Summary
В этом протоколе описывается эксперимент по миграции in vitro , подходящий для функционального анализа молекул, участвующих в миграции клеток нервного гребня in vivo во внеклеточный матрикс, богатый гиалуронаном.
Abstract
Клетки нервного гребня (NCC) представляют собой сильно мигрирующие клетки, которые происходят из дорсальной области нервной трубки. Эмиграция NCC из нервной трубки является важным процессом для производства NCC и их последующей миграции к целевым участкам. Миграционный путь NCC, включая окружающие ткани нервной трубки, включает внеклеточный матрикс, богатый гиалуроновой кислотой (ГК). Для моделирования миграции NCC в эти богатые ГК окружающие ткани из нервной трубки в этом исследовании был создан смешанный анализ миграции субстрата, состоящий из ГК (средняя молекулярная масса: 1,200-1,400 кДа) и коллагена типа I (Col1). Этот анализ миграции показывает, что клетки клеточной линии NCC, O9-1, сильно мигрируют на смешанном субстрате и что покрытие HA деградирует в месте очаговых спаек в ходе миграции. Эта модель in vitro может быть полезна для дальнейшего изучения механистического базиса, участвующего в миграции NCC. Этот протокол также применим для оценки различных субстратов в качестве каркасов для изучения миграции NCC.
Introduction
Клетки нервного гребня (NCC) представляют собой мультипотентную клеточную популяцию, которая присутствует в развивающихся эмбрионах, и они происходят из границы нервной пластинки во время нейруляции. Они способствуют формированию различных тканей, включая периферическую нервную систему, сердечно-сосудистую систему, черепно-лицевые ткани и скелет1. После индукции и спецификации NCC на границе нервной пластинки NCC эмигрируют из нейроэпителия и мигрируют к тканевым участкам, полученным из NCC1.
Гиалуронан (ГК) представляет собой несульфатированный гликозаминогликан, который распределяется в различных тканях как компонент внеклеточного матрикса (ECM). Важность гиалуроновой кислоты в развитии эмбриона была продемонстрирована в модельных системах путем абляции генов, ответственных за метаболизм гиалуроновой кислоты. Например, было обнаружено, что мутации в генах гиалуроновой синтазы (Has1 и Has2) у Xenopus приводят к дефектам миграции NCC и черепно-лицевой мальформации2. Кроме того, сообщалось, что HA-связывающие протеогликаны, аггрекан и версикан, оказывают ингибирующее действие на миграцию NCC3. У мышей абляция Has2 приводит к серьезным дефектам формирования эндокардиальной подушки, что приводит к летальности в середине беременности (E9,5-10) 4,5,6.
Недавно было продемонстрировано, что трансмембранный белок 2 (Tmem2), гиалуронидаза клеточной поверхности, играет решающую роль в стимулировании адгезии и миграции раковых клеток, опосредованных интегрином, путем удаления матрикс-ассоциированной ГК в местах адгезии 7,8. Совсем недавно Inubushi et al.9 продемонстрировали, что дефицит Tmem2 приводит к тяжелым черепно-лицевым дефектам из-за аномалий в эмиграции/миграции и выживаемости NCC. В предыдущем исследовании9 экспрессия Tmem2 была проанализирована во время формирования и миграции NCC. Экспрессия Tmem2 наблюдалась в месте расслоения NCC и в эмигрирующих Sox9-положительных NCC (рис. 1). Кроме того, с использованием истощенных Tmem2 клеток нервного гребня мыши O9-1 исследование показало, что экспрессия Tmem2 in vitro необходима для формирования фокальных спаек клетками O9-1 и их миграции в HA-содержащие субстраты (рис. 2 и рис. 3)9.
Эти результаты убедительно указывают на то, что Tmem2 также важен для адгезии и миграции NCC через HA-богатый ECM. Однако молекулярный механизм адгезии и миграции NCC в богатом ГК ECM до сих пор неясен. Поэтому необходимо создать экспериментальную систему культивирования in vitro для полного изучения адгезии и миграции NCC в богатом ГК ECM.
