Summary
该协议概述了适用于参与神经嵴细胞体内迁移到富含透明质的细胞外基质的分子的功能分析的体外迁移实验。
Abstract
神经嵴细胞（NCC）是起源于神经管背侧区域的高度迁移细胞。NCC从神经管迁移是NCC产生及其随后向靶位点迁移的重要过程。NCC的迁移途径，包括周围的神经管组织，涉及富含透明质酸（HA）的细胞外基质。为了模拟NCC从神经管迁移到这些富含HA的周围组织中，本研究建立了由HA（平均分子量：1，200-1，400 kDa）和I型胶原蛋白（Col1）组成的混合底物迁移测定。该迁移测定表明NCC细胞系O9-1细胞在混合基质上高度迁移，并且在迁移过程中HA涂层在粘附部位降解。该 体外 模型可用于进一步探索NCC迁移所涉及的机制基础。该协议也适用于评估不同的底物作为支架来研究NCC迁移。
Introduction
神经嵴细胞（NCC）是存在于发育中的胚胎中的多能细胞群，它们起源于神经形成过程中的神经板边界。它们有助于形成各种组织，包括周围神经系统、心血管系统、颅面组织和骨骼1。在神经板边界处诱导和NCC规范后，NCC从神经上皮迁移并迁移到NCC来源的组织部位1。
透明质酸（HA）是一种非硫酸化糖胺聚糖，作为细胞外基质（ECM）的组分分布在各种组织中。HA在胚胎发育中的重要性已在模型系统中通过消融负责透明质酸代谢的基因得到证实。例如，发现非洲爪蟾中透明质酸合酶基因（Has1和Has2）的突变会导致NCC迁移缺陷和颅面畸形2。此外，据报道，HA结合蛋白聚糖，聚集聚糖和保全糖对NCC迁移发挥抑制作用3。在小鼠中，Has2消融导致心内膜垫形成的严重缺陷，导致妊娠中期（E9.5-10）致死率4，5，6。
跨膜蛋白 2 （Tmem2） 是一种细胞表面透明质酸酶，最近已被证明通过去除粘附位点7，8 处的基质相关 HA，在促进整合素介导的癌细胞粘附和迁移中发挥关键作用。最近，Inubushi等人9证明，由于NCC迁移/迁移和存活的异常，Tmem2的缺乏会导致严重的颅面缺陷。在先前的研究9中，分析了NCC形成和迁移过程中Tmem2的表达。在NCC分层部位和迁移的Sox9阳性NCC中观察到Tmem2表达（图1）。此外，使用Tmem2耗尽的小鼠O9-1神经嵴细胞，研究表明Tmem2的体外表达对于O9-1细胞形成粘附并迁移到含HA的底物中至关重要（图2和图3）9。
这些结果强烈表明，Tmem2对于NCC通过富含HA的ECM的粘附和迁移也很重要。然而，富含HA的ECM中NCC粘附和迁移的分子机制尚不清楚。因此，有必要建立一个 体外 培养实验系统，以充分探索富含HA的ECM中的NCC粘附和迁移。
在测试细胞迁移的众多方法中，基于细胞伤口闭合的测定是生理学和肿瘤学领域经常使用的简单方法10。这种方法是有用的，因为它与 体内 表型相关，并且有效地确定药物和化学引诱剂在细胞迁移中的作用11。可以通过测量随时间变化的细胞间隙距离来评估整个细胞质量和单个细胞的迁移能力11。在本手稿中，介绍了 一种改良的 基于体外伤口闭合的测定法，以模拟NCC迁移到神经管周围富含HA的组织中。该程序也适用于研究不同的ECM成分（即胶原蛋白，纤连蛋白和层粘连蛋白），以分析ECM支架在NCC迁移中的作用。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有程序均由大阪大学牙科研究生院动物伦理委员会批准。
1. 小鼠颅神经嵴细胞培养
注意：本研究中使用的神经嵴细胞系包括O9-1细胞，最初来源于Wnt1-Cre;从E8.5小鼠胚胎12中分离出表达R26R-GFP的细胞（见讨论）。这里描述的用于培养O9-1细胞的方法遵循先前建立的方案13。
- 准备基底膜基质包被板。
- 在冰上解冻基底膜基质（见 材料表）。在冷藏的1x PBS中以1：50稀释基质，并保持在冰上。
- 用 10 mL 稀释的基底膜基质溶液涂覆 10 cm 培养板。将板在室温下孵育1小时，并在使用前吸出基质。
- 用 2 mL PBS 清洗板 3 次。
- 在基底膜基质包被的板上培养O9-1细胞。
- 在37°C的水浴中加热完整的胚胎干（ES）细胞培养基（参见 材料表）。
- 轻轻混合O9-1细胞悬液（参见材料表）并使用自动细胞计数器计数细胞数量（参见材料表）。用完整的ES细胞培养基将细胞浓度调节至1.1×106 / mL。
- 将 8 mL 预热的完整 ES 细胞培养基加入基质包被的 10 cm 培养板中，并以 1.1 x 10 6 细胞/板接种 O9-1细胞。 在37°C下在5%CO2 加湿培养箱中孵育。
- 第二天，用新鲜的完全ES细胞培养基（预热至37°C）替换培养基。此后每 2-3 天更换一次新鲜培养基。
注意：当细胞约80%汇合（接种后3-4天）时，可以用0.25%胰蛋白酶-EDTA解离并进一步传代或冷冻以备后用。O9-1细胞的代表性图像如图 1所示。 - 在胰蛋白酶消化之前，用 2 mL 的 1x PBS 洗涤培养板。加入2mL预热的0.25%胰蛋白酶-EDTA，并在37°C下孵育5分钟。 检查细胞是否完全脱离;如有必要，轻轻拍打盘子的侧面几次。
- 向培养板中加入 2 mL 预热的完整 ES 细胞培养基，并将解离的细胞转移到 15 mL 锥形管中。将试管以300× g 离心5分钟。
- 在不干扰细胞沉淀的情况下弃去上清液。然后，向管中加入 2 mL 预热的完整 ES 细胞培养基，并通过移液彻底重悬细胞。将细胞接种到所需细胞密度的新培养板上。
- 或者，通过在管中加入 1 mL 含有 10% 二甲基亚砜 （DMSO） 的细胞冷冻培养基代替完整的 ES 细胞培养基并彻底重悬细胞来制备冷冻细胞原液。将细胞悬液转移到冷冻管中，并储存在-80°C。
2. HA/Col1涂层培养皿的制备
注意：将HA / Col1涂覆到玻璃底培养皿上的原始方法是由Irie等人提出的7。
- 小心地将 50 μL 未稀释的三乙氧基硅烷加入 3.5 cm 玻璃底培养皿中（参见 材料表）。在室温（RT）下孵育5分钟并避光。
注意：用三乙氧基硅烷孵育不应超过5分钟。这可能会影响涂层效率并产生不良产品。 - 用 2 mL 蒸馏水快速清洗盘子 3 次。每皿加入 50 μL 0.25% 戊二醛，在 PBS 中稀释 100 倍，并在室温下孵育 30 分钟。
- 用 2 mL PBS 快速洗涤 4 次。然后，在室温下用 300 μL I 型胶原蛋白在 0.2 N 乙酸中涂覆培养皿 1 小时。
- 用 2 mL PBS 快速洗涤 3 次。向每个培养皿中加入 300 μL 200 μg/mL 荧光素标记的透明质酸钠-H2 （FAHA-H2）（在 PBS 中稀释），并在室温下孵育过夜。 用 2 mL PBS 再次洗涤 3 次。吸出PBS后，在干净的工作台上风干板5分钟。
注意：FAHA-H2是一种荧光素标记的透明质酸钠，平均分子量范围为1，200-1，600 KDa。可以根据研究设计使用适当分子量的HA。
3. HA/Col1 包被培养皿上的迁移测定
注意：使用2孔培养插入物在Col1 / HA底物中使用定义的500μm无细胞间隙进行基于伤口闭合的测定（参见 材料表）。O9-1细胞表达Tmem2，这是细胞外空间9 中HA粘附和降解所必需的（图2 和 图3）。
- 干燥涂层玻璃底培养皿后，将 2 孔培养插入物连接到培养皿上，并在外部填充 1 mL PBS 的插入物。
- 将 O9-1 细胞接种到孔中，在 100 μL Dulbecco 的改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中，每次插入物含有 2% 胎牛血清 （FBS）。将细胞在37°C下在5%CO 2加湿培养箱中培养2天。
- 用镊子小心地从涂层玻璃底培养皿中取出插入物。用 2 mL 的 1x PBS 轻轻清洗涂有涂层的玻璃底培养皿，以去除细胞和细胞碎片。将 2 mL 含有 2% FBS 的新鲜 DMEM 加入培养皿中。
- 现在，使用具有高分辨率设置（增益为6 dB，无合并）的单色模式下的一体化荧光显微镜捕获相衬图像作为起始时间点。本研究使用放大倍率为4倍至20倍的物镜进行成像（见 材料表）。
注意：使用相应的比例尺捕获相衬图像并将其保存为TIFF格式。 - 将细胞在37°C和5%CO2下再培养48小时。使用多合一荧光显微镜在培养物中捕获24小时和48小时的相衬图像。
- 在室温下用1mL的4%多聚甲醛（PFA）固定细胞48小时15分钟或在4°C下过夜。 然后，用 1 mL 新鲜 PBS 清洗餐具 3 次，每次 5 分钟。
- 将盖玻片与安装介质（见 材料表）放在一起进行进一步的形态观察。
注意：培养皿可以立即成像或在4°C下储存长达2个月。 - 可选：对感兴趣的蛋白质细胞进行免疫标记。
注意：此处以使用小鼠来源的单克隆抗黏着蛋白抗体（参见 材料表）检测粘连（FA）复合物的方案为例进行描述。- 将培养皿（来自步骤3.6）与0.5mL封闭缓冲液（PBS中的5%正常山羊血清）孵育60分钟。
注意：为一抗选择合适的封闭缓冲液。典型的封闭缓冲液是来自与所用二抗相同物种的 5% 正常血清。 - 在抗体稀释缓冲液（PBS中的1%正常山羊血清）中制备稀释的一抗。将培养皿与0.5mL稀释的一抗在4°C孵育过夜。
注意：选择合适的抗体稀释缓冲液。通常，抗体以1：50-1：200稀释度使用。 - 用 2 mL PBS 冲洗 3 次，每次冲洗 5 分钟。在抗体稀释缓冲液（PBS中的1%正常山羊血清）中制备稀释的山羊来源的抗小鼠二抗。将培养皿与0.5mL稀释的二抗在室温下孵育1-3小时。
注意：通常，二抗以1：500-1：1，000稀释度使用。DAPI可用于对细胞核进行染色。 - 用 2 mL PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。将盖玻片与 50 μL 封片剂一起放置。
注意：可以使用带有GFP滤光片（激发：470/40，发射：525/50）和TexasRed滤光片（激发：560/40，发射：630/75）的多合一荧光显微镜对培养皿进行成像，单色模式具有高分辨率设置（增益为6 dB，无合并）。本研究使用放大倍率为4倍至20倍的物镜进行成像。
注意：载玻片可在4°C下保存长达2个月。
- 将培养皿（来自步骤3.6）与0.5mL封闭缓冲液（PBS中的5%正常山羊血清）孵育60分钟。
4. 数据分析
- 打开 ImageJ 1.51s 软件。在 ImageJ 窗口中，从菜单栏中选择“文件>打开”以打开保存的图像文件。
- 要设置测量刻度，请绘制一条与比例尺距离相同的线。转到 分析>设置 比例，然后在 设置比例 窗口的相应框中键入线的已知距离和单位。
- 在单元格间隙之间绘制一条直线，然后按 “分析>度量 ”将值传输到数据窗口。测量每个样本中至少五个不同的位置，并平均距离以获得具有代表性的样本数据。使用适当的软件进行统计分析（见 材料表）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
使用此处描述的方案在由Col1和高分子量HA（平均分子量：1，200-1，400kDa）组成的混合底物上进行迁移测定。发现间隙边界处的O9-1细胞很容易迁移到富含HA的间隙中（图4）。FA标志物（长春斑蛋白14）的免疫染色证实，O9-1细胞在HA降解部位形成局灶粘附（FA）（图5）。
图 1：NCC 中的 TMEM2 表达。Tmem2-FLAGKI胚胎的神经管横截面在E9.0处。（A）神经管颅骨和躯干水平的切片被双标记TMEM2-FLAG蛋白和HA。在神经板和神经管的边界区域（填充箭头）中观察到TMEM2表达，而这些位点没有HA染色（开放箭头）。（B）TMEM2-FLAG和Sox9神经嵴细胞的双重标记。对E9.0神经管的横切片进行TMEM2-FLAG和Sox9染色。Sox9阳性的预迁移和迁移NCC在神经管边缘高表达TMEM2。缩写：nt = 神经管。比例尺： （A） 300 μm;（B） 100 微米。经犬武等人许可改编9.请点击此处查看此图的大图。
图 2：TMEM2 在 O9-1 细胞中降解 HA。 （A） 在常规培养皿上培养的 Tmem2 去除和对照 O9-1 细胞的代表性图像（左）。（B）通过qPCR评估这些细胞中Tmem2的表达，Gapdh作为标准化的内部对照（条形图）。SD ± （n = 5） 的平均值显示为水平条。p < 0.001 通过未配对的学生 t 检验。比例尺，5.0 μm。 （C）基于细胞的透明质酸酶测定。将Tmem2去除和对照O9-1细胞在涂有荧光HA（FA-HA）的玻璃盖玻片上培养48小时。HA降解活性在荧光背景中显示为暗区。如材料和方法（条形图）中所述，还定量比较了Tmem2耗尽细胞和对照O9-1细胞之间的HA降解水平。数据表示细胞下方荧光强度相对于无细胞区域中荧光强度的平均±SD（来自三个独立实验的每个条件n>50个细胞）。p < 0.001 通过未配对的学生 t 检验。经犬武等人许可通过9。请点击此处查看此图的大图。
图 3：O9-1 细胞中 FA 处底物结合的 HA 降解。进行基于细胞的透明质酸酶测定16小时，并对细胞进行长春花蛋白染色。在对照O9-1细胞中，HA降解发生在长春菌素阳性FA中。在去除Tmem2的O9-1细胞中，HA降解和FA形成大大减少。在Tmem2耗尽细胞和对照O9-1细胞之间定量比较每个细胞的FA数量（条形图）。数据表示SD±平均值（来自三个独立实验的每个条件n>30个细胞）。p < 0.001 通过未配对的学生 t 检验。经犬武等人许可通过9。请点击此处查看此图的大图。
图 4：O9-1 细胞迁移到混合 Col1/HA 底物上的无细胞间隙中的代表性图像。 （A）顶部面板显示了实验开始时（第0天）的间隙。底部面板显示孵育24小时（第1天）或48小时（第2天）后的间隙图像。比例尺 = 150 μm。 （B）显示细胞迁移定量分析的条形图。数据表示迁移细胞覆盖的间隙区域相对于原始间隙面积的平均± SD（每个条件n = 5）。*p < 0.05，**p < 0.01，****p < 0.001，通过未配对的学生 t 检验。请点击此处查看此图的大图。
图 5：O9-1 细胞中 FA 处混合 Col1/HA 底物中 HA 的降解。 在由Col1 / HA组成的混合底物上培养的O9-1细胞用抗粘着蛋白抗体（红色）进行免疫标记。黑点/条纹代表FAHA-H2底物中的HA降解活性（绿色）。HA降解和粘连（黏着蛋白）的位点在混合底物（箭头）上共定位。比例尺 = 500 μm。 请点击此处查看此图的大图。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
各种 ECM 组件规范 NCC 迁移/迁移。例如，HA积极调节NCC迁移2，15。有趣的是，一项基于细胞表面透明质酸酶Tmem2的遗传小鼠模型的研究阐明了NCC迁移中HA降解的要求9。神经管周围的ECM中也含有丰富的胶原蛋白16。Decorin是一种富含亮氨酸的小蛋白聚糖，已被证明可以在神经发育过程中调节NCC迁移17。其他ECM成分，包括层粘连蛋白和纤连蛋白，影响NCC粘附和迁移18。但是，ECM 组件在 NCC 迁移中的具体作用仍然未知。
这里描述的 体外 模型旨在检查迁移NCC遇到富含HA的ECM的行为。我们选择2D而不是3D底物，因为制备具有均匀凝胶特性的复合胶原蛋白-HA凝胶存在困难。在2D培养系统中，可溶性因子浓度的空间梯度和细胞外基质底物的刚度与活组织的空间梯度不同19。从这个角度来看，3D培养系统具有很大的优势，可以提供对细胞迁移机制的更深入的见解20，21。在这种情况下，如果适用，最好设置3D检测系统。该 体外 实验模型可能适用于检查NCC迁移行为以响应不同的ECM组分。这将有助于更好地理解NCC迁移的机制基础，它控制着胚胎形态发生。
本研究中使用的O9-1细胞稳定表达干细胞标志物（CD44，Sca-1和Bmi1）和神经嵴标志物（AP-2a，Twist1，Sox9，Myc，Ets1，Dlx1，Dlx2，Crabp1，Epha2和Itgb1）。在非分化培养条件下，O9-1细胞保持多能干细胞样特征。O9-1细胞具有在特定培养条件下分化为多种细胞类型的潜力，包括成骨细胞，软骨细胞，平滑肌细胞和神经胶质细胞12。因此，O9-1细胞是研究颅NCC迁移和分化的分子特性的有用工具。然而，使用原代NCC（例如，来自鸡或小鼠胚胎神经管）代替O9-1细胞将提供更详细的数据，以促进更好地了解NCC迁移的性质。
在基于伤口闭合的迁移测定中，NCC也将增殖，细胞数量的增加也将有助于细胞群向间隙区域22的扩展。为了最大限度地减少伤口愈合测定过程中的增殖，血清饥饿是最常用的方法，而不是使用药物23。然而，应在每种细胞类型中测试血清饥饿的影响。
该协议最关键的步骤是将HA的共价涂层添加到玻璃底培养皿中。使用硅烷试剂进行玻璃表面处理用于分析与ECM基材的粘附性24。三乙氧基硅烷是一种有机硅化合物，含有许多游离氨基，可以与二氧化硅玻璃表面上的游离羟基结合25。本研究开发并优化了一种使用三乙氧基硅烷在石英玻璃表面上产生薄而稳定的硅烷层的技术。三乙氧基硅烷涂层玻璃表面的胺可以结合HA上的羧基，从而化学固定HA在玻璃表面上8。然而，使用这种方法，不可能将其他基于蛋白质的ECM基板结合到玻璃表面。因此，这里使用戊二醛通过胺偶联与醛的化学固定I型胶原蛋白。值得注意的是，即使没有酶消化（例如，通过细胞粘附和迁移过程中的机械力作用），不充分的HA涂层也会导致HA涂层的去除。用ECM底物涂覆代替I型胶原蛋白是可能的，前提是底物具有胺基团。然而，由于基材的化学性质，将ECM共价涂覆到玻璃底培养皿上可能存在局限性;因此，可能需要反复试验。
