Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Sondering av RNA-struktur med dimetylsulfatmutationsprofilering med sekvensering in vitro och i celler

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64820
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology, Harvard Medical School

Summary

Protokollet ger instruktioner för modifiering av RNA med dimetylsulfat för mutationsprofileringsexperiment. Den inkluderar in vitro - och in vivo-sondering med två alternativa biblioteksberedningsmetoder.

Abstract

RNA-strukturens roll i praktiskt taget alla biologiska processer har blivit allt tydligare, särskilt under det senaste decenniet. Klassiska metoder för att lösa RNA-struktur, såsom RNA-kristallografi eller kryo-EM, har dock misslyckats med att hålla jämna steg med det snabbt utvecklande fältet och behovet av lösningar med hög genomströmning. Mutationsprofilering med sekvensering med dimetylsulfat (DMS) MaPseq är ett sekvenseringsbaserat tillvägagångssätt för att härleda RNA-strukturen från en bas reaktivitet med DMS. DMS-metylerar N1-kvävet i adenosiner och N3 i cytosiner vid deras Watson-Crick-ansikte när basen är oparad. Omvänd transkribering av det modifierade RNA med det termostabila grupp II-intron-omvända transkriptaset (TGIRT-III) leder till att de metylerade baserna införlivas som mutationer i cDNA. När du sekvenserar det resulterande cDNA och mappar det tillbaka till ett referenstranskript, är de relativa mutationshastigheterna för varje bas en indikation på basens "status" som parad eller oparad. Även om DMS-reaktivitet har ett högt signal-brusförhållande både in vitro och i celler, är denna metod känslig för bias i hanteringsprocedurerna. För att minska denna bias tillhandahåller detta papper ett protokoll för RNA-behandling med DMS i celler och med in vitro-transkriberat RNA.

Introduction

Sedan upptäckten att RNA har både strukturella 1,2 ochkatalytiska 3 egenskaper har betydelsen av RNA och dess reglerande funktion i en uppsjö av biologiska processer gradvis upptäckts. Faktum är att effekten av RNA-struktur på genreglering har fått ökad uppmärksamhet4. Liksom proteiner har RNA primära, sekundära och tertiära strukturer, med hänvisning till sekvensen av nukleotider, 2D-kartläggningen av basparningsinteraktioner respektive 3D-vikningen av dessa basparade strukturer. Även om bestämning av den tertiära strukturen är nyckeln till att förstå de exakta mekanismerna bakom RNA-beroende processer, är den sekundära strukturen också mycket informativ när det gäller RNA-funktion och ligger till grund för ytterligare 3D-vikning5.

Att bestämma RNA-strukturen har dock varit i sig utmanande med konventionella tillvägagångssätt. Medan för proteiner har kristallografi, kärnmagnetisk resonans (NMR) och kryogen elektronmikroskopi (kryo-EM) gjort det möjligt att bestämma mångfalden av strukturella motiv, vilket möjliggör strukturförutsägelse från sekvensen ensam6, är dessa tillvägagångssätt inte allmänt tillämpliga på RNA. Faktum är att RNA är flexibla molekyler med byggstenar (nukleotider) som har mycket mer konformations- och rotationsfrihet jämfört med deras aminosyrakomponenter. Dessutom är interaktionerna genom basparning mer dynamiska och mångsidiga än aminosyrarester. Som ett resultat har klassiska tillvägagångssätt varit framgångsrika endast för relativt små RNA med väldefinierade, mycket kompakta strukturer7.

Ett annat tillvägagångssätt för att bestämma RNA-strukturen är genom kemisk sondering i kombination med nästa generations sekvensering (NGS). Denna strategi genererar information om bindningsstatusen för varje bas i en RNA-sekvens (dvs. dess sekundära struktur). I korthet modifieras baserna i en RNA-molekyl som inte ägnar sig åt basparning differentiellt av små kemiska föreningar. Omvänd transkribering av dessa RNA med specialiserade omvända transkriptaser (RT) införlivar modifieringarna i komplementär deoxiribonukleinsyra (cDNA) som mutationer. Dessa cDNA-molekyler förstärks sedan av polymeraskedjereaktionen (PCR) och sekvenseras. För att få information om deras "status" som bunden eller obunden beräknas mutationsfrekvenserna vid varje bas i ett RNA av intresse och matas in i strukturförutsägelseprogramvara som begränsningar8. Baserat på närmaste granne regler9 och minsta fria energiberäkningar 10, genererar denna programvara strukturmodeller som bäst passar de erhållna experimentella data11,12.

DMS-MaPseq använder DMS, som metylerar N1-kvävet i adenosiner och N3-kväve i cytosiner vid deras Watson-Crick-ansikte på ett mycket specifikt sätt13. Genom att använda termostabilt grupp II-intron-omvänd transkriptas (TGIRT-III) i omvänd transkription skapas mutationsprofiler med oöverträffade signal-brusförhållanden, vilket till och med möjliggör dekonvolution av överlappande profiler som genereras av två eller flera alternativa konformationer14,15. Dessutom kan DMS penetrera cellmembran och hela vävnader, vilket möjliggör sondering inom fysiologiska sammanhang. Det är dock en utmaning att generera data av god kvalitet, eftersom variationer i hanteringsproceduren kan påverka resultaten. Därför tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för både in vitro och in-cell DMS-MaPseq för att minska bias och vägleda nykomlingar till metoden genom de svårigheter de kan stöta på. Särskilt mot bakgrund av den senaste SARS-CoV2-pandemin är högkvalitativa data om RNA-virus ett viktigt verktyg för att studera genuttryck och hitta möjliga terapier.

Protocol

OBS: Se materialförteckningen för detaljer relaterade till alla material, programvara, reagenser, instrument och celler som används i detta protokoll.

1. Genspecifik in vitro DMS-MaP

  1. RNA in vitro-transkription
    1. Få sekvensen av RNA av intresse som dubbelsträngat (ds) DNA (t.ex. som DNA-fragment, plasmider eller PCR från redan existerande / genomiskt DNA). Om DNA-sekvensen innehåller en polymerasmotor, hoppa till steg 3.
    2. Utför överlappande PCR för att fästa en RNA-polymeraspromotor uppströms det önskade DNA-fragmentet (framåtprimer för T7-polymeras: 5 'TAATACGACTCACTATAGG + första baser av målsekvens 3').
    3. In vitro transkribera DNA-fragmentet till RNA. Håll alltid RNA på is.
    4. Smält DNA med hjälp av en DNase.
    5. Isolera RNA med hjälp av en kolonnbaserad metod (steg 2.4) eller genom etanolutfällning (steg 2.5). Elute i en lämplig volym och förväntar sig ett utbyte på ~ 50 μg.
    6. Säkerställa RNA-integriteten genom att köra den på en agarosgel; denaturera RNA i 2-3 minuter vid 70 °C innan det körs.
      OBS: Bufferten och agarosen kan innehålla RNaser som bryter ner RNA och kan förorena RNA-provet. Prefabricerade agarosgeler har tidigare använts i detta labb; resultaten (särskilt med RNA) har ibland varit tvetydiga. De bästa resultaten erhölls med agaros eller PAGE-geler.
    7. Direkt användning av lagra RNA vid −80 °C i flera månader om inte nedbrytningen är synlig efter upptining.
  2. In vitro DMS-modifiering (vid 105 mM DMS)
    1. Bered en tillräcklig mängd omveckningsbuffert (0,4 M natriumkakodylat, pH 7,2, innehållande 6 mM MgCl2).
      OBS: För varje reaktion (slutlig volym på 100 μl), tillsätt 89 μL omveckningsbuffert.
    2. För varje reaktion, överför 89 μL omveckningsbuffert till ett bestämt 1,5 ml rör och förvärm vid 37 °C i en termoshaker placerad under en kemisk huva.
      DMS är mycket giftigt och måste alltid förvaras under en kemisk huva tills det släcks av ett reduktionsmedel.
    3. Elute 1-10 pmol RNA i 10 μl nukleasfritt vatten (NFH2O); överför till ett PCR-rör.
    4. Inkubera i en termocykler vid 95 °C i 1 minuter för att denaturera RNA.
    5. Placera omedelbart på ett isblock för att undvika felveckning.
    6. Tillsätt RNA-provet till det avsedda röret med omveckningsbuffert vid 37 °C, blanda väl och inkubera i 10-20 minuter för att återfukta RNA.
      OBS: De flesta RNA kommer att vikas i storleksordningen millisekunder till sekunder, även om undantag finns16.
    7. Tillsätt 1 μl 100 % (10,5 M) DMS till RNA-provet och inkubera i 5 minuter medan du skakar vid 800–1 400 rotationer per minut (rpm).
      OBS: Skakning (eller annat blandningsmedel) i detta steg är avgörande eftersom DMS är hydrofobt och kanske inte helt löses upp i omveckningsbufferten. Avvikelser i reaktionstider kan påverka reproducerbarheten av DMS-reaktiviteterna. För att minimera pipetteringsfel kan DMS lösas i 100% etanol innan det läggs till provet om en slutlig koncentration på 1% (105 mM) DMS bibehålls. För en obehandlad kontroll kan DMS ersättas med dimetylsulfoxid (DMSO) eller vatten.
    8. Efter 5 minuters reaktionstid, släck med 60 μL 100% β-merkaptoetanol (BME), blanda väl och placera omedelbart RNA på is.
      OBS: RNA kan säkert tas bort från huven efter att ha släckt reaktionen med BME för att rengöra den. Direkt exponering av BME för omgivningen bör dock fortfarande undvikas på grund av dess starka lukt och irriterande egenskaper.
    9. Rengör RNA genom utfällning av natriumacetat-etanol (se steg 2.5) eller en kolonnbaserad metod (se steg 2.6) och eluera i 10 μl vatten.
    10. Kvantifiera RNA med hjälp av en spektrofotometer.
    11. Direkt användning av lagra det modifierade RNA vid −80 °C.
      OBS: Långvarig lagring bör undvikas, eftersom RNA är mindre stabilt efter DMS-behandling.
  3. Genspecifik RT-PCR för modifierat RNA
    Se bild 1 för RT-PCR-installationen av de DMS-behandlade fragmenten.
    1. Elute 100 ng modifierat RNA i 10 μl nukleasfritt (NF)H2O. Överför till ett PCR-rör.
    2. Tillsätt 4 μL 5x första strängbuffert (FSB), 1 μL dNTP-blandning (10 mM vardera), 1 μL 0,1 M ditiotreitol (DTT) (undvik frys-upptiningscykler), 1 μL RNas-hämmare, 1 μL 10 μM omvänd primer (enkel primer eller en pool av primers) och 1 μL TGIRT III.
      OBS: För en pool av primers, tillsätt inte 1 μL av 10 μM av varje primer direkt till RT; Blanda i stället primersna först och tillsätt 1 μl från blandningen (vid 10 μM total primerkoncentration).
    3. Inkubera vid 57 °C i 30 minuter till 1,5 timmar (vanligtvis räcker det med 30 minuter för att tillverka en 500 nt-produkt) i en termocykler.
    4. Tillsätt 1 μl 4 M NaOH, blanda med pipettering och inkubera vid 95 °C i 3 minuter för att bryta ned RNA.
      OBS: Detta steg är avgörande eftersom det frigör TGIRT från cDNA genom att bryta ner RNA. Om den hoppas över kan den underordnade PCR påverkas.
    5. Rengör med en kolumnbaserad metod (se steg 2.6) som tar bort primersna tillräckligt och eluera i 10 μl NFH2O.
    6. PCR-förstärka cDNA genom att använda 1 μL av den omvända transkriptionsprodukten per 25 μL av reaktionen med ett PCR-kit utformat för att balansera utbyte och trohet.
      OBS: Primers bör ha en smälttemperatur på ~ 60 °C.
    7. Kör 2 μL av PCR-produkten på en agarosgel eller en prefabricerad agarosgel för att verifiera PCR-framgången.
    8. Helst bör endast ett band visas efter PCR. Om så är fallet, rensa upp reaktionen med en kolumnbaserad metod. Om alternativa band finns, använd den återstående PCR-reaktionen för att skära ut rätt band från gelén. Elute i en tillräckligt liten volym (t.ex. 10 μl).
    9. Kvantifiera de extraherade fragmenten med hjälp av en spektrofotometer.
    10. Indexera dsDNA-fragmenten för sekvensering med hjälp av en metod som passar den önskade sekvenseringsplattformen.

Figure 1
Bild 1: Experimentell inställning för RT-PCR för stora DMS-behandlade fragment. När du utför omvänd transkription på ett modifierat RNA kommer modifieringarna på sekvensen som primerglödgarna till inte att registreras. Således, när fragmenten överstiger 400-500 bp i längd, måste fragment som överlappar varandra i primerregionerna utformas, vilket exemplifieras här. Fragmentens längd beror på sekvenseringsbehoven. Vid användning av parkopplad 150-cykelsekvensering bör fragmenten inte överstiga 300 bp. Förkortningar: RT-PCR = omvänd transkriptionspolymeraskedjereaktion; DMS = dimetylsulfat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

2. Hela genomet DMS-MaP med virusinfekterade celler

OBS: I celler kan DMS-behandling också kombineras med den genspecifika förstärkningsmetoden som beskrivs ovan. Hela genombiblioteket kräver enormt sekvenseringsdjup för att uppnå full täckning på en enda gen. Men om virala RNA utgör en betydande del av det ribodepleterade RNA efter extraktion, skulle helgenomsekvensering vara lämplig. Dessutom kan andra anrikningsmetoder kombineras med hela genombiblioteksgenereringsmetoden.

  1. DMS-behandling
    1. Växa celler infekterade med viruset tills önskat infektionsstadium.
    2. Överför cellbehållaren till en dedikerad rökhuv som är lämplig för hantering av både virus på den erforderliga biosäkerhetsnivån och de kemiska ångor som genereras av medel som DMS.
    3. Tillsätt en 2,5% volym DMS till odlingsmediet och försegla behållaren (vanligtvis en 10 cm platta) med parafilm.
      OBS: Det är lätt att undermodifiera och övermodifiera med DMS. När du lägger DMS direkt till celler är det mycket viktigt att blanda väl. Alternativt kan du förvärma det nya mediet i ett 50 ml koniskt rör vid 37 °C och tillsätta DMS som skakar direkt kraftigt. Dekantera det förbrukade mediet på cellerna och pipettera långsamt i det DMS-innehållande mediet.
    4. Överför till en 37 °C inkubator i 5 minuter.
      OBS: Beroende på hur lång tid det tar att hantera DMS utanför inkubatorn är det möjligt att 5 min leder till övermodifiering. Håll tiden från att lägga till DMS till inkubering till ≤1 min. Om du utför experimentet för första gången rekommenderas att du gör en DMS-titrering och varierar inkubationstiden (mellan 3 min och 10 min) för att hitta den optimala modifieringshastigheten och se till att resultaten är robusta över ett fönster med koncentrationer.
    5. Pipettera försiktigt ut det DMS-innehållande mediet (till lämpligt kemiskt avfall) och tillsätt försiktigt 10 ml stoppbuffert (PBS med 30 % BME [t.ex. 3 ml BME och 7 ml PBS]).
      OBS: Tillsatsen av DMS och BME kan lyfta cellerna från plattan om cellerna inte är starkt vidhäftande. Om cellerna lyfter kan de behandlas som suspensionsceller - istället för att ta bort det DMS-innehållande mediet, lägg till stoppbufferten direkt och skrapa ut cellerna med DMS och BME i ett 50 ml koniskt rör. Pelletera cellerna genom centrifugering i 3 minuter vid 3 000 × g. se till att bli av med eventuell kvarvarande DMS, som kan pelletera under cellerna i stora droppar. Ett extra tvättsteg i 30% BME rekommenderas om DMS-mediet inte kan tas bort från början.
    6. Skrapa cellerna och överför dem till ett 15 ml koniskt rör.
    7. Pellet genom centrifugering vid 3 000 × g i 3 minuter.
    8. Ta bort supernatanten och tvätta 2x med 10 ml PBS.
    9. Ta försiktigt bort så mycket kvarvarande PBS som möjligt.
    10. Lös upp pelleten i en lämplig mängd av RNA-isoleringsreagenset (t.ex. 3 ml för en T75-odlingskolv, 1 ml för en 10 cm platta).
      OBS: Otillräckliga mängder av reagenset kan påverka RNA-utbytet.
  2. RNA-extraktion och ribosomalt RNA (rRNA) utarmning
    1. Till 1 ml homogeniserade celler i RNA-isoleringsreagenset, tillsätt 200 μL kloroform, virvel i 15-20 s tills den är ljusrosa och inkubera sedan i upp till 3 minuter tills fasseparationen är synlig.
      OBS: Den rosa lipidfasen bör sätta sig i botten. Om så inte är fallet var virveltiden sannolikt otillräcklig.
    2. Snurra med maximal hastighet (~ 20 000 × g) i 15 min vid 4 °C.
    3. Överför den övre vattenfasen till ett nytt rör.
    4. Rengör RNA genom utfällning av natriumacetat-etanol (se steg 2.5) eller en kolonnbaserad metod (se steg 2.6) och eluera i en tillräcklig volym NFH2O.
    5. Kontrollera RNA-integriteten på en agarosgel. Leta efter två band som motsvarar de två ribosomala underenheterna.
    6. Töm rRNA med den föredragna metoden och eluera i en tillräcklig volym (vanligtvis 20-50 μL) NFH2O.
      OBS: För nedströmsapplikationer föreslås ~ 500 ng av totalt RNA i en volym av 8 μL. Icke-ribosomala RNA utgör vanligtvis endast 5% -10% av det totala RNA.
    7. Kvantifiera med hjälp av en spektrofotometer.
  3. Generering av bibliotek
    1. Använd genspecifik RT-PCR eller andra metoder för att generera bibliotek15. Om slumpmässiga hexamerer används för grundning, tillsätt ett inkubationssteg vid en låg Tm (37–42 °C) för att möjliggöra hexamerglödgning.
      OBS: Standardbiblioteksgenereringssatser kan också användas genom att ersätta RT-enzymet med TGIRT och ändra RT-temperaturen till 57 °C.
  4. Kolumnbaserad RNA-rensning med RNA-renings- och koncentratorkolumnerna
    OBS: Alla steg ska utföras vid rumstemperatur.
    1. Tillsätt NFH2Otill provröret för att bringa det till en volym av 50 μl.
    2. Tillsätt 100 μl bindningsbuffert och 150 μl 100 % etanol till provet.
    3. Blanda och överför till en spinnkolumn.
    4. Snurra på 10 000-16 000 × g i 30 s; Kassera genomströmningen.
    5. Tillsätt 400 μL RNA-prepbuffert.
    6. Snurra på 10 000-16 000 × g i 30 s; Kassera genomströmningen.
    7. Tillsätt 700 μl RNA-tvättbuffert.
    8. Snurra på 10 000-16 000 × g i 30 s; Kassera genomströmningen.
    9. Tillsätt 400 μl RNA-tvättbuffert.
    10. Snurra vid 10 000-16 000 × g i 30 s; Kassera genomströmningen.
    11. (Valfritt) Överför kolonnen till ett nytt uppsamlingsrör och snurra på 10 000-16 000 × g i 2 minuter.
    12. Överför kolonnen till ett rent RNAse-fritt rör och tillsätt en lämplig mängd NFH2O.
    13. Snurra på 10 000-16 000 × g i 1 min.
  5. Syra fenol-kloroform RNA-extraktion.
    1. Tillsätt en lika stor volym syrafenol:kloroform:isoamylalkohol.
    2. Virvla noggrant och centrifugera vid 14 000 × g i 5 minuter.
    3. Om det inte finns någon fasseparation, tillsätt 20 μL 2 M NaCl och upprepa centrifugeringen.
    4. Överför vattenfasen till ett nytt rör.
    5. Tillsätt 500 μl isopropanol och 2 μl co-fällningsmedel.
    6. Blanda och inkubera vid RT i 3 min; inkubera sedan vid −80 °C över natten.
    7. Pelletera RNA genom centrifugering vid maximal hastighet (~ 20 000 × g) i 30 min vid 4 °C.
    8. Tvätta pelleten med 200 μL iskall 70% etanol.
    9. Snurra med maximal hastighet (~ 20 000 × g) i 5 minuter; Kassera genomströmningen.
    10. Återsuspendera pelleten i lämplig mängd NFH2O.
  6. Kolumnbaserad cDNA-rensning med oligo clean- och concentratorkolumnerna
    OBS: Alla steg ska utföras vid rumstemperatur.
    1. Tillsätt NFH2Otill provröret för att bringa det till en volym av 50 μl.
    2. Tillsätt 100 μl bindningsbuffert och 400 μl 100 % etanol.
    3. Blanda och överför till en spinnkolumn.
    4. Snurra på 10 000-16 000 × g i 30 s; Kassera genomströmningen.
    5. Tillsätt 750 μl DNA-tvättbuffert.
    6. Snurra på 10 000-16 000 × g i 30 s; Kassera genomströmningen.
    7. (Valfritt) Överför kolonnen till ett nytt uppsamlingsrör och snurra på 10 000-16 000 × g i 2 min.
    8. Överför kolonnen till ett rent RNAse-fritt rör och tillsätt en lämplig mängd NFH2O.
    9. Snurra på 10 000-16 000 × g i 1 min.

