرة من السيلان على سطح زجاج السيليكا باستخدام ثلاثي إيثوكسيسيلان. يمكن للأمين الموجود في السطح الزجاجي المطلي بثلاثي إيثوكسيسيلان أن يربط مجموعات الكربوكسيل على HA ، وبالتالي يجمد حمض الهيالورونيك كيميائيا على السطح الزجاجي8. ومع ذلك ، مع هذه الطريقة ، لا يمكن ربط ركائز ECM الأخرى القائمة على البروتين بسطح الزجاج. لذلك ، تم استخدام الجلوتارالدهيد هنا لشل حركة الكولاجين من النوع الأول كيميائيا من خلال اقتران الأمين بالألدهيد. والجدير بالذكر أن طلاء HA غير الكافي يمكن أن يؤدي إلى إزالة طلاء HA حتى بدون الهضم الأنزيمي (على سبيل المثال ، من خلال عمل القوة الميكانيكية أثناء التصاق الخلية والهجرة). يمكن الطلاء بركائز ECM بدلا من النوع الأول من الكولاجين ، بشرط أن تمتلك الركائز مجموعات أمين. ومع ذلك ، قد توجد قيود في طلاء ECM تساهميا على أطباق ذات قاع زجاجي بسبب الخواص الكيميائية للركيزة ؛ وبالتالي ، قد تكون هناك حاجة للتجربة والخطأ.

على الرغم من أنه ليس نموذجا مثاليا لتقليد هجرة NCC إلى ECM الغني ب HA المحيط بالأنبوب العصبي ، إلا أن تجربة الهجرة في المختبر هذه قد تكون مفيدة للتحليل الوظيفي للجزيئات المشاركة في هجرة NCC في الجسم الحي . بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون هذا الفحص في المختبر مفيدا لفحص الأدوية العلاجية لتسريع أو منع تدهور حمض الهيالورونيك ، وكذلك هجرة أنواع الخلايا الأخرى ، بما في ذلك الخلايا الليفية الجلدية والخلايا الكيراتينية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحب البلاغ أنه لا توجد مصالح متنافسة.

