Summary
Le présent protocole décrit toutes les étapes essentielles à la réussite de la transplantation utérine (UTx) chez le rat. Le modèle chez le rat s’est avéré approprié pour promouvoir la mise en œuvre clinique de l’UTx; cependant, l’UTx du rat est une procédure très complexe nécessitant des instructions minutieuses.
Abstract
La transplantation utérine (UTx) est une nouvelle approche pour traiter les femmes atteintes d’infertilité utérine absolue (AUFI). On estime que 3 % à 5 % des femmes souffrent d’AUFI. Ces femmes ont été privées de la possibilité d’avoir des enfants jusqu’à l’avènement de l’UTx. L’application clinique de l’UTx a été motivée par des études expérimentales chez l’animal, et la première UTx réussie a été réalisée chez le rat. Compte tenu de leurs caractéristiques physiologiques, immunologiques, génétiques et reproductives, les rats constituent un système modèle approprié pour de telles greffes. En particulier, leur courte période de gestation est un avantage évident, car le critère d’évaluation habituel de l’UTx expérimentale est une grossesse réussie avec une naissance vivante. Le plus grand défi pour les modèles de rats reste la petite anatomie, qui nécessite des compétences et une expérience avancées en microchirurgie. Bien que l’UTx ait conduit à une grossesse en clinique, la procédure n’est pas établie et nécessite une optimisation expérimentale continue. Ici, un protocole détaillé est présenté, y compris le dépannage essentiel pour l’UTx du rat, ce qui devrait rendre l’ensemble de la procédure plus facile à comprendre pour ceux qui n’ont pas d’expérience dans ce type de microchirurgie.
Introduction
La transplantation utérine (UTx) est un nouveau traitement de l’infertilité absolue du facteur utérin (AUFI). L’AUFI résulte d’une absence (congénitale ou acquise) ou d’une malformation de l’utérus et touche 3% à 5% des femmes dans le monde1. Des raisons éthiques, juridiques ou religieuses excluent l’adoption ou la maternité de substitution pour de nombreuses femmes qui ont un désir de maternité mais souffrent d’AUFI2. Pour ces femmes, UTx reste la seule option pour fonder leur propre famille. UTx a été appliqué en clinique, bien qu’avec un succès mitigé; La procédure est techniquement difficile et nécessite une amélioration constante pour son établissement clinique.
En 2014, la première transplantation d’utérus à partir d’un donneur vivant (LD) - aboutissant à une grossesse réussie - a été réalisée par le groupe suédois pionnier de Brännström3. La première naissance après UTx d’un donneur décédé (DD) a été signalée en 2016 au Brésil4. En 2021, plus de 80 UTxs ont été réalisées dans le monde, mais avec un taux de réussite d’environ 50% et avec des greffes provenant de ML pour la majorité1.
Bien qu’elle ne sauve pas des vies, UTx est une procédure de plus en plus populaire pour satisfaire les désirs de sa propre progéniture. En tant que tel, la demande de greffons augmente, plaçant le don DD dans une priorité future. Cependant, le don de DD est compliqué en raison d’expositions ischémiques considérablement plus longues au froid (et dans le cas d’une mort cardiaque, également chaudes), ce qui augmente les risques de dysfonctionnement et de rejetdu greffon 5,6. La technique chirurgicale, l’appariement exigeant de la compatibilité et l’immunosuppression associée restent des problèmes critiques concernant les résultats UTx7.
Pour gérer les risques ci-dessus en clinique, des modèles animaux appropriés pour l’exploration de l’ischémie et de l’immunosuppression sont nécessaires. Le critère d’évaluation le plus cliniquement pertinent pour les modèles animaux reste la réussite de la naissance; à ce jour, des grossesses après UTx expérimentales ont été réalisées chez des souris, des rats, des moutons, des lapins et des singes cynomolgus8. Alors que les gros animaux sont prédestinés à acquérir et à optimiser les techniques chirurgicales, les rongeurs présentent l’avantage distinct de courtes périodes de gestation. Par conséquent, les modèles de rongeurs sont supérieurs en ce qui concerne les considérations pratiques, financières et éthiques9. Cependant, le principal défi de l’UTx chez la souris est la petite anatomie, avec la chirurgie très exigeante liée à la faible reproductibilité de l’UTx10 murine. En revanche, les rats sont plus accessibles chirurgicalement et conservent les avantages de temps de gestation courts. En tant que tel, le rat est devenu le modèle de choix pour UTx9. Wranning et al. ont introduit le modèle de rat d’UTx orthotopique en 2008, et en utilisant ce modèle, la première naissance vivante après UTx et l’accouplement naturel a étésignalée 11,12,13. Des études ultérieures ont apporté des contributions essentielles à la mise en œuvre de l’UTx chez l’homme9.
Néanmoins, UTx reste difficile chez les rats, et seuls quelques groupes ont encore maîtrisé cette technique chirurgicale. Un obstacle pertinent à la propagation de l’UTx chez le rat parmi les chercheurs est l’absence d’une description précise des étapes microchirurgicales individuelles, des pièges et des mesures correspondantes pour le dépannage14. Ce protocole vise à fournir un guide détaillé pour cette procédure microchirurgicale très complexe afin de faciliter la mise en œuvre de ce modèle animal dans les recherches futures.
