Summary
Denne protokollen skisserer et in vitro migrasjonseksperiment egnet for funksjonell analyse av molekylene involvert i in vivo migrasjon av nevrale kamceller inn i den hyaluronanrike ekstracellulære matrisen.
Abstract
Nevrale kamceller (NCCs) er svært migrerende celler som stammer fra den dorsale regionen av nevrale røret. Utvandringen av NCC fra nerverøret er en viktig prosess for NCC-produksjon og deres påfølgende migrasjon mot mållokaliteter. Migrasjonsruten til NCCs, inkludert det omkringliggende nevrale rørvevet, involverer hyaluronan (HA) -rik ekstracellulær matriks. For å modellere NCC-migrasjon i disse HA-rike omkringliggende vevene fra nevralrøret, ble det i denne studien etablert en blandet substratmigrasjonsanalyse bestående av HA (gjennomsnittlig molekylvekt: 1,200-1,400 kDa) og kollagen type I (Col1). Denne migrasjonsanalysen viser at NCC-cellelinjen, O9-1, celler er svært migrerende på det blandede substratet, og at HA-belegget brytes ned på stedet for fokale adhesjoner i løpet av migrasjonen. Denne in vitro-modellen kan være nyttig for videre utforskning av det mekanistiske grunnlaget som er involvert i NCC-migrasjon. Denne protokollen er også anvendelig for evaluering av ulike underlag som stillaser for å studere NCC-migrasjon.
Introduction
Nevrale kamceller (NCCs) er en multipotent cellepopulasjon som er tilstede i å utvikle embryoer, og de stammer fra nevralplategrensen under neurulasjon. De bidrar til dannelsen av en rekke vev, inkludert det perifere nervesystemet, kardiovaskulærsystemet, kraniofacial vev og skjelettet1. Etter induksjon og NCC-spesifisering ved nevralplategrensen emigrerer NCCer fra nevroepitelet og migrerer mot NCC-avledede vevssteder1.
Hyaluronan (HA) er en ikke-sulfatert glykosaminoglykan som distribueres i en rekke vev som en komponent i den ekstracellulære matriksen (ECM). Betydningen av hyaluronsyre i embryoutvikling har blitt demonstrert i modellsystemer gjennom ablasjon av gener som er ansvarlige for hyaluronans metabolisme. For eksempel ble mutasjoner i hyaluronansyntasegener (Has1 og Has2) i Xenopus funnet å føre til NCC-migrasjonsdefekter og kraniofacial misdannelse2. I tillegg er det rapportert at HA-bindende proteoglykaner, aggrekan og versikan, har hatt hemmende effekter på NCC-migrasjon3. Hos mus fører Has2-ablasjon til alvorlige defekter i endokardial putedannelse, noe som resulterer i middels drektighet (E9.5-10) dødelighet 4,5,6.
Transmembranprotein 2 (Tmem2), en hyaluronidase på celleoverflaten, har nylig vist seg å spille en kritisk rolle i å fremme integrinmediert kreftcelleadhesjon og migrasjon ved å fjerne matriksassosiert HA ved adhesjonsstedene 7,8. Mer nylig har Inubushi et al.9 vist at mangel på Tmem2 fører til alvorlige kraniofaciale defekter på grunn av abnormiteter i NCC utvandring/migrasjon og overlevelse. I den forrige studien9 ble Tmem2-uttrykk analysert under NCC-dannelse og migrasjon. Tmem2-ekspresjon ble observert på stedet for NCC-delaminering og hos emigrerende Sox9-positive NCCer (figur 1). I tillegg, ved bruk av Tmem2-utarmede O9-1 nevrale kamceller fra mus, viste studien at in vitro-ekspresjonen av Tmem2 var avgjørende for at O9-1-cellene skulle danne fokaladhesjoner og for deres migrasjon til HA-holdige substrater (figur 2 og figur 3) 9.
Disse resultatene tyder sterkt på at Tmem2 også er viktig for NCC-adhesjon og migrasjon gjennom den HA-rike ECM. Imidlertid er den molekylære mekanismen for NCC-adhesjon og migrasjon innenfor den HA-rike ECM fortsatt uklar. Det er derfor nødvendig å etablere et in vitro kultureksperimentelt system for å fullt ut utforske NCC-adhesjon og migrasjon innenfor den HA-rike ECM.
Av de mange tilnærmingene som brukes til å teste cellemigrasjon, er cellesårlukkingsbasert analyse en enkel metode som ofte brukes innen fysiologi og onkologi10. Denne tilnærmingen er nyttig på grunn av dens relevans for in vivo-fenotypen og er effektiv for å bestemme rollene til narkotika og kjemoattraktanter under cellemigrasjon11. Det er mulig å evaluere migrasjonsevnen til både hele cellemasser og individuelle celler ved å måle cellegapavstandene over tid11. I dette manuskriptet introduseres en modifisert in vitro sårlukkingsbasert analyse for å modellere NCC-migrasjon i HA-rikt vev rundt nevralrøret. Denne prosedyren er også anvendelig for å studere forskjellige ECM-komponenter (dvs. kollagen, fibronektin og laminin) for å analysere rollen til ECM-stillaset i NCC-migrasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble godkjent av dyreetikkomiteen ved Osaka University Graduate School of Dentistry.
1. Kultur av muskraniale nevrale kamceller
MERK: Den nevrale kamcellelinjen som ble brukt i denne studien består av O9-1-celler, opprinnelig avledet fra Wnt1-Cre; R26R-GFP-uttrykkende celler isolert fra E8.5 museembryoer12 (se diskusjon). Metoden beskrevet her for dyrking av O9-1-celler følger en tidligere etablert protokoll13.
- Forbered kjellermembranmatrisebelagt plate.
- Tine matrisen av kjellermembranen (se materialtabell) på is. Fortynn matrisen 1:50 i kjølt 1x PBS, og hold på is.
- Belegg en 10 cm kulturplate med 10 ml av den fortynnede kjellermembranmatriseløsningen. Inkuber platen ved romtemperatur i 1 time, og aspirer matrisen før bruk.
- Vask platen 3x med 2 ml PBS.
- Kultur O9-1 celler på kjellermembranen matrisebelagt plate.
- Varm hele cellemediet embryonal stamme (ES) (se materialfortegnelse) i et vannbad ved 37 °C.
- Bland O9-1-cellesuspensjonen forsiktig (se Materialfortegnelse) og tell antall celler ved hjelp av en automatisert celleteller (se Materialfortegnelse). Juster cellekonsentrasjonen til 1,1 × 106/ml med komplett ES-cellemedium.
- Tilsett 8 ml forvarmet komplett ES-cellemedium til den matriksbelagte 10 cm kulturplaten, og frø O9-1-cellene ved 1,1 x 106 celler / plate. Inkuber ved 37 °C i en 5% CO2 fuktet inkubator.
- Neste dag, bytt ut mediet med ferskt komplett ES-cellemedium (forvarmet til 37 °C). Erstatt med friskt medium hver 2-3 dager deretter.
MERK: Når cellene er ca. 80% konfluente (3-4 dager etter plating), kan de dissosieres med 0,25% trypsin-EDTA og passeres videre eller fryses for senere bruk. Representative bilder av O9-1-celler er vist i figur 1. - Vask dyrkningsplaten med 2 ml 1x PBS før trypsinisering. Tilsett 2 ml forvarmet 0,25 % trypsin-EDTA og inkuber i 5 minutter ved 37 °C. Sjekk for fullstendig celle løsrivelse; Trykk forsiktig på siden av platen et par ganger om nødvendig.
- Tilsett 2 ml forvarmet komplett ES-cellemedium til kulturplaten og overfør de dissosierte cellene til et 15 ml konisk rør. Sentrifuger røret ved 300 x g i 5 minutter.
- Kast supernatanten uten å forstyrre cellepelleten. Deretter tilsettes 2 ml forvarmet komplett ES-cellemedium til røret, og resuspenderer cellene grundig ved pipettering. Frø cellene på en ny dyrkningsplate ved ønsket celletetthet.
- Alternativt kan du forberede en frossen cellebestand ved å tilsette 1 ml cellefrysemedium inneholdende 10% dimetylsulfoksid (DMSO) til røret i stedet for fullstendig ES-cellemedium og grundig resuspendere cellene. Overfør cellesuspensjonen til kryorør, og oppbevar ved -80 °C.
2. Tilberedning av den HA/Col1-belagte retten
MERK: Den opprinnelige metoden for å belegge HA / Col1 på glassbunnsfat ble foreslått av Irie et al.7.
- Tilsett forsiktig 50 μL ufortynnet trietoksysilan til en 3,5 cm glassbunnsfat (se materialfortegnelse). Inkuber i 5 minutter ved romtemperatur (RT) og beskytt mot lys.
MERK: Inkubasjonen med trietoksysilan bør ikke overstige 5 minutter. Dette kan påvirke beleggets effektivitet og produsere uønskede produkter. - Vask fatet raskt 3x med 2 ml destillert vann. Tilsett 50 μL 0,25% glutaraldehyd, fortynnet 100x i PBS, per tallerken, og inkuber ved RT i 30 minutter.
- Vask raskt 4x med 2 ml PBS. Belegg deretter oppvasken med 300 μL kollagen type I i 0,2 N eddiksyre ved RT i 1 time.
- Vask raskt 3x med 2 ml PBS. Tilsett 300 μL 200 μg/ml fluoresceinaminmerket natriumhyaluronat-H2 (FAHA-H2) (fortynnet i PBS) til hver tallerken og inkuber over natten ved RT. Vask igjen 3x med 2 ml PBS. Etter å ha aspirert PBS, lufttørk platen i 5 min på en ren benk.
MERK: FAHA-H2 er et fluoresceinaminmerket natriumhyaluronat med en gjennomsnittlig molekylvekt fra 1,200-1,600 KDa. HA med passende molekylvekt kan brukes i henhold til forskningsdesignet.
3. Migrasjonsanalyse på HA/Col1-belagt tallerken
MERK: En sårlukkingsbasert analyse ved bruk av definerte 500 μm cellefrie hull i Col1/HA-substrater ble utført ved bruk av 2-brønns kulturinnlegg (se materialtabell). O9-1-cellene uttrykker Tmem2, som er nødvendig for adhesjon og nedbrytning av HA i det ekstracellulære rommet9 (figur 2 og figur 3).
- Etter tørking av den belagte glassbunnfatet, fest 2-brønnskulturinnsatsene til oppvasken, og fyll innsatsene eksternt med 1 ml PBS.
- Frø O9-1-cellene inn i brønnene ved 1 x 104 celler i 100 μL Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) som inneholder 2% føtalt bovint serum (FBS) per innsetting. Dyrk cellene i 2 dager ved 37 °C i en 5% CO2 fuktet inkubator.
- Fjern innsatsene forsiktig fra de belagte glassbunnene med pinsett. Vask de belagte glassbunnene forsiktig med 2 ml 1x PBS for å fjerne cellene og celleavfallet. Tilsett 2 ml fersk DMEM som inneholder 2% FBS i kulturrettene.
- Ta fasekontrastbilder nå som starttidspunkt ved hjelp av et alt-i-ett-fluorescensmikroskop i monokrom modus med høyoppløselige innstillinger (forsterkning ved 6 dB, ingen binning). Objektive linser med forstørrelser på 4x til 20x ble brukt til avbildning i denne studien (se materialtabell).
MERK: Ta fasekontrastbildene med de tilsvarende skalastengene og lagre dem i TIFF-format. - Dyrk cellene i ytterligere 48 timer ved 37 °C og 5 % CO2. Ta fasekontrastbilder ved 24 timer og 48 timer i kultur ved hjelp av alt-i-ett-fluorescensmikroskopet.
- Fest cellene ved 48 timer med 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA) i 15 minutter ved romtemperatur eller over natten ved 4 °C. Vask deretter oppvasken 3x i 5 min hver med 1 ml fersk PBS.
- Plasser en dekkseddel med monteringsmedium (se Materialfortegnelse) for videre morfologisk observasjon.
MERK: Oppvasken kan avbildes umiddelbart eller oppbevares i opptil 2 måneder ved 4 °C. - Valgfritt: Immunmerk cellene for proteiner av interesse.
MERK: En protokoll for å oppdage fokaladhesjonskomplekset (FA) ved hjelp av et musavledet monoklonalt antivinkulinantistoff (se materialfortegnelse) er beskrevet her som et eksempel.- Inkuber oppvasken (fra trinn 3.6) med 0,5 ml blokkerende buffer (5% normalt geitserum i PBS) i 60 minutter.
MERK: Velg en passende blokkeringsbuffer for det primære antistoffet. En typisk blokkeringsbuffer vil være 5% normalt serum fra samme art som det sekundære antistoffet som brukes. - Klargjør det fortynnede primære antistoffet i antistofffortynningsbuffer (1 % normalt geitserum i PBS). Inkuber oppvasken med 0,5 ml fortynnet primærantistoff over natten ved 4 °C.
MERK: Velg riktig antistofffortynningsbuffer. Vanligvis brukes antistoffet ved en 1:50-1:200 fortynning. - Skyll 3x i 5 min hver med 2 ml PBS. Klargjør det fortynnede geitavledede sekundære antistoffet mot mus i antistofffortynningsbufferen (1 % normalt geiteserum i PBS). Inkuber oppvasken med 0,5 ml fortynnet sekundært antistoff i 1-3 timer ved romtemperatur.
MERK: Vanligvis brukes det sekundære antistoffet ved en fortynning på 1:500-1:1,000. DAPI kan brukes til farging av kjernene. - Skyll 3x med 2 ml PBS i 5 min hver gang. Plasser dekselet med 50 μL monteringsmedium.
MERK: Rettene kan avbildes ved hjelp av alt-i-ett-fluorescensmikroskopet med et GFP-filter (eksitasjon: 470/40, utslipp: 525/50) og et TexasRed-filter (eksitasjon: 560/40, utslipp: 630/75) i monokrom modus med høyoppløselige innstillinger (forsterkning ved 6 dB, ingen binning). Objektive linser med forstørrelser på 4x til 20x ble brukt til avbildningen i denne studien.
MERK: Lysbildet kan lagres i opptil 2 måneder ved 4 °C.
- Inkuber oppvasken (fra trinn 3.6) med 0,5 ml blokkerende buffer (5% normalt geitserum i PBS) i 60 minutter.
4. Dataanalyse
- Åpne ImageJ 1.51s-programvaren. I ImageJ-vinduet velger du File > Open fra menylinjen for å åpne den lagrede bildefilen.
- For å stille inn måleskalaen, tegne en linje med samme avstand som skalastangen. Gå til Analyser > Angi skala og skriv inn den kjente avstanden og enhetene til linjen i de aktuelle boksene i vinduet Angi skala .
- Tegn en rett linje mellom cellegapet, og trykk Analyser > mål for å overføre verdiene til et datavindu. Mål minst fem forskjellige posisjoner i hver prøve, og gjennomsnitt avstandene for å få de representative utvalgsdataene. Utfør de statistiske analysene ved hjelp av egnet programvare (se Materialfortegnelse).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En migrasjonsanalyse ble utført på blandede substrater sammensatt av Col1 og høymolekylær HA (gjennomsnittlig molekylvekt: 1,200-1,400 kDa) ved bruk av protokollen beskrevet her. O9-1-celler ved grensen av gapet ble funnet å lett migrere inn i det HA-rike gapet (figur 4). Immunfarging for en FA-markør, vinculin14, bekreftet at O9-1-cellene dannet fokale adhesjoner (FAs) på stedene for HA-nedbrytning (figur 5).
Figur 1: TMEM2-uttrykk i NCC. Tverrsnitt av nevrale røret av Tmem2-FLAG KI-embryoer ved E9.0. (A) Seksjoner på kranial- og trunknivå i nevralrøret ble dobbeltmerket for TMEM2-FLAG-proteinet og HA. TMEM2-uttrykk ble observert i nevralplaten og grenseregionen av nevralrøret (fylte pilspisser), mens disse stedene var blottet for HA-farging (åpne pilspisser). (B) Dobbeltmerking av nevrale kamceller for TMEM2-FLAG og Sox9. Tverrsnitt av nevralrøret E9.0 ble farget for TMEM2-FLAG og Sox9. Sox9-positive pre-migrerende og emigrerende NCCer på kanten av nevralrøret uttrykte TMEM2 høyt. Forkortelse: nt = nevralrør. Skala barer: (A) 300 μm; (B) 100 μm. Tilpasset med tillatelse fra Inubushi et al.9. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Nedbrytning av hyaluronsyre med TMEM2 i O9-1-celler. (A) Representative bilder av Tmem2-utarmede og kontrollerende O9-1-celler dyrket på en vanlig dyrkningsskål (venstre). (B) Ekspresjon av Tmem2 i disse cellene ble evaluert av qPCR, med Gapdh som internkontroll for normalisering (søylediagram). Midler ± SD (n = 5) vises som horisontale søyler. p < 0,001 ved uparet Student t-test. Skala bar, 5,0 μm. (C) Cellebasert hyaluronidaseanalyse. Tmem2-utarmede og kontroll-O9-1-celler ble dyrket i 48 timer på glassdeksler belagt med fluoresceinert HA (FA-HA). HA-nedbrytende aktivitet avsløres som mørke områder i fluorescerende bakgrunn. Nivået av HA-degradering ble også kvantitativt sammenlignet mellom Tmem2-utarmede og kontroll-O9-1-celler som beskrevet i Materials and Methods (bargraph). Data representerer gjennomsnittlig ± SD av fluorescensintensiteten under en celle i forhold til den i det cellefrie området (n > 50 celler per tilstand samlet fra tre uavhengige eksperimenter). p < 0,001 ved uparet Student t-test. Vedtatt med tillatelse fra Inubushi et al.9. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Degradering av substratbundet hyaluronsyre ved FAs i O9-1 celler. Cellebaserte hyaluronidaseanalyser ble utført i 16 timer og celler ble farget for vinkulin. I kontroll-O9-1-celler forekommer HA-nedbrytning i vinkulin-positive FAer. I Tmem2-utarmede O9-1-celler er HA-nedbrytning og FA-dannelse sterkt redusert. Antall FAs per celle ble kvantitativt sammenlignet mellom Tmem2-utarmede og kontroll-O9-1-celler (søylediagram). Data representerer gjennomsnittlig ± SD (n >30 celler per tilstand samlet fra tre uavhengige eksperimenter). p < 0,001 ved uparet Student t-test. Vedtatt med tillatelse fra Inubushi et al.9. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative bilder av O9-1-cellemigrasjon til et cellefritt gap på blandede Col1/HA-substrater. (A) Det øverste panelet viser hullene ved starten av eksperimentet (dag 0). De nederste panelene viser gapbilder etter 24 timer (dag 1) eller 48 timer (dag 2) inkubasjon. Skala bar = 150 μm. (B) Et søylediagram som viser den kvantitative analysen av cellemigrasjon. Dataene representerer gjennomsnittet ± SD for gapområdet som dekkes av trekkceller i forhold til arealet av det opprinnelige gapet (n = 5 per tilstand). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 ved uparet Student t-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Degradering av hyaluronsyre i de blandede Col1/HA-substratene ved FAs i O9-1-celler. O9-1-celler dyrket på blandede substrater bestående av Col1/HA ble immunmerket med antivinkulinantistoff (rødt). De mørke flekkene/stripene representerer HA-nedbrytningsaktivitet i FAHA-H2-substratet (grønn). Stedene for HA-nedbrytning og fokale adhesjoner (vinculin) ble samlokalisert på de blandede substratene (pilspisser). Skala bar = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ulike ECM-komponenter regulerer NCC utvandring/migrasjon. For eksempel regulerer HA NCC-migrasjon 2,15 positivt. Interessant nok belyste en studie basert på genetiske musemodeller av Tmem2, en celleoverflatehyaluronidase, kravet om HA-nedbrytning i NCC-migrasjon9. Kollagen er også rikelig i ECM som omgir nevrale røret16. Decorin, en liten leucinrik proteoglykan, har vist seg å regulere NCC-migrasjon under nevral utvikling17. Andre ECM-komponenter, inkludert laminin og fibronektin, påvirker NCC-adhesjon og migrasjon18. De spesifikke rollene til ECM-komponenter i NCC-migrering er imidlertid fortsatt ukjente.
In vitro-modellen beskrevet her tar sikte på å undersøke atferden til migrerende NCC-er som møter HA-rik ECM. Vi valgte 2D, i stedet for 3D, substrater på grunn av vanskelighetene med å fremstille kompositt kollagen-HA-geler med ensartede geleringsegenskaper. I et 2D-kultursystem er de romlige gradientene til de oppløselige faktorkonsentrasjonene og stivhetene til de ekstracellulære matrikssubstratene forskjellige fra de for levende vev19. Fra dette synspunktet har et 3D-kultursystem store fordeler og kan gi dypere innsikt i cellemigrasjonsmekanismer20,21. I denne sammenhengen foretrekkes det å sette opp et 3D-analysesystem, hvis aktuelt. Denne in vitro eksperimentelle modellen kan være anvendelig for å undersøke NCC-migrasjonsatferd som respons på varierende ECM-komponenter. Dette vil muliggjøre en bedre forståelse av det mekanistiske grunnlaget for NCC-migrasjon, som styrer embryomorfogenese.
O9-1-cellene som ble brukt i denne studien, uttrykker stabilt stamcellemarkører (CD44, Sca-1 og Bmi1) og nevrale kammarkører (AP-2a, Twist1, Sox9, Myc, Ets1, Dlx1, Dlx2, Crabp1, Epha2 og Itgb1). Under ikke-differensierende kulturforhold opprettholder O9-1-celler multipotente stamcellelignende egenskaper. O9-1-celler har potensial til å differensiere i flere celletyper, inkludert osteoblaster, kondrocytter, glatte muskelceller og gliaceller under spesifikke kulturforhold12. Derfor er O9-1-celler et nyttig verktøy for å undersøke molekylære egenskaper ved kranial NCC-migrasjon og differensiering. Likevel vil bruk av primære NCCer (f.eks. fra embryonale nevrale rør fra kylling eller mus) i stedet for O9-1-celler gi mer detaljerte data for å muliggjøre en bedre forståelse av NCC-migrasjonens natur.
I sårlukkingsbasert migrasjonsanalyse vil NCC også spre seg, og økningen i celletallet vil også bidra til utvidelse av cellepopulasjonen inn i gapområdet22. For å minimere spredning under sårhelingsanalyse, er serumsult den vanligste metoden i stedet for å bruke farmakologiske midler23. Imidlertid bør effekten av serumsult testes i hver celletype.
Det mest kritiske trinnet i denne protokollen er å legge det kovalente belegget av HA til glassbunnsfatene. Glassoverflatebehandling med silanreagenser brukes til analyse av fokaladhesjoner til ECM-substrater24. Trietoksysilan er en organosilisiumforbindelse som inneholder mange frie aminogrupper som kan binde seg til frie hydroksylgrupper på silikaglassoverflater25. En teknikk ble utviklet og optimalisert i denne studien for å produsere et tynt, stabilt silanlag på en silikaglassoverflate ved bruk av trietoksysilan. Aminet i den trietoksysilanbelagte glassoverflaten kan binde karboksylgruppene på HA, og følgelig kjemisk immobilisere HA på glassoverflaten8. Med denne metoden er det imidlertid ikke mulig å binde andre proteinbaserte ECM-substrater til glassoverflaten. Derfor ble glutaraldehyd brukt her for å kjemisk immobilisere type I kollagen gjennom aminkobling til aldehydet. Spesielt kan utilstrekkelig HA-belegg føre til fjerning av HA-belegget selv uten enzymatisk fordøyelse (f.eks. ved virkningen av mekanisk kraft under celleadhesjon og migrasjon). Belegg med ECM-substrater i stedet for kollagen type I er mulig, forutsatt at substratene har amingrupper. Imidlertid kan det være begrensninger i kovalent belegg av ECM på glassbunnsfat på grunn av substratets kjemiske egenskaper; Dermed kan prøving og feiling være nødvendig.
Selv om det ikke er en perfekt modell for å etterligne NCC-migrasjon inn i den HA-rike ECM som omgir nevralrøret, kan dette in vitro-migrasjonseksperimentet være nyttig for funksjonell analyse av molekylene involvert i in vivo NCC-migrasjon. I tillegg kan denne in vitro-analysen være nyttig for terapeutisk legemiddelscreening for å akselerere eller forhindre HA-nedbrytning, samt migrasjon av andre celletyper, inkludert hudfibroblaster og keratinocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren erklærer at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Acknowledgments
Jeg vil uttrykke stor takknemlighet til Fumitoshi Irie og Yu Yamaguchi for deres oppmuntring og gode forslag til å etablere denne metoden. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd til vitenskapelige forskningsprogrammer fra Japan Society for the Promotion of Science (#19KK0232 til TI, #20H03896 til TI). Den opprinnelige metoden for belegging av HA på glasssubstrater og in situ HA-nedbrytningsanalyser på substratene ble beskrevet i Yamamoto et al. (2017) 8, mens metoden for fremstilling av HA/Col1 blandede substrater ble beskrevet i Irie et al. (2021) 7.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10cm cell culture dish | CORNING | Cat. 353003 | |
| 1X PBS | Millipore | Cat. No. BSS-1005-B | |
| 2-well culture inserts | ibidi | Cat. No. 80209 | |
| Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG | Invitrogen | Cat. A21422 | Goat derived anti-mouse secondary antibody |
| automated cell counter | Bio-Rad | Cat. No. TC20 | |
| CELLBANKER | ZENOGEN PHARMA | Cat. 11910 | Cell freezing medium |
| collagen type I | Sigma | Cat. No. 08-115 | |
| Complete ES Cell Medium | Millipore | Cat. No. ES-101-B | |
| DAPI | Invitrogen | Cat. 10184322 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | Cat. 11971025 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | Cat. 10270106 | |
| fluorescence microscope | Keyence | Cat. No. BZ-X700 | |
| Fluoresent labelled HA | PG Research | FAHA-H2 | |
| Glas bottom dish | Iwaki | Cat. 11-0602 | |
| glutaldehyde | Sigma | Cat. No. G5882 | |
| Matrigel | Fisher | Cat. No. CB-40234 | The basement-membrane matrix |
| monoclonal anti-vinculin antibody | Sigma | Cat. No. V9264 | |
| mounting media | Dako | S3023 | |
| Normal goat serum | Fisher | Cat. 50062Z | |
| O9-1 cells | Millipore | Cat. No. SCC049 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | Cat. 158127 | |
| triethoxysilane | Sigma | Cat. No. 390143 | |
| trypsin-EDTA | Millipore | Cat. No. SM-2003-C |
References
- Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326 (2013).
