Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

במבחנה חקר ההשפעות של מטריצה חוץ-תאית עשירה בהיאלורונן על נדידת תאי קרסט עצביים

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64749
Automatic Translation
1
1Department of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics, Osaka University Graduate School of Dentistry

Summary

פרוטוקול זה מתאר ניסוי נדידה חוץ גופית המתאים לניתוח פונקציונלי של המולקולות המעורבות בנדידת in vivo של תאי פסגה עצבית לתוך מטריצה חוץ-תאית עשירה בהיאלורונן.

Abstract

תאי פסגה עצבית (NCCs) הם תאים נודדים מאוד שמקורם באזור הגבי של הצינור העצבי. הגירה של NCCs מן הצינור העצבי הוא תהליך חיוני לייצור NCC ואת ההגירה שלהם לאחר מכן לעבר אתרי המטרה. מסלול הנדידה של NCCs, כולל רקמות הצינור העצבי שמסביב, כולל מטריצה חוץ-תאית עשירה בהיאלורונן (HA). כדי למדל נדידת NCC לתוך הרקמות הסובבות העשירות בחומצה היאלורונית מהצינור העצבי, הוקמה במחקר זה בדיקת נדידת מצע מעורבת המורכבת מחומצה היאלורונית (משקל מולקולרי ממוצע: 1,200-1,400 kDa) וקולגן מסוג I (Col1). בדיקת נדידה זו מראה כי תאי קו תאי NCC, O9-1, נודדים מאוד על המצע המעורב וכי ציפוי החומצה ההיאלורונית מתפרק באתר של הידבקויות מוקדיות במהלך הנדידה. מודל זה במבחנה יכול להיות שימושי לחקירה נוספת של הבסיס המכניסטי המעורב בהגירה של NCC. פרוטוקול זה ישים גם להערכת מצעים שונים כפיגומים לחקר נדידת NCC.

Introduction

תאי קרסט עצביים (Neural crest cells או NCCs) הם אוכלוסיית תאים רב-פוטנטית הקיימת בעוברים מתפתחים, והם מקורם בגבול הצלחת העצבית במהלך הנוירולציה. הם תורמים להיווצרות של מגוון רקמות, כולל מערכת העצבים ההיקפית, מערכת הלב וכלי הדם, רקמות craniofacial ואת השלד1. לאחר אינדוקציה ואפיון NCC בגבול הצלחת העצבית, NCCs מהגרים מהנוירואפיתל ונודדים לעבר אתרי רקמות שמקורם ב- NCC1.

היאלורונן (HA) הוא גליקוזאמינוגליקן ללא סולפט המופץ במגוון רקמות כמרכיב של המטריצה החוץ תאית (ECM). חשיבותה של חומצה היאלורונית בהתפתחות עוברים הודגמה במערכות מודל באמצעות אבלציה של גנים האחראים על חילוף החומרים של היאלורונן. לדוגמה, מוטציות בגנים סינתאז היאלורונן (Has1 ו- Has2) ב- Xenopus נמצאו כמובילות לפגמים בנדידת NCC ומום גולגולתי2. בנוסף, דווח כי הפרוטאוגליקנים קושרי HA, אגרקן וורסיקני, מפעילים השפעות מעכבות על נדידת NCC3. בעכברים, אבלציה Has2 מובילה לפגמים חמורים בהיווצרות כרית אנדוקרדיאלית, וכתוצאה מכך קטלניות באמצע ההיריון (E9.5-10) 4,5,6.

חלבון טרנסממברנה 2 (Tmem2), היאלורונידאז על פני התא, הוכח לאחרונה כממלא תפקיד קריטי בקידום הידבקות ונדידה של תאים סרטניים בתיווך אינטגרין על ידי הסרת חומצה היאלורונית הקשורה למטריצה באתרי ההדבקה 7,8. לאחרונה, Inubushi et al.9 הראו כי מחסור ב- Tmem2 מוביל למומים גולגולתיים חמורים עקב חריגות בהגירה / הגירה של NCC והישרדות. במחקר הקודם9, ביטוי Tmem2 נותח במהלך היווצרות והגירה של NCC. ביטוי Tmem2 נצפה באתר של דלמינציה של NCC ובהגירה של NCCs חיוביים ל-Sox9 (איור 1). נוסף על כך, באמצעות שימוש בתאי סמל עצבי O9-1 של עכבר שהתרוקן מ-Tmem2, המחקר הראה שהביטוי במבחנה של Tmem2 היה חיוני ליצירת הידבקויות מוקדיות עבור תאי O9-1 ולנדידתם למצעים המכילים HA (איור 2 ואיור 3)9.

