Summary
Dit protocol schetst een in vitro migratie-experiment dat geschikt is voor de functionele analyse van de moleculen die betrokken zijn bij de in vivo migratie van neurale topcellen naar de hyaluronrijke extracellulaire matrix.
Abstract
Neurale topcellen (NCC's) zijn sterk migrerende cellen die afkomstig zijn uit het dorsale gebied van de neurale buis. De emigratie van NCC's uit de neurale buis is een essentieel proces voor NCC-productie en hun daaropvolgende migratie naar doellocaties. De migratieroute van NCC's, inclusief de omliggende neurale buisweefsels, omvat hyaluronaat (HA) -rijke extracellulaire matrix. Om NCC-migratie in deze HA-rijke omliggende weefsels vanuit de neurale buis te modelleren, werd in deze studie een gemengde substraatmigratietest bestaande uit HA (gemiddeld molecuulgewicht: 1.200-1.400 kDa) en collageen type I (Col1) vastgesteld. Deze migratietest toont aan dat NCC-cellijn, O9-1, cellen sterk migrerend zijn op het gemengde substraat en dat de HA-coating wordt afgebroken op de plaats van focale verklevingen in de loop van de migratie. Dit in vitro model kan nuttig zijn voor verdere verkenning van de mechanistische basis die betrokken is bij NCC-migratie. Dit protocol is ook van toepassing voor het evalueren van verschillende substraten als steigers om NCC-migratie te bestuderen.
Introduction
Neurale topcellen (NCC's) zijn een multipotente celpopulatie die aanwezig is in zich ontwikkelende embryo's en ze zijn afkomstig van de neurale plaatrand tijdens neurulatie. Ze dragen bij aan de vorming van een verscheidenheid aan weefsels, waaronder het perifere zenuwstelsel, het cardiovasculaire systeem, craniofaciale weefsels en het skelet1. Na inductie en NCC-specificatie aan de neurale plaatrand emigreren NCC's van het neuro-epitheel en migreren ze naar NCC-afgeleide weefsellocaties1.
Hyaluronaat (HA) is een niet-gesulfateerd glycosaminoglycaan dat in verschillende weefsels wordt verdeeld als onderdeel van de extracellulaire matrix (ECM). Het belang van HA in de ontwikkeling van embryo's is aangetoond in modelsystemen door de ablatie van genen die verantwoordelijk zijn voor het hyaluronaatmetabolisme. Zo bleken mutaties in hyaluronaatsynthasegenen (Has1 en Has2) in Xenopus te leiden tot NCC-migratiedefecten en craniofaciale misvorming2. Bovendien is gemeld dat de HA-bindende proteoglycanen, aggrecan en versican, remmende effecten uitoefenen op NCC-migratie3. Bij muizen leidt Has2-ablatie tot ernstige defecten in de vorming van endocardiale kussens, wat resulteert in een dodelijkheid halverwege de dracht (E9,5-10) 4,5,6.
Van transmembraaneiwit 2 (Tmem2), een hyaluronidase van het celoppervlak, is onlangs aangetoond dat het een cruciale rol speelt bij het bevorderen van integrine-gemedieerde kankerceladhesie en migratie door het verwijderen van matrix-geassocieerd HA op de adhesieplaatsen 7,8. Meer recent toonden Inubushi et al.9 aan dat een tekort aan Tmem2 leidt tot ernstige craniofaciale defecten als gevolg van afwijkingen in NCC emigratie/migratie en overleving. In de vorige studie9 werd Tmem2-expressie geanalyseerd tijdens NCC-vorming en migratie. Tmem2-expressie werd waargenomen op de plaats van NCC-delaminatie en bij het emigreren van Sox9-positieve NCC's (figuur 1). Bovendien toonde de studie, met behulp van Tmem2-uitgeputte muis O9-1 neurale topcellen, aan dat de in vitro expressie van Tmem2 essentieel was voor de O9-1-cellen om focale verklevingen te vormen en voor hun migratie naar HA-bevattende substraten (figuur 2 en figuur 3)9.