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Protocol
Toutes les expérimentations sur les animaux ont été réalisées conformément à la réglementation fédérale sur les animaux et approuvées par l’Office vétérinaire de Zurich (n° 225/2019), garantissant les soins aux humains. Des rats Lewis vierges femelles (poids corporel de 170 à 200 g) et des rats bruns bruns femelles (170 à 200 g) ont été utilisés comme donneuses/receveuses d’utérus, tandis que des rats Lewis mâles (300 à 320 g) ont été utilisés pour l’accouplement. Les rats étaient âgés de 12 à 15 mois. Les animaux provenaient de sources commerciales (voir le tableau des matériaux) et étaient logés dans des conditions contrôlées et dans un environnement enrichi avec un accès gratuit à l’eau et à de la nourriture standard.
1. Prélèvement de l’utérus
NOTE: Pour plus de détails sur la procédure, veuillez consulter les rapports 12,13,15 publiés précédemment.
- Induire l’anesthésie avec de l’isoflurane et de l’oxygène dans un récipient en plexiglas fermé (14 cm x 25 cm x 13 cm) pendant 1-2 min (isoflurane à 5 % en volume dans O2).
- Administrer la buprénorphine par voie sous-cutanée (0,05 mg/kg) et la bupivacaïne (0,5 %, 8 mg/kg) par voie sous-cutanée dans la région de l’incision abdominale prévue 30 minutes avant la chirurgie.
- Rasez toute la peau abdominale du rat avec un rasoir électrique.
- Utilisez des rubans adhésifs pour maintenir l’animal fixé sur une plaque chauffante pendant la chirurgie. Appliquez une pommade pour les yeux sur les deux yeux.
- Maintenir l’anesthésie pendant la procédure avec 2-4% vol% isoflurane dans l’oxygène par administration continue à travers un petit cône nasal.
- Surveiller la profondeur de l’anesthésie à l’aide de paramètres cliniques sans outils spécialisés (fréquence respiratoire de ~70-120/min-une baisse lente du taux de 50 % est acceptable pendant l’anesthésie; vérification de la profondeur de l’anesthésie avec pincement des orteils; la couleur des muqueuses doit être rose, et non bleue ou grise)16, et ajuster la concentration d’isoflurane en conséquence.
REMARQUE: Facultatif: une surveillance respiratoire fréquente pendant la chirurgie est possible avec l’aide d’un assistant. - Confirmez la profondeur de l’anesthésie en effectuant un pincement de l’orteil.
- Nettoyez la peau abdominale dans un mouvement circulaire avec trois écouvillons alternés d’une solution antiseptique et d’alcool à 70%. Laisser sécher.
- Placez un champ stérile (voir le tableau des matières) avec une fenêtre abdominale au-dessus de l’animal.
- Effectuer une laparotomie médiane.
- Ouvrez l’abdomen par une longue incision médiane de 6 à 8 cm, en commençant à 0,5 cm sous le xiphisternum vers l’hypogastrium. Utilisez un scalpel n ° 10 pour l’incision cutanée et de petits ciseaux tranchants pour l’incision linea alba. N’endommagez pas le foie ou la vessie.
- Déplacez les intestins à l’extérieur de la cavité abdominale à l’aide de coton-tiges, couvrez-les doucement d’une gaze humidifiée avec une solution saline stérile et protégez-les avec un sac en plastique stérile pour une meilleure isolation.
- Insérez des rétracteurs ou des clips (voir le tableau des matières) dans les dossiers des parois abdominales gauche et droite pour garder le muscle péritonéal de côté et l’abdomen ouvert, afin d’obtenir un accès et une visibilité optimaux de l’utérus et des vaisseaux associés. Fixez les clips/rétracteurs avec des rubans.
- Appliquez une solution saline préchauffée pour garder la zone chirurgicale et les intestins humides et éviter le dessèchement des viscères.
- Récoltez la corne utérine droite avec la cavité utérine et le col de l’utérus communs ainsi que les pédicules vasculaires, y compris les vaisseaux utérins, internes et iliaques droits.
- Ligate (polyglactine 4/0; voir le tableau des matériaux), cautériser et sectionner la corne utérine gauche adjacente à la ramification de la cavité utérine commune.
- Enlevez l’excès de graisse entourant l’utérus et le vagin.
REMARQUE: Gardez la graisse autour du système utérin-vasculaire. - Disséquer la vessie à sa fixation au col de l’utérus avec cautérisation de tous les vaisseaux de la vessie drainant et nourrissant. Pendant la cautérisation, maintenez une distance adéquate entre le col de l’utérus et le vagin pour éviter une cautérisation inutile sur ces deux structures. Sinon, le risque de nécrose du greffon augmente.
REMARQUE: La plupart des manipulations chirurgicales devraient affecter la vessie. Rétractez ou tirez la vessie caudale à l’aide d’une pince vasculaire (voir le tableau des matériaux) pour obtenir une meilleure vue de l’excavatio vesicouterina. - Cautériser et sectionner les vaisseaux utérins descendants au niveau de l’uretère aussi distal que possible au col de l’utérus.
REMARQUE: Maintenez la microcirculation autour du vagin et du col de l’utérus autant que possible pendant la division. - Séparer la partie cervicale / vaginale du futur greffon de l’attache rectale et des ligaments paravaginaux et paracervicaux.
NOTE: Évitez toute cautérisation sur le vagin greffé. - Disséquez soigneusement le vagin par diathermie autour de 2-3 mm caudale du col de l’utérus.
REMARQUE: Aucune villosité (col de l’utérus) n’est visible à l’intérieur de la lumière vaginale. - Localisez à la fois l’artère utérine et la veine à leurs origines. Ligate (polyamide 8/0; voir le tableau des matériaux), cautériser et sectionner les vaisseaux fessiers et tous les vaisseaux caudales des vaisseaux utérins.
REMARQUE: La ligature directe de la veine caudale iliaque commune à la veine utérine est généralement possible. - Par dissection contondante, libérer les vaisseaux iliaques communs les uns des autres, de la bifurcation de l’aorte et de la veine cave jusqu’à la division des vaisseaux utérins.
REMARQUE: On peut obtenir un meilleur accès chirurgical à la région en enlevant un ou deux ganglions lymphatiques adjacents. - Extrayez la corne utérine droite à 3 mm de la trompe de Fallope, après cautérisation du pédicule utéro-ovarien au même niveau. Cela permet l’anastomose de la corne utérine greffée à la partie supérieure de la corne utérine receveuse.
- Placez des ligatures (polyamide 8/0) directement autour de l’artère iliaque commune droite et de la veine, à proximité des bifurcations aortique et cavale. Faites une petite incision (0,5-1 mm) dans l’artère iliaque commune droite adjacente à la bifurcation, et insérez une aiguille courbée et émoussée de 30 G ou une aiguille droite et émoussée de 25 G dans la lumière (pour rincer). Fixez-le avec une ligature (polyamide 6/0).
REMARQUE: Une autre option est la fixation supplémentaire avec une pince bulldog pour éviter le déplacement de l’aiguille et / ou du vaisseau. - Disséquer la veine iliaque commune caudale de la ligature au niveau de la veine iliaque commune droite pour permettre l’écoulement pendant le rinçage.
- Rincez la greffe en suivant les étapes ci-dessous.
- Rincer l’utérus manuellement à l’aide de seringues de 3 mL avec environ 9 mL de solution froide de Ringer (RHX : Ringer supplémenté avec 50 UI/mL d’héparine et 0,4 mg/mL de xylazine) à un débit de 6 mL/min. Rincer de nouveau avec 6 mL de solution de préservation d’organes additionnée d’héparine (50 UI/mL) et de xylazine (0,4 mg/mL) (voir le tableau des matières).
REMARQUE: Évitez la pression de rinçage élevée et assurez-vous que l’aiguille est bien placée. - Retirez la greffe lorsque le tissu utérin est devenu pâle. Couper l’artère iliaque commune caudale de la ligature à la bifurcation de l’aorte abdominale.
- Rincer l’utérus manuellement à l’aide de seringues de 3 mL avec environ 9 mL de solution froide de Ringer (RHX : Ringer supplémenté avec 50 UI/mL d’héparine et 0,4 mg/mL de xylazine) à un débit de 6 mL/min. Rincer de nouveau avec 6 mL de solution de préservation d’organes additionnée d’héparine (50 UI/mL) et de xylazine (0,4 mg/mL) (voir le tableau des matières).
- Placer la greffe dans une solution de préservation d’organes réfrigérée (4 °C) pour la préparation et le stockage avant la transplantation.
- Après avoir retiré le greffon, euthanasier l’animal en tournant d’abord le réglage d’isoflurane au maximum, puis en provoquant un pneumothorax bilatéral suivi d’une exsanguination17.
2. Transplantation d’utérus syngénique
NOTE: Pour plus de détails sur la procédure, veuillez consulter les rapports 12,13,15 publiés précédemment.
- Induire l’anesthésie et préparer l’animal comme mentionné à l’étape 1.1.
- Administrer une analgésie efficace (telle que décrite à l’étape 1.1.1) et 200 UI/kg d’héparine de haut poids moléculaire 30 minutes avant la chirurgie.
- Effectuer une laparotomie médiane.
- Ouvrez l’abdomen par une incision médiane de 6 à 8 cm de long commençant à 0,5 cm sous le xiphisternum vers l’hypogastrium. Utilisez un scalpel n ° 10 pour l’incision cutanée et de petits ciseaux tranchants pour l’incision linea alba. N’endommagez pas le foie et la vessie.
- Déplacez l’intestin grêle à l’extérieur de la cavité abdominale à l’aide de coton-tiges, enveloppez-les d’une gaze stérile humidifiée et recouvrez-les d’un sac en plastique stérile pour une meilleure isolation.
- Insérez des rétracteurs ou des clips dans les dossiers des parois abdominales gauche et droite pour garder le muscle péritonéal de côté et l’abdomen ouvert, afin d’obtenir un accès et une visibilité optimaux de l’utérus et des vaisseaux associés. Fixez les clips/rétracteurs avec des rubans.
- Appliquez une solution saline préchauffée pour garder la zone chirurgicale et les intestins humides et éviter le dessèchement des viscères.
- Effectuer une hystérectomie avec dissection et mobilisation du tiers supérieur du vagin du rectum et de la vessie.
- Cautériser la microvascularisation autour de l’utérus, du col de l’utérus et du vagin. Coupez et séparez l’utérus des structures environnantes proches de l’organe pour protéger la microcirculation du sinistre utérus.
- Enlevez le tissu adipeux de l’environnement.
- Amputer la corne gauche par cautérisation. Sur le côté droit, conservez un segment de 7-8 mm de la partie supérieure de l’utérus pour une anastomose ultérieure à la greffe utérine.
- Effectuer une greffe d’utérus.
- Mobiliser et séparer les vaisseaux iliaques communs droits, de l’origine des vaisseaux utérins jusqu’à la bifurcation aortique/cavale.
- Positionnez le greffon dans la cavité abdominale. Enveloppez le greffon dans une gaze imbibée d’une solution froide de préservation d’organes.
REMARQUE: Le greffon doit être conservé au froid pendant l’anastomose. - Placez des pinces vasculaires atraumatiques sur la veine iliaque commune droite de chaque côté, encadrant le futur site d’anastomose.
REMARQUE : Abaisser l’anesthésie à 1-1,5 vol% d’isoflurane pour s’adapter à la diminution soudaine de la précharge cardiaque et à l’hypotension qui en résulte. - Couper une fente légèrement plus grande que l’ouverture de la veine du greffon dans la veine iliaque commune.