תוצאות אלה מצביעות בבירור על כך ש- Tmem2 חשוב גם להידבקות והגירה של NCC באמצעות ECM עשיר ב- HA. עם זאת, המנגנון המולקולרי של הידבקות והגירה של NCC בתוך ECM עשיר HA עדיין לא ברור. לכן, יש צורך להקים מערכת ניסויית בתרבית חוץ גופית כדי לחקור באופן מלא הידבקות והגירה של NCC בתוך ECM עשיר HA.

מבין הגישות הרבות המשמשות לבדיקת נדידת תאים, הבדיקה המבוססת על סגירת פצעי תאים היא שיטה פשוטה המשמשת לעתים קרובות בתחומי הפיזיולוגיה והאונקולוגיה10. גישה זו שימושית בשל הרלוונטיות שלה לפנוטיפ in vivo והיא יעילה בקביעת התפקידים של תרופות וכימואטרקטנטים במהלך נדידת תאים11. ניתן להעריך את יכולת הנדידה הן של מסות תאים שלמים והן של תאים בודדים על ידי מדידת מרחקי פער התא לאורך זמן11. בכתב יד זה, מוצגת בדיקה שונה המבוססת על סגירת פצעים במבחנה כדי למדל נדידת NCC לרקמות עשירות בחומצה היאלורונית המקיפות את הצינור העצבי. הליך זה ישים גם לחקר רכיבי ECM שונים (כלומר, קולגן, פיברונקטין ולמינין) כדי לנתח את תפקיד פיגום ECM בנדידת NCC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הנהלים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של בית הספר למוסמכים של אוניברסיטת אוסקה לרפואת שיניים.

1. תרבות של עכבר גולגולתי עצבי crest תאים

הערה: קו תאי הפסגה העצבית ששימש במחקר זה כולל תאי O9-1, שמקורם ב-Wnt1-Cre; תאים המבטאים R26R-GFP שבודדו מעוברי עכבר E8.512 (ראו דיון). השיטה המתוארת כאן לגידול תאי O9-1 עוקבת אחר פרוטוקול13 שנקבע בעבר.

  1. הכינו את הצלחת מצופה המטריצה של קרום המרתף.
    1. הפשירו את מטריצת קרום המרתף (ראו טבלת חומרים) על קרח. לדלל את המטריצה 1:50 ב 1x PBS מקורר, ולשמור על קרח.
    2. מצפים צלחת תרבית בקוטר 10 ס"מ ב-10 מ"ל של תמיסת מטריצת קרום מרתף מדוללת. דוגרים על הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה, ושאפו את המטריצה לפני השימוש.
    3. לשטוף את הצלחת 3x עם 2 מ"ל של PBS.
  2. תאי תרבית O9-1 על הצלחת המצופה מטריצה של קרום המרתף.
    1. יש לחמם את תא הגזע העוברי המלא (ES) (ראו טבלת חומרים) באמבט מים בטמפרטורה של 37°C.
    2. ערבב בעדינות את תרחיף התאים O9-1 (ראה טבלת חומרים) וספור את מספר התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי (ראה רשימת חומרים). כוונן את ריכוז התא ל- 1.1 × 106/מ"ל עם תווך תאי ES מלא.
    3. הוסף 8 מ"ל של תווך תאי ES שלם שחומם מראש לצלחת התרבית המצופה מטריצה בקוטר 10 ס"מ, וזרע את תאי O9-1 בגודל 1.1 x 106 תאים לצלחת. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח של 5% CO2 .
    4. למחרת, החלף את המדיום בתווך תאי ES מלא טרי (מחומם מראש ל-37°C). יש להחליף במדיום טרי כל 2-3 ימים לאחר מכן.
      הערה: כאשר התאים הם בערך 80% confluent (3-4 ימים לאחר ציפוי), הם יכולים להיות מנותקים עם 0.25% טריפסין-EDTA ולהעביר הלאה או להקפיא לשימוש מאוחר יותר. תמונות מייצגות של תאי O9-1 מוצגות באיור 1.
    5. שטפו את צלחת התרבית עם 2 מ"ל של 1x PBS לפני טריפסיניזציה. הוסף 2 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA שחומם מראש ודגר במשך 5 דקות ב 37 ° C. בדוק ניתוק תאים מלא; טפחו בעדינות על צד הצלחת כמה פעמים במידת הצורך.
    6. הוסף 2 מ"ל של תווך תאי ES שלם שחומם מראש לצלחת התרבית והעבר את התאים המנותקים לצינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה את הצינור ב 300 x גרם במשך 5 דקות.
    7. השליכו את הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדורית התא. לאחר מכן, הוסף 2 מ"ל של תווך תאי ES שלמים שחוממו מראש לצינור, והשהה מחדש את התאים ביסודיות על ידי צנרת. זרעו את התאים על צלחת תרבית חדשה בצפיפות התאים הרצויה.
    8. לחלופין, הכינו מלאי תאים קפואים על ידי הוספת 1 מ"ל של מדיום הקפאת תאים המכיל 10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO) לצינור במקום תווך תאי ES שלם והשעיה יסודית של התאים. העבירו את תרחיף התא לצינורות הקפאה, ואחסנו בטמפרטורה של -80°C.

2. הכנת התבשיל המצופה HA/Col1

הערה: השיטה המקורית של ציפוי HA/Col1 על כלים בעלי תחתית זכוכית הוצעה על ידי Irie et al.7.

  1. הוסיפו בזהירות 50 מיקרוליטר של טריאתוקסיסילן לא מדולל לצלחת בעלת תחתית זכוכית בקוטר 3.5 ס"מ (ראו טבלת חומרים). יש לדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ולהגן מפני אור.
    הערה: הדגירה עם triethoxysilane לא יעלה על 5 דקות. זה עלול להשפיע על יעילות הציפוי ולייצר מוצרים לא רצויים.
  2. לשטוף את המנה במהירות 3x עם 2 מ"ל של מים מזוקקים. הוסיפו 50 μL של 0.25% גלוטראלדהיד, מדולל פי 100 ב-PBS, לכל מנה, ודגרו ב-RT למשך 30 דקות.
  3. יש לשטוף במהירות 4x עם 2 מ"ל של PBS. לאחר מכן, מצפים את הכלים עם 300 μL של קולגן מסוג I ב 0.2 N חומצה אצטית ב RT במשך 1 שעה.
  4. לשטוף במהירות 3x עם 2 מ"ל של PBS. יש להוסיף 300 μL של 200 מיקרוגרם/מ"ל נתרן היאלורונאט-H2 (FAHA-H2) עם תווית פלואורסציינמין (מדולל ב-PBS) לכל מנה ולדגור למשך הלילה ב-RT. יש לשטוף שוב 3x עם 2 מ"ל PBS. לאחר שאיפת PBS, לייבש את הצלחת באוויר במשך 5 דקות על ספסל נקי.
    הערה: FAHA-H2 הוא נתרן היאלורונט עם תווית פלואורסציינמין עם משקל מולקולרי ממוצע שנע בין 1,200-1,600 KDa. HA של משקל מולקולרי מתאים ניתן להשתמש על פי תכנון המחקר.

3. בדיקת נדידה על צלחת מצופה HA/Col1

הערה: בדיקה מבוססת סגירת פצע באמצעות מרווחים מוגדרים של 500 מיקרומטר ללא תאים במצעי Col1/HA בוצעה באמצעות תוספות תרבית של 2 בארות (ראה טבלת חומרים). תאי O9-1 מבטאים את Tmem2, אשר נדרש להידבקות ולפירוק של חומצה היאלורונית בחלל החוץ-תאי9 (איור 2 ואיור 3).

  1. לאחר ייבוש צלחת תחתית הזכוכית המצופה מחברים את תוספות התרבית 2 בארות לכלים, וממלאים את התוספות חיצונית עם 1 מ"ל של PBS.
  2. זרעו את תאי O9-1 לתוך הבארות ב 1 x 104 תאים ב 100 μL של מדיום הנשר המעובד של Dulbecco (DMEM) המכיל 2% סרום בקר עוברי (FBS) לכל תוספת. תרבית את התאים במשך 2 ימים ב 37 ° C באינקובטור 5% CO2 לח.
  3. מוציאים את התוספות בזהירות מהכלים המצופים בתחתית הזכוכית בפינצטה. שטפו בעדינות את הכלים המצופים בתחתית הזכוכית עם 2 מ"ל של 1x PBS כדי להסיר את התאים ואת פסולת התא. הוסף 2 מ"ל של DMEM טרי המכיל 2% FBS לתוך מנות התרבית.
  4. צלם תמונות עם ניגודיות פאזה כעת כנקודת זמן התחלה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי All-in-One במצב מונוכרום עם הגדרות ברזולוציה גבוהה (רווח של 6 dB, ללא binning). במחקר זה נעשה שימוש בעדשות אובייקטיביות עם הגדלות של פי 4 עד פי 20 לצורך הדמיה (ראו טבלת חומרים).
    הערה: לכוד את התמונות עם ניגודיות הפאזה עם פסי קנה המידה המתאימים ושמור אותן בתבנית TIFF.
  5. תרבית את התאים במשך 48 שעות נוספות ב 37 ° C ו 5% CO2. צלם תמונות עם ניגודיות פאזה בתרבית של 24 שעות ו-48 שעות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רב-תכליתי.
  6. תקן את התאים ב 48 שעות עם 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA) במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C. לאחר מכן, לשטוף את הכלים 3x במשך 5 דקות כל אחד עם 1 מ"ל של PBS טרי.
  7. הניחו תלוש כיסוי עם אמצעי הרכבה (ראו טבלת חומרים) לתצפית מורפולוגית נוספת.
    הערה: ניתן לצלם את הכלים באופן מיידי או לאחסן עד חודשיים בטמפרטורה של 4°C.
  8. אופציונלי: סימון חיסוני של התאים לחלבונים מעניינים.
    הערה: פרוטוקול לזיהוי קומפלקס הידבקות מוקד (FA) באמצעות נוגדן חד-שבטי אנטי-וינקולין שמקורו בעכבר (ראה טבלת חומרים) מתואר כאן כדוגמה.
    1. דוגרים על הכלים (משלב 3.6) עם 0.5 מ"ל של חיץ חוסם (5% סרום עיזים רגיל ב-PBS) למשך 60 דקות.
      הערה: בחר מאגר חסימה מתאים עבור הנוגדן הראשי. חיץ חוסם טיפוסי יהיה 5% סרום נורמלי מאותו מין כמו הנוגדן המשני בשימוש.
    2. הכינו את הנוגדן הראשוני המדולל במאגר דילול נוגדנים (1% סרום עיזים תקין ב-PBS). לדגור את הכלים עם 0.5 מ"ל של נוגדן ראשוני מדולל לילה ב 4 °C (75 °F).
      הערה: בחר את מאגר דילול הנוגדנים המתאים. בדרך כלל, הנוגדן משמש בדילול 1:50-1:200.
    3. יש לשטוף 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם 2 מ"ל של PBS. הכינו את הנוגדן המשני נגד עכבר שמקורו בעז מדוללת במאגר דילול הנוגדנים (1% סרום עיזים תקין ב-PBS). לדגור את הכלים עם 0.5 מ"ל של נוגדן משני מדולל במשך 1-3 שעות בטמפרטורת החדר.
      הערה: בדרך כלל, הנוגדן המשני משמש בדילול של 1:500-1:1,000. DAPI יכול לשמש להכתמת הגרעינים.
    4. יש לשטוף 3 פעמים עם 2 מ"ל PBS במשך 5 דקות בכל פעם. מניחים את הכיסוי עם 50 μL של אמצעי הרכבה.
      הערה: ניתן לצלם את הכלים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי All-in-One עם מסנן GFP (עירור: 470/40, פליטה: 525/50) ומסנן TexasRed (עירור: 560/40, פליטה: 630/75) במצב מונוכרום עם הגדרות ברזולוציה גבוהה (רווח ב 6 dB, ללא binning). במחקר זה נעשה שימוש בעדשות אובייקטיביות עם הגדלות של פי 4 עד פי 20.
      הערה: ניתן לאחסן את השקופית עד חודשיים ב- 4 °C.

4. ניתוח נתונים

  1. פתח את תוכנת ImageJ 1.51s. בחלון ImageJ, בחר File > Open משורת התפריטים כדי לפתוח את קובץ התמונה שנשמר.
  2. לקביעת קנה המידה, ציירו קו באותו מרחק כמו סרגל קנה המידה. עבור אל נתח > הגדר קנה מידה והקלד את המרחק והיחידות הידועים של הקו בתיבות המתאימות בחלון הגדר קנה מידה .
  3. צייר קו ישר בין המרווח בין התאים והקש Analyze > Measure כדי להעביר את הערכים לחלון נתונים. מדדו לפחות חמישה מיקומים שונים בכל מדגם, וערכו ממוצע של המרחקים כדי לקבל את נתוני המדגם המייצגים. בצע את הניתוחים הסטטיסטיים באמצעות תוכנה מתאימה (ראה טבלת חומרים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בדיקת נדידה בוצעה על מצעים מעורבים המורכבים מ-Col1 ו-HA בעל משקל מולקולרי גבוה (משקל מולקולרי ממוצע: 1,200-1,400 kDa) באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן. תאי O9-1 בגבול הפער נמצאו נודדים בקלות לתוך הפער העשיר בחומצה היאלורונית (איור 4). צביעה חיסונית עבור סמן FA, וינקולין14, אישרה שתאי O9-1 יצרו הידבקויות מוקדיות (FAs) באתרים של פירוק HA (איור 5).

Figure 1
איור 1: ביטוי TMEM2 ב-NCCs. חתכים רוחביים של הצינור העצבי של עוברי Tmem2-FLAGKI ב-E9.0. (A) מקטעים ברמת הגולגולת ותא המטען של הצינור העצבי סומנו פעמיים עבור חלבון TMEM2-FLAG ו-HA. ביטוי TMEM2 נצפה בלוח העצבי ובאזור הגבול של הצינור העצבי (ראשי חץ מלאים), בעוד שאתרים אלה היו נטולי צביעת HA (ראשי חץ פתוחים). (B) תיוג כפול של תאי הפסגה העצבית עבור TMEM2-FLAG ו-Sox9. חלקים רוחביים של הצינור העצבי E9.0 הוכתמו עבור TMEM2-FLAG ו-Sox9. Sox9-חיובי טרום נדידה והגירה NCCs בקצה הצינור העצבי מבוטא גבוה TMEM2. קיצור: nt = צינור עצבי. מוטות קנה מידה: (A) 300 מיקרומטר; (B) 100 מיקרומטר. הותאם באישור Inubushi et al.9. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: התפרקות של חומצה היאלורונית על-ידי TMEM2 בתאי O9-1. (A) תמונות מייצגות של תאי O9-1 מדולדלים ומבוקרים של Tmem2 שגודלו בתרבית על צלחת תרבית רגילה (משמאל). (B) ביטוי של Tmem2 בתאים אלה הוערך על ידי qPCR, עם Gapdh כבקרה פנימית לנורמליזציה (גרף עמודות). אמצעים ± SD (n = 5) מוצגים כסורגים אופקיים. p < 0.001 על ידי מבחן t של סטודנט לא מזווג. סרגל קנה מידה, 5.0 מיקרומטר. (C) בדיקת היאלורונידאז מבוססת תאים. תאי O9-1 שהתרוקנו ב-Tmem2 ובבקרה גודלו בתרבית במשך 48 שעות על כיסויי זכוכית מצופים ב-HA (FA-HA) פלואורסציין. פעילות משפילה של HA מתגלה כאזורים כהים ברקע הפלואורסצנטי. רמת הפירוק של חומצה היאלורונית הושוותה כמותית גם בין תאי O9-1 מדולדלים ב-Tmem2 לבין תאי O9-1 ביקורתיים, כמתואר ב-Materials and Methods (bargraph). הנתונים מייצגים ממוצע ± SD של עוצמת הפלואורסצנטיות מתחת לתא ביחס לזו שבאזור נטול התאים (n > 50 תאים לכל מצב שנאספו משלושה ניסויים בלתי תלויים). p < 0.001 על ידי מבחן t של סטודנט לא מזווג. אומץ באישור Inubushi et al.9. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: התפרקות של חומצה היאלורונית קשורה למצע בתאי FA בתאי O9-1. בדיקות היאלורונידאז מבוססות תאים בוצעו במשך 16 שעות ותאים הוכתמו עבור וינקולין. בתאי O9-1 בקרה, פירוק HA מתרחש ב-FAs חיוביים לוינקולין. בתאי O9-1 שהתרוקנו ב-Tmem2, פירוק HA והיווצרות FA פוחתים מאוד. מספר FAs לכל תא הושווה כמותית בין תאי Tmem2 מדוללים לבין תאי O9-1 בקרה (גרף עמודות). הנתונים מייצגים ממוצע ± SD (n >30 תאים לכל מצב שנאספו משלושה ניסויים בלתי תלויים). p < 0.001 על ידי מבחן t של סטודנט לא מזווג. אומץ באישור Inubushi et al.9. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: תמונות מייצגות של נדידת תאי O9-1 לתוך רווח ללא תאים על מצעי Col1/HA מעורבים. (A) הלוח העליון מציג את הפערים בתחילת הניסוי (יום 0). הלוחות התחתונים מציגים תמונות רווח לאחר דגירה של 24 שעות (יום 1) או 48 שעות (יום 2). סרגל קנה מידה = 150 מיקרומטר. (B) גרף עמודות המציג את הניתוח הכמותי של נדידת תאים. הנתונים מייצגים את הממוצע ± SD של שטח הפער המכוסה על ידי תאים נודדים ביחס לשטח הפער המקורי (n = 5 לכל תנאי). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 על ידי מבחן t של סטודנט לא מזווג. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: התפרקות של HA במצעי Col1/HA מעורבים ב-FAs בתאי O9-1. תאי O9-1 שגודלו בתרבית על מצעים מעורבים המורכבים מ-Col1/HA סומנו כתאי חיסון עם נוגדן אנטי-וינקולין (אדום). הכתמים/הפסים הכהים מייצגים פעילות פירוק HA במצע FAHA-H2 (ירוק). האתרים של התפרקות חומצה היאלורונית והידבקויות מוקדיות (וינקולין) מוקמו במשותף על המצע המעורב (ראשי חץ). סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

רכיבי ECM שונים מסדירים הגירה/הגירה של NCC. לדוגמה, HA מווסת באופן חיובי את נדידת NCC 2,15. באופן מעניין, מחקר המבוסס על מודלים גנטיים של עכברים של Tmem2, היאלורונידאז על פני התא, הבהיר את הדרישה לפירוק HA בנדידת NCC9. קולגן מצוי בשפע גם ב-ECM המקיף את הצינור העצבי16. הוכח כי דקורין, פרוטאוגליקן קטן עשיר בלאוצין, מווסת נדידת NCC במהלך התפתחות עצבית17. רכיבי ECM אחרים, כולל למינין ופיברונקטין משפיעים על הידבקות ונדידת NCC18. עם זאת, התפקידים הספציפיים של רכיבי ECM בהעברת NCC עדיין אינם ידועים.

מודל ה-in vitro המתואר כאן נועד לבחון את ההתנהגות של NCCs נודדים הנתקלים ב-ECM עתיר HA. בחרנו במצעים דו-ממדיים ולא תלת-ממדיים בגלל הקשיים בהכנת ג'ל קולגן-HA מרוכב עם תכונות ג'לציה אחידות. במערכת תרבית דו-ממדית, השיפועים המרחביים של ריכוזי הגורמים המסיסים והנוקשות של מצעי המטריקס החוץ-תאיים שונים מאלה של רקמה חיה19. מנקודת מבט זו, למערכת תרבית תלת ממדית יש יתרונות גדולים והיא יכולה לספק תובנות עמוקות יותר על מנגנוני נדידת תאים20,21. בהקשר זה, קיימת עדיפות להקמת מערכת בדיקה תלת-ממדית, אם רלוונטי. מודל ניסויי במבחנה זה עשוי להיות ישים לבחינת התנהגות הגירה של NCC בתגובה לרכיבי ECM משתנים. זה יאפשר הבנה טובה יותר של הבסיס המכניסטי של הגירה NCC, אשר שולט במורפוגנזה עוברית.

תאי O9-1 ששימשו במחקר זה מבטאים ביציבות סמני תאי גזע (CD44, Sca-1 ו-Bmi1) וסמני פסגה עצבית (AP-2a, Twist1, Sox9, Myc, Ets1, Dlx1, Dlx2, Crabp1, Epha2 ו-Itgb1). בתנאי תרבית שאינם מתמיינים, תאי O9-1 שומרים על מאפיינים דמויי תאי גזע רב-עוצמה. לתאי O9-1 יש פוטנציאל להתמיין למספר סוגי תאים, כולל אוסטאובלסטים, כונדרוציטים, תאי שריר חלק ותאי גלייה בתנאי תרבית ספציפיים12. לכן, תאי O9-1 הם כלי שימושי לחקר התכונות המולקולריות של נדידת NCC גולגולתית והתמיינות. אף על פי כן, השימוש בתאי NCC ראשוניים (למשל, מצינורות עצביים עובריים של תרנגולות או עכברים) במקום תאי O9-1 יספק נתונים מפורטים יותר כדי להקל על הבנה טובה יותר של אופי נדידת NCC.

בניסוי הנדידה מבוסס סגירת הפצעים, גם המועצה לשלום הילד תתרבה והגידול במספר התאים יתרום גם הוא להתרחבות אוכלוסיית התאים לאזור הפער22. כדי למזער את ההתפשטות במהלך בדיקת ריפוי פצעים, רעב בסרום היא השיטה הנפוצה ביותר במקום להשתמש בחומרים פרמקולוגיים23. עם זאת, ההשפעות של רעב בסרום צריך להיבדק בכל סוג תא.

השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה הוא הוספת הציפוי הקוולנטי של HA לכלים בעלי תחתית הזכוכית. טיפול משטח זכוכית עם ריאגנטים סילאן משמש לניתוח הידבקויות מוקדיות למצעי ECM24. Triethoxysilane היא תרכובת אורגנוסיליקון המכילה קבוצות אמינו חופשיות רבות שיכולות להיקשר לקבוצות הידרוקסיל חופשיות על משטחי זכוכית סיליקה25. במחקר זה פותחה ואופטימיזציה טכניקה לייצור שכבת סילאן דקה ויציבה על משטח זכוכית סיליקה באמצעות טריאתוקסיסילן. האמין במשטח הזכוכית המצופה בטריאתוקסיסילן יכול לקשור את קבוצות הקרבוקסיל על HA, וכתוצאה מכך לשתק כימית את HA על משטח הזכוכית8. עם זאת, בשיטה זו, לא ניתן לקשור מצעי ECM אחרים מבוססי חלבון למשטח הזכוכית. לכן, גלוטאראלדהיד שימש כאן כדי לשתק כימית את הקולגן מסוג I באמצעות צימוד אמין לאלדהיד. יש לציין כי ציפוי HA לקוי יכול להוביל להסרת ציפוי HA גם ללא עיכול אנזימטי (למשל, על ידי פעולה של כוח מכני במהלך היצמדות תאים ונדידה). ציפוי במצעי ECM במקום קולגן מסוג I אפשרי, בתנאי שלמצעים יש קבוצות אמין. עם זאת, ייתכנו מגבלות בציפוי קוולנטי של ה-ECM על גבי כלים בעלי תחתית זכוכית בשל התכונות הכימיות של המצע; לכן, ניסוי וטעייה עשויים להידרש.

למרות שזה לא מודל מושלם לחיקוי נדידת NCC לתוך ECM עשיר HA סביב הצינור העצבי, ניסוי נדידת מבחנה זה עשוי להיות שימושי עבור ניתוח פונקציונלי של המולקולות המעורבות בנדידת NCC vivo . בנוסף, בדיקה זו במבחנה עשויה להיות שימושית עבור סינון תרופות טיפוליות כדי להאיץ או למנוע פירוק HA, כמו גם נדידה של סוגי תאים אחרים, כולל פיברובלסטים בעור וקרטינוציטים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחבר מצהיר כי לא קיימים אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

אני מביע תודה רבה לפומיטושי איירי ויו ימאגוצ'י על עידודם והצעותיהם האדיבות בביסוס שיטה זו. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים לתוכניות מחקר מדעי מהאגודה היפנית לקידום המדע (#19KK0232 ל- T.I., #20H03896 ל- T.I). השיטה המקורית לציפוי HA על מצעי זכוכית ומבחני פירוק HA באתרם על המצע תוארה ב- Yamamoto et al. (2017)8, ואילו השיטה להכנת מצעים מעורבים HA/Col1 תוארה ב- Irie et al. (2021)7.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10cm cell culture dish CORNING Cat. 353003
1X PBS Millipore Cat. No. BSS-1005-B
2-well culture inserts ibidi Cat. No. 80209
Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG Invitrogen Cat. A21422 Goat derived anti-mouse secondary antibody
automated cell counter Bio-Rad Cat. No. TC20
CELLBANKER ZENOGEN PHARMA Cat. 11910 Cell freezing medium
collagen type I Sigma Cat. No. 08-115
Complete ES Cell Medium Millipore Cat. No. ES-101-B
DAPI Invitrogen Cat. 10184322
Dulbecco’s Modified Eagle Medium  Gibco Cat. 11971025
Fetal Bovine serum Gibco Cat. 10270106
fluorescence microscope Keyence Cat. No. BZ-X700
Fluoresent labelled HA PG Research FAHA-H2
Glas bottom dish Iwaki Cat. 11-0602
glutaldehyde Sigma Cat. No. G5882
Matrigel Fisher Cat. No. CB-40234 The basement-membrane matrix
monoclonal anti-vinculin antibody Sigma Cat. No. V9264
mounting media Dako S3023
Normal goat serum Fisher Cat. 50062Z
O9-1 cells Millipore Cat. No. SCC049
Paraformaldehyde Sigma Cat. 158127
triethoxysilane Sigma Cat. No. 390143
trypsin-EDTA Millipore Cat. No. SM-2003-C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326 (2013).
  2. Casini, P., Nardi, I., Ori, M. Hyaluronan is required for cranial neural crest cells migration and craniofacial development. Developmental Dynamics. 241 (2), 294-302 (2012).
  3. Landolt, R. M., Vaughan, L., Winterhalter, K. H., Zimmermann, D. R. Versican is selectively expressed in embryonic tissues that act as barriers to neural crest cell migration and axon outgrowth. Development. 121 (8), 2303-2312 (1995).
  4. Camenisch, T. D., et al. Disruption of hyaluronan synthase-2 abrogates normal cardiac morphogenesis and hyaluronan-mediated transformation of epithelium to mesenchyme. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 349-360 (2000).
  5. Camenisch, T. D., Schroeder, J. A., Bradley, J., Klewer, S. E., McDonald, J. A. Heart-valve mesenchyme formation is dependent on hyaluronan-augmented activation of ErbB2-ErbB3 receptors. Nature Medicine. 8 (8), 850-855 (2002).
  6. Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
  7. Irie, F., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 regulates cell adhesion and migration via degradation of hyaluronan at focal adhesion sites. Journal of Biological Chemistry. 296, 100481 (2021).
  8. Yamamoto, H., et al. A mammalian homolog of the zebrafish transmembrane protein 2 (TMEM2) is the long-sought-after cell-surface hyaluronidase. Journal of Biological Chemistry. 292 (18), 7304-7313 (2017).
  9. Inubushi, T., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 plays an essential role in mouse neural crest cell development and survival. PLoS Genetics. 18 (7), 1009765 (2022).
  10. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
  11. Pijuan, J., et al. Cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
  12. Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
  13. Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
  14. Humphries, J. D., et al. Vinculin controls focal adhesion formation by direct interactions with talin and actin. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1043-1057 (2007).
  15. Perris, R., Perissinotto, D. Role of the extracellular matrix during neural crest cell migration. Mechanisms of Development. 95 (1-22), 3-21 (2000).
  16. Perris, R., et al. Spatial and temporal changes in the distribution of proteoglycans during avian neural crest development. Development. 111 (2), 583-599 (1991).
  17. Zagris, N., Gilipathi, K., Soulintzi, N., Konstantopoulos, K. Decorin developmental expression and function in the early avian embryo. The International Journal of Developmental Biology. 55 (6), 633-639 (2011).
  18. Perris, R., Paulsson, M., Bronner-Fraser, M. Molecular mechanisms of avian neural crest cell migration on fibronectin and laminin. Developmental Biology. 136 (1), 222-238 (1989).
  19. Chevalier, N. R., et al. How tissue mechanical properties affect enteric neural crest cell migration. Scientific Reports. 6, 20927 (2016).
  20. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  21. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
  22. Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion and Migration. 8 (5), 440-451 (2014).
  23. Davis, P. K., Ho, A., Dowdy, S. F. Biological methods for cell-cycle synchronization of mammalian cells. Biotechniques. 30 (6), 1322-1331 (2001).
  24. Wayner, E. A., Garcia-Pardo, A., Humphries, M. J., McDonald, J. A., Carter, W. G. Identification and characterization of the T lymphocyte adhesion receptor for an alternative cell attachment domain (CS-1) in plasma fibronectin. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1321-1330 (1989).
  25. Robert, G. A., et al. Molecular structure of 3-aminopropyltriethoxysilane layers formed on silanol-terminated silicon surfaces. The Journal of Physical Chemistry. 116 (10), 6289-6297 (2012).

Tags

החודש ב-JoVE גיליון 192
<em>במבחנה</em> חקר ההשפעות של מטריצה חוץ-תאית עשירה בהיאלורונן על נדידת תאי קרסט עצביים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Inubushi, T. In Vitro… More

Inubushi, T. In Vitro Investigation of the Effects of the Hyaluronan-Rich Extracellular Matrix on Neural Crest Cell Migration. J. Vis. Exp. (192), e64749, doi:10.3791/64749 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter