Summary
Ce protocole décrit une expérience de migration in vitro adaptée à l’analyse fonctionnelle des molécules impliquées dans la migration in vivo des cellules de la crête neurale dans la matrice extracellulaire riche en hyaluronane.
Abstract
Les cellules de la crête neurale (CCN) sont des cellules hautement migratrices qui proviennent de la région dorsale du tube neural. L’émigration des NCC du tube neural est un processus essentiel pour la production de NCC et leur migration ultérieure vers les sites cibles. La voie migratoire des NCC, y compris les tissus environnants du tube neural, implique une matrice extracellulaire riche en hyaluronane (HA). Pour modéliser la migration des NCC dans ces tissus environnants riches en HA à partir du tube neural, un test de migration de substrat mixte composé d’HA (poids moléculaire moyen: 1 200-1 400 kDa) et de collagène de type I (Col1) a été établi dans cette étude. Ce test de migration démontre que les cellules de la lignée cellulaire NCC, O9-1, sont hautement migratrices sur le substrat mixte et que le revêtement HA est dégradé au site des adhérences focales au cours de la migration. Ce modèle in vitro peut être utile pour explorer davantage la base mécaniste impliquée dans la migration des CCN. Ce protocole est également applicable à l’évaluation de différents substrats comme échafaudages pour étudier la migration NCC.
Introduction
Les cellules de la crête neurale (CCN) sont une population cellulaire multipotente présente dans les embryons en développement, et elles proviennent de la bordure de la plaque neurale pendant la neurulation. Ils contribuent à la formation d’une variété de tissus, y compris le système nerveux périphérique, le système cardiovasculaire, les tissus craniofaciaux et le squelette1. Après induction et spécification NCC à la frontière de la plaque neurale, les NCC émigrent du neuroépithélium et migrent vers les sites tissulaires dérivés de NCC1.
L’hyaluronane (HA) est un glycosaminoglycane non sulfaté qui est distribué dans une variété de tissus en tant que composant de la matrice extracellulaire (ECM). L’importance de l’AH dans le développement de l’embryon a été démontrée dans des systèmes modèles par l’ablation des gènes responsables du métabolisme de l’hyaluronane. Par exemple, des mutations dans les gènes de la hyaluronane synthase (Has1 et Has2) chez Xenopus se sont avérées entraîner des défauts de migration NCC et une malformation craniofaciale2. De plus, il a été rapporté que les protéoglycanes se liant à l’HA, aggrécan et versican, exercent des effets inhibiteurs sur la migration NCC3. Chez la souris, l’ablation Has2 entraîne de graves défauts dans la formation du coussin endocardique, entraînant une létalité 4,5,6 en milieu de gestation (E9.5-10).
Il a récemment été démontré que la protéine transmembranaire 2 (Tmem2), une hyaluronidase de surface cellulaire, joue un rôle essentiel dans la promotion de l’adhésion et de la migration des cellules cancéreuses médiées par l’intégrine en éliminant l’AH associée à la matrice aux sites d’adhésion 7,8. Plus récemment, Inubushi et coll.9 ont démontré qu’une déficience en Tmem2 entraîne de graves anomalies craniofaciales dues à des anomalies de l’émigration/migration et de la survie des CCN. Dans l’étude précédente9, l’expression de Tmem2 a été analysée pendant la formation et la migration de NCC. L’expression de Tmem2 a été observée sur le site de délaminage des NCC et chez les NCC positifs pour Sox9 en émigration (Figure 1). De plus, en utilisant des cellules de crête neurale de souris O9-1 appauvries en Tmem2, l’étude a démontré que l’expression in vitro de Tmem2 était essentielle pour que les cellules O9-1 forment des adhérences focales et pour leur migration dans des substrats contenant de l’HA (Figure 2 et Figure 3)9.
Ces résultats indiquent fortement que Tmem2 est également important pour l’adhésion et la migration des CCN par l’intermédiaire de l’ECM riche en HA. Cependant, le mécanisme moléculaire de l’adhésion et de la migration des NCC au sein de l’ECM riche en HA n’est toujours pas clair. Il est donc nécessaire d’établir un système expérimental de culture in vitro pour explorer pleinement l’adhésion et la migration des NCC au sein de la MCE riche en HA.
Parmi les nombreuses approches utilisées pour tester la migration cellulaire, le test basé sur la fermeture des plaies cellulaires est une méthode simple fréquemment utilisée dans les domaines de la physiologie et de l’oncologie10. Cette approche est utile en raison de sa pertinence pour le phénotype in vivo et est efficace pour déterminer les rôles des médicaments et des chimioattractants au cours de la migration cellulaire11. Il est possible d’évaluer la capacité de migration des masses cellulaires entières et des cellules individuelles en mesurant les distances d’écart cellulaire au fil du temps11. Dans ce manuscrit, un essai modifié in vitro basé sur la fermeture des plaies est introduit pour modéliser la migration NCC dans les tissus riches en HA entourant le tube neural. Cette procédure est également applicable à l’étude de différents composants de la MCE (collagène, fibronectine et laminine) afin d’analyser le rôle de l’échafaudage de la MCE dans la migration des CCN.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’École supérieure de médecine dentaire de l’Université d’Osaka.
1. Culture de cellules de crête neurale crânienne de souris
REMARQUE : La lignée cellulaire de crête neurale utilisée dans cette étude comprend des cellules O9-1, dérivées à l’origine de Wnt1-Cre; Cellules exprimant R26R-GFP isolées à partir d’embryons de souris E8.512 (voir discussion). La méthode décrite ici pour la culture de cellules O9-1 suit un protocole préalablement établi13.
- Préparez la plaque revêtue de matrice de membrane basale.
- Décongeler la matrice de la membrane basale (voir le tableau des matériaux) sur la glace. Diluez la matrice 1:50 dans 1x PBS réfrigéré et gardez la glace.
- Enduire une plaque de culture de 10 cm de 10 mL de la solution diluée de matrice bas-membrane. Incuber la plaque à température ambiante pendant 1 h et aspirer la matrice avant utilisation.
- Lavez la plaque 3x avec 2 ml de PBS.
- Culture de cellules O9-1 sur la plaque recouverte de matrice membranaire basale.
- Réchauffer le milieu cellulaire embryonnaire complet (SE) (voir le tableau des matériaux) au bain-marie à 37 °C.
- Mélangez délicatement la suspension de cellules O9-1 (voir le tableau des matériaux) et comptez le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé (voir le tableau des matériaux). Ajuster la concentration cellulaire à 1,1 × 106/mL avec un milieu cellulaire ES complet.
- Ajouter 8 mL de milieu cellulaire ES complet préchauffé à la plaque de culture de 10 cm recouverte de matrice et ensemencer les cellules O9-1 à 1,1 x 106 cellules/plaque. Incuber à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5% de CO2 .
- Le lendemain, remplacez le milieu par un milieu de cellule ES complet frais (préchauffé à 37 °C). Remplacer par un milieu frais tous les 2-3 jours par la suite.
REMARQUE: Lorsque les cellules sont confluentes à environ 80% (3-4 jours après le placage), elles peuvent être dissociées avec 0,25% de trypsine-EDTA et évacuées plus loin ou congelées pour une utilisation ultérieure. Des images représentatives des cellules O9-1 sont présentées à la figure 1. - Laver la plaque de culture avec 2 ml de 1x PBS avant la trypsinisation. Ajouter 2 mL de trypsine-EDTA préchauffé à 0,25 % et incuber pendant 5 min à 37 °C. Vérifier s’il y a un détachement complet de la cellule; Tapotez doucement le côté de la plaque plusieurs fois si nécessaire.
- Ajouter 2 mL de milieu cellulaire ES complet préchauffé à la plaque de culture et transférer les cellules dissociées dans un tube conique de 15 mL. Centrifuger le tube à 300 x g pendant 5 min.
- Jetez le surnageant sans déranger la pastille de cellule. Ensuite, ajoutez 2 mL de milieu cellulaire ES complet préchauffé dans le tube et remettez soigneusement les cellules en suspension par pipetage. Ensemencer les cellules sur une nouvelle plaque de culture à la densité cellulaire désirée.
- Vous pouvez également préparer un stock de cellules congelées en ajoutant 1 mL de milieu de congélation cellulaire contenant 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO) dans le tube au lieu du milieu cellulaire ES complet et en remettant complètement les cellules en suspension. Transférer la suspension cellulaire dans des tubes cryogéniques et conserver à −80 °C.
2. Préparation du plat enrobé de HA/Col1
REMARQUE : La méthode originale d’enrobage de HA/Col1 sur des plats à fond de verre a été proposée par Irie et coll.7.
- Ajouter délicatement 50 μL de triéthoxysilane non dilué à un plat à fond de verre de 3,5 cm (voir le tableau des matières). Incuber pendant 5 min à température ambiante (RT) et protéger de la lumière.
NOTE: L’incubation avec le triéthoxysilane ne doit pas dépasser 5 min. Cela peut affecter l’efficacité du revêtement et produire des produits indésirables. - Lavez le plat rapidement 3x avec 2 ml d’eau distillée. Ajouter 50 μL de glutaraldéhyde à 0,25 %, dilué 100x dans du PBS, par boîte, et incuber à TA pendant 30 min.
- Laver rapidement 4x avec 2 ml de PBS. Ensuite, enrobez les plats de 300 μL de collagène de type I dans de l’acide acétique 0,2 N à TA pendant 1 h.
- Laver rapidement 3x avec 2 mL de PBS. Ajouter 300 μL de hyaluronate de sodium H2 marqué à la fluorescéinamine (FAHA-H2) à 200 μg/mL (dilué dans du PBS) à chaque plat et incuber toute la nuit à TA. Laver à nouveau 3x avec 2 mL de PBS. Après avoir aspiré le PBS, sécher la plaque à l’air libre pendant 5 minutes sur un banc propre.
REMARQUE: FAHA-H2 est un hyaluronate de sodium marqué à la fluorescéinamine avec un poids moléculaire moyen allant de 1 200 à 1 600 KDa. HA d’un poids moléculaire approprié peut être utilisé selon le plan de recherche.
3. Essai de migration sur la capsule enrobée de HA/Col1
REMARQUE : Un essai basé sur la fermeture de la plaie utilisant des espaces sans cellules définis de 500 μm dans des substrats Col1/HA a été effectué à l’aide d’inserts de culture à 2 puits (voir le tableau des matériaux). Les cellules O9-1 expriment Tmem2, nécessaire à l’adhésion et à la dégradation de l’HA dans l’espace extracellulaire9 (Figure 2 et Figure 3).
- Après avoir séché le plat à fond de verre enrobé, fixez les inserts de culture à 2 puits aux plats et remplissez les inserts à l’extérieur avec 1 ml de PBS.
- Ensemencer les cellules O9-1 dans les puits à raison de 1 x 104 cellules dans 100 μL de milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco contenant 2 % de sérum fœtal bovin (FBS) par insert. Culture des cellules pendant 2 jours à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5% de CO2 .
- Retirez soigneusement les inserts de la vaisselle à fond de verre enduite avec une pince à épiler. Lavez doucement la vaisselle à fond de verre enduit de 2 ml de 1x PBS pour enlever les cellules et les débris cellulaires. Ajouter 2 ml de DMEM frais contenant 2% de FBS dans les plats de culture.
- Capturez des images à contraste de phase dès maintenant comme point de départ à l’aide d’un microscope à fluorescence tout-en-un en mode monochrome avec des réglages haute résolution (gain à 6 dB, pas de rangement). Des lentilles objectives avec des grossissements de 4x à 20x ont été utilisées pour l’imagerie dans cette étude (voir le tableau des matériaux).
REMARQUE: Capturez les images à contraste de phase avec les barres d’échelle correspondantes et enregistrez-les au format TIFF. - Culture des cellules pendant 48 heures supplémentaires à 37 °C et 5 % de CO2. Capturez des images à contraste de phase à 24 h et 48 h en culture à l’aide du microscope à fluorescence tout-en-un.
- Fixer les cellules à 48 h avec 1 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % pendant 15 min à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C. Ensuite, lavez la vaisselle 3x pendant 5 minutes chacune avec 1 ml de PBS frais.
- Placer une lamelle de couverture avec un support de montage (voir le tableau des matériaux) pour une observation morphologique plus approfondie.
REMARQUE: Les plats peuvent être imagés immédiatement ou conservés jusqu’à 2 mois à 4 ° C. - Facultatif : Immunomarquer les cellules pour les protéines d’intérêt.
REMARQUE : Un protocole de détection du complexe d’adhésion focale (AF) à l’aide d’un anticorps monoclonal antivinculine dérivé de souris (voir le tableau des matériaux) est décrit ici à titre d’exemple.- Incuber les plats (à partir de l’étape 3.6) avec 0,5 mL de tampon bloquant (5% de sérum de chèvre normal dans PBS) pendant 60 min.
REMARQUE: Choisissez un tampon de blocage approprié pour l’anticorps primaire. Un tampon bloquant typique serait 5% de sérum normal de la même espèce que l’anticorps secondaire utilisé. - Préparer l’anticorps primaire dilué dans un tampon de dilution d’anticorps (1% de sérum de chèvre normal dans PBS). Incuber les plats avec 0,5 mL d’anticorps primaire dilué pendant une nuit à 4 °C.
REMARQUE: Choisissez le tampon de dilution d’anticorps approprié. En règle générale, l’anticorps est utilisé à une dilution de 1:50-1:200. - Rincer 3x pendant 5 min chacun avec 2 mL de PBS. Préparer l’anticorps secondaire anti-souris dérivé de chèvre dilué dans le tampon de dilution des anticorps (sérum de chèvre normal à 1% dans PBS). Incuber les boîtes avec 0,5 mL d’anticorps secondaire dilué pendant 1 à 3 h à température ambiante.
REMARQUE: En règle générale, l’anticorps secondaire est utilisé à une dilution de 1:500-1:1 000. DAPI peut être utilisé pour colorer les noyaux. - Rincer 3x avec 2 mL de PBS pendant 5 min à chaque fois. Placez le couvercle avec 50 μL de support de montage.
REMARQUE: Les antennes peuvent être imagées à l’aide du microscope à fluorescence tout-en-un avec un filtre GFP (excitation: 470/40, émission: 525/50) et un filtre TexasRed (excitation: 560/40, émission: 630/75) en mode monochrome avec des réglages haute résolution (gain à 6 dB, pas de rangement). Des lentilles objectives avec des grossissements de 4x à 20x ont été utilisées pour l’imagerie dans cette étude.
REMARQUE: La lame peut être conservée jusqu’à 2 mois à 4 ° C.
- Incuber les plats (à partir de l’étape 3.6) avec 0,5 mL de tampon bloquant (5% de sérum de chèvre normal dans PBS) pendant 60 min.
4. Analyse des données
- Ouvrez le logiciel ImageJ 1.51s. Dans la fenêtre ImageJ, sélectionnez Fichier > Ouvrir dans la barre de menus pour ouvrir le fichier image enregistré.
- Pour définir l’échelle de mesure, tracez une ligne de la même distance que la barre d’échelle. Accédez à Analyser > Définir l’échelle et saisissez la distance et les unités connues de la ligne dans les zones appropriées de la fenêtre Définir l’échelle .
- Tracez une ligne droite entre l’espace de cellule et appuyez sur Analyser > Mesure pour transférer les valeurs dans une fenêtre de données. Mesurer au moins cinq positions différentes dans chaque échantillon et faire la moyenne des distances pour obtenir les données représentatives de l’échantillon. Effectuer les analyses statistiques à l’aide d’un logiciel approprié (voir le tableau des matières).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Un essai de migration a été réalisé sur des substrats mixtes composés de Col1 et de HA de haut poids moléculaire (poids moléculaire moyen : 1 200-1 400 kDa) en utilisant le protocole décrit ici. On a constaté que les cellules O9-1 à la limite de l’écart migraient facilement dans l’espace riche en HA (figure 4). L’immunomarquage d’un marqueur de l’AF, la vinculine14, a confirmé que les cellules O9-1 formaient des adhérences focales (AF) aux sites de dégradation de l’AH (figure 5).
Figure 1 : Expression de TMEM2 dans les CCN. Coupes transversales du tube neural des embryons KI Tmem2-FLAGà E9.0. (A) Les coupes au niveau crânien et tronc du tube neural ont été marquées deux fois pour la protéine TMEM2-FLAG et HA. L’expression de TMEM2 a été observée dans la plaque neurale et la région frontalière du tube neural (pointes de flèches remplies), alors que ces sites étaient dépourvus de coloration HA (pointes de flèches ouvertes). (B) Double marquage des cellules de la crête neurale pour TMEM2-FLAG et Sox9. Des sections transversales du tube neural E9.0 ont été colorées pour TMEM2-FLAG et Sox9. Les CCN pré-migrateurs et émigrés positifs Sox9 au bord du tube neural expriment fortement TMEM2. Abréviation : nt = tube neural. Barres d’échelle: (A) 300 μm; B) 100 μm. Adapté avec la permission d’Inubushi et coll.9. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Dégradation de l’HA par TMEM2 dans les cellules O9-1. (A) Images représentatives de cellules O9-1 appauvries en Tmem2 et témoins cultivées sur une boîte de culture régulière (à gauche). (B) L’expression de Tmem2 dans ces cellules a été évaluée par qPCR, avec Gapdh comme contrôle interne pour la normalisation (graphique à barres). Les moyennes ± écart-type (n = 5) sont indiquées sous forme de barres horizontales. p < 0,001 par le test t de Student non apparié. Barre d’échelle, 5,0 μm. (C) Dosage de la hyaluronidase à base de cellules. Des cellules O9-1 appauvries en Tmem2 et témoins ont été cultivées pendant 48 heures sur des lamelles de verre recouvertes d’HA FLUORESCEINÉ (FA-HA). L’activité dégradante de l’HA se révèle sous forme de zones sombres dans le fond fluorescent. Le niveau de dégradation de l’HA a également été comparé quantitativement entre les cellules O9-1 appauvries en Tmem2 et les cellules témoins, tel que décrit dans Matériaux et méthodes (bargraphe). Les données représentent l’écart type moyen ± de l’intensité de fluorescence sous une cellule par rapport à celle de la zone sans cellules (n > 50 cellules par condition regroupées à partir de trois expériences indépendantes). p < 0,001 par le test t de Student non apparié. Adopté avec la permission d’Inubushi et al.9. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Dégradation de l’AH lié au substrat aux FA dans les cellules O9-1. Des tests de hyaluronidase à base de cellules ont été effectués pendant 16 heures et les cellules ont été colorées pour la vinculine. Dans les cellules O9-1 témoins, la dégradation de l’HA se produit dans les AF positifs à la vinculine. Dans les cellules O9-1 appauvries en Tmem2, la dégradation de l’HA et la formation d’AF sont grandement diminuées. Le nombre d’AF par cellule a été comparé quantitativement entre les cellules O9-1 appauvries en Tmem2 et les cellules témoins O9-1 (graphique à barres). Les données représentent la moyenne ± ET (n >30 cellules par condition regroupées à partir de trois expériences indépendantes). p < 0,001 par le test t de Student non apparié. Adopté avec la permission d’Inubushi et al.9. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Images représentatives de la migration des cellules O9-1 dans un espace sans cellules sur des substrats mixtes Col1/HA. (A) Le panneau supérieur montre les lacunes au début de l’expérience (Jour 0). Les panneaux inférieurs montrent des images d’écart après 24 h (Jour 1) ou 48 h (Jour 2) d’incubation. Barre d’échelle = 150 μm. (B) Graphique à barres montrant l’analyse quantitative de la migration cellulaire. Les données représentent la moyenne ± ET de la zone de trou couverte par les cellules migratoires par rapport à la surface de l’écart initial (n = 5 par condition). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 par test t de Student non apparié. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Dégradation de l’HA dans les substrats mixtes Col1/HA au niveau des FA dans les cellules O9-1. Les cellules O9-1 cultivées sur des substrats mixtes constitués de Col1/HA ont été immunomarquées avec des anticorps anti-vinculine (rouge). Les taches/stries sombres représentent l’activité de dégradation de l’AH dans le substrat FAHA-H2 (vert). Les sites de dégradation de l’HA et d’adhérences focales (vinculine) ont été colocalisés sur les substrats mixtes (pointes de flèches). Barre d’échelle = 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Diverses composantes de l’ECM régissent l’émigration et la migration des CCN. Par exemple, HA réglemente positivement la migration NCC 2,15. Fait intéressant, une étude basée sur des modèles génétiques murins de Tmem2, une hyaluronidase de surface cellulaire, a élucidé la nécessité de la dégradation de l’HA dans la migration NCC9. Les collagènes sont également abondants dans l’ECM entourant le tube neural16. Il a été démontré que la décorine, un petit protéoglycane riche en leucine, régule la migration des NCC au cours du développement neuronal17. D’autres composants de la MCE, dont la laminine et la fibronectine, influencent l’adhésion et la migration des NCC18. Toutefois, les rôles précis des composantes ECM dans la migration de NCC sont encore inconnus.
Le modèle in vitro décrit ici vise à examiner le comportement des CCN migrateurs confrontés à une ECM riche en HA. Nous avons choisi des substrats 2D plutôt que 3D en raison des difficultés à préparer des gels composites collagène-HA avec des propriétés de gélification uniformes. Dans un système de culture 2D, les gradients spatiaux des concentrations de facteurs solubles et les rigidités des substrats de la matrice extracellulaire sont différents de ceux des tissus vivants19. De ce point de vue, un système de culture 3D présente de grands avantages et peut fournir des informations plus approfondies sur les mécanismes de migration cellulaire20,21. Dans ce contexte, la mise en place d’un système de dosage 3D est préférable, le cas échéant. Ce modèle expérimental in vitro peut être applicable à l’examen du comportement de migration NCC en réponse à divers composants ECM. Cela permettrait de mieux comprendre la base mécaniste de la migration NCC, qui régit la morphogenèse embryonnaire.
Les cellules O9-1 utilisées dans cette étude expriment de manière stable les marqueurs de cellules souches (CD44, Sca-1 et Bmi1) et les marqueurs de la crête neurale (AP-2a, Twist1, Sox9, Myc, Ets1, Dlx1, Dlx2, Crabp1, Epha2 et Itgb1). Dans des conditions de culture non différenciantes, les cellules O9-1 conservent des caractéristiques multipotentes semblables à celles des cellules souches. Les cellules O9-1 ont le potentiel de se différencier en plusieurs types de cellules, y compris les ostéoblastes, les chondrocytes, les cellules musculaires lisses et les cellules gliales dans des conditions de culture spécifiques12. Par conséquent, les cellules O9-1 sont un outil utile pour étudier les propriétés moléculaires de la migration et de la différenciation des NCC crâniens. Néanmoins, l’utilisation de CNC primaires (p. ex. provenant de tubes neuraux embryonnaires de poulet ou de souris) au lieu de cellules O9-1 fournira des données plus détaillées pour faciliter une meilleure compréhension de la nature de la migration des NCC.
Dans le test de migration basé sur la fermeture des plaies, le NCC proliférera également et l’augmentation du nombre de cellules contribuera également à l’expansion de la population cellulaire dans la zone de trou22. Pour minimiser la prolifération pendant le test de cicatrisation, la famine sérique est la méthode la plus courante au lieu d’utiliser des agents pharmacologiques23. Cependant, les effets de la famine sérique doivent être testés dans chaque type de cellule.
L’étape la plus critique de ce protocole consiste à ajouter le revêtement covalent de HA aux plats à fond de verre. Le traitement de surface du verre avec des réactifs de silane est utilisé pour l’analyse des adhérences focales aux substrats ECM24. Le triéthoxysilane est un composé organosilicié contenant de nombreux groupes aminés libres qui peuvent se lier à des groupes hydroxyles libres sur des surfaces de verre de silice25. Une technique a été développée et optimisée dans cette étude pour produire une fine couche de silane stable sur une surface de verre de silice en utilisant du triéthoxysilane. L’amine dans la surface de verre recouverte de triéthoxysilane peut lier les groupes carboxyle sur HA, immobilisant chimiquement HA sur la surface du verre8. Cependant, avec cette méthode, il n’est pas possible de lier d’autres substrats ECM à base de protéines à la surface du verre. Par conséquent, le glutaraldéhyde a été utilisé ici pour immobiliser chimiquement le collagène de type I par couplage d’amine à l’aldéhyde. Notamment, un revêtement HA inadéquat peut entraîner l’élimination du revêtement HA même sans digestion enzymatique (par exemple, par l’action de la force mécanique pendant l’adhésion et la migration cellulaires). Le revêtement avec des substrats ECM à la place du collagène de type I est possible, à condition que les substrats possèdent des groupes amine. Cependant, il peut exister des limitations dans le revêtement covalent de l’ECM sur des plats à fond de verre en raison des propriétés chimiques du substrat; Ainsi, des essais et des erreurs peuvent être nécessaires.
Bien qu’il ne s’agisse pas d’un modèle parfait pour imiter la migration NCC dans l’ECM riche en HA entourant le tube neural, cette expérience de migration in vitro peut être utile pour l’analyse fonctionnelle des molécules impliquées dans la migration in vivo de NCC. En outre, ce test in vitro peut être utile pour le criblage de médicaments thérapeutiques afin d’accélérer ou de prévenir la dégradation de l’HA, ainsi que la migration d’autres types de cellules, y compris les fibroblastes cutanés et les kératinocytes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
L’auteur déclare qu’il n’existe pas d’intérêts concurrents.
Acknowledgments
J’exprime ma grande gratitude à Fumitoshi Irie et Yu Yamaguchi pour leurs encouragements et leurs aimables suggestions dans l’établissement de cette méthode. Ce travail a été soutenu par des subventions pour des programmes de recherche scientifique de la Société japonaise pour la promotion de la science (#19KK0232 à T.I., #20H03896 à T.I.). La méthode originale pour le revêtement de l’AH sur des substrats de verre et les essais de dégradation in situ de l’AH sur les substrats ont été décrits dans Yamamoto et coll. (2017)8, tandis que la méthode de préparation de substrats mixtes HA/Col1 a été décrite dans Irie et coll. (2021)7.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10cm cell culture dish | CORNING | Cat. 353003 | |
| 1X PBS | Millipore | Cat. No. BSS-1005-B | |
| 2-well culture inserts | ibidi | Cat. No. 80209 | |
| Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG | Invitrogen | Cat. A21422 | Goat derived anti-mouse secondary antibody |
| automated cell counter | Bio-Rad | Cat. No. TC20 | |
| CELLBANKER | ZENOGEN PHARMA | Cat. 11910 | Cell freezing medium |
| collagen type I | Sigma | Cat. No. 08-115 | |
| Complete ES Cell Medium | Millipore | Cat. No. ES-101-B | |
| DAPI | Invitrogen | Cat. 10184322 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | Cat. 11971025 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | Cat. 10270106 | |
| fluorescence microscope | Keyence | Cat. No. BZ-X700 | |
| Fluoresent labelled HA | PG Research | FAHA-H2 | |
| Glas bottom dish | Iwaki | Cat. 11-0602 | |
| glutaldehyde | Sigma | Cat. No. G5882 | |
| Matrigel | Fisher | Cat. No. CB-40234 | The basement-membrane matrix |
| monoclonal anti-vinculin antibody | Sigma | Cat. No. V9264 | |
| mounting media | Dako | S3023 | |
| Normal goat serum | Fisher | Cat. 50062Z | |
| O9-1 cells | Millipore | Cat. No. SCC049 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | Cat. 158127 | |
| triethoxysilane | Sigma | Cat. No. 390143 | |
| trypsin-EDTA | Millipore | Cat. No. SM-2003-C |
References
- Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326 (2013).
- Casini, P., Nardi, I., Ori, M. Hyaluronan is required for cranial neural crest cells migration and craniofacial development. Developmental Dynamics. 241 (2), 294-302 (2012).
- Landolt, R. M., Vaughan, L., Winterhalter, K. H., Zimmermann, D. R. Versican is selectively expressed in embryonic tissues that act as barriers to neural crest cell migration and axon outgrowth. Development. 121 (8), 2303-2312 (1995).
- Camenisch, T. D., et al. Disruption of hyaluronan synthase-2 abrogates normal cardiac morphogenesis and hyaluronan-mediated transformation of epithelium to mesenchyme. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 349-360 (2000).
- Camenisch, T. D., Schroeder, J. A., Bradley, J., Klewer, S. E., McDonald, J. A. Heart-valve mesenchyme formation is dependent on hyaluronan-augmented activation of ErbB2-ErbB3 receptors. Nature Medicine. 8 (8), 850-855 (2002).
- Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
- Irie, F., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 regulates cell adhesion and migration via degradation of hyaluronan at focal adhesion sites. Journal of Biological Chemistry. 296, 100481 (2021).
- Yamamoto, H., et al. A mammalian homolog of the zebrafish transmembrane protein 2 (TMEM2) is the long-sought-after cell-surface hyaluronidase. Journal of Biological Chemistry. 292 (18), 7304-7313 (2017).
- Inubushi, T., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 plays an essential role in mouse neural crest cell development and survival. PLoS Genetics. 18 (7), 1009765 (2022).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
- Pijuan, J., et al. Cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Humphries, J. D., et al. Vinculin controls focal adhesion formation by direct interactions with talin and actin. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1043-1057 (2007).
- Perris, R., Perissinotto, D. Role of the extracellular matrix during neural crest cell migration. Mechanisms of Development. 95 (1-22), 3-21 (2000).
- Perris, R., et al. Spatial and temporal changes in the distribution of proteoglycans during avian neural crest development. Development. 111 (2), 583-599 (1991).
- Zagris, N., Gilipathi, K., Soulintzi, N., Konstantopoulos, K. Decorin developmental expression and function in the early avian embryo. The International Journal of Developmental Biology. 55 (6), 633-639 (2011).
- Perris, R., Paulsson, M., Bronner-Fraser, M. Molecular mechanisms of avian neural crest cell migration on fibronectin and laminin. Developmental Biology. 136 (1), 222-238 (1989).
- Chevalier, N. R., et al. How tissue mechanical properties affect enteric neural crest cell migration. Scientific Reports. 6, 20927 (2016).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion and Migration. 8 (5), 440-451 (2014).
- Davis, P. K., Ho, A., Dowdy, S. F. Biological methods for cell-cycle synchronization of mammalian cells. Biotechniques. 30 (6), 1322-1331 (2001).
- Wayner, E. A., Garcia-Pardo, A., Humphries, M. J., McDonald, J. A., Carter, W. G. Identification and characterization of the T lymphocyte adhesion receptor for an alternative cell attachment domain (CS-1) in plasma fibronectin. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1321-1330 (1989).
- Robert, G. A., et al. Molecular structure of 3-aminopropyltriethoxysilane layers formed on silanol-terminated silicon surfaces. The Journal of Physical Chemistry. 116 (10), 6289-6297 (2012).