Из многочисленных подходов, используемых при тестировании миграции клеток, анализ на основе закрытия клеточной раны является простым методом, часто используемым в области физиологии и онкологии10. Этот подход полезен из-за его актуальности для фенотипа in vivo и эффективен при определении роли лекарств и хемоаттрактантов во время миграции клеток11. Можно оценить миграционную способность как целых клеточных масс, так и отдельных клеток, измеряя расстояния между клеточными промежутками во времени11. В этой рукописи модифицированный анализ, основанный на закрытии раны in vitro , представлен для моделирования миграции NCC в богатые ГК ткани, окружающие нервную трубку. Эта процедура также применима для изучения различных компонентов ECM (например, коллагенов, фибронектина и ламинина) для анализа роли каркаса ECM в миграции NCC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были одобрены Комитетом по этике животных Высшей школы стоматологии Университета Осаки.
1. Культура клеток черепного нервного гребня мыши
ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточная линия нервного гребня, используемая в этом исследовании, включает клетки O9-1, первоначально полученные из Wnt1-Cre; R26R-GFP-экспрессирующие клетки, выделенные из эмбрионов мышей E8.512 (см. обсуждение). Описанный здесь способ культивирования клеток O9-1 следует ранее установленному протоколу13.
- Подготовьте пластину с матричным покрытием базальной мембраны.
- Разморозьте матрицу базальной мембраны (см. Таблицу материалов) на льду. Разбавьте матрицу 1:50 в охлажденном 1x PBS и держите на льду.
- Покройте 10-сантиметровую культуральную пластину 10 мл разбавленного матричного раствора с базальной мембраной. Инкубируйте пластину при комнатной температуре в течение 1 часа и аспирируйте матрицу перед использованием.
- Вымойте тарелку 3 раза 2 мл PBS.
- Культура клеток O9-1 на пластине с матричным покрытием базальной мембраны.
- Нагрейте всю среду эмбриональных стволовых клеток (см. Таблицу материалов) на водяной бане при температуре 37 °C.
- Аккуратно перемешайте суспензию ячеек O9-1 (см. Таблицу материалов) и подсчитайте количество ячеек с помощью автоматического счетчика ячеек (см. Таблицу материалов). Отрегулируйте концентрацию клеток до 1,1 × 106 / мл с полной клеточной средой ES.
- Добавьте 8 мл предварительно нагретой полной среды ES-клеток в 10-сантиметровую культуральную пластину с матричным покрытием и засейте клетки O9-1 в количестве 1,1 x 106 клеток/планшет. Инкубировать при 37 °C в 5% увлажненном инкубаторе CO2 .
- На следующий день замените среду свежей полной средой ES-ячейки (предварительно подогретой до 37 °C). После этого заменяйте свежим носителем каждые 2-3 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда клетки сливаются примерно на 80% (через 3-4 дня после нанесения покрытия), их можно диссоциировать с 0,25% трипсина-ЭДТА и передавать дальше или замораживать для последующего использования. Репрезентативные изображения клеток O9-1 показаны на рисунке 1. - Перед трипсинизацией вымойте культуральную тарелку 2 мл 1x PBS. Добавьте 2 мл предварительно подогретого 0,25% трипсина-ЭДТА и инкубируйте в течение 5 мин при 37 ° C. Проверка на полное отсоединение клеток; При необходимости аккуратно постучите по стенке тарелки пару раз.
- Добавьте 2 мл предварительно подогретой полной среды ES-клеток в культуральную пластину и перенесите диссоциированные клетки в коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте пробирку при 300 x g в течение 5 мин.
- Выбросьте надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу. Затем добавьте в пробирку 2 мл предварительно нагретой полной среды ES-клеток и тщательно ресуспендируйте клетки пипеткой. Засейте клетки на новую культуральную пластину с желаемой плотностью клеток.
- Альтернативно, готовят замороженный клеточный запас, добавляя 1 мл клеточной замораживающей среды, содержащей 10% диметилсульфоксида (ДМСО), в пробирку вместо полной среды ES-клеток и тщательно ресуспендируя клетки. Переложите клеточную суспензию в криопробирки и храните при температуре -80 °C.
2. Приготовление блюда, покрытого HA/Col1
ПРИМЕЧАНИЕ: Оригинальный метод нанесения HA/Col1 на посуду со стеклянным дном был предложен Irie et al.7.
- Осторожно добавьте 50 мкл неразбавленного триэтоксисилана в чашку со стеклянным дном диаметром 3,5 см (см. Таблицу материалов). Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре (RT) и беречь от света.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация с триэтоксисиланом не должна превышать 5 минут. Это может повлиять на эффективность покрытия и привести к получению нежелательных продуктов. - Быстро вымойте посуду 3 раза 2 мл дистиллированной воды. Добавьте 50 мкл 0,25% глутарового альдегида, разбавленного в 100 раз в PBS, на чашку и инкубируйте при RT в течение 30 минут.
- Быстро вымойте 4 раза с 2 мл PBS. Затем смажьте посуду 300 мкл коллагена I типа в 0,2 N уксусной кислоты при РТ в течение 1 часа.
- Быстро промойте 3 раза с 2 мл PBS. Добавьте 300 мкл 200 мкг / мл меченного флуоресцеинамином гиалуроната натрия-H2 (FAHA-H2) (разбавленного в PBS) в каждую чашку и инкубируйте в течение ночи при RT. Снова промойте 3 раза с 2 мл PBS. После аспирации PBS высушите пластину на воздухе в течение 5 минут на чистой скамье.
ПРИМЕЧАНИЕ: FAHA-H2 представляет собой меченный флуоресцеинамином гиалуронат натрия со средней молекулярной массой в диапазоне от 1,200 до 1,600 кДа. Гиалуроновая кислота соответствующей молекулярной массы может быть использована в соответствии с дизайном исследования.
3. Анализ миграции на тарелке, покрытой HA/Col1
ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ на основе закрытия раны с использованием определенных 500 мкм бесклеточных промежутков в субстратах Col1 / HA был выполнен с использованием 2-луночных культуральных вставок (см. Таблицу материалов). Клетки O9-1 экспрессируют Tmem2, который необходим для адгезии и деградации ГК во внеклеточном пространстве9 (рис. 2 и рис. 3).
- После высыхания чашки со стеклянным дном с покрытием прикрепите 2-луночные вкладыши для культуры к посуде и заполните вкладыши снаружи 1 мл PBS.
- Засейте клетки O9-1 в лунки в количестве 1 x 104 клеток в 100 мкл модифицированной среды Eagle (DMEM) Дульбекко, содержащей 2% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) на вкладыш. Культивируйте клетки в течение 2 дней при 37 ° C в 5% увлажненном инкубаторе CO2 .
- Аккуратно снимите вставки с покрытой стеклянной посуды пинцетом. Аккуратно вымойте посуду со стеклянным дном с покрытием 2 мл 1x PBS, чтобы удалить клетки и клеточный мусор. Добавьте 2 мл свежего ДМЭМ, содержащего 2% FBS, в чашки для культивирования.
- Захват фазово-контрастных изображений теперь в качестве начальной точки времени с помощью флуоресцентного микроскопа «все в одном» в монохромном режиме с настройками высокого разрешения (усиление при 6 дБ, без биннинга). Линзы объектива с увеличением от 4x до 20x использовались для визуализации в этом исследовании (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Захватите фазово-контрастные изображения с соответствующими масштабными линейками и сохраните их в формате TIFF. - Культивируют клетки еще 48 ч при 37 °C и 5%CO2. Получение фазово-контрастных изображений через 24 ч и 48 ч в культуре с помощью флуоресцентного микроскопа «все в одном».
- Зафиксируйте клетки в течение 48 ч 1 мл 4% параформальдегида (PFA) в течение 15 минут при комнатной температуре или на ночь при 4 ° C. Затем вымойте посуду 3 раза по 5 минут каждая, добавив 1 мл свежего PBS.
- Поместите покровное стекло с монтажной средой (см. Таблицу материалов) для дальнейшего морфологического наблюдения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Посуду можно сразу же наносить или хранить до 2 месяцев при температуре 4 °C. - Дополнительно: Иммуномаркировка клеток на наличие интересующих белков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол для обнаружения комплекса фокальной адгезии (FA) с использованием моноклонального антивинкулинового антитела мышиного происхождения (см. Таблицу материалов) описан здесь в качестве примера.- Инкубируйте посуду (начиная с шага 3.6) с 0,5 мл блокирующего буфера (5% нормальной козьей сыворотки в PBS) в течение 60 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите подходящий блокирующий буфер для первичного антитела. Типичным блокирующим буфером будет 5% нормальной сыворотки того же вида, что и вторичное антитело. - Приготовьте разбавленное первичное антитело в буфере для разведения антител (1% нормальной козьей сыворотки в PBS). Инкубируйте чашки с 0,5 мл разбавленного первичного антитела в течение ночи при 4 ° C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите подходящий буфер для разбавления антител. Как правило, антитело используют в разведении 1:50-1:200. - Ополаскивайте 3 раза в течение 5 минут по 2 мл PBS. Приготовьте разбавленное вторичное антитело против мышей, полученное из козы, в буфере для разбавления антител (1% нормальной козьей сыворотки в PBS). Инкубируют в чашках с 0,5 мл разведенного вторичного антитела в течение 1-3 ч при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, вторичное антитело используется в разведении 1:500-1:1000. DAPI можно использовать для окрашивания ядер. - Промывайте 3 раза 2 мл PBS в течение 5 минут каждый раз. Поместите покровное стекло в 50 мкл монтажной среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чашки можно визуализировать с помощью флуоресцентного микроскопа «все в одном» с фильтром GFP (возбуждение: 470/40, излучение: 525/50) и фильтром TexasRed (возбуждение: 560/40, излучение: 630/75) в монохромном режиме с настройками высокого разрешения (усиление при 6 дБ, без биннинга). Линзы объектива с увеличением от 4x до 20x использовались для визуализации в этом исследовании.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предметное стекло можно хранить до 2 месяцев при температуре 4 °C.
- Инкубируйте посуду (начиная с шага 3.6) с 0,5 мл блокирующего буфера (5% нормальной козьей сыворотки в PBS) в течение 60 мин.
4. Анализ данных
- Откройте программное обеспечение ImageJ 1.51s. В окне ImageJ выберите «Файл» > «Открыть» в строке меню, чтобы открыть сохраненный файл изображения.
- Для настройки шкалы измерения нарисуйте линию на том же расстоянии, что и масштабная линейка. Перейдите в раздел « Анализ» > «Задать масштаб» и введите известное расстояние и единицы измерения линии в соответствующих полях окна «Задать масштаб ».
- Проведите прямую линию между ячейками и нажмите « Анализировать» > «Измерить », чтобы перенести значения в окно данных. Измерьте не менее пяти различных положений в каждом образце и усредните расстояния, чтобы получить репрезентативные данные выборки. Выполните статистический анализ с помощью соответствующего программного обеспечения (см. Таблицу материалов).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Анализ миграции проводили на смешанных субстратах, состоящих из Col1 и высокомолекулярной ГК (средняя молекулярная масса: 1,200-1,400 кДа) с использованием протокола, описанного здесь. Было обнаружено, что клетки O9-1 на границе разрыва легко мигрируют в богатую ГК щель (рис. 4). Иммуноокрашивание на маркер ЖК, винкулин14, подтвердило, что клетки О9-1 образуют очаговые спайки (ЖК) в местах деградации ГК (рис. 5).
Рисунок 1: Экспрессия TMEM2 в NCC. Поперечные срезы нервной трубки эмбрионов Tmem2-FLAGKI при E9.0. (A) Срезы на уровне черепа и туловища нервной трубки были дважды мечены белком TMEM2-FLAG и HA. Экспрессия TMEM2 наблюдалась в нервной пластинке и пограничной области нервной трубки (заполненные наконечники стрелок), тогда как эти участки были лишены окрашивания ГК (открытые наконечники стрелок). (B) Двойная маркировка клеток нервного гребня для TMEM2-FLAG и Sox9. Поперечные срезы нервной трубки E9.0 окрашивали на TMEM2-FLAG и Sox9. Sox9-положительные премигрирующие и эмигрирующие NCC на краю нервной трубки высокоэкспрессируют TMEM2. Аббревиатура: nt = нервная трубка. Масштабные линейки: (A) 300 мкм; (B) 100 мкм. Адаптировано с разрешения Inubushi et al.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Деградация ГК TMEM2 в клетках O9-1. (A) Репрезентативные изображения обедненных Tmem2 и контрольных клеток O9-1, культивируемых на обычной чашке для культивирования (слева). (B) Экспрессию Tmem2 в этих клетках оценивали с помощью кПЦР с Gapdh в качестве внутреннего контроля для нормализации (гистограмма). Средние значения ± SD (n = 5) показаны в виде горизонтальных полос. p < 0,001 по непарному t-критерию Стьюдента. Масштабная линейка, 5,0 мкм. (C) Клеточный анализ гиалуронидазы. Обедненные Tmem2 и контрольные клетки O9-1 культивировали в течение 48 ч на стеклянных покровных стеклах, покрытых флуоресцеинированной HA (FA-HA). Деградирующая активность ГК проявляется в виде темных участков на флуоресцентном фоне. Уровень деградации ГК также количественно сравнивался между клетками, обедненными Tmem2, и контрольными клетками O9-1, как описано в разделе «Материалы и методы» (гистограмма). Данные представляют собой среднюю ± SD интенсивности флуоресценции под клеткой по сравнению с таковой в безклеточной области (n > 50 клеток на условие, объединенные из трех независимых экспериментов). p < 0,001 по непарному t-критерию Стьюдента. Принят с разрешения Inubushi et al.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Деградация субстрат-связанной ГК в FA в клетках O9-1. В течение 16 часов проводили клеточный анализ гиалуронидазы и окрашивали клетки на винкулин. В контрольных клетках O9-1 деградация ГК происходит в винкулин-положительных ЖК. В клетках O9-1, обедненных Tmem2, деградация ГК и образование ЖК значительно уменьшаются. Количественно сравнивали количество ЖК на клетку между обедненными Tmem2 и контрольными клетками O9-1 (гистограмма). Данные представляют собой среднее значение ± SD (n >30 клеток на условие, объединенное из трех независимых экспериментов). p < 0,001 по непарному t-критерию Стьюдента. Принят с разрешения Inubushi et al.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативные изображения миграции клеток O9-1 в бесклеточный промежуток на смешанных субстратах Col1/HA. (A) На верхней панели показаны промежутки в начале эксперимента (День 0). На нижних панелях показаны изображения зазоров после инкубации через 24 часа (1-й день) или 48 часов (2-й день). Масштабная линейка = 150 мкм. (B) Гистограмма, показывающая количественный анализ миграции клеток. Данные представляют собой среднее значение ± SD площади разрыва, охватываемой миграционными клетками, по отношению к площади исходного разрыва (n = 5 на условие). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 по непарному t-критерию Стьюдента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Деградация ГК в смешанных субстратах Col1/HA на ЖК в клетках O9-1. Клетки O9-1, культивируемые на смешанных субстратах, состоящих из Col1/HA, были иммуномечены антивинкулиновым антителом (красный). Темные пятна/полосы представляют активность разложения ГК в субстрате FAHA-H2 (зеленый). Участки деградации ГК и фокальные адгезии (винкулин) были локализованы на смешанных субстратах (наконечники стрел). Масштабная линейка = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Различные компоненты ECM регулируют эмиграцию/миграцию NCC. Например, HA положительно регулирует миграцию NCC 2,15. Интересно, что исследование, основанное на генетических мышиных моделях Tmem2, гиалуронидазы клеточной поверхности, выявило необходимость деградации HA при миграции NCC9. Коллагены также в изобилии содержатся в ECM, окружающем нервную трубку16. Было показано, что декорин, небольшой богатый лейцином протеогликан, регулирует миграцию NCC во время развития нервной системы17. Другие компоненты ECM, включая ламинин и фибронектин, влияют на адгезию и миграцию NCC18. Однако конкретные роли компонентов ECM в миграции NCC до сих пор неизвестны.
Модель in vitro, описанная здесь, направлена на изучение поведения мигрирующих NCC, сталкивающихся с HA-богатым ECM. Мы выбрали 2D, а не 3D субстраты из-за трудностей с получением композитных гелей коллаген-ГК с однородными гелеобразующими свойствами. В системе 2D-культивирования пространственные градиенты концентраций растворимого фактора и жесткости субстратов внеклеточного матрикса отличаются от таковых в живой ткани19. С этой точки зрения система 3D-культивирования имеет большие преимущества и может обеспечить более глубокое понимание механизмов миграции клеток20,21. В этом контексте предпочтительным является создание системы 3D-анализа, если это применимо. Эта экспериментальная модель in vitro может быть применима для изучения поведения миграции NCC в ответ на различные компоненты ECM. Это позволило бы лучше понять механистическую основу миграции NCC, которая управляет морфогенезом эмбриона.
Клетки O9-1, используемые в этом исследовании, стабильно экспрессируют маркеры стволовых клеток (CD44, Sca-1 и Bmi1) и маркеры нервного гребня (AP-2a, Twist1, Sox9, Myc, Ets1, Dlx1, Dlx2, Crabp1, Epha2 и Itgb1). В условиях недифференцированного культивирования клетки O9-1 сохраняют мультипотентные характеристики, подобные стволовым клеткам. Клетки O9-1 обладают потенциалом дифференцировки в несколько типов клеток, включая остеобласты, хондроциты, гладкомышечные клетки и глиальные клетки при определенных условиях культивирования12. Таким образом, клетки O9-1 являются полезным инструментом для исследования молекулярных свойств миграции и дифференцировки черепных NCC. Тем не менее, использование первичных NCC (например, из эмбриональных нервных трубок курицы или мыши) вместо клеток O9-1 предоставит более подробные данные, способствующие лучшему пониманию природы миграции NCC.
В анализе миграции, основанном на закрытии раны, NCC также будет размножаться, и увеличение числа клеток также будет способствовать расширению популяции клеток в областьразрыва 22. Чтобы свести к минимуму пролиферацию во время анализа заживления ран, сывороточное голодание является наиболее распространенным методом вместо использования фармакологических средств23. Тем не менее, эффекты сывороточного голодания должны быть проверены в каждом типе клеток.
Наиболее важным этапом этого протокола является добавление ковалентного покрытия гиалуроновой кислоты в посуду со стеклянным дном. Обработка поверхности стекла силановыми реагентами используется для анализа фокальных адгезий к подложкам24 ECM. Триэтоксисилан представляет собой кремнийорганическое соединение, содержащее множество свободных аминогрупп, которые могут связываться со свободными гидроксильными группами на поверхностях25 кварцевого стекла. В этом исследовании была разработана и оптимизирована методика получения тонкого, стабильного слоя силана на поверхности кварцевого стекла с использованием триэтоксисилана. Амин на поверхности стекла, покрытой триэтоксисиланом, может связывать карбоксильные группы на ГК, следовательно, химически иммобилизуя ГК на поверхностистекла 8. Однако с помощью этого метода невозможно связать другие субстраты ECM на основе белка с поверхностью стекла. Поэтому глутаровый альдегид использовался здесь для химической иммобилизации коллагена I типа посредством аминового соединения с альдегидом. Примечательно, что недостаточное покрытие ГК может привести к удалению покрытия ГК даже без ферментативного сбраживания (например, под действием механической силы во время адгезии и миграции клеток). Возможно покрытие подложками ECM вместо коллагена I типа при условии, что субстраты обладают аминогруппами. Однако могут существовать ограничения при ковалентном нанесении ECM на чашки со стеклянным дном из-за химических свойств подложки; Таким образом, может потребоваться метод проб и ошибок.
Несмотря на то, что это не идеальная модель для имитации миграции NCC в богатый HA ECM, окружающий нервную трубку, этот эксперимент по миграции in vitro может быть полезен для функционального анализа молекул, участвующих в миграции NCC in vivo . Кроме того, этот анализ in vitro может быть полезен для терапевтического скрининга лекарств для ускорения или предотвращения деградации ГК, а также миграции других типов клеток, включая фибробласты кожи и кератиноциты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Автор заявляет, что конкурирующих интересов не существует.
Acknowledgments
Я выражаю огромную признательность Фумитоси Ириэ и Ю Ямагути за их поддержку и добрые предложения в создании этого метода. Эта работа была поддержана грантами для научно-исследовательских программ от Японского общества содействия науке (#19KK0232 до T.I., #20H03896 до T.I.). Оригинальный метод нанесения ГК на стеклянные подложки и анализов деградации ГК in situ на подложках был описан в Yamamoto et al. (2017)8, в то время как метод получения смешанных субстратов HA/Col1 был описан в Irie et al. (2021)7.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10cm cell culture dish | CORNING | Cat. 353003 | |
| 1X PBS | Millipore | Cat. No. BSS-1005-B | |
| 2-well culture inserts | ibidi | Cat. No. 80209 | |
| Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG | Invitrogen | Cat. A21422 | Goat derived anti-mouse secondary antibody |
| automated cell counter | Bio-Rad | Cat. No. TC20 | |
| CELLBANKER | ZENOGEN PHARMA | Cat. 11910 | Cell freezing medium |
| collagen type I | Sigma | Cat. No. 08-115 | |
| Complete ES Cell Medium | Millipore | Cat. No. ES-101-B | |
| DAPI | Invitrogen | Cat. 10184322 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | Cat. 11971025 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | Cat. 10270106 | |
| fluorescence microscope | Keyence | Cat. No. BZ-X700 | |
| Fluoresent labelled HA | PG Research | FAHA-H2 | |
| Glas bottom dish | Iwaki | Cat. 11-0602 | |
| glutaldehyde | Sigma | Cat. No. G5882 | |
| Matrigel | Fisher | Cat. No. CB-40234 | The basement-membrane matrix |
| monoclonal anti-vinculin antibody | Sigma | Cat. No. V9264 | |
| mounting media | Dako | S3023 | |
| Normal goat serum | Fisher | Cat. 50062Z | |
| O9-1 cells | Millipore | Cat. No. SCC049 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | Cat. 158127 | |
| triethoxysilane | Sigma | Cat. No. 390143 | |
| trypsin-EDTA | Millipore | Cat. No. SM-2003-C |
References
- Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326 (2013).
- Casini, P., Nardi, I., Ori, M. Hyaluronan is required for cranial neural crest cells migration and craniofacial development. Developmental Dynamics. 241 (2), 294-302 (2012).
- Landolt, R. M., Vaughan, L., Winterhalter, K. H., Zimmermann, D. R. Versican is selectively expressed in embryonic tissues that act as barriers to neural crest cell migration and axon outgrowth. Development. 121 (8), 2303-2312 (1995).
- Camenisch, T. D., et al. Disruption of hyaluronan synthase-2 abrogates normal cardiac morphogenesis and hyaluronan-mediated transformation of epithelium to mesenchyme. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 349-360 (2000).
- Camenisch, T. D., Schroeder, J. A., Bradley, J., Klewer, S. E., McDonald, J. A. Heart-valve mesenchyme formation is dependent on hyaluronan-augmented activation of ErbB2-ErbB3 receptors. Nature Medicine. 8 (8), 850-855 (2002).
- Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
- Irie, F., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 regulates cell adhesion and migration via degradation of hyaluronan at focal adhesion sites. Journal of Biological Chemistry. 296, 100481 (2021).
- Yamamoto, H., et al. A mammalian homolog of the zebrafish transmembrane protein 2 (TMEM2) is the long-sought-after cell-surface hyaluronidase. Journal of Biological Chemistry. 292 (18), 7304-7313 (2017).
- Inubushi, T., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 plays an essential role in mouse neural crest cell development and survival. PLoS Genetics. 18 (7), 1009765 (2022).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
- Pijuan, J., et al. Cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Humphries, J. D., et al. Vinculin controls focal adhesion formation by direct interactions with talin and actin. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1043-1057 (2007).
- Perris, R., Perissinotto, D. Role of the extracellular matrix during neural crest cell migration. Mechanisms of Development. 95 (1-22), 3-21 (2000).
- Perris, R., et al. Spatial and temporal changes in the distribution of proteoglycans during avian neural crest development. Development. 111 (2), 583-599 (1991).
- Zagris, N., Gilipathi, K., Soulintzi, N., Konstantopoulos, K. Decorin developmental expression and function in the early avian embryo. The International Journal of Developmental Biology. 55 (6), 633-639 (2011).
- Perris, R., Paulsson, M., Bronner-Fraser, M. Molecular mechanisms of avian neural crest cell migration on fibronectin and laminin. Developmental Biology. 136 (1), 222-238 (1989).
- Chevalier, N. R., et al. How tissue mechanical properties affect enteric neural crest cell migration. Scientific Reports. 6, 20927 (2016).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion and Migration. 8 (5), 440-451 (2014).
- Davis, P. K., Ho, A., Dowdy, S. F. Biological methods for cell-cycle synchronization of mammalian cells. Biotechniques. 30 (6), 1322-1331 (2001).
- Wayner, E. A., Garcia-Pardo, A., Humphries, M. J., McDonald, J. A., Carter, W. G. Identification and characterization of the T lymphocyte adhesion receptor for an alternative cell attachment domain (CS-1) in plasma fibronectin. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1321-1330 (1989).
- Robert, G. A., et al. Molecular structure of 3-aminopropyltriethoxysilane layers formed on silanol-terminated silicon surfaces. The Journal of Physical Chemistry. 116 (10), 6289-6297 (2012).