Deze resultaten geven sterk aan dat Tmem2 ook belangrijk is voor NCC-adhesie en migratie via de HA-rijke ECM. Het moleculaire mechanisme van NCC-adhesie en migratie binnen de HA-rijke ECM is echter nog steeds onduidelijk. Het is daarom noodzakelijk om een experimenteel systeem voor in vitro kweken op te zetten om de NCC-adhesie en -migratie binnen de HA-rijke ECU volledig te onderzoeken.
Van de vele benaderingen die worden gebruikt bij het testen van celmigratie, is de op celwondsluiting gebaseerde test een eenvoudige methode die vaak wordt gebruikt op het gebied van fysiologie en oncologie10. Deze benadering is nuttig vanwege de relevantie voor het in vivo fenotype en is effectief bij het bepalen van de rol van geneesmiddelen en chemoattractanten tijdens celmigratie11. Het is mogelijk om het migratievermogen van zowel hele celmassa's als individuele cellen te evalueren door de celspleetafstanden in de loop van de tijdte meten 11. In dit manuscript wordt een gemodificeerde in vitro op wondsluiting gebaseerde test geïntroduceerd om NCC-migratie te modelleren naar HA-rijke weefsels rond de neurale buis. Deze procedure is ook van toepassing op het bestuderen van verschillende ECM-componenten (d.w.z. collageen, fibronectine en laminine) om de rol van de ECM-steiger in NCC-migratie te analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van de Osaka University Graduate School of Dentistry.
1. Cultuur van hersenneurale topcellen van muizen
OPMERKING: De neurale topcellijn die in deze studie wordt gebruikt, bestaat uit O9-1-cellen, oorspronkelijk afgeleid van Wnt1-Cre; R26R-GFP-tot expressie brengende cellen geïsoleerd uit E8.5 muizenembryo's12 (zie discussie). De hier beschreven methode voor het kweken van O9-1-cellen volgt een eerder vastgesteld protocol13.
- Bereid de keldermembraan matrix-gecoate plaat voor.
- Ontdooi de keldermembraanmatrix (zie Materiaaltabel) op ijs. Verdun de matrix 1:50 in gekoelde 1x PBS en houd op ijs.
- Bedek een kweekplaat van 10 cm met 10 ml van de verdunde keldermembraanmatrixoplossing. Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en zuig de matrix voor gebruik op.
- Was de plaat 3x met 2 ml PBS.
- Kweek O9-1 cellen op de kelder membraan matrix-gecoate plaat.
- Verwarm het volledige embryonale stamcelmedium (ES) (zie materiaaltabel) in een waterbad bij 37 °C.
- Meng voorzichtig de O9-1 celsuspensie (zie Tabel met materialen) en tel het aantal cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller (zie Tabel met materialen). Stel de celconcentratie in op 1,1 × 106/ml met volledig ES-celmedium.
- Voeg 8 ml voorverwarmd compleet ES-celmedium toe aan de matrixgecoate kweekplaat van 10 cm en zaai de O9-1-cellen op 1,1 x 106 cellen / plaat. Incubeer bij 37 °C in een 5% CO2 bevochtigde incubator.
- Vervang het medium de volgende dag door vers compleet ES-celmedium (voorverwarmd tot 37 °C). Vervang daarna elke 2-3 dagen door vers medium.
OPMERKING: Wanneer de cellen ongeveer 80% confluent zijn (3-4 dagen na plating), kunnen ze worden gedissocieerd met 0,25% trypsine-EDTA en verder worden gepasseerd of ingevroren voor later gebruik. Representatieve beelden van O9-1-cellen zijn weergegeven in figuur 1. - Was de kweekplaat met 2 ml 1x PBS voorafgaand aan trypsinisatie. Voeg 2 ml voorverwarmd 0,25% trypsine-EDTA toe en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C. Controleer op volledige celloslating; Tik indien nodig een paar keer zachtjes op de zijkant van de plaat.
- Voeg 2 ml voorverwarmd compleet ES-celmedium toe aan de kweekplaat en breng de gedissocieerde cellen over in een conische buis van 15 ml. Centrifugeer de buis op 300 x g gedurende 5 minuten.
- Gooi het supernatant weg zonder de celkorrel te verstoren. Voeg vervolgens 2 ml voorverwarmd volledig ES-celmedium toe aan de buis en resuspendeer de cellen grondig door pipetteren. Zaai de cellen op een nieuwe kweekplaat met de gewenste celdichtheid.
- U kunt ook een bevroren celvoorraad bereiden door 1 ml celvriesmedium met 10% dimethylsulfoxide (DMSO) aan de buis toe te voegen in plaats van volledig ES-celmedium en de cellen grondig te resuspenderen. Breng de celsuspensie over naar cryobuizen en bewaar bij −80 °C.
2. Bereiding van de HA/Col1-gecoate schaal
OPMERKING: De oorspronkelijke methode voor het coaten van HA/Col1 op schotels met glazen bodem werd voorgesteld door Irie et al.7.
- Voeg voorzichtig 50 μL onverdund triethoxysilaan toe aan een schaal met glazen bodem van 3,5 cm (zie materiaaltabel). Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) en bescherm tegen licht.
OPMERKING: De incubatie met triethoxysilaan mag niet langer zijn dan 5 min. Dit kan de coatingefficiëntie beïnvloeden en ongewenste producten produceren. - Was de schaal snel 3x met 2 ml gedestilleerd water. Voeg 50 μL 0,25% glutaaraldehyde toe, 100x verdund in PBS, per gerecht, en incubeer gedurende 30 minuten bij RT.
- Snel 4x wassen met 2 ml PBS. Bedek vervolgens de gerechten met 300 μL collageen type I in 0,2 N azijnzuur bij RT gedurende 1 uur.
- Snel 3x wassen met 2 ml PBS. Voeg 300 μL 200 μg/ml fluoresceinamine-gelabeld natriumhyaluronaat-H2 (FAHA-H2) (verdund in PBS) toe aan elk gerecht en incubeer een nacht bij RT. Was opnieuw 3x met 2 ml PBS. Na het aanzuigen van de PBS, droogt u de plaat gedurende 5 minuten aan de lucht op een schone bank.
OPMERKING: FAHA-H2 is een fluoresceinamine-gelabeld natriumhyaluronaat met een gemiddeld molecuulgewicht variërend van 1.200-1.600 KDa. HA met een geschikt molecuulgewicht kan worden gebruikt volgens de onderzoeksopzet.
3. Migratietest op de met HA/Col1 gecoate schaal
OPMERKING: Een op wondsluiting gebaseerde test met behulp van gedefinieerde celvrije openingen van 500 μm in Col1/HA-substraten werd uitgevoerd met behulp van 2-well kweekinzetstukken (zie materiaaltabel). De O9-1-cellen drukken Tmem2 uit, dat nodig is voor de adhesie en afbraak van HA in de extracellulaire ruimte9 (figuur 2 en figuur 3).
- Na het drogen van de gecoate schaal met glazen bodem, bevestigt u de 2-well cultuurinzetstukken aan de gerechten en vult u de inzetstukken extern met 1 ml PBS.
- Zaai de O9-1 cellen in de putjes op 1 x 104 cellen in 100 μL van Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) met 2% foetaal runderserum (FBS) per insert. Kweek de cellen gedurende 2 dagen bij 37 °C in een 5% CO2 bevochtigde incubator.
- Verwijder de inzetstukken voorzichtig van de gecoate glazen bodemschalen met een pincet. Was de gecoate glazen bodemschalen voorzichtig met 2 ml 1x PBS om de cellen en celresten te verwijderen. Voeg 2 ml verse DMEM met 2% FBS toe aan de kweekgerechten.
- Leg fasecontrastbeelden nu vast als begintijdpunt met behulp van een alles-in-één fluorescentiemicroscoop in monochrome modus met instellingen met hoge resolutie (versterking bij 6 dB, geen binning). Objectieve lenzen met vergrotingen van 4x tot 20x werden gebruikt voor beeldvorming in deze studie (zie Tabel van materialen).
OPMERKING: Leg de fasecontrastafbeeldingen vast met de bijbehorende schaalbalken en sla ze op in TIFF-indeling. - Kweek de cellen nog eens 48 uur bij 37 °C en 5% CO2. Leg fasecontrastbeelden vast op 24 uur en 48 uur in cultuur met behulp van de alles-in-één fluorescentiemicroscoop.
- Fixeer de cellen op 48 uur met 1 ml 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C. Was vervolgens de vaat 3x gedurende 5 minuten elk met 1 ml verse PBS.
- Plaats een afdekplaat met montagemedium (zie materiaaltabel) voor verdere morfologische observatie.
OPMERKING: De gerechten kunnen onmiddellijk worden afgebeeld of maximaal 2 maanden bij 4 °C worden bewaard. - Optioneel: Immunolabel de cellen voor eiwitten van belang.
OPMERKING: Een protocol om het focale adhesie (FA) complex te detecteren met behulp van een muis-afgeleid monoklonaal anti-vinculine antilichaam (zie tabel van materialen) wordt hier beschreven als een voorbeeld.- Incubeer de gerechten (vanaf stap 3.6) met 0,5 ml blokkeringsbuffer (5% normaal geitenserum in PBS) gedurende 60 minuten.
OPMERKING: Kies een geschikte blokkeringsbuffer voor het primaire antilichaam. Een typische blokkeringsbuffer zou 5% normaal serum zijn van dezelfde soort als het gebruikte secundaire antilichaam. - Bereid het verdunde primaire antilichaam in antilichaamverdunningsbuffer (1% normaal geitenserum in PBS). Incubeer de gerechten met 0,5 ml verdund primair antilichaam gedurende een nacht bij 4 °C.
OPMERKING: Kies de juiste antilichaamverdunningsbuffer. Meestal wordt het antilichaam gebruikt bij een verdunning van 1:50-1:200. - Spoel 3x gedurende 5 minuten elk met 2 ml PBS. Bereid het verdunde van geiten afgeleide antimuis secundaire antilichaam in de antilichaamverdunningsbuffer (1% normaal geitenserum in PBS). Incubeer de gerechten met 0,5 ml verdund secundair antilichaam gedurende 1-3 uur bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Meestal wordt het secundaire antilichaam gebruikt bij een verdunning van 1:500-1:1.000. DAPI kan worden gebruikt voor het kleuren van de kernen. - Spoel 3x af met 2 ml PBS gedurende telkens 5 min. Plaats de afdekplaat met 50 μL montagemedium.
OPMERKING: De gerechten kunnen worden afgebeeld met behulp van de alles-in-één fluorescentiemicroscoop met een GFP-filter (excitatie: 470/40, emissie: 525/50) en een TexasRed-filter (excitatie: 560/40, emissie: 630/75) in monochrome modus met instellingen met hoge resolutie (versterking bij 6 dB, geen binning). Voor de beeldvorming in dit onderzoek werden objectieflenzen met vergrotingen van 4x tot 20x gebruikt.
OPMERKING: De dia kan maximaal 2 maanden worden bewaard bij 4 °C.
- Incubeer de gerechten (vanaf stap 3.6) met 0,5 ml blokkeringsbuffer (5% normaal geitenserum in PBS) gedurende 60 minuten.
4. Data-analyse
- Open de ImageJ 1.51s-software. Selecteer in het ImageJ-venster Bestand > openen in de menubalk om het opgeslagen afbeeldingsbestand te openen.
- Voor het instellen van de meetschaal tekent u een lijn van dezelfde afstand als de schaalbalk. Ga naar Schaal analyseren > instellen en typ de bekende afstand en eenheden van de lijn in de juiste vakken van het venster Schaal instellen .
- Teken een rechte lijn tussen de celspleet en druk op Analyseren > meten om de waarden over te brengen naar een gegevensvenster. Meet ten minste vijf verschillende posities in elk monster en bereken het gemiddelde van de afstanden om de representatieve steekproefgegevens te verkrijgen. Voer de statistische analyses uit met behulp van de juiste software (zie Materiaaltabel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een migratietest werd uitgevoerd op gemengde substraten bestaande uit Col1 en hoog molecuulgewicht HA (gemiddeld molecuulgewicht: 1.200-1.400 kDa) met behulp van het hier beschreven protocol. O9-1-cellen aan de grens van de kloof bleken gemakkelijk te migreren naar de HA-rijke kloof (figuur 4). Immunostaining voor een FA-marker, vinculine14, bevestigde dat de O9-1-cellen focale verklevingen (VA's) vormden op de plaatsen van HA-afbraak (figuur 5).
Figuur 1: TMEM2-expressie in NCC's. Transversale secties van de neurale buis van Tmem2-FLAG KI-embryo's bij E9.0. (A) Secties op het schedel- en rompniveau van de neurale buis werden dubbel gelabeld voor het TMEM2-FLAG-eiwit en HA. TMEM2-expressie werd waargenomen in de neurale plaat en het grensgebied van de neurale buis (gevulde pijlpunten), terwijl deze plaatsen verstoken waren van HA-kleuring (open pijlpunten). (B) Dubbele labeling van de neurale topcellen voor TMEM2-FLAG en Sox9. Transversale secties van de E9.0 neurale buis werden gekleurd voor TMEM2-FLAG en Sox9. Sox9-positieve pre-migrerende en emigrerende NCC's aan de rand van de neurale buis sterk tot expressie gebrachte TMEM2. Afkorting: nt = neurale buis. Schaalstaven: (A) 300 μm; B) 100 μm. Aangepast met toestemming van Inubushi et al.9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Afbraak van HA door TMEM2 in O9-1 cellen. (A) Representatieve beelden van Tmem2-uitgeputte en controle O9-1 cellen gekweekt op een gewone kweekschaal (links). (B) Expressie van Tmem2 in deze cellen werd geëvalueerd door qPCR, met Gapdh als interne controle voor normalisatie (staafdiagram). Gemiddelden ± SD (n = 5) worden weergegeven als horizontale balken. p < 0,001 door de t-toets van de ongepaarde student. Schaalbalk, 5,0 μm. (C) Op cellen gebaseerde hyaluronidase-test. Tmem2-uitgeputte en controle O9-1 cellen werden gedurende 48 uur gekweekt op glazen dekplaten bedekt met gefluoresceerd HA (FA-HA). HA-degraderende activiteit wordt onthuld als donkere gebieden in de fluorescerende achtergrond. Het niveau van HA-degradatie werd ook kwantitatief vergeleken tussen Tmem2-uitgeputte en controle O9-1-cellen zoals beschreven in Materialen en methoden (bargraph). Gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SD van de fluorescentie-intensiteit onder een cel ten opzichte van die in het celvrije gebied (n > 50 cellen per aandoening gepoold uit drie onafhankelijke experimenten). p < 0,001 door de t-toets van de ongepaarde student. Aangenomen met toestemming van Inubushi et al.9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Afbraak van substraatgebonden HA bij VA's in O9-1 cellen. Celgebaseerde hyaluronidase-assays werden gedurende 16 uur uitgevoerd en cellen werden gekleurd voor vinculine. In controle O9-1 cellen treedt HA-afbraak op in vinculine-positieve VA's. In Tmem2-uitgeputte O9-1-cellen zijn HA-afbraak en FA-vorming sterk verminderd. Het aantal VA's per cel werd kwantitatief vergeleken tussen Tmem2-uitgeputte en controle-O9-1-cellen (staafdiagram). Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± SD (n >30 cellen per aandoening gepoold uit drie onafhankelijke experimenten). p < 0,001 door de t-toets van de ongepaarde student. Aangenomen met toestemming van Inubushi et al.9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve beelden van O9-1 celmigratie naar een celvrije opening op gemengde Col1/HA substraten. (A) Het bovenste paneel toont de hiaten aan het begin van het experiment (dag 0). De onderste panelen tonen gapbeelden na 24 uur (dag 1) of 48 uur (dag 2) incubatie. Schaalbalk = 150 μm. (B) Een staafdiagram met de kwantitatieve analyse van celmigratie. De gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SD van het gap-gebied dat door migrerende cellen wordt bestreken ten opzichte van het gebied van de oorspronkelijke gap (n = 5 per aandoening). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 door de t-toets van de ongepaarde student. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Afbraak van HA in de gemengde Col1/HA-substraten bij VA's in O9-1-cellen. O9-1-cellen gekweekt op gemengde substraten bestaande uit Col1/HA werden immunogelabeld met anti-vinculine-antilichaam (rood). De donkere vlekken/strepen vertegenwoordigen HA-degradatieactiviteit in het FAHA-H2-substraat (groen). De plaatsen van HA-degradatie en focale verklevingen (vinculine) werden gelokaliseerd op de gemengde substraten (pijlpunten). Schaalbalk = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verschillende ECM-componenten regelen NCC-emigratie/-migratie. Zo reguleert HA de NCC-migratie 2,15 positief. Interessant is dat een studie op basis van genetische muismodellen van Tmem2, een hyaluronidase van het celoppervlak, de vereiste van HA-degradatie bij NCC-migratieophelderde 9. Collageen zijn ook overvloedig aanwezig in de ECM rond de neurale buis16. Van decorine, een kleine leucine-rijke proteoglycaan, is aangetoond dat het de NCC-migratie reguleert tijdens neurale ontwikkeling17. Andere ECM-componenten, waaronder laminine en fibronectine, beïnvloeden de hechting en migratie van NCC18. De specifieke rollen van ECM-componenten in NCC-migratie zijn echter nog onbekend.
Het hier beschreven in vitro model is bedoeld om het gedrag te onderzoeken van migrerende NCC's die HA-rijke ECM tegenkomen. We kozen voor 2D- in plaats van 3D-substraten vanwege de moeilijkheden bij het bereiden van samengestelde collageen-HA-gels met uniforme gelatie-eigenschappen. In een 2D-kweeksysteem verschillen de ruimtelijke gradiënten van de oplosbare factorconcentraties en de stijfheid van de extracellulaire matrixsubstraten van die van levend weefsel19. Vanuit dit oogpunt heeft een 3D-kweeksysteem grote voordelen en kan het diepere inzichten bieden in celmigratiemechanismen20,21. In dit verband heeft het opzetten van een 3D-testsysteem, indien van toepassing, de voorkeur. Dit in vitro experimentele model kan van toepassing zijn op het onderzoeken van NCC-migratiegedrag in reactie op verschillende ECM-componenten. Dit zou een beter begrip mogelijk maken van de mechanistische basis van NCC-migratie, die embryomorfogenese regelt.
De O9-1-cellen die in deze studie worden gebruikt, drukken stabiel stamcelmarkers (CD44, Sca-1 en Bmi1) en neurale topmarkers (AP-2a, Twist1, Sox9, Myc, Ets1, Dlx1, Dlx2, Crabp1, Epha2 en Itgb1) uit. Onder niet-differentiërende kweekomstandigheden behouden O9-1-cellen multipotente stamcelachtige kenmerken. O9-1-cellen hebben het potentieel om te differentiëren in meerdere celtypen, waaronder osteoblasten, chondrocyten, gladde spiercellen en gliacellen onder specifieke kweekomstandigheden12. Daarom zijn O9-1-cellen een nuttig hulpmiddel voor het onderzoeken van de moleculaire eigenschappen van craniale NCC-migratie en -differentiatie. Niettemin zal het gebruik van primaire NCC's (bijvoorbeeld van embryonale neurale buizen van kippen of muizen) in plaats van O9-1-cellen meer gedetailleerde gegevens opleveren om een beter begrip van de aard van NCC-migratie te vergemakkelijken.
In de op wondsluiting gebaseerde migratietest zal de NCC zich ook vermenigvuldigen en de toename van het celaantal zal ook bijdragen aan de uitbreiding van de celpopulatie naar het gap-gebied22. Om de proliferatie tijdens wondgenezingstest te minimaliseren, is serumuithongering de meest voorkomende methode in plaats van farmacologische middelente gebruiken 23. De effecten van serumuithongering moeten echter in elk celtype worden getest.
De meest kritische stap van dit protocol is het toevoegen van de covalente coating van HA aan de glazen bodemschotels. Glasoppervlakbehandeling met silaanreagentia wordt gebruikt voor de analyse van focale verklevingen aan ECM-substraten24. Triethoxysilaan is een organosiliciumverbinding die veel vrije aminogroepen bevat die kunnen binden aan vrije hydroxylgroepen op silicaglasoppervlakken25. In deze studie werd een techniek ontwikkeld en geoptimaliseerd om een dunne, stabiele silaanlaag op een silicaglasoppervlak te produceren met behulp van triethoxysilaan. De amine in het met triethoxysilaan gecoate glasoppervlak kan de carboxylgroepen op HA binden, waardoor HA chemisch wordt geïmmobiliseerd op het glasoppervlak8. Met deze methode is het echter niet mogelijk om andere op eiwitten gebaseerde ECM-substraten aan het glasoppervlak te binden. Daarom werd glutaaraldehyde hier gebruikt om het type I collageen chemisch te immobiliseren door aminekoppeling aan het aldehyde. Met name onvoldoende HA-coating kan leiden tot de verwijdering van de HA-coating, zelfs zonder enzymatische vertering (bijvoorbeeld door de werking van mechanische kracht tijdens celadhesie en migratie). Coating met ECM-substraten in plaats van collageentype I is mogelijk, mits de substraten aminegroepen bezitten. Er kunnen echter beperkingen bestaan bij het covalent coaten van de ECU op glazen bodemschalen vanwege de chemische eigenschappen van het substraat; vallen en opstaan kan dus nodig zijn.
Hoewel het geen perfect model is om NCC-migratie na te bootsen in de HA-rijke ECU rond de neurale buis, kan dit in vitro migratie-experiment nuttig zijn voor de functionele analyse van de moleculen die betrokken zijn bij in vivo NCC-migratie. Bovendien kan deze in vitro test nuttig zijn voor therapeutische geneesmiddelenscreening om HA-afbraak te versnellen of te voorkomen, evenals de migratie van andere celtypen, waaronder huidfibroblasten en keratinocyten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur verklaart dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan.
Acknowledgments
Ik spreek grote dank uit aan Fumitoshi Irie en Yu Yamaguchi voor hun aanmoediging en vriendelijke suggesties bij het vaststellen van deze methode. Dit werk werd ondersteund door subsidies-in-steun voor wetenschappelijke onderzoeksprogramma's van de Japan Society for the Promotion of Science (#19KK0232 tot T.I., #20H03896 tot T.I.). De oorspronkelijke methode voor het coaten van HA op glassubstraten en in situ HA-afbraaktests op de substraten werd beschreven in Yamamoto et al. (2017)8, terwijl de methode voor de bereiding van HA/Col1 gemengde substraten werd beschreven in Irie et al. (2021)7.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10cm cell culture dish | CORNING | Cat. 353003 | |
| 1X PBS | Millipore | Cat. No. BSS-1005-B | |
| 2-well culture inserts | ibidi | Cat. No. 80209 | |
| Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG | Invitrogen | Cat. A21422 | Goat derived anti-mouse secondary antibody |
| automated cell counter | Bio-Rad | Cat. No. TC20 | |
| CELLBANKER | ZENOGEN PHARMA | Cat. 11910 | Cell freezing medium |
| collagen type I | Sigma | Cat. No. 08-115 | |
| Complete ES Cell Medium | Millipore | Cat. No. ES-101-B | |
| DAPI | Invitrogen | Cat. 10184322 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | Cat. 11971025 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | Cat. 10270106 | |
| fluorescence microscope | Keyence | Cat. No. BZ-X700 | |
| Fluoresent labelled HA | PG Research | FAHA-H2 | |
| Glas bottom dish | Iwaki | Cat. 11-0602 | |
| glutaldehyde | Sigma | Cat. No. G5882 | |
| Matrigel | Fisher | Cat. No. CB-40234 | The basement-membrane matrix |
| monoclonal anti-vinculin antibody | Sigma | Cat. No. V9264 | |
| mounting media | Dako | S3023 | |
| Normal goat serum | Fisher | Cat. 50062Z | |
| O9-1 cells | Millipore | Cat. No. SCC049 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | Cat. 158127 | |
| triethoxysilane | Sigma | Cat. No. 390143 | |
| trypsin-EDTA | Millipore | Cat. No. SM-2003-C |
References
- Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326 (2013).
- Casini, P., Nardi, I., Ori, M. Hyaluronan is required for cranial neural crest cells migration and craniofacial development. Developmental Dynamics. 241 (2), 294-302 (2012).
- Landolt, R. M., Vaughan, L., Winterhalter, K. H., Zimmermann, D. R. Versican is selectively expressed in embryonic tissues that act as barriers to neural crest cell migration and axon outgrowth. Development. 121 (8), 2303-2312 (1995).
- Camenisch, T. D., et al. Disruption of hyaluronan synthase-2 abrogates normal cardiac morphogenesis and hyaluronan-mediated transformation of epithelium to mesenchyme. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 349-360 (2000).
- Camenisch, T. D., Schroeder, J. A., Bradley, J., Klewer, S. E., McDonald, J. A. Heart-valve mesenchyme formation is dependent on hyaluronan-augmented activation of ErbB2-ErbB3 receptors. Nature Medicine. 8 (8), 850-855 (2002).
- Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
- Irie, F., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 regulates cell adhesion and migration via degradation of hyaluronan at focal adhesion sites. Journal of Biological Chemistry. 296, 100481 (2021).
- Yamamoto, H., et al. A mammalian homolog of the zebrafish transmembrane protein 2 (TMEM2) is the long-sought-after cell-surface hyaluronidase. Journal of Biological Chemistry. 292 (18), 7304-7313 (2017).
- Inubushi, T., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 plays an essential role in mouse neural crest cell development and survival. PLoS Genetics. 18 (7), 1009765 (2022).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
- Pijuan, J., et al. Cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Humphries, J. D., et al. Vinculin controls focal adhesion formation by direct interactions with talin and actin. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1043-1057 (2007).
- Perris, R., Perissinotto, D. Role of the extracellular matrix during neural crest cell migration. Mechanisms of Development. 95 (1-22), 3-21 (2000).
- Perris, R., et al. Spatial and temporal changes in the distribution of proteoglycans during avian neural crest development. Development. 111 (2), 583-599 (1991).
- Zagris, N., Gilipathi, K., Soulintzi, N., Konstantopoulos, K. Decorin developmental expression and function in the early avian embryo. The International Journal of Developmental Biology. 55 (6), 633-639 (2011).
- Perris, R., Paulsson, M., Bronner-Fraser, M. Molecular mechanisms of avian neural crest cell migration on fibronectin and laminin. Developmental Biology. 136 (1), 222-238 (1989).
- Chevalier, N. R., et al. How tissue mechanical properties affect enteric neural crest cell migration. Scientific Reports. 6, 20927 (2016).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion and Migration. 8 (5), 440-451 (2014).
- Davis, P. K., Ho, A., Dowdy, S. F. Biological methods for cell-cycle synchronization of mammalian cells. Biotechniques. 30 (6), 1322-1331 (2001).
- Wayner, E. A., Garcia-Pardo, A., Humphries, M. J., McDonald, J. A., Carter, W. G. Identification and characterization of the T lymphocyte adhesion receptor for an alternative cell attachment domain (CS-1) in plasma fibronectin. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1321-1330 (1989).
- Robert, G. A., et al. Molecular structure of 3-aminopropyltriethoxysilane layers formed on silanol-terminated silicon surfaces. The Journal of Physical Chemistry. 116 (10), 6289-6297 (2012).
