Summary
El presente protocolo describe todos los pasos esenciales para el éxito del trasplante uterino (UTx) en ratas. El modelo de rata ha demostrado ser adecuado para promover la implementación clínica de UTx; sin embargo, UTx de rata es un procedimiento altamente complejo que requiere instrucciones cuidadosas.
Abstract
El trasplante uterino (UTx) es un nuevo enfoque para tratar a las mujeres con infertilidad absoluta por factor uterino (AUFI). Se estima que entre el 3% y el 5% de las mujeres sufren de AUFI. Estas mujeres fueron privadas de la opción de tener hijos hasta el advenimiento de UTx. La aplicación clínica de UTx fue impulsada por estudios experimentales en animales, y el primer UTx exitoso se logró en ratas. Dadas sus características fisiológicas, inmunológicas, genéticas y reproductivas, las ratas son un sistema modelo adecuado para tales trasplantes. En particular, su corto período de gestación es una clara ventaja, ya que el objetivo habitual de la UTx experimental es el embarazo exitoso con nacidos vivos. El mayor desafío para los modelos de ratas sigue siendo la pequeña anatomía, que requiere habilidades microquirúrgicas avanzadas y experiencia. Aunque UTx ha llevado al embarazo en la clínica, el procedimiento no está establecido y requiere una optimización experimental continua. Aquí, se presenta un protocolo detallado, que incluye la solución de problemas esenciales para UTx de rata, que se espera que haga que todo el procedimiento sea más fácil de comprender para aquellos sin experiencia en este tipo de microcirugía.
Introduction
El trasplante uterino (UTx) es un tratamiento novedoso para la infertilidad por factor uterino absoluto (AUFI). AUFI resulta de una ausencia (congénita o adquirida) o malformación del útero y afecta al 3% -5% de las mujeres en todo el mundo1. Razones éticas, legales o religiosas descartan la adopción o la gestación subrogada para muchas mujeres que tienen un deseo de maternidad pero sufren de AUFI2. Para estas mujeres, UTx sigue siendo la única opción para comenzar su propia familia. UTx se ha aplicado en la clínica, aunque con éxito mixto; El procedimiento es técnicamente desafiante y requiere una mejora constante para su establecimiento clínico.
En 2014, el primer trasplante de útero de una donante viva (LD), que resultó en un embarazo exitoso, fue realizado por el grupo pionero sueco de Brännström3. El primer nacimiento después de UTx de un donante fallecido (DD) fue reportado en 2016 en Brasil4. Para 2021, se han realizado más de 80 UTxs en todo el mundo, sin embargo, con una tasa de éxito de alrededor del 50% y con injertos provenientes de LD para la mayoría1.
Aunque no salva vidas, UTx es un procedimiento cada vez más popular para satisfacer los deseos de su propia progenie. Como tal, la demanda de injertos está aumentando, colocando la donación de DD en un enfoque futuro. Sin embargo, la donación de DD es complicada debido a exposiciones isquémicas considerablemente más prolongadas al frío (y en el caso de muerte cardíaca, también caliente), elevando los riesgos de disfunción y rechazo del injerto 5,6. La técnica quirúrgica, la compatibilidad exigente y la inmunosupresión asociada siguen siendo cuestiones críticas con respecto a los resultados de UTx7.
Para manejar los riesgos anteriores en la clínica, se necesitan modelos animales apropiados para la exploración de la isquemia y la inmunosupresión. El criterio de valoración más relevante clínicamente para los modelos animales sigue siendo el nacimiento exitoso; hasta la fecha, se han logrado embarazos después de UTx experimental en ratones, ratas, ovejas, conejos y monos cynomolgus8. Mientras que los animales más grandes están predestinados para adquirir y optimizar técnicas quirúrgicas, los roedores vienen con la clara ventaja de períodos de gestación cortos. Por lo tanto, los modelos de roedores son superiores en cuanto a consideraciones prácticas, financieras y éticas9. Sin embargo, el principal desafío de UTx en ratones es la pequeña anatomía, con la cirugía altamente exigente vinculada a la baja reproducibilidad de UTxmurino 10. Por el contrario, las ratas son quirúrgicamente más accesibles y conservan las ventajas de los cortos tiempos de gestación. Como tal, la rata se ha convertido en el modelo de elección para UTx9. Wranning et al. introdujeron el modelo de rata de UTx ortotópico en 2008, y usando este modelo, el primer nacimiento vivo después de UTx y apareamiento natural ha sido reportado11,12,13. Estudios posteriores han tenido contribuciones críticas para la implementación de UTx en humanos9.
No obstante, UTx sigue siendo un desafío en ratas, y solo unos pocos grupos hasta ahora han dominado esta técnica quirúrgica. Un obstáculo relevante para la propagación de UTx en ratas entre los investigadores es la falta de una descripción precisa de los pasos microquirúrgicos individuales, las trampas y las medidas correspondientes para la resolución de problemas14. Este protocolo tiene como objetivo proporcionar una guía detallada para este procedimiento microquirúrgico altamente complejo para facilitar la implementación de este modelo animal en futuras investigaciones.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se realizaron siguiendo las Regulaciones Federales Alimentarias Suizas y aprobadas por la Oficina Veterinaria de Zurich (n° 225/2019), asegurando el cuidado humano. Las ratas Lewis virgen hembra (peso corporal de 170-200 g) y las ratas virgen hembra Brown Norway (170-200 g) se utilizaron como donantes/receptoras de útero, mientras que las ratas Lewis macho (300-320 g) se utilizaron para el apareamiento. Las ratas tenían entre 12 y 15 meses de edad. Los animales se obtuvieron de fuentes comerciales (ver Tabla de Materiales) y fueron alojados en condiciones controladas y un ambiente enriquecido con libre acceso al agua y alimentos estándar.
1. Recuperación del útero
NOTA: Para más detalles sobre el procedimiento, consulte los informes publicados anteriormente12,13,15.
- Inducir la anestesia con isoflurano y oxígeno dentro de un recipiente cerrado de plexiglás (14 cm x 25 cm x 13 cm) durante 1-2 min (5 vol% isoflurano enO2).
- Administrar buprenorfina por vía subcutánea (0,05 mg/kg) y bupivacaína (0,5%, 8 mg/kg) por vía subcutánea en la región de la incisión abdominal planificada 30 min antes de la cirugía.
- Afeite toda la piel abdominal de la rata con una afeitadora eléctrica.
- Use cintas para mantener al animal fijo en una placa calefactora durante la cirugía. Aplique ungüento para los ojos en ambos ojos.
- Mantener la anestesia durante el procedimiento con 2-4 vol% de isoflurano en oxígeno mediante la administración continua a través de un pequeño cono nasal.
- Monitorear la profundidad anestésica por parámetros clínicos sin herramientas especializadas (frecuencia respiratoria de ~ 70-120 / min, una caída lenta de la tasa del 50% es aceptable durante la anestesia; verificar la profundidad anestésica con pellizco del dedo del pie; el color de las membranas mucosas debe ser rosa, no azul o gris)16, y ajustar la concentración de isoflurano en consecuencia.
NOTA: Opcional: el monitoreo frecuente de la respiración durante la cirugía es factible con la ayuda de un asistente. - Confirme la profundidad de la anestesia realizando un pellizco en el dedo del pie.
- Limpie la piel abdominal con un movimiento circular con tres hisopos alternados de una solución antiséptica y alcohol al 70%. Dejar secar.
- Coloque una cortina estéril (consulte la Tabla de materiales) con una ventana abdominal sobre el animal.
- Realizar laparotomía mediana.
- Abra el abdomen a través de una incisión de 6-8 cm en la línea media de largo, comenzando 0,5 cm por debajo del xiphisternum hacia el hipogastrio. Use un bisturí no. 10 para la incisión de la piel y tijeras pequeñas y afiladas para la incisión de la línea alba. No dañe el hígado ni la vejiga.
- Mueva los intestinos fuera de la cavidad abdominal con hisopos de algodón, cúbralos suavemente con una gasa humedecida con solución salina estéril y protéjalos con una bolsa de plástico estéril para un mejor aislamiento.
- Inserte retractores o clips (consulte la Tabla de materiales) en las carpetas de la pared abdominal izquierda y derecha para mantener el músculo peritoneal a un lado y el abdomen abierto, para obtener un acceso y visibilidad óptimos del útero y los vasos asociados. Arregle los clips/retractores con cintas.
- Aplique solución salina precalentada para mantener el área quirúrgica y los intestinos húmedos y evitar el secado de las vísceras.
- Cosechar el cuerno uterino derecho con la cavidad uterina común y el cuello uterino más pedículos vasculares, incluidos los vasos uterinos derechos, internos y líacos comunes.
- Ligate (4/0 poliglactina; ver Tabla de materiales), cauterizar y cortar el cuerno uterino izquierdo adyacente a la ramificación de la cavidad uterina común.
- Elimine el exceso de grasa que rodea el útero y la vagina.
NOTA: Mantenga la grasa alrededor del sistema uterino-vascular. - Diseccionar la vejiga en su unión al cuello uterino con cauterización de todos los vasos vesicales de drenaje y alimentación. Durante la cauterización, mantenga una distancia adecuada entre el cuello uterino y la vagina para evitar la cauterización no cesante en estas dos estructuras. De lo contrario, aumenta el riesgo de necrosis del injerto.
NOTA: La mayoría de la manipulación quirúrgica debe afectar la vejiga. Retraiga o tire de la vejiga caudalmente con una pinza vascular (ver Tabla de materiales) para obtener una mejor vista de la excavatio vesicouterina. - Cauterizar y cortar los vasos uterinos descendentes a nivel del uréter lo más distal posible al cuello uterino.
NOTA: Mantenga la microcirculación alrededor de la vagina y el cuello uterino tanto como sea posible durante la división. - Separe la porción cervical/vaginal del futuro injerto de la inserción rectal y los ligamentos paravaginal y paracervical.
NOTA: Evite cualquier cauterización en la vagina del injerto. - Diseccionar cuidadosamente la vagina mediante diatermia alrededor de 2-3 mm caudal del cuello uterino.
NOTA: No hay vellosidades (cuello uterino) visibles dentro de la luz vaginal. - Localice tanto la arteria uterina como la vena en sus orígenes. Ligate (poliamida 8/0; ver Tabla de materiales), cauterizar y cortar los vasos glúteos y todos los vasos caudales de los vasos uterinos.
NOTA: La ligadura directa de la vena ilíaca caudal común a la vena uterina suele ser posible. - Mediante disección roma, liberar los vasos ilíacos comunes entre sí, desde la bifurcación de la aorta y la vena cava hasta la división de los vasos uterinos.
NOTA: Uno puede obtener un mejor acceso quirúrgico al área mediante la extirpación de uno o dos ganglios linfáticos adyacentes. - Extirpar el cuerno uterino derecho a 3 mm de la trompa de Falopio, después de cauterizar el pedículo utero-ovárico al mismo nivel. Esto permite la anastomosis del cuerno uterino del injerto a la parte superior del cuerno uterino receptor.
- Colocar ligaduras (poliamida 8/0) directamente alrededor de la arteria ilíaca común derecha y la vena, proximal a las bifurcaciones aórtica y cava. Haga una pequeña incisión (0.5-1 mm) en la arteria ilíaca común derecha adyacente a la bifurcación, e inserte una aguja doblada y roma de 30 G o una aguja recta y roma de 25 G en el lumen (para enjuagar). Asegúrelo con una ligadura (poliamida 6/0).
NOTA: Otra opción es la sujeción adicional con una abrazadera de bulldog para evitar el desplazamiento de la aguja y / o recipiente. - Diseccionar la vena ilíaca común caudalmente de la ligadura en la vena ilíaca común derecha para permitir la salida durante el lavado.
- Enjuague el injerto siguiendo los pasos a continuación.
- Enjuague el útero manualmente usando jeringas de 3 ml con aproximadamente 9 ml de solución fría de Ringer (RHX: Ringer suplementado con 50 UI/ml de heparina y 0,4 mg/ml de xilazina) a un caudal de 6 ml/min. Enjuague nuevamente con 6 ml de solución de preservación de órganos suplementada con heparina (50 UI/ml) y xilazina (0.4 mg/ml) (ver Tabla de materiales).
NOTA: Evite la alta presión de lavado y asegúrese de colocar la aguja correctamente. - Retirar el trasplante cuando el tejido uterino se haya vuelto pálido. Cortar la arteria ilíaca común caudalmente de la ligadura en la bifurcación de la aorta abdominal.
- Enjuague el útero manualmente usando jeringas de 3 ml con aproximadamente 9 ml de solución fría de Ringer (RHX: Ringer suplementado con 50 UI/ml de heparina y 0,4 mg/ml de xilazina) a un caudal de 6 ml/min. Enjuague nuevamente con 6 ml de solución de preservación de órganos suplementada con heparina (50 UI/ml) y xilazina (0.4 mg/ml) (ver Tabla de materiales).
- Colocar el trasplante en una solución refrigerada de preservación de órganos (4 °C) para la preparación y el almacenamiento de la mesa posterior antes del trasplante.
- Después de retirar el injerto, sacrificar al animal girando primero el ajuste de isoflurano al máximo y luego induciendo neumotórax bilateral seguido de exsanguinación17.
2. Trasplante de útero singénico
NOTA: Para más detalles sobre el procedimiento, consulte los informes publicados anteriormente12,13,15.
- Inducir la anestesia y preparar al animal como se menciona en el paso 1.1.
- Administrar analgesia eficaz (como se describe en el paso 1.1.1) y 200 UI/kg de heparina de alto peso molecular 30 min antes de la cirugía.
- Realizar laparotomía mediana.
- Abra el abdomen a través de una incisión de línea media de 6-8 cm de largo que comienza 0,5 cm por debajo del xiphisternum hacia el hipogastrio. Use un bisturí no. 10 para la incisión de la piel y tijeras pequeñas y afiladas para la incisión de la línea alba. No dañe el hígado y la vejiga.
- Mueva el intestino delgado fuera de la cavidad abdominal con hisopos de algodón, envuélvalos con una gasa humedecida estéril y cúbralos con una bolsa de plástico estéril para un mejor aislamiento.
- Inserte retractores o clips en las carpetas de la pared abdominal izquierda y derecha para mantener el músculo peritoneal a un lado y el abdomen abierto, para obtener un acceso y visibilidad óptimos del útero y los vasos asociados. Arregle los clips/retractores con cintas.
- Aplique solución salina precalentada para mantener el área quirúrgica y los intestinos húmedos y evitar el secado de las vísceras.
- Realizar una histerectomía con disección y movilización del tercio superior de la vagina desde el recto y la vejiga.
- Cauterizar la microvasculatura alrededor del útero, el cuello uterino y la vagina. Cortar y separar el útero de las estructuras circundantes cercanas al órgano para proteger la microcirculación del siniestro útero.
- Retire el tejido graso de los alrededores.
- Amputar el cuerno izquierdo por cauterización. En el lado derecho, preservar un segmento de 7-8 mm de la parte superior del útero para la anastomosis posterior al injerto uterino.
- Realizar trasplante de útero.
- Movilizar y separar los vasos ilíacos comunes derechos, desde el origen de los vasos uterinos hasta la bifurcación aórtica/cava.
- Coloque el injerto en la cavidad abdominal. Envuelva el injerto en una gasa empapada en una solución fría de preservación de órganos.
NOTA: El injerto debe mantenerse frío durante la anastomosis. - Coloque pinzas vasculares atraumáticas en la vena ilíaca común derecha a cada lado, enmarcando el futuro sitio de anastomosis.
NOTA: Baje la anestesia a 1-1.5% vol% isoflurano para adaptarse a la disminución repentina de la precarga cardíaca y la hipotensión resultante. - Corte una hendidura ligeramente más grande que la abertura de la vena del injerto en la vena ilíaca común.
- Coloque la vena del injerto.
- Coloque una sutura de tirante (poliamida 10/0; ver Tabla de materiales) en cada esquina de la hendidura en la vena ilíaca común derecha.
NOTA: Mantenga el nudo de sutura en la esquina caudal suelto para un mejor ajuste y para evitar efectos de cuerda de bolso. - Enjuague regularmente el área de anastomosis con RHX enfriada durante el procedimiento para prevenir trombosis.
- Anastomosar un lado de la vena del injerto a la vena del receptor con seis a ocho asas de una sutura continua (Figura 1).
NOTA: Comience con la sutura de la estancia craneal (poliamida 10/0) y primero anastomose la parte entrante de los vasos. - Anastomosa el otro lado del recipiente de la misma manera, esta vez comenzando desde el exterior.
- Hacer un nudo en la sutura del tirante craneal, y luego uno en la sutura del tirante caudal (poliamida 10/0), después de terminar las anastomosis por ambos lados.
NOTA: Apriete las suturas continuas solo tanto como sea necesario para evitar efectos de cuerda de bolso. - Coloque pinzas vasculares atraumáticas en la arteria ilíaca común derecha a cada lado, enmarcando el futuro sitio de anastomosis.
- Realizar la anastomosis arterial (arteria ilíaca común derecha [RICA] mediante 8-10 asas mediante suturas interrumpidas (poliamida 10/0).
NOTA: Las suturas interrumpidas son más fáciles de controlar que las continuas (opcional con la técnica de "boca de pez")18. El lavado constante del área de anastomosis con RHX enfriado durante el procedimiento ayuda a prevenir trombosis. Cuando se utilizan suturas continuas, realice este paso análogo a la anastomosis venosa.
- Realizar reperfusión de injerto.
- Cuando ambos sitios de anastomosis aparecen permeables y se detiene cualquier sangrado, libere las pinzas vasculares en los vasos del injerto (Figura 2).
- Inspeccione el injerto en busca de signos de reperfusión, como enrojecimiento, llenado de la vena o pulsación en la arteria del injerto.
- Conecte el manguito vaginal del trasplante a la bóveda vaginal de la receptora mediante el uso de seis a siete suturas intraluminales (6/0 poliglactina) interrumpidas.
NOTA: Comience con una sola sutura en la posición de las 12 en punto primero, y coloque las siguientes en las posiciones de las 10 y 1 en punto. Las dos suturas en las posiciones de las 9 y 3 en punto deben atarse después de las suturas en la primera fila19,20. - Anastomosar el cuerno uterino del injerto de extremo a extremo al segmento uterino craneal restante del útero receptor mediante el uso de cinco a siete suturas interrumpidas (poliamida 7/0).
NOTA: No cose a través de la luz.
- Cierre el abdomen con una sutura continua. Use poliglactina 4/0 para suturar la capa muscular y poliamida 6/0 o clips quirúrgicos para la piel.
- Deje que el animal se recupere en una jaula calentada una vez que se complete el trasplante. Permanecer con el animal hasta que haya recuperado la capacidad de decúbito esternal, y mantener el alojamiento único hasta su recuperación completa. Proporcionar tratamiento de analgesia psotopertativa mediante la administración subcutánea de buprenorfina (0,05 mg/kg) y AINE adecuados, sin embargo, no antes de 4-8 horas después de la primera dosis de anestesia. Proporcionar buprenorfina continua a través del agua potable (1 mg/kg, oral, 5 ml de buprenorfina en 160 ml de agua potable (0,3 mg/ml)) durante tres días después de la cirugía.
- La sutura de la piel se retira 10-14 días después de la cirugía.
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Representative Results
Se presentan los resultados de dos grupos de ratas. UTx se llevó a cabo antes (grupo 1, n = 8) y después (grupo 2, n = 8) ajuste del protocolo (Tabla 1) para demostrar los efectos de nuestras modificaciones (consulte la Discusión para una explicación de nuestras modificaciones)12,15,21.
El resultado de UTx de rata se asocia con tres fases clave. La primera fase es la recuperación exitosa de UTx. Por lo general, los receptores deben recuperarse dentro de los primeros 2 días postoperatorios. La segunda fase se refiere al estado de salud del injerto 2 semanas después de la cirugía, que decide la inclusión en el proceso de apareamiento (Tabla 2). La tercera fase implica el apareamiento espontáneo seguido de un parto exitoso como evidencia de fertilidad.
Todos los animales de ambos grupos tuvieron una recuperación sin incidentes de la cirugía. Durante la segunda fase, cuatro animales fueron excluidos del grupo 1 y dos del grupo 2. La exclusión se debió a trombosis y absceso del injerto (n = 4 para el grupo 1, n = 2 para el grupo 2) y anastomosis uterouterina estrechada/malformada (adicionalmente para n = 1, grupo 1) en el examen en la relaparotomía (Tabla 2). La relaparotomía (junto con la cicatriz de la laparotomía original) se realizó para todas las hembras 2 semanas después del trasplante, ya que la apariencia física de los animales tenía poco valor como indicador de la salud del injerto. En general, la tasa de supervivencia del injerto a las 2 semanas fue del 50% y 75% para los grupos 1 y 2, respectivamente (Tabla 3).
Durante la fase 3, cuatro hembras del grupo 1 fueron emparejadas para aparearse con machos de Lewis, alrededor de 9 semanas después de UTx. Dos hembras mostraron signos de embarazo (aumento de peso corporal, Figura 3; comportamiento de anidación); sin embargo, no se observaron nacidos vivos. Después de dos ciclos de apareamiento de tres hembras, se encontraron partes del cuerpo del cachorro (hueso y tejido) en una rata hembra (° 1). El examen histológico de las secciones de tejido teñido con hematoxilina y eosina por un patólogo veterinario reveló que estas crías se desarrollaron hasta el parto (Figuras 4 y Figura 5).
Seis hembras del grupo 2 se aparearon con machos de Lewis (ver Figura 6 para los cambios de peso corporal). Tres de las seis ratas (dos Lewis y una rata Brown Norway) dieron a luz a cachorros, mientras que otras dos mostraron signos de embarazo. La primera camada de la rata Lewis hembra consistió en dos cachorros (Figura 7). Poco después del nacimiento, la hembra Lewis quedó embarazada de nuevo; sin embargo, solo dos de cada tres crías sobrevivieron después del parto (Figura 8). Una explicación probable para la única muerte es el infanticidio, ya que ocurre incluso con cachorros sanos en condiciones de estrés posparto. Del mismo modo, la hembra de Noruega marrón dio a luz dos veces, cada vez a cuatro crías por ciclo de apareamiento (Figura 9). El mayor número de camadas del grupo 2 fue entregado por otra hembra de Lewis (# 3), con siete crías después del primer ciclo de apareamiento. Todos los cachorros sobrevivientes mostraron un desarrollo normal (Figura 10).
En general, la adaptación del protocolo aumentó la supervivencia del injerto a las 2 semanas del 50% al 75%. Cinco de cada seis mujeres quedaron embarazadas, en comparación con dos de cada cuatro del grupo 1. Del mismo modo, tres de cada seis hembras dieron a luz a crías vivas en comparación con cero de cada cuatro de las hembras del grupo 1. En conclusión, el protocolo adaptado mejoró tanto los resultados quirúrgicos directos como la tasa de nacidos vivos exitosos después de UTx (Tabla 4 y Figura 6).
Figura 1: Anastomosis del injerto y de la vena del receptor. La vena ilíaca común derecha (RCIV) del injerto está conectada a la RCIV del receptor a través de anastomosis de extremo a lado (paso 2.4). RICA = arteria ilíaca común derecha Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Anastomosis del injerto y de la arteria receptora. La arteria ilíaca común derecha (RICA) se conecta al RICA del receptor a través de la anastomosis de extremo a lado (paso 2.4). Después de abrir ambas pinzas vasculares (2.5), la arteria debe perfundirse completamente en ausencia de sangrado externo. Flecha negra: injerto RICA; flecha roja: injerto RCIV. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cambios en el peso corporal después del apareamiento de las hembras en el grupo 1. Monitoreo del peso corporal de las cuatro hembras del grupo 1 que mostraron un injerto intacto en la relaparotomía. Un animal (° 1) fue sacrificado durante la cesárea para inspeccionar el útero. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Examen histológico del útero de la rata del grupo 1 con cachorros muertos. Se encontraron partes del cuerpo de los cachorros en rata ° 1. El examen reveló un útero vital y dilatado, lo que sugiere que los cachorros se desarrollaron normalmente pero no pudieron nacer. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Partes del cuerpo del cachorro dentro del útero de la rata del grupo 1 ° 1. La etapa de desarrollo de los huesos fue consistente con los cachorros a término. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Monitoreo del peso corporal de las seis hembras del grupo 2 que mostraron un injerto intacto en la relaparotomía. Las estrellas verdes marcan eventos de nacimiento individuales. Los números de hashtag se refieren a las mujeres individuales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: El primer nacimiento vivo después de UTx de rata siguiendo el protocolo modificado. Dos ratas recién nacidas y su madre (cabeza a la derecha; Lewis hembra #1, grupo 2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: La segunda camada después del segundo ciclo de apareamiento después de UTx de rata siguiendo el protocolo modificado. La hembra #1 (grupo 2) dio a luz a tres cachorros, dos de los cuales sobrevivieron. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: La primera camada de la rata noruega marrón después de UTx siguiendo el protocolo modificado. Después del primer ciclo de apareamiento, la rata noruega marrón (# 2, grupo 2) dio a luz a cuatro cachorros, seguidos de otros cuatro después del segundo ciclo de apareamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10: Desarrollo de cachorros. Todos los cachorros sobrevivientes mostraron un desarrollo normal a las 3 semanas de edad. Se muestra un ejemplo representativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 11: Formación del tapón vaginal después de un apareamiento exitoso. Se deben formar tapones blancos para cubrir la vagina después de la fertilización para evitar un mayor apareamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Grupo 1 | Grupo 2 | UTx singénico en ratas | UTx alogénico en ratas | |
| Antes de la modificación | después de la modificación | Ver ref. 12 | Ver ref. 15 | |
| Número total de animales | 8 | 8 | 27 | 14 |
| Supervivencia del injerto a dos semanas | 4/8 (50%) | 6/8 (75%) | 19/27 (70%) | 9/14 (64%) |
| Número de hembras apareadas | 4/4 (100%) | 6/6 (100%) | 17/19 (89%) | 9/9 (100%) |
| Embarazo a término | 1/4 (25%) | 5/6 (83%) | 11/17(65%) | 5/9 (56%) |
| Basura entregada con éxito | 0 | 5A/TD> | 1 | 5 |
| Número total de cachorros vivos | 0 | 20ter | 3c | 25d |
| Embarazo a término sin nacidos vivos | 1 | 1e | 10 | 2 |
Tabla 1: Comparación de resultados del protocolo modificado y no modificado para UTx de rata. a: Dos embarazos de la misma rata; b: Incluyendo el cachorro de infanticidio; c: Mediana; d: Suma de la mediana/entrega; e: Cachorros muertos en etapa de reabsorción después de tres ciclos de apareamiento.
| Entornos quirúrgicos | Grupo 1 (n = 8) | Grupo 2 (n = 8) |
| Fase del proyecto | Etapa inicial | Etapa tardía |
| Tiempo de almacenamiento en frío | 2-3 h | 2-3 h |
| Solución de lavado durante la anastomosis | RH | RHX |
| Anastomosis vaginal | 6/0 Ethilon | 6/0 Vicryl |
| Anastomosis del cuerno del útero | Sutura parcialmente continua | sutura interrumpida |
| Anastomosis de arteria | sutura continua | Interrumpido y continuo |
| Microvascularización alrededor de la vagina y el cuello uterino | cauterización cerca del tejido vaginal/cervical | cauterización más distalmente |
Tabla 2: Entornos quirúrgicos grupo 1 versus grupo 2.
| Criterios de exclusión# |
| Signos de trombosis (particularmente alrededor de las anastomosis) |
| Mayor adhesión |
| Útero constreñido |
| Signos de infección |
| Necrosis del injerto |
Tabla 3: Criterios de exclusión para el apareamiento. #Applied en la relaparotomía 2 semanas después de UTx.
| n (grupo 1) | n (grupo 2) | |
| Animales | 8 | 8 |
| Injerto sano después de 2 semanas | 4 | 6 |
| Acoplado | 4 | 6 |
| Embarazo a término | 1 | 5 |
| Basura entregada con éxito | 0 | 5bis |
| Número total de cachorros vivos | 0 | 20ter |
| Embarazo a término, no nacido vivo | 1 | 0 |
Tabla 4: Resultados del grupo 1 versus grupo 2. a: Dos embarazos consecutivos en la misma rata; b: Incluyendo al cachorro asesinado por infanticidio.
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Discussion
El protocolo presentado aquí ofrece instrucciones detalladas para el enfoque quirúrgico detrás del trasplante de útero en ratas. El protocolo ha sido optimizado para aumentar las probabilidades de nacimientos vivos después de UTx y posterior apareamiento. El protocolo original ha sido tomado del grupo Brännström 12,13, inspirado en el trabajo con ratones de Akouri et al.10, y modificado en base a las experiencias de los autores en los últimos años. Como tal, las modificaciones fueron impulsadas por verdaderas curvas de aprendizaje que reflejan el desarrollo de trasplantes fallidos a resultados reproducibles.
Las modificaciones clave que probablemente fueron decisivas fueron: (1) la adición de xilazina a la solución de lavado durante la recuperación de órganos y la anastomosis, lo que estimuló la vasodilatación que condujo a riesgos trombóticos reducidos. (2) El uso de suturas interrumpidas para la anastomosis arterial de extremo a lado. Las suturas interrumpidas no solo aumentan el control quirúrgico sobre la permeabilidad y evitan los efectos de la cuerda de la bolsa, sino que también permiten el ensanchamiento posterior del área anastomótica para aumentar el flujo sanguíneo a través de la arteria uterina. (3) La aplicación de suturas interrumpidas y no absorbibles para la anastomosis del cuerno del útero con costura solo dentro de la capa del perimetrio; Esta modificación evita la constricción de la pared del útero, lo que puede dificultar la fertilización posterior. (4) El uso de material de sutura absorbible para la anastomosis vaginal reduce el riesgo de estenosis vaginal y, por lo tanto, aumenta las posibilidades de nacidos vivos. (5) Realizar cualquier manipulación quirúrgica lo más lejos posible de la vagina y el cuello uterino es un paso crucial para evitar la cicatrización vaginal y aumentar las posibilidades de nacidos vivos. (6) La ligadura directa de la vena ilíaca común derecha y la arteria en lugar de ligar la vena cava, la aorta abdominal y la arteria de la vena ilíaca común izquierda. La ligadura directa caudal a la vena uterina es, en la mayoría de los casos, factible; La ligadura directa simplifica la obtención de órganos y acorta los tiempos quirúrgicos sin afectar negativamente los resultados del trasplante. (7) La reducción de la concentración de isoflurano a 1% -1,5 vol% inmediatamente después del pinzamiento de la vena ilíaca común (paso 2.4.3) también es crucial, ya que de lo contrario puede ocurrir la muerte cardíaca.
Los puntos anteriores son los principales elementos que distinguen el presente protocolo del enfoque quizás más utilizado descrito por el grupo sueco10,12,13. Estas medidas beneficiaron el criterio de valoración final de UTx, el nacido vivo, como lo demuestra la comparación de grupos (protocolo original vs. modificado; ver Tabla 1). Claramente, la curva de aprendizaje quirúrgico a lo largo del tiempo también se ha sumado a mejores resultados; sin embargo, su contribución es difícil de estimar.
Además de una técnica quirúrgica meticulosa, el cuidado postoperatorio del receptor también es crucial para el resultado final. Los tratamientos postoperatorios siguen el protocolo local respectivo; Las instrucciones aquí recomiendan 0,05 mg / kg de buprenorfina después de que el receptor se despierte de la anestesia, y durante el primer día postoperatorio si presenta dolor según lo definido por nuestra evaluación de puntuación. Los criterios de puntuación se basan en el comportamiento (actividad, respiración, pelaje, postura, herida) y el peso corporal. Inmediatamente después de la cirugía, los signos positivos de recuperación son un retorno de la coloración rosada de las extremidades y las orejas, así como un retorno de la coloración roja de los ojos. Dada la duración del procedimiento de trasplante, el monitoreo regular durante las primeras 3 horas después del trasplante es crítico. Si no se cumplen los criterios de evaluación durante estas 3 horas, el animal es sacrificado para evitar más sufrimiento. El monitoreo se continúa tres veces al día durante los primeros 3 días postoperatorios. Si el animal no se recupera completamente durante los primeros 2 días, se le practica la eutanasia. Dependiendo de su condición, el animal permanece en una sola vivienda durante 2-3 días después de la cirugía.
Las condiciones estériles durante la cirugía son otro aspecto relevante para resultados exitosos. Una estricta rutina de higiene es obligatoria para minimizar los riesgos de infección. Al ingresar a la instalación de animales, las manos deben lavarse bien antes de vestirse con un mono limpio, una máscara facial, guantes y una gorra. Toda el área quirúrgica se desinfecta con un hisopo especial que contiene cloruro de bencil-C12-18-alquildimetilamonio, cloruro de didecildimetilamonio y glutaraldehído. Sigue una desinfección adicional con etanol al 70%. Antes de cada manipulación quirúrgica, los guantes se limpian brevemente con etanol al 70%, y el área que rodea el sitio quirúrgico se cubre con una cortina estéril. Estas medidas ayudan en gran medida a minimizar los riesgos de infección.
Un problema con el éxito de la progenie es la dificultad para monitorear el embarazo real. Los aumentos de peso corporal pueden ser indicativos de embarazo, pero también pueden deberse al infanticidio y generalmente no reflejan de manera confiable el estado de la mujer. Por ejemplo, solo los cambios de peso modestos en general fueron evidentes para el grupo 1 durante el monitoreo. Los animales 3 y 4 mostraron aumentos de peso similares durante los dos ciclos de apareamiento, sin embargo, solo el animal 4 estaba preñado en la relaparotomía (Figura 3 y Figura 4). Además, la pérdida de peso después del primer ciclo de apareamiento con parto ausente puede apuntar a la absorción del embarazo. Aunque no está claro por qué la absorción tisular resulta en la pérdida de peso, este fenómeno ha sido observado repetidamente en receptores de UTx en ratas12. La formación del tapón vaginal después del apareamiento exitoso (Figura 11) también estuvo ausente a menudo y no mostró una correlación con cambios posteriores en el peso corporal. Dado el poco valor de marcar el embarazo, la frecuencia de monitoreo del peso corporal se redujo para el grupo 2 para minimizar la exposición al estrés animal. Otra consecuencia de la presencia inconsistente del tapón y los cambios de peso fue una definición poco confiable del tiempo de concepción. Por lo tanto, las fechas de vencimiento para los nacimientos se han calculado utilizando el2º día posterior a la exposición masculina como el día de la concepción. Curiosamente, los cambios de peso corporal en el grupo 2 se correlacionaron relativamente bien con el curso del embarazo, con el parto marcado por una clara caída de peso (Figura 6).
La comparación de los cambios en el peso corporal (Figura 6) de los animales 1, 2 y 3 (preñados) con los animales 5 y 6 (nunca embarazadas) ilustra muy bien los efectos del embarazo y el nacimiento vivo frente al apareamiento fallido. La razón detrás del comportamiento diferente del peso corporal en el grupo 2 en comparación con el grupo 1 sigue sin estar clara. Sin embargo, los cambios de peso pueden ser más confiables simplemente debido al mayor número de embarazos a término en el grupo 2. La baja tasa de embarazo en el grupo 1 posiblemente se relacione con la estenosis vaginal, que estaba sobrerrepresentada en relación con el grupo 2 (Tabla 3) y es una causa de concepción obstaculizada. La reducción de la incidencia estenótica en el grupo 2 puede deberse al uso de suturas no absorbibles en lugar de absorbibles para la anastomosis vaginal, probablemente junto con una mejor manipulación quirúrgica durante la disección vaginal en este grupo.
A diferencia del enfoque sueco10,12, el protocolo descrito aquí utiliza la solución IGL-1 (Instituto Georges López) para el almacenamiento de injertos en lugar de Ringer u otras soluciones. Si bien se desconoce el impacto exacto de la solución IGL-1 en los resultados de UTx, varios informes sugieren beneficios generales en el trasplante experimental para esta solución22,23,24,25. Por último, algunos pasos de protocolo generalmente realizados para UTx12 no afectaron los resultados si se omitían. Estos incluyen el recorte en el cuerno del útero izquierdo o derecho y la sustitución postoperatoria de heparina, que los autores consideran opcional.
Una limitación inherente a UTx experimental también es válida para el protocolo presentado. El procedimiento lleva mucho tiempo y la recuperación de órganos seguida de un trasplante puede demorar hasta 6 horas. Por lo tanto, rat UTx requiere un enfoque completo durante varias horas para realizar cada paso sin problemas. Este último sigue siendo el aspecto más importante del éxito. Tal atención se puede lograr siempre que las habilidades microquirúrgicas estén completamente desarrolladas y se practiquen continuamente. Del mismo modo, la paciencia y la resistencia son rasgos clave para evitar errores durante todo el procedimiento. Otra consecuencia del largo procedimiento es que solo se puede operar un animal por día. La planificación cuidadosa y el enfoque en las preguntas clave ayudan a desarrollar un diseño de investigación productivo. En general, se recomienda lograr una supervivencia del injerto superior al 70% antes de comprometerse con la serie experimental real para garantizar que los hallazgos sean lo suficientemente sólidos. Por último, tal vez se desee reconsiderar el nacimiento vivo como criterio de valoración. La alta incidencia de estenosis vaginal y reabsorción del embarazo12 aumenta notablemente el número de UTxs necesarios para obtener resultados significativos. A la espera de la cuestión experimental, otros criterios de valoración, como la supervivencia del injerto, pueden ser más eficaces.
A pesar de su creciente aplicación, UTx sigue siendo una aplicación experimental también en la clínica. Además de la necesidad de mejorar los enfoques quirúrgicos y las estrategias inmunosupresoras, el uso de injertos de donantes fallecidos, en particular, es un área que requiere investigación adicional. No se han establecido estrategias para mitigar la lesión isquémica, pero serían muy bienvenidas para la expansión de posibles grupos de donantes. De hecho, el impacto de la isquemia en el útero está mal investigado, con conocimiento aplicado basado en hallazgos de otros órganos26,27. Rat UTx ofrece un medio para explorar la lesión isquémica en entornos controlados, utilizando enfoques adaptados a la clínica28,29. Cabe destacar que la donación en vivo está asociada con ciertos riesgos; Los donantes tienen una alta tasa de complicaciones quirúrgicas, como traumatismo urinario e intestinal. En consecuencia, la demanda de donaciones muertas y su investigación está creciendo 5,30.
Existen muchas preguntas adicionales donde rat UTx podría ser informativo. Por ejemplo, el sistema de ratas ofrece la oportunidad de identificar y / o validar marcadores biológicos que podrían usarse para monitorear de manera no invasiva el curso de los trasplantes de útero en la clínica. Los desarrollos sociales recientes pueden crear nuevas preguntas donde el modelo de rata puede ser útil. UTx ahora está siendo defendido también para individuos transgénero, con la anatomía masculina pidiendo enfoques quirúrgicos adaptados31.
En conclusión, se presenta un nuevo protocolo de UTx de rata basado en el trabajo existente de roedores y modificado por la experiencia práctica. El protocolo modificado tiene una alta probabilidad de UTx en ratas que resulta en nacimientos vivos que proporcionan suficientes habilidades y práctica microquirúrgica. UTx es quizás el más complejo de los principales procedimientos de trasplante. Las instrucciones descritas se añadirán a un protocolo común, que actualmente falta pero es necesario para establecer el exigente procedimiento de UTx de rata dentro de la comunidad investigadora.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (subvención del proyecto no. 310030_192736). Nos gustaría agradecer a la Dra. Frauke Seehusen del Instituto de Patología Veterinaria de la Universidad de Zurich por su apoyo histopatológico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angled to Side Scissor 5 mm | F.S.T | 15008-08 | |
| Big Paper Clip | No specific | Used as retractor | |
| Blunt Bend Needle G30 | Unimed S.A. | ||
| Bupivacain 0.5% | Sintetica | ||
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Temgesic | ||
| Dosiernadel G25 | H.SIGRIST& PARTNER AG | ||
| Dumont #5SF Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Ethilon 10/0 | Ethicon | 2810G | |
| Ethilon 6/0 | Ethicon | 667H | |
| Ethilon 7/0 | Ethicon | EH7446H | |
| Ethilon 8/0 | Ethicon | 2808G | |
| Femal Brown Norway Rats (150-170 g) | Janvier | ||
| Femal Lewis Rats (150-170 g) | Charles River Deutschland | ||
| Fine Scissors - Sharp | F.S.T | 14060-09 | Any other small scissor works too |
| Halsey Micro Needle Holder | F.S.T | 12500-12 | Any other small needholder works too |
| Heparin Natrium 25000 I.E./ 5 mL | B. Braun | ||
| Institute Georges Lopez Perfusion Solution (IGL) | Institute Georges Lopez | Organ preservation solution | |
| Male Lewis Rats (300-320 g) | Charles River Deutschland | ||
| Micro Serrefines 13 mm | F.S.T | 18055-04 | |
| Micro Serrefines 16 mm gebogen | F.S.T | 18055-06 | |
| Micro-Serrefine Clamp Applicator with Lock | F.S.T | 18056-14 | |
| Mölnlyncke Op Towel | Mölnlyncke | 800300 | Sterile drape |
| NaCl 0.9% | B.Braun | ||
| Octenisept | Schülke | ||
| Paper Tape | Tesa | For fixing the animal | |
| Philips Avent Schneller Flaschenwärmer SCF358/02 | Philips | 12824216 | |
| Ringerfundin | B.Braun | ||
| Rompun 2% | Bayer | Xylazine | |
| Round Handled Needle Holders | F.S.T | 12075-12 | |
| Round Handled Needle Holders | F.S.T | 12075-12 | |
| S&T Vessel Dilating Forceps - Angled 45° | F.S.T | 00276-13 | |
| Sacryl Naht | KRUUSE | 152575 | |
| Scapel No 10 | Swann Morton | 201 | |
| Small Histo-Container | Any small histo-container works fine-for coldstorage of the graft | ||
| Small Plastik Bags | Any transparant plastic bags are fine | ||
| Steril Cotton swab | Lohmann-Rauscher | Any steril cotton swab is fine | |
| Sterile Gauze | Lohmann-Rauscher | Any steril gauze is fine | |
| Straight Scissor 8mm | F.S.T | 15024-10 | |
| Surgical microscope – SZX9 | Olympus | OLY-SZX9-B | |
| Sutter Non Stick GLISS 0.4 mm | Sutter | 78 01 69 SLS | |
| Suture Tying Forceps | F.S.T | 00272-13 | |
| ThermoLux warming mat | ThermoLux | ||
| Tissue Forceps for Skin | Any tissue forceps are fine | ||
| Vesseldilatator Forceps | F.S.T | 00125-11 | |
| Vicryl plus 4/0 | Ethicon | VCP292H |
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