虽然不是模拟NCC迁移到神经管周围富含HA的ECM中的完美模型，但这种 体外 迁移实验可能有助于参与 体内 NCC迁移的分子的功能分析。此外，这种 体外 测定可用于治疗性药物筛选，以加速或预防HA降解，以及其他细胞类型的迁移，包括皮肤成纤维细胞和角质形成细胞。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
提交人声明不存在相互竞争的利益。
Acknowledgments
我非常感谢入江文俊和山口优在建立这种方法时给予的鼓励和善意的建议。这项工作得到了日本科学促进会（#19KK0232至T.I.，#20H03896至T.I.）的科学研究项目资助。Yamamoto等人（2017）8描述了在玻璃基板上涂覆HA和在基板上原位HA降解测定的原始方法，而Irie等人（2021）7描述了HA / Col1混合基板的制备方法。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10cm cell culture dish | CORNING | Cat. 353003 | |
| 1X PBS | Millipore | Cat. No. BSS-1005-B | |
| 2-well culture inserts | ibidi | Cat. No. 80209 | |
| Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG | Invitrogen | Cat. A21422 | Goat derived anti-mouse secondary antibody |
| automated cell counter | Bio-Rad | Cat. No. TC20 | |
| CELLBANKER | ZENOGEN PHARMA | Cat. 11910 | Cell freezing medium |
| collagen type I | Sigma | Cat. No. 08-115 | |
| Complete ES Cell Medium | Millipore | Cat. No. ES-101-B | |
| DAPI | Invitrogen | Cat. 10184322 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | Cat. 11971025 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | Cat. 10270106 | |
| fluorescence microscope | Keyence | Cat. No. BZ-X700 | |
| Fluoresent labelled HA | PG Research | FAHA-H2 | |
| Glas bottom dish | Iwaki | Cat. 11-0602 | |
| glutaldehyde | Sigma | Cat. No. G5882 | |
| Matrigel | Fisher | Cat. No. CB-40234 | The basement-membrane matrix |
| monoclonal anti-vinculin antibody | Sigma | Cat. No. V9264 | |
| mounting media | Dako | S3023 | |
| Normal goat serum | Fisher | Cat. 50062Z | |
| O9-1 cells | Millipore | Cat. No. SCC049 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | Cat. 158127 | |
| triethoxysilane | Sigma | Cat. No. 390143 | |
| trypsin-EDTA | Millipore | Cat. No. SM-2003-C |
References
- Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326 (2013).
- Casini, P., Nardi, I., Ori, M. Hyaluronan is required for cranial neural crest cells migration and craniofacial development. Developmental Dynamics. 241 (2), 294-302 (2012).
- Landolt, R. M., Vaughan, L., Winterhalter, K. H., Zimmermann, D. R. Versican is selectively expressed in embryonic tissues that act as barriers to neural crest cell migration and axon outgrowth. Development. 121 (8), 2303-2312 (1995).
- Camenisch, T. D., et al. Disruption of hyaluronan synthase-2 abrogates normal cardiac morphogenesis and hyaluronan-mediated transformation of epithelium to mesenchyme. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 349-360 (2000).
- Camenisch, T. D., Schroeder, J. A., Bradley, J., Klewer, S. E., McDonald, J. A. Heart-valve mesenchyme formation is dependent on hyaluronan-augmented activation of ErbB2-ErbB3 receptors. Nature Medicine. 8 (8), 850-855 (2002).
- Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
- Irie, F., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 regulates cell adhesion and migration via degradation of hyaluronan at focal adhesion sites. Journal of Biological Chemistry. 296, 100481 (2021).
- Yamamoto, H., et al. A mammalian homolog of the zebrafish transmembrane protein 2 (TMEM2) is the long-sought-after cell-surface hyaluronidase. Journal of Biological Chemistry. 292 (18), 7304-7313 (2017).
- Inubushi, T., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 plays an essential role in mouse neural crest cell development and survival. PLoS Genetics. 18 (7), 1009765 (2022).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
- Pijuan, J., et al. Cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Humphries, J. D., et al. Vinculin controls focal adhesion formation by direct interactions with talin and actin. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1043-1057 (2007).
- Perris, R., Perissinotto, D. Role of the extracellular matrix during neural crest cell migration. Mechanisms of Development. 95 (1-22), 3-21 (2000).
- Perris, R., et al. Spatial and temporal changes in the distribution of proteoglycans during avian neural crest development. Development. 111 (2), 583-599 (1991).
- Zagris, N., Gilipathi, K., Soulintzi, N., Konstantopoulos, K. Decorin developmental expression and function in the early avian embryo. The International Journal of Developmental Biology. 55 (6), 633-639 (2011).
- Perris, R., Paulsson, M., Bronner-Fraser, M. Molecular mechanisms of avian neural crest cell migration on fibronectin and laminin. Developmental Biology. 136 (1), 222-238 (1989).
- Chevalier, N. R., et al. How tissue mechanical properties affect enteric neural crest cell migration. Scientific Reports. 6, 20927 (2016).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion and Migration. 8 (5), 440-451 (2014).
- Davis, P. K., Ho, A., Dowdy, S. F. Biological methods for cell-cycle synchronization of mammalian cells. Biotechniques. 30 (6), 1322-1331 (2001).
- Wayner, E. A., Garcia-Pardo, A., Humphries, M. J., McDonald, J. A., Carter, W. G. Identification and characterization of the T lymphocyte adhesion receptor for an alternative cell attachment domain (CS-1) in plasma fibronectin. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1321-1330 (1989).
- Robert, G. A., et al. Molecular structure of 3-aminopropyltriethoxysilane layers formed on silanol-terminated silicon surfaces. The Journal of Physical Chemistry. 116 (10), 6289-6297 (2012).