- Casini, P., Nardi, I., Ori, M. Hyaluronan is required for cranial neural crest cells migration and craniofacial development. Developmental Dynamics. 241 (2), 294-302 (2012).
- Landolt, R. M., Vaughan, L., Winterhalter, K. H., Zimmermann, D. R. Versican is selectively expressed in embryonic tissues that act as barriers to neural crest cell migration and axon outgrowth. Development. 121 (8), 2303-2312 (1995).
- Camenisch, T. D., et al. Disruption of hyaluronan synthase-2 abrogates normal cardiac morphogenesis and hyaluronan-mediated transformation of epithelium to mesenchyme. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 349-360 (2000).
- Camenisch, T. D., Schroeder, J. A., Bradley, J., Klewer, S. E., McDonald, J. A. Heart-valve mesenchyme formation is dependent on hyaluronan-augmented activation of ErbB2-ErbB3 receptors. Nature Medicine. 8 (8), 850-855 (2002).
- Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
- Irie, F., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 regulates cell adhesion and migration via degradation of hyaluronan at focal adhesion sites. Journal of Biological Chemistry. 296, 100481 (2021).
- Yamamoto, H., et al. A mammalian homolog of the zebrafish transmembrane protein 2 (TMEM2) is the long-sought-after cell-surface hyaluronidase. Journal of Biological Chemistry. 292 (18), 7304-7313 (2017).
- Inubushi, T., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 plays an essential role in mouse neural crest cell development and survival. PLoS Genetics. 18 (7), 1009765 (2022).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
- Pijuan, J., et al. Cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Humphries, J. D., et al. Vinculin controls focal adhesion formation by direct interactions with talin and actin. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1043-1057 (2007).
- Perris, R., Perissinotto, D. Role of the extracellular matrix during neural crest cell migration. Mechanisms of Development. 95 (1-22), 3-21 (2000).
- Perris, R., et al. Spatial and temporal changes in the distribution of proteoglycans during avian neural crest development. Development. 111 (2), 583-599 (1991).
- Zagris, N., Gilipathi, K., Soulintzi, N., Konstantopoulos, K. Decorin developmental expression and function in the early avian embryo. The International Journal of Developmental Biology. 55 (6), 633-639 (2011).
- Perris, R., Paulsson, M., Bronner-Fraser, M. Molecular mechanisms of avian neural crest cell migration on fibronectin and laminin. Developmental Biology. 136 (1), 222-238 (1989).
- Chevalier, N. R., et al. How tissue mechanical properties affect enteric neural crest cell migration. Scientific Reports. 6, 20927 (2016).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion and Migration. 8 (5), 440-451 (2014).
- Davis, P. K., Ho, A., Dowdy, S. F. Biological methods for cell-cycle synchronization of mammalian cells. Biotechniques. 30 (6), 1322-1331 (2001).
- Wayner, E. A., Garcia-Pardo, A., Humphries, M. J., McDonald, J. A., Carter, W. G. Identification and characterization of the T lymphocyte adhesion receptor for an alternative cell attachment domain (CS-1) in plasma fibronectin. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1321-1330 (1989).
- Robert, G. A., et al. Molecular structure of 3-aminopropyltriethoxysilane layers formed on silanol-terminated silicon surfaces. The Journal of Physical Chemistry. 116 (10), 6289-6297 (2012).