Acknowledgments

أعرب عن تقديري الكبير لفوميتوشي إيري ويو ياماغوتشي لتشجيعهما واقتراحاتهما الطيبة في إنشاء هذه الطريقة. تم دعم هذا العمل من خلال المنح المساعدة لبرامج البحث العلمي من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (#19KK0232 إلى TI ، #20H03896 إلى T.I.). تم وصف الطريقة الأصلية لطلاء HA على ركائز زجاجية ومقايسات تحلل HA في الموقع على الركائز في Yamamoto et al. (2017) 8 ، بينما تم وصف طريقة تحضير ركائز HA / Col1 المختلطة في Irie et al. (2021) 7.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10cm cell culture dish CORNING Cat. 353003
1X PBS Millipore Cat. No. BSS-1005-B
2-well culture inserts ibidi Cat. No. 80209
Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG Invitrogen Cat. A21422 Goat derived anti-mouse secondary antibody
automated cell counter Bio-Rad Cat. No. TC20
CELLBANKER ZENOGEN PHARMA Cat. 11910 Cell freezing medium
collagen type I Sigma Cat. No. 08-115
Complete ES Cell Medium Millipore Cat. No. ES-101-B
DAPI Invitrogen Cat. 10184322
Dulbecco’s Modified Eagle Medium  Gibco Cat. 11971025
Fetal Bovine serum Gibco Cat. 10270106
fluorescence microscope Keyence Cat. No. BZ-X700
Fluoresent labelled HA PG Research FAHA-H2
Glas bottom dish Iwaki Cat. 11-0602
glutaldehyde Sigma Cat. No. G5882
Matrigel Fisher Cat. No. CB-40234 The basement-membrane matrix
monoclonal anti-vinculin antibody Sigma Cat. No. V9264
mounting media Dako S3023
Normal goat serum Fisher Cat. 50062Z
O9-1 cells Millipore Cat. No. SCC049
Paraformaldehyde Sigma Cat. 158127
triethoxysilane Sigma Cat. No. 390143
trypsin-EDTA Millipore Cat. No. SM-2003-C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326 (2013).
  2. Casini, P., Nardi, I., Ori, M. Hyaluronan is required for cranial neural crest cells migration and craniofacial development. Developmental Dynamics. 241 (2), 294-302 (2012).
  3. Landolt, R. M., Vaughan, L., Winterhalter, K. H., Zimmermann, D. R. Versican is selectively expressed in embryonic tissues that act as barriers to neural crest cell migration and axon outgrowth. Development. 121 (8), 2303-2312 (1995).
  4. Camenisch, T. D., et al. Disruption of hyaluronan synthase-2 abrogates normal cardiac morphogenesis and hyaluronan-mediated transformation of epithelium to mesenchyme. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 349-360 (2000).
  5. Camenisch, T. D., Schroeder, J. A., Bradley, J., Klewer, S. E., McDonald, J. A. Heart-valve mesenchyme formation is dependent on hyaluronan-augmented activation of ErbB2-ErbB3 receptors. Nature Medicine. 8 (8), 850-855 (2002).
  6. Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
  7. Irie, F., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 regulates cell adhesion and migration via degradation of hyaluronan at focal adhesion sites. Journal of Biological Chemistry. 296, 100481 (2021).
  8. Yamamoto, H., et al. A mammalian homolog of the zebrafish transmembrane protein 2 (TMEM2) is the long-sought-after cell-surface hyaluronidase. Journal of Biological Chemistry. 292 (18), 7304-7313 (2017).
  9. Inubushi, T., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 plays an essential role in mouse neural crest cell development and survival. PLoS Genetics. 18 (7), 1009765 (2022).
  10. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
  11. Pijuan, J., et al. Cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
  12. Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
  13. Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
  14. Humphries, J. D., et al. Vinculin controls focal adhesion formation by direct interactions with talin and actin. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1043-1057 (2007).
  15. Perris, R., Perissinotto, D. Role of the extracellular matrix during neural crest cell migration. Mechanisms of Development. 95 (1-22), 3-21 (2000).
  16. Perris, R., et al. Spatial and temporal changes in the distribution of proteoglycans during avian neural crest development. Development. 111 (2), 583-599 (1991).
  17. Zagris, N., Gilipathi, K., Soulintzi, N., Konstantopoulos, K. Decorin developmental expression and function in the early avian embryo. The International Journal of Developmental Biology. 55 (6), 633-639 (2011).
  18. Perris, R., Paulsson, M., Bronner-Fraser, M. Molecular mechanisms of avian neural crest cell migration on fibronectin and laminin. Developmental Biology. 136 (1), 222-238 (1989).
  19. Chevalier, N. R., et al. How tissue mechanical properties affect enteric neural crest cell migration. Scientific Reports. 6, 20927 (2016).
  20. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  21. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
  22. Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion and Migration. 8 (5), 440-451 (2014).
  23. Davis, P. K., Ho, A., Dowdy, S. F. Biological methods for cell-cycle synchronization of mammalian cells. Biotechniques. 30 (6), 1322-1331 (2001).
  24. Wayner, E. A., Garcia-Pardo, A., Humphries, M. J., McDonald, J. A., Carter, W. G. Identification and characterization of the T lymphocyte adhesion receptor for an alternative cell attachment domain (CS-1) in plasma fibronectin. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1321-1330 (1989).
  25. Robert, G. A., et al. Molecular structure of 3-aminopropyltriethoxysilane layers formed on silanol-terminated silicon surfaces. The Journal of Physical Chemistry. 116 (10), 6289-6297 (2012).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 192 ،
<em>في المختبر</em> التحقيق في آثار المصفوفة خارج الخلية الغنية بالهيالورونان على هجرة خلايا القمة العصبية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Inubushi, T. In Vitro… More

Inubushi, T. In Vitro Investigation of the Effects of the Hyaluronan-Rich Extracellular Matrix on Neural Crest Cell Migration. J. Vis. Exp. (192), e64749, doi:10.3791/64749 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter