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Developmental Biology

इन विट्रो न्यूरल क्रेस्ट सेल माइग्रेशन पर हायलूरोनन-रिच एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स के प्रभावों की जांच

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64749
Automatic Translation
1
1Department of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics, Osaka University Graduate School of Dentistry

Summary

यह प्रोटोकॉल एक इन विट्रो माइग्रेशन प्रयोग को रेखांकित करता है जो हाइलूरोनन-समृद्ध बाह्य मैट्रिक्स में तंत्रिका शिखा कोशिकाओं के विवो माइग्रेशन में शामिल अणुओं के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त है।

Abstract

तंत्रिका शिखा कोशिकाएं (NCCs) अत्यधिक प्रवासी कोशिकाएं हैं जो तंत्रिका ट्यूब के पृष्ठीय क्षेत्र से उत्पन्न होती हैं। न्यूरल ट्यूब से एनसीसी का उत्प्रवास एनसीसी उत्पादन और लक्षित स्थलों की ओर उनके बाद के प्रवास के लिए एक आवश्यक प्रक्रिया है। आसपास के तंत्रिका ट्यूब ऊतकों सहित एनसीसी के प्रवासी मार्ग में हाइलूरोनन (एचए) समृद्ध बाह्य मैट्रिक्स शामिल हैं। तंत्रिका ट्यूब से इन एचए-समृद्ध आसपास के ऊतकों में एनसीसी माइग्रेशन को मॉडल करने के लिए, इस अध्ययन में एचए (औसत आणविक भार: 1,200-1,400 केडीए) और कोलेजन टाइप 1 (सीओएल 1) से युक्त एक मिश्रित सब्सट्रेट माइग्रेशन परख स्थापित की गई थी। यह माइग्रेशन परख दर्शाता है कि एनसीसी सेल लाइन, ओ 9 -1, कोशिकाएं मिश्रित सब्सट्रेट पर अत्यधिक प्रवासी हैं और प्रवास के दौरान फोकल आसंजन की साइट पर एचए कोटिंग खराब हो जाती है। यह इन विट्रो मॉडल एनसीसी माइग्रेशन में शामिल यांत्रिक आधार की आगे की खोज के लिए उपयोगी हो सकता है। यह प्रोटोकॉल एनसीसी माइग्रेशन का अध्ययन करने के लिए मचानों के रूप में विभिन्न सब्सट्रेट्स का मूल्यांकन करने के लिए भी लागू है।

Introduction

तंत्रिका शिखा कोशिकाएं (NCCs) एक मल्टीपोटेंट सेल आबादी हैं जो विकासशील भ्रूण में मौजूद हैं, और वे न्यूरुलेशन के दौरान तंत्रिका प्लेट सीमा से उत्पन्न होती हैं। वे परिधीय तंत्रिका तंत्र, कार्डियोवैस्कुलर सिस्टम, क्रानियोफेशियल ऊतकों और कंकाल1 सहित विभिन्न प्रकार के ऊतकों के गठन में योगदान करते हैं। न्यूरल प्लेट सीमा पर प्रेरण और एनसीसी विनिर्देश के बाद, एनसीसी न्यूरोएपिथेलियम से उत्प्रवास करते हैं और एनसीसी-व्युत्पन्नऊतक साइटों की ओर पलायन करते हैं।

Hyaluronan (HA) एक गैर-सल्फेटेड ग्लाइकोसामिनोग्लाइकन है जिसे बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के एक घटक के रूप में विभिन्न प्रकार के ऊतकों में वितरित किया जाता है। भ्रूण के विकास में एचए के महत्व को मॉडल सिस्टम में हाइलूरोनन चयापचय के लिए जिम्मेदार जीन के पृथक्करण के माध्यम से प्रदर्शित किया गया है। उदाहरण के लिए, जेनोपस में हायलूरोनन सिंथेज़ जीन (हैस 1 और हैस 2) में उत्परिवर्तन एनसीसी माइग्रेशन दोष और क्रैनियोफेशियल विकृति2 का कारण पाया गया। इसके अलावा, एचए-बाइंडिंग प्रोटीओग्लाइकेन्स, एग्ग्रेकन और वर्सिकन, एनसीसी माइग्रेशन3 पर निरोधात्मक प्रभाव डालने के लिए रिपोर्ट किए गए हैं। चूहों में, हैस 2 एब्लेशन एंडोकार्डियल कुशन गठन में गंभीर दोष की ओर जाता है, जिसके परिणामस्वरूप मध्य-गर्भधारण (ई 9.5-10) घातकता 4,5,6 होती है।

ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन 2 (Tmem2), एक सेल सतह हायलूरोनिडेस, हाल ही में आसंजन साइटों 7,8 पर मैट्रिक्स से जुड़े एचए को हटाकर इंटीग्रिन-मध्यस्थता कैंसर सेल आसंजन और प्रवास को बढ़ावा देने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए प्रदर्शित किया गया है। हाल ही में, इनुबुशी एट अल.9 ने प्रदर्शित किया कि टीएमईएम 2 में कमी से एनसीसी उत्प्रवास / प्रवासन और अस्तित्व में असामान्यताओं के कारण गंभीर क्रैनियोफेशियल दोष होते हैं। पिछले अध्ययन9 में, एनसीसी गठन और प्रवासन के दौरान Tmem2 अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया गया था। Tmem2 अभिव्यक्ति को NCC डिलेमिनेशन के स्थल पर और Sox9-पॉजिटिव NCCs के उत्प्रवास में देखा गया था (चित्र 1)। इसके अतिरिक्त, Tmem2-क्षीण माउस O9-1 तंत्रिका शिखा कोशिकाओं का उपयोग करते हुए, अध्ययन से पता चला कि Tmem2 की इन विट्रो अभिव्यक्ति O9-1 कोशिकाओं के लिए फोकल आसंजन बनाने और HA-युक्त सब्सट्रेट्स में उनके प्रवास के लिए आवश्यक थी (चित्रा 2 और चित्रा 3)9।

ये परिणाम दृढ़ता से इंगित करते हैं कि एचए-समृद्ध ईसीएम के माध्यम से एनसीसी आसंजन और प्रवास के लिए टीएमईएम 2 भी महत्वपूर्ण है। हालांकि, एचए-समृद्ध ईसीएम के भीतर एनसीसी आसंजन और प्रवासन का आणविक तंत्र अभी भी स्पष्ट नहीं है। इसलिए, एचए-समृद्ध ईसीएम के भीतर एनसीसी आसंजन और प्रवासन का पूरी तरह से पता लगाने के लिए एक इन विट्रो संस्कृति प्रयोगात्मक प्रणाली स्थापित करना आवश्यक है।

सेल माइग्रेशन के परीक्षण में नियोजित कई दृष्टिकोणों में से, सेल घाव बंद करने-आधारित परख एक सरल विधि है जो अक्सर शरीर विज्ञान और ऑन्कोलॉजी10 के क्षेत्र में उपयोग की जाती है। यह दृष्टिकोण विवो फेनोटाइप में इसकी प्रासंगिकता के कारण उपयोगी है और सेल माइग्रेशन11 के दौरान दवाओं और केमोअट्रैक्टेंट्स की भूमिकाओं को निर्धारित करने में प्रभावी है। समय के साथ सेल गैप दूरी को मापकर पूरे सेल द्रव्यमान और व्यक्तिगत कोशिकाओं दोनों की प्रवासन क्षमता का मूल्यांकन करना संभवहै। इस पांडुलिपि में, तंत्रिका ट्यूब के आसपास एचए-समृद्ध ऊतकों में एनसीसी माइग्रेशन को मॉडल करने के लिए एक संशोधित इन विट्रो घाव बंद-आधारित परख पेश की गई है। यह प्रक्रिया एनसीसी माइग्रेशन में ईसीएम पाड़ की भूमिका का विश्लेषण करने के लिए विभिन्न ईसीएम घटकों (यानी, कोलेजन, फाइब्रोनेक्टिन और लैमिनिन) का अध्ययन करने के लिए भी लागू होती है।

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Protocol

ओसाका यूनिवर्सिटी ग्रेजुएट स्कूल ऑफ डेंटिस्ट्री की पशु आचार समिति द्वारा सभी प्रक्रियाओं को मंजूरी दी गई थी।

1. माउस कपाल तंत्रिका शिखा कोशिकाओं की संस्कृति

नोट: इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली तंत्रिका शिखा सेल लाइन में ओ 9 -1 कोशिकाएं शामिल हैं, जो मूल रूप से डब्ल्यूएनटी 1-सीआरई से प्राप्त होती हैं; आर 26 आर-जीएफपी-व्यक्त करने वाली कोशिकाएं ई 8.5 माउस भ्रूण12 से अलग हैं (चर्चा देखें)। ओ 9 -1 कोशिकाओं के संवर्धन के लिए यहां वर्णित विधि पहले से स्थापित प्रोटोकॉल13 का पालन करती है।

  1. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित प्लेट तैयार करें।
    1. बर्फ पर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स ( सामग्री की तालिका देखें) को पिघलाएं। ठंडा 1x PBS में मैट्रिक्स 1:50 पतला करें, और बर्फ पर रखें।
    2. पतला तहखाने-झिल्ली मैट्रिक्स समाधान के 10 एमएल के साथ 10 सेमी कल्चर प्लेट को कोट करें। प्लेट को 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें, और उपयोग से पहले मैट्रिक्स को एस्पिरेट करें।
    3. प्लेट को 2 एमएल पीबीएस के साथ 3x धो लें।
  2. बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित प्लेट पर संस्कृति ओ 9 -1 कोशिकाएं।
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में पूर्ण भ्रूण स्टेम (ईएस) सेल माध्यम ( सामग्री की तालिका देखें) को गर्म करें।
    2. धीरे से O9-1 सेल निलंबन मिलाएं ( सामग्री की तालिका देखें) और स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की संख्या की गणना करें ( सामग्री की तालिका देखें)। पूर्ण ईएस सेल माध्यम के साथ सेल एकाग्रता को 1.1 × 106 / एमएल में समायोजित करें।
    3. मैट्रिक्स-लेपित 10 सेमी कल्चर प्लेट में 8 एमएल प्री-वार्म्ड पूर्ण ईएस सेल माध्यम जोड़ें, और ओ 9 -1 कोशिकाओं को 1.1 x 106 कोशिकाओं / प्लेट पर बीज दें। 5% सीओ2 ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. अगले दिन, माध्यम को ताजा पूर्ण ईएस सेल माध्यम (37 डिग्री सेल्सियस तक पूर्व-गर्म) के साथ बदलें। इसके बाद हर 2-3 दिनों में ताजा माध्यम से बदलें।
      नोट: जब कोशिकाएं लगभग 80% कंफ्लुएंट (प्लेटिंग के 3-4 दिन बाद) होती हैं, तो उन्हें 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के साथ अलग किया जा सकता है और बाद में उपयोग के लिए आगे या जमे हुए पारित किया जा सकता है। O9-1 कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवियों को चित्र 1 में दिखाया गया है।
    5. ट्रिप्सिनाइजेशन से पहले कल्चर प्लेट को 1x PBS के 2 एमएल से धोएं। 2 एमएल प्री-वार्मेड 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। पूर्ण सेल डिटेचमेंट की जांच करें; यदि आवश्यक हो तो प्लेट के किनारे को धीरे से टैप करें।
    6. कल्चर प्लेट में 2 एमएल प्री-वार्म्ड पूर्ण ईएस सेल माध्यम जोड़ें और विघटित कोशिकाओं को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। ट्यूब को 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    7. सेल पेलेट को परेशान किए बिना सुपरनैटेंट को छोड़ दें। फिर, ट्यूब में 2 एमएल पूर्व-गर्म पूर्ण ईएस सेल माध्यम जोड़ें, और पाइपिंग द्वारा कोशिकाओं को अच्छी तरह से पुन: निलंबित करें। वांछित सेल घनत्व पर एक नई संस्कृति प्लेट पर कोशिकाओं को बीज दें।
    8. वैकल्पिक रूप से, पूर्ण ईएस सेल माध्यम के स्थान पर ट्यूब में 10% डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) युक्त सेल फ्रीजिंग माध्यम के 1 एमएल को जोड़कर एक जमे हुए सेल स्टॉक तैयार करें और कोशिकाओं को अच्छी तरह से पुन: निलंबित करें। सेल निलंबन को क्रायो ट्यूबों में स्थानांतरित करें, और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. एचए /कोल 1-लेपित पकवान की तैयारी

नोट: ग्लास-बॉटम व्यंजनों पर एचए / कोल 1 कोटिंग की मूल विधि इरी एट अल.7 द्वारा प्रस्तावित की गई थी।

  1. सावधानी से 3.5 सेमी ग्लास-बॉटम डिश में 50 μL अनडिल्यूटेड ट्राइथोक्सीसिलेन जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)। कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और प्रकाश से बचाएं।
    नोट: ट्राइथोक्सीसिलेन के साथ इनक्यूबेशन 5 मिनट से अधिक नहीं होना चाहिए। यह कोटिंग दक्षता को प्रभावित कर सकता है और अवांछनीय उत्पादों का उत्पादन कर सकता है।
  2. डिश को 2 एमएल आसुत जल के साथ जल्दी से 3 गुना धो लें। 0.25% ग्लूटारल्डिहाइड का 50 μL जोड़ें, पीबीएस में 100x पतला, प्रति डिश, और 30 मिनट के लिए RT पर इनक्यूबेट करें।
  3. पीबीएस के 2 एमएल के साथ जल्दी से 4x धो लें। फिर, 1 घंटे के लिए आरटी पर 0.2 एन एसिटिक एसिड में कोलेजन टाइप 1 के 300 μL के साथ व्यंजन को कोट करें।
  4. पीबीएस के 2 एमएल के साथ जल्दी से 3x धो लें। प्रत्येक डिश में 200 μg/mL फ्लोरेसिनामाइन-लेबल सोडियम हाइलूरोनेट-H2 (FAHA-H2) (PBS में पतला) का 300 μL जोड़ें और RT पर रात भर इनक्यूबेट करें। पीबीएस को एस्पिरेट करने के बाद, प्लेट को एक साफ बेंच पर 5 मिनट के लिए हवा से सुखाएं।
    नोट: एफएएचए-एच 2 एक फ्लोरेसिनामाइन-लेबल सोडियम हाइलूरोनेट है जिसका औसत आणविक भार 1,200-1,600 केडीए से है। एक उपयुक्त आणविक भार के एचए का उपयोग अनुसंधान डिजाइन के अनुसार किया जा सकता है।

3. एचए / कोल 1-लेपित डिश पर माइग्रेशन परख

नोट: कोल 1 / एचए सब्सट्रेट्स में परिभाषित 500 μm सेल-मुक्त अंतराल का उपयोग करके एक घाव बंद-आधारित परख 2-वेल कल्चर इंसर्ट ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके किया गया था। O9-1 कोशिकाएं Tmem2 को व्यक्त करती हैं, जो बाह्य अंतरिक्ष9 (चित्रा 2 और चित्रा 3) में एचए के आसंजन और गिरावट के लिए आवश्यक है।

  1. लेपित ग्लास-बॉटम डिश को सुखाने के बाद, व्यंजनों में 2-वेल कल्चर इंसर्ट संलग्न करें, और 1 एमएल पीबीएस के साथ बाहरी रूप से इंसर्ट भरें।
  2. ओ 9-1 कोशिकाओं को 1 x 104 कोशिकाओं में 100 μL Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) में कुओं में बीज दें जिसमें प्रति सम्मिलित 2% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) होता है। 5% सीओ 2 ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर2 दिनों के लिए कोशिकाओं को कल्चर करें।
  3. चिमटी के साथ लेपित ग्लास-बॉटम व्यंजनों से इंसर्ट को सावधानीपूर्वक हटा दें। कोशिकाओं और सेल मलबे को हटाने के लिए लेपित ग्लास-बॉटम व्यंजनों को 1x PBS के 2 एमएल के साथ धीरे से धोएं। संस्कृति व्यंजनों में 2% एफबीएस युक्त 2 एमएल ताजा डीएमईएम जोड़ें।
  4. उच्च-रिज़ॉल्यूशन सेटिंग्स के साथ मोनोक्रोम मोड में ऑल-इन-वन फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके शुरुआती समय बिंदु के रूप में अब चरण-कंट्रास्ट छवियों को कैप्चर करें (6 डीबी पर लाभ, कोई बिनिंग नहीं)। इस अध्ययन में इमेजिंग के लिए 4x से 20x के आवर्धन के साथ उद्देश्य लेंस का उपयोग किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: संबंधित स्केल सलाखों के साथ चरण-कंट्रास्ट छवियों को कैप्चर करें और उन्हें टीआईएफएफ प्रारूप में सहेजें।
  5. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर अतिरिक्त 48 घंटे के लिए कोशिकाओं कोकल्चर करें। ऑल-इन-वन फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके संस्कृति में 24 घंटे और 48 घंटे पर चरण-कंट्रास्ट छवियों को कैप्चर करें।
  6. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 1 एमएल के साथ 48 घंटे पर कोशिकाओं को ठीक करें। फिर, 1 एमएल ताजा पीबीएस के साथ प्रत्येक 5 मिनट के लिए व्यंजन 3x धोएं।
  7. आगे के रूपात्मक अवलोकन के लिए माउंटिंग माध्यम ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ एक कवरस्लिप रखें।
    नोट: व्यंजन को तुरंत चित्रित किया जा सकता है या 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 महीने तक संग्रहीत किया जा सकता है।
  8. वैकल्पिक: रुचि के प्रोटीन के लिए कोशिकाओं को इम्यूनोलेबल करें।
    नोट: माउस-व्युत्पन्न मोनोक्लोनल एंटी-विन्कुलिन एंटीबॉडी ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके फोकल आसंजन (एफए) कॉम्प्लेक्स का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल यहां एक उदाहरण के रूप में वर्णित है।
    1. 60 मिनट के लिए 0.5 एमएल ब्लॉकिंग बफर (पीबीएस में 5% सामान्य बकरी सीरम) के साथ व्यंजन (चरण 3.6 से) को इनक्यूबेट करें।
      नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए एक उपयुक्त ब्लॉकिंग बफर चुनें। एक विशिष्ट ब्लॉकिंग बफर उसी प्रजाति से 5% सामान्य सीरम होगा जो द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग करता है।
    2. एंटीबॉडी कमजोर पड़ने वाले बफर (पीबीएस में 1% सामान्य बकरी सीरम) में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के 0.5 एमएल के साथ व्यंजनों को इनक्यूबेट करें।
      नोट: उपयुक्त एंटीबॉडी कमजोर पड़ने वाले बफर का चयन करें। आमतौर पर, एंटीबॉडी का उपयोग 1: 50-1: 200 कमजोर पड़ने पर किया जाता है।
    3. 2 एमएल पीबीएस के साथ प्रत्येक को 5 मिनट के लिए 3 गुना कुल्ला करें। एंटीबॉडी तनुकरण बफर (पीबीएस में 1% सामान्य बकरी सीरम) में पतला बकरी-व्युत्पन्न एंटी-माउस द्वितीयक एंटीबॉडी तैयार करें। कमरे के तापमान पर 1-3 घंटे के लिए 0.5 एमएल पतला माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ व्यंजनों को इनक्यूबेट करें।
      नोट: आमतौर पर, द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग 1: 500-1: 1,000 कमजोर पड़ने पर किया जाता है। DAPI का उपयोग नाभिक को धुंधला करने के लिए किया जा सकता है।
    4. हर बार 5 मिनट के लिए 2 एमएल पीबीएस के साथ 3x कुल्ला करें। कवरस्लिप को 50 μL माउंटिंग माध्यम के साथ रखें।
      नोट: व्यंजनों को जीएफपी फिल्टर (उत्तेजना: 470/40, उत्सर्जन: 525/50) और टेक्सासरेड फिल्टर (उत्तेजना: 560/40, उत्सर्जन: 630/75) के साथ ऑल-इन-वन फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन सेटिंग्स (6 डीबी पर लाभ, कोई बिनिंग नहीं) के साथ मोनोक्रोम मोड का उपयोग करके चित्रित किया जा सकता है। इस अध्ययन में इमेजिंग के लिए 4x से 20x के आवर्धन के साथ उद्देश्य लेंस का उपयोग किया गया था।
      नोट: स्लाइड को 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 महीने तक संग्रहीत किया जा सकता है।

4. डेटा विश्लेषण

  1. ImageJ 1.51s सॉफ़्टवेयर खोलें। ImageJ विंडो में, सहेजी गई छवि फ़ाइल को खोलने के लिए मेनू पट्टी से फ़ाइल > खोलें का चयन करें।
  2. माप पैमाने को सेट करने के लिए, स्केल बार के समान दूरी की एक रेखा खींचें। सेट स्केल > विश्लेषण करने के लिए जाएं और सेट स्केल विंडो के उपयुक्त बक्से में लाइन की ज्ञात दूरी और इकाइयाँ टाइप करें ।
  3. सेल गैप के बीच एक सीधी रेखा खींचें, और मानों को डेटा विंडो में स्थानांतरित करने के लिए विश्लेषण > माप दबाएं । प्रत्येक नमूने में कम से कम पांच अलग-अलग पदों को मापें, और प्रतिनिधि नमूना डेटा प्राप्त करने के लिए दूरी का औसत निकालें। उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण करें ( सामग्री की तालिका देखें)।

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Representative Results

यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके कोल 1 और उच्च आणविक भार एचए (औसत आणविक भार: 1,200-1,400 केडीए) से बने मिश्रित सब्सट्रेट्स पर एक माइग्रेशन परख की गई थी। अंतराल की सीमा पर ओ 9-1 कोशिकाओं को आसानी से एचए-समृद्ध अंतर में स्थानांतरित करने के लिए पाया गया (चित्रा 4)। एफए मार्कर के लिए इम्यूनोस्टेनिंग, विनकुलिन14 ने पुष्टि की कि ओ 9 -1 कोशिकाओं ने एचए गिरावट के स्थलों पर फोकल आसंजन (एफए) का गठन किया (चित्रा 5)।

Figure 1
चित्रा 1: NCCs में TMEM2 अभिव्यक्ति। E9.0 पर Tmem2-FLAGKI भ्रूण के तंत्रिका ट्यूब के अनुप्रस्थ खंड। (ए) न्यूरल ट्यूब के कपाल और ट्रंक स्तरों पर वर्गों को टीएमईएम 2-फ्लैग प्रोटीन और एचए के लिए डबल-लेबल किया गया था। टीएमईएम 2 अभिव्यक्ति तंत्रिका प्लेट और तंत्रिका ट्यूब (भरे हुए तीर) के सीमा क्षेत्र में देखी गई थी, जबकि ये साइटें एचए धुंधला (खुले तीर) से रहित थीं। (बी) टीएमईएम 2-फ्लैग और एसओएक्स 9 के लिए तंत्रिका शिखा कोशिकाओं की डबल-लेबलिंग। E9.0 न्यूरल ट्यूब के अनुप्रस्थ खंड TMEM2-FLAG और Sox9 के लिए दागदार थे। सॉक्स 9-पॉजिटिव प्री-माइग्रेटरी और उत्प्रवास करने वाले एनसीसी तंत्रिका ट्यूब के किनारे पर अत्यधिक व्यक्त टीएमईएम 2। संक्षिप्त नाम: एनटी = तंत्रिका ट्यूब। स्केल सलाखों: (ए) 300 μm; (बी) 100 μm. इनुबुशी एट अल.9 से अनुमति के साथ अनुकूलित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: O9-1 कोशिकाओं में TMEM2 द्वारा HA का क्षरण। (A) Tmem2-क्षीण और नियंत्रण O9-1 कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवियां एक नियमित संस्कृति डिश (बाएं) पर संवर्धित होती हैं। (बी) इन कोशिकाओं में Tmem2 की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन QPCR द्वारा किया गया था, जिसमें Gapdh सामान्यीकरण (बार ग्राफ) के लिए एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में था। इसका मतलब है ± एसडी (एन = 5) क्षैतिज सलाखों के रूप में दिखाए गए हैं। पी < 0.001 अप्रकाशित छात्र के टी-टेस्ट द्वारा। स्केल बार, 5.0 μm. (C) सेल-आधारित Hyaluronidase परख। Tmem2-क्षीण और नियंत्रण O9-1 कोशिकाओं को फ्लोरेसिनेटेड HA (FA-HA) के साथ लेपित ग्लास कवरलिप्स पर 48 घंटे के लिए संवर्धित किया गया था। एचए अपमानजनक गतिविधि फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि में अंधेरे क्षेत्रों के रूप में प्रकट होती है। एचए क्षरण के स्तर की मात्रात्मक रूप से Tmem2-क्षीण और नियंत्रण O9-1 कोशिकाओं के बीच तुलना की गई थी जैसा कि सामग्री और विधियों (बारग्राफ) में वर्णित है। डेटा सेल-मुक्त क्षेत्र (एन > 50 कोशिकाओं प्रति स्थिति तीन स्वतंत्र प्रयोगों से एकत्रित) के सापेक्ष एक सेल के नीचे प्रतिदीप्ति तीव्रता के औसत ± एसडी का प्रतिनिधित्व करता है। पी < 0.001 अप्रकाशित छात्र के टी-टेस्ट द्वारा। इनुबुशी एट अल.9 से अनुमति के साथ अपनाया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: ओ 9 -1 कोशिकाओं में एफए में सब्सट्रेट-बाउंड एचए का क्षरण। सेल-आधारित हाइलूरोनिडेस परख 16 घंटे के लिए किया गया था और कोशिकाओं को विन्कुलिन के लिए दाग दिया गया था। नियंत्रण ओ 9 -1 कोशिकाओं में, एचए क्षरण विनकुलिन-पॉजिटिव एफए में होता है। Tmem2-क्षीण O9-1 कोशिकाओं में, HA अवक्रमण और FA गठन बहुत कम हो जाते हैं। प्रति सेल एफए की संख्या मात्रात्मक रूप से Tmem2-क्षीण और नियंत्रण O9-1 कोशिकाओं (बार ग्राफ) के बीच तुलना की गई थी। डेटा औसत ± एसडी (एन >30 कोशिकाएं प्रति स्थिति तीन स्वतंत्र प्रयोगों से एकत्रित) का प्रतिनिधित्व करता है। पी < 0.001 अप्रकाशित छात्र के टी-टेस्ट द्वारा। इनुबुशी एट अल.9 से अनुमति के साथ अपनाया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: मिश्रित Col1/HA सब्सट्रेट्स पर सेल-मुक्त अंतराल में O9-1 सेल माइग्रेशन की प्रतिनिधि छवियां। (A) शीर्ष पैनल प्रयोग की शुरुआत में अंतराल दिखाता है (दिन 0)। निचले पैनल 24 घंटे (दिन 1) या 48 घंटे (दिन 2) इनक्यूबेशन के बाद अंतराल छवियां दिखाते हैं। स्केल बार = 150 μm. (B) एक बार ग्राफ जो सेल माइग्रेशन के मात्रात्मक विश्लेषण को दर्शाता है। डेटा मूल अंतर (एन = 5 प्रति स्थिति) के क्षेत्र के सापेक्ष प्रवासी कोशिकाओं द्वारा कवर किए गए अंतर क्षेत्र के औसत ± एसडी का प्रतिनिधित्व करता है। *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 अप्रकाशित छात्र के टी-टेस्ट द्वारा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: O9-1 कोशिकाओं में FAs पर मिश्रित Col1/HA सब्सट्रेट्स में HA का क्षरण। कोल 1/एचए से युक्त मिश्रित सब्सट्रेट्स पर संवर्धित ओ 9 -1 कोशिकाओं को एंटी-विनकुलिन एंटीबॉडी (लाल) के साथ इम्युनोलेबल किया गया था। काले धब्बे /लकीरें एफएएचए-एच 2 सब्सट्रेट (हरे) में एचए गिरावट गतिविधि का प्रतिनिधित्व करती हैं। एचए क्षरण और फोकल आसंजन (विनकुलिन) की साइटों को मिश्रित सब्सट्रेट्स (एरोहेड्स) पर सह-स्थानीयकृत किया गया था। स्केल बार = 500 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

विभिन्न ईसीएम घटक एनसीसी उत्प्रवास/प्रवसन को विनियमित करते हैं। उदाहरण के लिए, एचए एनसीसी माइग्रेशन 2,15 को सकारात्मक रूप से नियंत्रित करता है। दिलचस्प बात यह है कि, एक सेल सतह हाइलूरोनिडेस, Tmem2 के आनुवंशिक माउस मॉडल पर आधारित एक अध्ययन ने एनसीसी माइग्रेशन9 में एचए गिरावट की आवश्यकता को स्पष्ट किया। तंत्रिका ट्यूब16 के आसपास ईसीएम में कोलेजन भी प्रचुर मात्रा में हैं। डेकोरिन, एक छोटा ल्यूसीन युक्त प्रोटिओग्लाइकन, तंत्रिका विकास के दौरान एनसीसी माइग्रेशन को विनियमित करने के लिए दिखाया गयाहै। लैमिनिन और फाइब्रोनेक्टिन सहित अन्य ईसीएम घटक एनसीसी आसंजन और प्रवासन को प्रभावित करतेहैं। हालांकि, एनसीसी माइग्रेशन में ईसीएम घटकों की विशिष्ट भूमिकाएं अभी भी अज्ञात हैं।

यहां वर्णित इन विट्रो मॉडल का उद्देश्य एचए-समृद्ध ईसीएम का सामना करने वाले एनसीसी के पलायन के व्यवहार की जांच करना है। हमने समान गेलेशन गुणों के साथ मिश्रित कोलेजन-एचए जैल तैयार करने में कठिनाइयों के कारण 3 डी, सब्सट्रेट्स के बजाय 2 डी, सब्सट्रेट्स को चुना। एक 2 डी संस्कृति प्रणाली में, घुलनशील कारक सांद्रता के स्थानिक ग्रेडिएंट और बाह्य मैट्रिक्स सब्सट्रेट्स की कठोरता जीवित ऊतक19 से अलग हैं। इस दृष्टिकोण से, एक 3 डी संस्कृति प्रणाली के बहुत फायदे हैं और सेल माइग्रेशन तंत्र20,21 में गहरी अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। इस संदर्भ में, यदि लागू हो, तो 3 डी परख प्रणाली स्थापित करना पसंद किया जाता है। यह इन विट्रो प्रयोगात्मक मॉडल अलग-अलग ईसीएम घटकों के जवाब में एनसीसी माइग्रेशन व्यवहार की जांच करने के लिए लागू हो सकता है। यह एनसीसी माइग्रेशन के यांत्रिक आधार की बेहतर समझ को सक्षम करेगा, जो भ्रूण मोर्फोजेनेसिस को नियंत्रित करता है।

इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली O9-1 कोशिकाएं स्थिर रूप से स्टेम सेल मार्करों (CD44, Sca-1, और Bmi1) और तंत्रिका शिखा मार्करों (AP-2a, Twist1, Sox9, Myc, Ets1, Dlx1, Dlx2, क्रैब1, Epha2, और Itgb1) को व्यक्त करती हैं। गैर-विभेदकारी संस्कृति स्थितियों के तहत, ओ 9 -1 कोशिकाएं मल्टीपोटेंट स्टेम सेल जैसी विशेषताओं को बनाए रखती हैं। ओ 9 -1 कोशिकाओं में विशिष्ट संस्कृति स्थितियों के तहत ओस्टियोब्लास्ट, चोंड्रोसाइट्स, चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं और ग्लियल कोशिकाओं सहित कई सेल प्रकारों में अंतर करने की क्षमता होतीहै। इसलिए, ओ 9 -1 कोशिकाएं कपाल एनसीसी माइग्रेशन और भेदभाव के आणविक गुणों की जांच के लिए एक उपयोगी उपकरण हैं। फिर भी, ओ 9 -1 कोशिकाओं के बजाय प्राथमिक एनसीएस (जैसे, चिकन या माउस भ्रूण तंत्रिका ट्यूबों से) का उपयोग एनसीसी माइग्रेशन की प्रकृति की बेहतर समझ की सुविधा के लिए अधिक विस्तृत डेटा प्रदान करेगा।

घाव बंद करने-आधारित माइग्रेशन परख में, एनसीसी भी प्रसार करेगा और सेल संख्या में वृद्धि भी अंतर क्षेत्र22 में सेल आबादी के विस्तार में योगदान देगी। घाव भरने परख के दौरान प्रसार को कम करने के लिए, औषधीय एजेंटों का उपयोग करने के बजाय सीरम भुखमरी सबसे आमतरीका है। हालांकि, सीरम भुखमरी के प्रभावों को प्रत्येक सेल प्रकार में परीक्षण किया जाना चाहिए।

इस प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम ग्लास-बॉटम व्यंजनों में एचए की सहसंयोजक कोटिंग को जोड़ना है। सिलेन अभिकर्मकों के साथ ग्लास सतह उपचार का उपयोग ईसीएम सब्सट्रेट्स24 के फोकल आसंजन के विश्लेषण के लिए किया जाता है। ट्राइथोक्सीसिलेन एक ऑर्गेनोसिलिकॉन यौगिक है जिसमें कई मुक्त अमीनो समूह होते हैं जो सिलिका ग्लास सतहों पर मुक्त हाइड्रॉक्सिल समूहों को बांधसकते हैं। ट्राइथोक्सीसिलेन का उपयोग करके सिलिका ग्लास की सतह पर एक पतली, स्थिर सिलेन परत का उत्पादन करने के लिए इस अध्ययन में एक तकनीक विकसित और अनुकूलित की गई थी। ट्राइथोक्सीसिलेन-लेपित कांच की सतह में अमाइन एचए पर कार्बोक्सिल समूहों को बांध सकता है, जिसके परिणामस्वरूप कांच की सतह 8 पर रासायनिक रूप से एचए को स्थिर कियाजा सकता है। हालांकि, इस विधि के साथ, कांच की सतह पर अन्य प्रोटीन-आधारित ईसीएम सब्सट्रेट्स को बांधना संभव नहीं है। इसलिए, ग्लूटारल्डिहाइड का उपयोग एल्डिहाइड के लिए अमाइन युग्मन के माध्यम से टाइप 1 कोलेजन को रासायनिक रूप से स्थिर करने के लिए किया गया था। विशेष रूप से, अपर्याप्त एचए कोटिंग एंजाइमेटिक पाचन के बिना भी एचए कोटिंग को हटाने का कारण बन सकती है (उदाहरण के लिए, सेल आसंजन और प्रवास के दौरान यांत्रिक बल की कार्रवाई से)। कोलेजन टाइप 1 के स्थान पर ईसीएम सब्सट्रेट्स के साथ कोटिंग संभव है, बशर्ते सब्सट्रेट्स में अमाइन समूह हों। हालांकि, सब्सट्रेट के रासायनिक गुणों के कारण ग्लास-बॉटम व्यंजनों पर ईसीएम को सहसंयोजक रूप से कोटिंग करने में सीमाएं मौजूद हो सकती हैं; इस प्रकार, परीक्षण और त्रुटि की आवश्यकता हो सकती है।

यद्यपि तंत्रिका ट्यूब के आसपास एचए-समृद्ध ईसीएम में एनसीसी माइग्रेशन की नकल करने के लिए एक आदर्श मॉडल नहीं है, यह इन विट्रो माइग्रेशन प्रयोग विवो एनसीसी माइग्रेशन में शामिल अणुओं के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए उपयोगी हो सकता है। इसके अलावा, यह इन विट्रो परख एचए क्षरण को तेज करने या रोकने के लिए चिकित्सीय दवा स्क्रीनिंग के साथ-साथ त्वचा फाइब्रोब्लास्ट और केराटिनोसाइट्स सहित अन्य सेल प्रकारों के प्रवास के लिए उपयोगी हो सकती है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करता है कि कोई प्रतिस्पर्धी हित मौजूद नहीं हैं।

Acknowledgments

मैं इस पद्धति को स्थापित करने में उनके प्रोत्साहन और दयालु सुझावों के लिए फुमितोशी इरी और यू यामागुची को बहुत स्वीकृति व्यक्त करता हूं। इस काम को जापान सोसाइटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस (#19KK0232 से टीआई, #20H03896 से टीआई) से वैज्ञानिक अनुसंधान कार्यक्रमों के लिए अनुदान-सहायता द्वारा समर्थित किया गया था। ग्लास सब्सट्रेट्स पर एचए की कोटिंग और सब्सट्रेट्स पर सीटू एचए डिग्रेडेशन परख के लिए मूल विधि का वर्णन यामामोटो एट अल (2017)8 में किया गया था, जबकि एचए / कोल 1 मिश्रित सब्सट्रेट्स की तैयारी के लिए विधि को इरी एट अल (2021)7 में वर्णित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10cm cell culture dish CORNING Cat. 353003
1X PBS Millipore Cat. No. BSS-1005-B
2-well culture inserts ibidi Cat. No. 80209
Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG Invitrogen Cat. A21422 Goat derived anti-mouse secondary antibody
automated cell counter Bio-Rad Cat. No. TC20
CELLBANKER ZENOGEN PHARMA Cat. 11910 Cell freezing medium
collagen type I Sigma Cat. No. 08-115
Complete ES Cell Medium Millipore Cat. No. ES-101-B
DAPI Invitrogen Cat. 10184322
Dulbecco’s Modified Eagle Medium  Gibco Cat. 11971025
Fetal Bovine serum Gibco Cat. 10270106
fluorescence microscope Keyence Cat. No. BZ-X700
Fluoresent labelled HA PG Research FAHA-H2
Glas bottom dish Iwaki Cat. 11-0602
glutaldehyde Sigma Cat. No. G5882
Matrigel Fisher Cat. No. CB-40234 The basement-membrane matrix
monoclonal anti-vinculin antibody Sigma Cat. No. V9264
mounting media Dako S3023
Normal goat serum Fisher Cat. 50062Z
O9-1 cells Millipore Cat. No. SCC049
Paraformaldehyde Sigma Cat. 158127
triethoxysilane Sigma Cat. No. 390143
trypsin-EDTA Millipore Cat. No. SM-2003-C

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References

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<em>इन विट्रो</em> न्यूरल क्रेस्ट सेल माइग्रेशन पर हायलूरोनन-रिच एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स के प्रभावों की जांच
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Inubushi, T. In Vitro Investigation of the Effects of the Hyaluronan-Rich Extracellular Matrix on Neural Crest Cell Migration. J. Vis. Exp. (192), e64749, doi:10.3791/64749 (2023).

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