- Positionnez la veine du greffon.
- Placer une suture de hauban (polyamide 10/0; voir le tableau des matériaux) dans chaque coin de la fente de la veine iliaque commune droite.
REMARQUE: Gardez le nœud de suture au coin caudale lâche pour un meilleur ajustement et pour éviter les effets de corde de bourse. - Rincer régulièrement la zone d’anastomose avec RHX refroidi pendant la procédure pour prévenir les thromboses.
- Anastomose un côté de la veine du greffon à la veine du receveur avec six à huit boucles d’une suture continue (Figure 1).
REMARQUE: Commencez par la suture du hauban crânien (polyamide 10/0) et anastomose d’abord la partie entrante des vaisseaux. - Anastomose l’autre côté du navire de la même manière, cette fois en commençant par l’extérieur.
- Nouez un nœud à la suture du hauban crânien, puis un autre à la suture caudale (polyamide 10/0), après avoir terminé les anastomoses des deux côtés.
REMARQUE: Serrez les sutures continues autant que nécessaire pour éviter les effets de cordon de la bourse. - Placez des pinces vasculaires atraumatiques sur l’artère iliaque commune droite de chaque côté, encadrant le futur site d’anastomose.
- Effectuer l’anastomose artérielle (artère iliaque commune droite [RCIA] via 8-10 boucles en utilisant des sutures interrompues (polyamide 10/0).
NOTE: Les sutures interrompues sont plus faciles à contrôler que les sutures continues (facultatives avec la technique « bouche de poisson »)18. Un rinçage constant de la zone d’anastomose avec RHX refroidi pendant la procédure aide à prévenir les thromboses. Lorsque vous utilisez des sutures continues, effectuez cette étape analogue à l’anastomose veineuse.
- Effectuer la reperfusion du greffon.
- Lorsque les deux sites d’anastomose apparaissent patentés et que tout saignement est arrêté, relâchez les pinces vasculaires sur les vaisseaux du greffon (Figure 2).
- Inspectez le greffon pour détecter des signes de reperfusion, tels que rougissement, remplissage de la veine ou pulsation dans l’artère du greffon.
- Reliez la brassard vaginal de la greffe à la voûte vaginale de la receveuse en utilisant six à sept sutures interrompues intraluminales (polyglactine 6/0).
REMARQUE: Commencez par une seule suture à la position 12 heures en premier, et placez les suivantes aux positions 10 et 1 heures. Les deux sutures aux positions 9 et 3 heures doivent être attachées après les sutures de la première rangée19,20. - Anastomose la corne utérine greffée bout à bout au segment utérin crânien restant de l’utérus receveur en utilisant cinq à sept sutures interrompues (polyamide 7/0).
REMARQUE: Ne coudez pas à travers la lumière.
- Fermez l’abdomen avec une suture continue. Utilisez du polyglactin 4/0 pour suturer la couche musculaire et du polyamide 6/0 ou des clips de plaie chirurgicale pour la peau.
- Laissez l’animal récupérer dans une cage chauffée une fois la greffe terminée. Restez avec l’animal jusqu’à ce qu’il ait retrouvé sa capacité de couchage sternale et maintenez un logement unique jusqu’à son rétablissement complet. Fournir un traitement analgésique psotopertaïf en administrant par voie sous-cutanée de la buprénorphine (0,05 mg / kg) et des AINS appropriés, mais pas avant 4 à 8 heures après la première dose d’anesthésie. Fournir en continu de la buprénorphine dans l’eau potable (1 mg/kg, voie orale, 5 mL de buprénorphine dans 160 mL d’eau potable (0,3 mg/mL)) pendant trois jours après la chirurgie.
- La suture de la peau est retirée 10-14 jours après la chirurgie.
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Representative Results
Les résultats de deux groupes de rats sont présentés. UTx a été effectué avant (groupe 1, n = 8) et après (groupe 2, n = 8) ajustement du protocole (tableau 1) pour démontrer les effets de nos modifications (voir la discussion pour une explication de nos modifications)12,15,21.
Le résultat de l’UTx du rat est associé à trois phases clés. La première phase est la récupération réussie d’UTx. Habituellement, les receveurs doivent se rétablir dans les 2 premiers jours postopératoires. La deuxième phase concerne l’état de santé du greffon 2 semaines après la chirurgie, qui décide de l’inclusion dans le processus d’accouplement (tableau 2). La troisième phase implique un accouplement spontané suivi d’une naissance réussie comme preuve de fertilité.
Tous les animaux des deux groupes se sont rétablis sans incident après la chirurgie. Au cours de la deuxième phase, quatre animaux ont été exclus du groupe 1 et deux du groupe 2. L’exclusion était due à la thrombose du greffon et à l’abcès (n = 4 pour le groupe 1, n = 2 pour le groupe 2) et à l’anastomose utéro-utérine rétrécie/malformée (en plus pour n = 1, groupe 1) à l’examen lors de la relaparotomie (tableau 2). La laparotomie (le long de la cicatrice de la laparotomie originale) a été réalisée pour toutes les femelles 2 semaines après la transplantation, car l’apparence physique des animaux avait peu de valeur en tant qu’indicateur de la santé du greffon. Dans l’ensemble, le taux de survie du greffon à 2 semaines était de 50 % et de 75 % pour les groupes 1 et 2, respectivement (tableau 3).
Au cours de la phase 3, quatre femelles du groupe 1 ont été appariées pour l’accouplement avec des mâles Lewis, environ 9 semaines après UTx. Deux femelles présentaient des signes de gestation (augmentation du poids corporel, figure 3; comportement de nidification); cependant, aucune naissance vivante n’a été observée. Après deux cycles d’accouplement de trois femelles, des parties du corps des petits (os et tissus) ont été trouvées chez un rat femelle (°1). L’examen histologique des coupes de tissus colorés à l’hématoxyline et à l’éosine par un pathologiste vétérinaire a révélé que ces petits se développaient jusqu’à la parturition (figures 4 et 5).
Six femelles du groupe 2 ont été accouplées avec des mâles Lewis (voir la figure 6 pour les changements de poids corporel). Trois des six rats (deux rats Lewis et un rat brun brun) ont donné naissance à des petits, tandis que deux autres ont montré des signes de grossesse. La première portée de la femelle rat Lewis # 1 était composée de deux petits (figure 7). Peu de temps après la naissance, la femelle Lewis est retombée enceinte; toutefois, seulement deux des trois petits ont survécu après la naissance (figure 8). Une explication probable du décès est l’infanticide, car il se produit même avec des chiots en bonne santé dans des conditions de stress post-partum. De même, la femelle brun de Norvège a donné naissance deux fois, chaque fois à quatre petits par cycle d’accouplement (figure 9). Le plus grand nombre de portées du groupe 2 a été mis au monde par une autre femelle Lewis # 3, avec sept petits après le premier cycle d’accouplement. Tous les petits survivants ont affiché un développement normal (figure 10).
Dans l’ensemble, l’adaptation du protocole a augmenté la survie du greffon à 2 semaines de 50% à 75%. Cinq femmes sur six sont tombées enceintes, comparativement à deux sur quatre du groupe 1. De même, trois femelles sur six ont donné naissance à des petits vivants, comparativement à zéro sur quatre des quatre femelles du groupe 1. En conclusion, le protocole adapté a amélioré à la fois les résultats chirurgicaux directs et le taux de naissances vivantes réussies après une UTx (Tableau 4 et Figure 6).
Figure 1 : Anastomose du greffon et de la veine du receveur. La veine iliaque commune droite (RCIV) du greffon est reliée au RCIV du receveur par anastomose de bout en bout (étape 2.4). ARCI = artère iliaque commune droite Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Anastomose du greffon et de l’artère receveuse. L’artère iliaque commune droite (ARCI) est reliée à l’ARCI du receveur par anastomose de bout en bout (étape 2.4). Après avoir ouvert les deux pinces vasculaires (2.5), l’artère doit être complètement perfusée en l’absence de saignement externe. Flèche noire: greffe RCIA; flèche rouge: greffe RCIV. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Changements de poids corporel après l’accouplement des femelles du groupe 1. Surveillance du poids corporel des quatre femelles du groupe 1 qui ont présenté une greffe intacte lors de la relaparotomie. Un animal (°1) a été euthanasié lors d’une césarienne pour inspecter l’utérus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Examen histologique de l’utérus du rat du groupe 1 avec des petits morts. Des parties du corps des petits ont été trouvées chez le rat°1. L’examen a révélé un utérus vital et dilaté, suggérant que les chiots se sont développés normalement mais n’ont pas pu être mis au monde. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Parties du corps du chiot à l’intérieur de l’utérus du rat du groupe 1°1. Le stade de développement des os correspondait à celui des petits à terme. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Surveillance du poids corporel des six femmes du groupe 2 qui ont présenté une greffe intacte lors de la relaparotomie. Les étoiles vertes marquent les événements de naissance individuels. Les numéros de hashtag font référence aux femmes individuelles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Première naissance vivante après l’UTx du rat suivant le protocole modifié. Deux rats nouveau-nés et leur mère (tête à droite; Lewis femelle #1, groupe 2). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : La deuxième portée après le deuxième cycle d’accouplement après l’UTx du rat suivant le protocole modifié. La femelle #1 (groupe 2) a donné naissance à trois petits, dont deux ont survécu. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 9 : Première portée du rat brun brun après UTx suivant le protocole modifié. Après le premier cycle d’accouplement, le rat brun de Norvège (#2, groupe 2) a donné naissance à quatre petits, suivis de quatre autres après le deuxième cycle d’accouplement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 10 : Développement des petits. Tous les chiots survivants ont montré un développement normal à l’âge de 3 semaines. Un exemple représentatif est présenté. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 11 : Formation du bouchon vaginal après un accouplement réussi. Des bouchons blancs devraient se former pour couvrir le vagin après la fécondation afin d’empêcher un accouplement ultérieur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Groupe 1 | Groupe 2 | UTx syngénique chez le rat | UTx allogénique chez le rat | |
| avant modification | après modification | Voir réf. 12 | Voir réf. 15 | |
| Nombre total d’animaux | 8 | 8 | 27 | 14 |
| Survie du greffon de deux semaines | 4/8 (50%) | 6/8 (75%) | 19/27 (70%) | 9/14 (64%) |
| Nombre de femelles accouplées | 4/4 (100%) | 6/6 (100%) | 17/19 (89%) | 9/9 (100%) |
| Grossesse à terme | 1/4 (25%) | 5/6 (83%) | 11/17(65%) | 5/9 (56%) |
| Litière livrée avec succès | 0 | 5A/TD> | 1 | 5 |
| Nombre total de chiots vivants | 0 | 20b | 3c | 25jours |
| De la grossesse à terme sans naissance vivante | 1 | 1e | 10 | 2 |
Tableau 1 : Comparaison des résultats du protocole modifié et non modifié pour l’UTx chez le rat. a: Deux grossesses par le même rat; b: Y compris le chiot infanticide; c : médiane; d : Somme de la médiane/livraison; e: Les petits morts en phase de résorption après trois cycles d’accouplement.
| Milieux chirurgicaux | Groupe 1 (n = 8) | Groupe 2 (n = 8) |
| Phase de projet | Phase initiale | stade avancé |
| Temps de stockage frigorifique | 2-3 h | 2-3 h |
| Solution de rinçage pendant l’anastomose | L’humidité relative | RHX |
| Anastomose vaginale | 6/0 Ethilon | 6/0 Vicryl |
| Anastomose de la corne utérine | suture partiellement continue | suture interrompue |
| Arteria anastomose | suture continue | Interrompu et continu |
| Micro-vascularisation autour du vagin et du col de l’utérus | cautérisation près du tissu vaginal/cervical | cautérisation plus distale |
Tableau 2 : Milieux chirurgicaux du groupe 1 par rapport au groupe 2.
| Critères d’exclusion# |
| Signes de thrombose (en particulier autour des anastomoses) |
| Adhérence majeure |
| Utérus rétréci |
| Signes d’infection |
| Nécrose du greffon |
Tableau 3 : Critères d’exclusion pour l’accouplement. #Applied à la relaparotomie 2 semaines après UTx.
| n (groupe 1) | n (groupe 2) | |
| Animaux | 8 | 8 |
| Greffe saine après 2 semaines | 4 | 6 |
| Accouplé | 4 | 6 |
| Grossesse à terme | 1 | 5 |
| Litière livrée avec succès | 0 | 5a |
| Nombre total de chiots vivants | 0 | 20b |
| De la grossesse à terme, pas de la naissance vivante | 1 | 0 |
Tableau 4 : Résultats du groupe 1 par rapport au groupe 2. a: Deux grossesses consécutives chez le même rat; b: Y compris le chiot tué par infanticide.
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Discussion
Le protocole présenté ici offre des instructions détaillées pour l’approche chirurgicale derrière la transplantation d’utérus chez le rat. Le protocole a été optimisé pour augmenter les chances de naissances vivantes après UTx et l’accouplement ultérieur. Le protocole original a été repris du groupe Brännström 12,13, inspiré par le travail sur la souris d’Akouri et al.10, et modifié en fonction des expériences des auteurs au cours des dernières années. En tant que telles, les modifications ont été motivées par de véritables courbes d’apprentissage reflétant le développement des greffes ratées à des résultats reproductibles.
Les principales modifications qui sont probablement décisives étaient: (1) l’ajout de xylazine à la solution de rinçage pendant le prélèvement d’organes et l’anastomose, ce qui a stimulé la vasodilatation conduisant à une réduction des risques thrombotiques. (2) L’utilisation de sutures interrompues pour l’anastomose artérielle de bout en bout. Les sutures interrompues augmentent non seulement le contrôle chirurgical de la perméabilité et évitent les effets de corde de la bourse, mais permettent également l’élargissement ultérieur de la zone anastomotique pour augmenter le flux sanguin dans l’artère utérine. (3) L’application de sutures interrompues et non résorbables pour l’anastomose de la corne utérine avec des points de suture uniquement dans la couche du périmètre; Cette modification empêche la constriction de la paroi de l’utérus, ce qui peut entraver la fécondation ultérieure. (4) L’utilisation de matériel de suture résorbable pour l’anastomose vaginale réduit le risque de sténose vaginale et augmente ainsi les chances de naissances vivantes. (5) Effectuer toute manipulation chirurgicale aussi loin que possible du vagin et du col de l’utérus est une étape cruciale pour éviter les cicatrices vaginales et augmenter les chances de naissances vivantes. (6) La ligature directe de la veine iliaque commune droite et de l’artère au lieu de ligaturer la veine cave, l’aorte abdominale et l’artère de la veine iliaque commune gauche. La ligature directe caudale de la veine utérine est, dans la plupart des cas, réalisable; La ligature directe simplifie l’obtention d’organes et raccourcit les temps chirurgicaux sans impact négatif sur les résultats de la transplantation. (7) Il est également crucial d’abaisser la concentration d’isoflurane à 1 %-1,5 % vol. juste après le serrage de la veine iliaque commune (étape 2.4.3), sinon la mort cardiaque pourrait survenir.
Les points ci-dessus sont les principaux éléments qui distinguent le présent protocole de l’approche peut-être la plus largement utilisée décrite par le groupe suédois10,12,13. Ces mesures ont bénéficié au critère d’évaluation ultime de l’UTx, la naissance vivante, comme en témoigne la comparaison entre les groupes (protocole original vs protocole modifié; voir le tableau 1). De toute évidence, la courbe d’apprentissage chirurgical au fil du temps a également contribué à de meilleurs résultats; cependant, sa contribution est difficile à estimer.
En plus d’une technique chirurgicale méticuleuse, les soins postopératoires aux receveurs sont également cruciaux pour le résultat final. Les traitements postopératoires suivent le protocole local respectif; Les instructions ici recommandent 0,05 mg / kg de buprénorphine après le réveil du receveur de l’anesthésie, et pendant le premier jour postopératoire si vous présentez une douleur telle que définie par notre évaluation de notation. Les critères de notation sont basés sur le comportement (activité, respiration, pelage, posture, plaie) et le poids corporel. Immédiatement après la chirurgie, les signes positifs de récupération sont un retour de la coloration rose des extrémités et des oreilles, ainsi qu’un retour de la coloration rouge des yeux. Compte tenu de la durée de la procédure de transplantation, une surveillance régulière pendant les 3 premières heures suivant la transplantation est essentielle. Si les critères d’évaluation ne sont pas respectés pendant ces 3 heures, l’animal est euthanasié pour éviter d’autres souffrances. La surveillance est poursuivie trois fois par jour pendant les 3 premiers jours postopératoires. Si l’animal ne se rétablit pas complètement pendant les 2 premiers jours, il est euthanasié. Selon son état, l’animal reste dans un seul logement pendant 2-3 jours après la chirurgie.
Les conditions stériles pendant la chirurgie sont encore un autre aspect pertinent pour les résultats positifs. Une routine d’hygiène stricte est obligatoire pour minimiser les risques d’infection. Lorsque vous entrez dans l’animalerie, les mains doivent être soigneusement lavées avant de s’habiller avec une combinaison propre, un masque facial, des gants et une casquette. Toute la zone chirurgicale est désinfectée avec un écouvillon spécial contenant du chlorure de benzyl-C12-18-alkyldiméthylammonium, du chlorure de didécyldiméthylammonium et du glutaraldéhyde. Une désinfection supplémentaire avec de l’éthanol à 70% suit. Avant chaque manipulation chirurgicale, les gants sont brièvement nettoyés avec de l’éthanol à 70% et la zone entourant le site chirurgical est recouverte d’un champ stérile. Ces mesures aident grandement à minimiser les risques d’infection.
Un problème avec le succès de la progéniture est la difficulté de surveiller la grossesse réelle. L’augmentation du poids corporel peut être révélatrice d’une grossesse, mais peut aussi être due à l’infanticide et ne reflète généralement pas de manière fiable l’état de la femme. Par exemple, seuls des changements de poids modestes dans l’ensemble étaient apparents pour le groupe 1 au cours de la surveillance. Les animaux 3 et 4 ont montré des augmentations de poids similaires au cours des deux cycles d’accouplement, mais seul l’animal 4 était enceinte lors de la relaparotomie (Figure 3 et Figure 4). De plus, la perte de poids après le premier cycle d’accouplement avec l’absence de naissance peut indiquer une absorption de la grossesse. Bien qu’on ne sache toujours pas pourquoi l’absorption tissulaire entraîne une perte de poids, ce phénomène a été observé à plusieurs reprises chez les rats receveurs d’UTx12. La formation de bouchons vaginaux après un accouplement réussi (figure 11) était également souvent absente et n’a pas montré de corrélation avec les changements ultérieurs de poids corporel. Compte tenu de la faible valeur du marquage de la gestation, la fréquence de surveillance du poids corporel a été réduite pour le groupe 2 afin de minimiser l’exposition au stress des animaux. Une autre conséquence de la présence incohérente du bouchon et des changements de poids était une définition peu fiable du temps de conception. Les dates d’accouchement ont donc été calculées en utilisant le 2e jour suivant l’exposition masculinecomme jour de la conception. Il est intéressant de noter que les changements de poids corporel dans le groupe 2 étaient relativement bien corrélés avec le cours de la grossesse, l’accouchement étant marqué par une nette perte de poids (Figure 6).
La comparaison des changements de poids corporel (figure 6) des animaux 1, 2 et 3 (gestantes) avec les animaux 5 et 6 (jamais gestantes) illustre bien les effets de la grossesse et de la naissance vivante par rapport à l’accouplement infructueux. La raison derrière le comportement différent du poids corporel dans le groupe 2 par rapport au groupe 1 reste incertaine. Cependant, les changements de poids peuvent être plus fiables simplement en raison du nombre plus élevé de grossesses à terme dans le groupe 2. Le faible taux de grossesse dans le groupe 1 peut être lié à la sténose vaginale, qui était surreprésentée par rapport au groupe 2 (tableau 3) et est une cause de conception entravée. La réduction de l’incidence sténose dans le groupe 2 peut être due à l’utilisation de sutures non résorbables au lieu de sutures résorbables pour l’anastomose vaginale, probablement avec une manipulation chirurgicale améliorée pendant la dissection vaginale dans ce groupe.
Contrairement à l’approche suédoise10,12, le protocole décrit ici utilise la solution IGL-1 (Institut Georges Lopez) pour le stockage des greffons au lieu de Ringer ou d’autres solutions. Bien que l’impact exact de la solution IGL-1 sur les résultats UTx soit inconnu, divers rapports suggèrent des avantages globaux dans la transplantation expérimentale pour cette solution22,23,24,25. Enfin, quelques étapes du protocole habituellement effectuées pour UTx12 n’ont pas affecté les résultats si elles étaient ignorées. Il s’agit notamment de la coupure de la corne de l’utérus gauche ou droit et de la substitution postopératoire de l’héparine, que les auteurs jugent facultative.
Une limitation inhérente à l’UTx expérimentale est également valable pour le protocole présenté. La procédure prend du temps et le prélèvement d’organes suivi d’une transplantation peut prendre jusqu’à 6 heures. Par conséquent, Rat UTx nécessite une mise au point complète pendant plusieurs heures afin d’effectuer chaque étape parfaitement. Ce dernier reste l’aspect le plus important du succès. Une telle attention peut être accomplie à condition que les compétences microchirurgicales soient pleinement développées et pratiquées en permanence. De même, la patience et l’endurance sont des traits clés pour éviter les erreurs tout au long de la procédure. Une autre conséquence de la longue procédure est qu’un seul animal peut être opéré par jour. Une planification minutieuse et l’accent mis sur les questions clés aident à développer un plan de recherche productif. En général, il est conseillé d’atteindre un taux de survie du greffon supérieur à 70% avant de s’engager dans la série expérimentale réelle afin de s’assurer que les résultats seront suffisamment robustes. Enfin, on peut souhaiter reconsidérer la naissance vivante comme un critère d’évaluation. L’incidence élevée de sténose vaginale et de résorption de la grossesse12 augmente considérablement le nombre d’UTx nécessaires pour obtenir des résultats significatifs. En attendant la question expérimentale, d’autres paramètres, tels que la survie du greffon, pourraient être plus efficaces.
Malgré son application croissante, UTx reste une application expérimentale également en clinique. Outre la nécessité d’améliorer les approches chirurgicales et les stratégies immunosuppressives, l’utilisation de greffons provenant de donneurs décédés, en particulier, est un domaine nécessitant des recherches supplémentaires. Les stratégies d’atténuation des lésions ischémiques ne sont pas établies, mais seraient les bienvenues pour l’expansion des bassins de donneurs potentiels. En effet, l’impact de l’ischémie sur l’utérus est mal documenté, les connaissances appliquées s’appuyant sur les résultats d’autres organes26,27. Rat UTx offre un moyen d’explorer les lésions ischémiques dans des environnements contrôlés tout en utilisant des approches adaptées à la clinique28,29. Il convient de noter que le don vivant est associé à certains risques; Les donneurs ont un taux élevé de complications chirurgicales, telles que les traumatismes urinaires et intestinaux. En conséquence, la demande de dons morts et ses recherches augmententde 5,30.
De nombreuses questions supplémentaires existent où Rat UTx pourrait être instructif. Par exemple, le système du rat offre la possibilité d’identifier et / ou de valider des marqueurs biologiques qui pourraient être utilisés pour surveiller de manière non invasive l’évolution des transplantations d’utérus en clinique. Les développements sociétaux récents peuvent créer de nouvelles questions où le modèle du rat peut être utile. UTx est maintenant également préconisé pour les personnes transgenres, l’anatomie masculine demandant des approches chirurgicales adaptées31.
En conclusion, un nouveau protocole de rat UTx basé sur le travail existant sur les rongeurs et modifié par l’expérience pratique est présenté. Le protocole modifié a une forte probabilité que l’UTx du rat entraîne des naissances vivantes - à condition que les compétences et la pratique microchirurgicales soient suffisantes. UTx est peut-être la plus complexe des principales procédures de transplantation. Les instructions décrites s’ajoutent à un protocole commun, qui fait actuellement défaut mais qui est nécessaire pour établir la procédure exigeante de l’UTx chez le rat au sein de la communauté des chercheurs.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par le Fonds national suisse (subvention de projet n° 310030_192736). Nous remercions le Dr Frauke Seehusen de l’Institut de pathologie vétérinaire de l’Université de Zurich pour son soutien histopathologique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angled to Side Scissor 5 mm | F.S.T | 15008-08 | |
| Big Paper Clip | No specific | Used as retractor | |
| Blunt Bend Needle G30 | Unimed S.A. | ||
| Bupivacain 0.5% | Sintetica | ||
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Temgesic | ||
| Dosiernadel G25 | H.SIGRIST& PARTNER AG | ||
| Dumont #5SF Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Ethilon 10/0 | Ethicon | 2810G | |
| Ethilon 6/0 | Ethicon | 667H | |
| Ethilon 7/0 | Ethicon | EH7446H | |
| Ethilon 8/0 | Ethicon | 2808G | |
| Femal Brown Norway Rats (150-170 g) | Janvier | ||
| Femal Lewis Rats (150-170 g) | Charles River Deutschland | ||
| Fine Scissors - Sharp | F.S.T | 14060-09 | Any other small scissor works too |
| Halsey Micro Needle Holder | F.S.T | 12500-12 | Any other small needholder works too |
| Heparin Natrium 25000 I.E./ 5 mL | B. Braun | ||
| Institute Georges Lopez Perfusion Solution (IGL) | Institute Georges Lopez | Organ preservation solution | |
| Male Lewis Rats (300-320 g) | Charles River Deutschland | ||
| Micro Serrefines 13 mm | F.S.T | 18055-04 | |
| Micro Serrefines 16 mm gebogen | F.S.T | 18055-06 | |
| Micro-Serrefine Clamp Applicator with Lock | F.S.T | 18056-14 | |
| Mölnlyncke Op Towel | Mölnlyncke | 800300 | Sterile drape |
| NaCl 0.9% | B.Braun | ||
| Octenisept | Schülke | ||
| Paper Tape | Tesa | For fixing the animal | |
| Philips Avent Schneller Flaschenwärmer SCF358/02 | Philips | 12824216 | |
| Ringerfundin | B.Braun | ||
| Rompun 2% | Bayer | Xylazine | |
| Round Handled Needle Holders | F.S.T | 12075-12 | |
| Round Handled Needle Holders | F.S.T | 12075-12 | |
| S&T Vessel Dilating Forceps - Angled 45° | F.S.T | 00276-13 | |
| Sacryl Naht | KRUUSE | 152575 | |
| Scapel No 10 | Swann Morton | 201 | |
| Small Histo-Container | Any small histo-container works fine-for coldstorage of the graft | ||
| Small Plastik Bags | Any transparant plastic bags are fine | ||
| Steril Cotton swab | Lohmann-Rauscher | Any steril cotton swab is fine | |
| Sterile Gauze | Lohmann-Rauscher | Any steril gauze is fine | |
| Straight Scissor 8mm | F.S.T | 15024-10 | |
| Surgical microscope – SZX9 | Olympus | OLY-SZX9-B | |
| Sutter Non Stick GLISS 0.4 mm | Sutter | 78 01 69 SLS | |
| Suture Tying Forceps | F.S.T | 00272-13 | |
| ThermoLux warming mat | ThermoLux | ||
| Tissue Forceps for Skin | Any tissue forceps are fine | ||
| Vesseldilatator Forceps | F.S.T | 00125-11 | |
| Vicryl plus 4/0 | Ethicon | VCP292H |
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