3. Analys av sekvenseringsdata

OBS: För att skapa RNA-sekundära strukturmodeller från DMS-MaP-sekvenseringsdata måste de resulterande .fastq-filerna bearbetas med flera olika steg. Dessa steg kan utföras automatiskt med hjälp av

  1. Trimma adaptersekvenserna med TrimGalore eller Cutadapt.
  2. Mappa läsningarna till referenssekvenserna (.fasta-format) med Bowtie2.
  3. Räkna läsningarna med specialiserad RNA-strukturprogramvara (t.ex. DREEM14, RNA-Framework17 eller liknande) och skapa reaktivitetsprofiler.
  4. (Valfritt) Gruppera läsningarna för att hitta alternativa RNA-konformationer med DREEM14, DRACO17, DANCE-MaP18 eller liknande.
  5. Förutsäga den minsta fria energistrukturen baserat på reaktivitetsprofilerna med hjälp av RNAStructure12, WienRNA eller liknande.
  6. Visualisera RNA11-strukturen med VARNA (https://varna.lri.fr/) eller liknande.
    OBS: För praktiska egenskaper innehåller programvara som DREEM (www.rnadreem.org) och RNA-Framework19 i stor utsträckning steg 1–-5 i sina pipelines, vilket effektiviserar analysprocessen. Alla strukturförutsägelser bör dock hanteras med försiktighet (t.ex. genom att verifiera strukturens överensstämmelse med data20.

Representative Results

Genspecifik in vitro DMS-MaP
För att studera 5'UTR för SARS2 beställdes virusets första 300 bp som en gBlock-sekvens, tillsammans med tre primers. Dessa inkluderade två primers för att sprida fragmentet ("FW" & "RV") via PCR, samt en för att fästa T7-promotorn ("FW-T7"). Dessa sekvenser kan ses i tabell 1.

Namn Sekvens (5'->3')
FW ATTAAAGGTTTATACCTTCCCAGGTAAC
RV GCAAACTGAGTTGGACGTGT
FW-T7 TAATACGACTCACTATAGG ATTAAAGGTTTATACCTTCCCAGGTAAC

Tabell 1: Primersekvens för DMS-MaP RT-PCR för SARS-CoV2 5'UTR. Här behövs FW-T7 och RV för att generera en DNA-mall för in vitro-transkription, RV används i omvänd transkription och FW-RV-primerparet används i den efterföljande PCR-förstärkningen av cDNA. Primersna glödgas till början av SARS-CoV2-genomet (FW) och sekvensen direkt nedströms om intresseområdet. Förkortningar: DMS-MaP = Mutationsprofilering med sekvensering med användning av dimetylsulfat; RT-PCR = omvänd transkriptionspolymeraskedjereaktion; SARS-CoV2 = allvarligt akut respiratoriskt syndrom-coronavirus 2; UTR = oöversatt region; RV = omvänd primer; FW = framåt primer.

För att generera RNA från gBlock-fragmentet fästes sekvensen av T7-polymeraspromotorn med användning av överlappande PCR med PCR-premixen enligt schemat som ses i figur 2A. Från det långsträckta fragmentet genererades RNA med användning av T7 Transcription Kit. DNA-mallen smältes därefter med hjälp av DNase och RNA isolerade med hjälp av RNA Clean & Concentrator-kolumner.

Kvalitetskontroll av in vitro-transkriptionen gjordes genom att köra RNA-produkten på en 1% agarosgel tillsammans med en ssRNA-stege. Eftersom det bara fanns ett band synligt utfördes in vitro DMS-sondering och RT-PCR (se figur 2B).

För att verifiera framgången med PCR-reaktionen kördes provet på en 2% agarosgel med hjälp av en dsDNA-stege. Efter indexering bör bandet köras ~ 150 bp högre på samma gel, vilket står för storleken på indexeringsprimrarna.

Figure 2
Figur 2: In vitro-transkription av DNA-mallen. a) För att in vitro transkribera en DNA-mall som ännu inte har en inneboende RNA-polymeraspromotor måste mallen först bifogas med överlappande PCR. Detta görs genom att använda en framåtriktad primer, som inkluderar sekvensen TAATACGACTCACTATAGG (i fallet med T7-RNA-polymeraset) uppströms de första baserna som överlappar det önskade fragmentet. Den understrukna basen här symboliserar polymerasets transkriptionsstartplats. När promotorn har fäst vid dsDNA-fragmentet kan den transkriberas av T7-polymeraset. Viktigt är att polymeraset använder strängen i motsats till den nämnda promotorsekvensen som mall (blå), vilket effektivt skapar RNA som är identiskt med sekvensen omedelbart nedströms den angivna promotorsekvensen (röd). (B) En 1% agarosgel med en ssRNA-stege (bana 1) och den in vitro-transkriberade RNA-produkten vid 300 nt (bana 2). (C) En 2% agarosgel med GeneRuler 1 kb plus Ladder (lane 1), PCR-produkten efter RT-PCR som körs vid 300 bp (lane 2) och det indexerade fragmentet efter biblioteksberedning som körs vid 470 bp (lane 3). Förkortningar: RT-PCR = omvänd transkriptionspolymeraskedjereaktion; DMS = dimetylsulfat; nt = nukleotider; dsDNA = dubbelsträngat DNA; ssRNA = enkelsträngat RNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Helgenom in vivo DMS-MaP med virusinfekterade celler
Före DMS-behandlingen infekterades HCT-8-cellerna med OC43. När en cytopatisk effekt (CPE) observerades 4 dagar efter infektion (dpi) (som ses i figur 3A) behandlades dessa celler och RNA extraherades och ribodepleterades. När man körde det totala RNA på en agarosgel var två ljusa band synliga, som stod för 40S- och 60S-underenheterna i ribosomen, som utgör cirka 95% av den totala RNA-massan (se figur 3B). När RNA-extraktion misslyckades eller försämrades (t.ex. genom flera frys-upptiningscykler) var RNA-nedbrytningsprodukterna synliga på botten av gelén (se figur 3C, andra körfältet). Dessutom, efter rRNA-utarmning, försvann de två ljusa banden och lämnade ett smet i körfältet (se figur 3C, tredje körfältet). Slutligen, efter biblioteksförberedelse, hade proverna varierande storleksfördelningar och visades som ett smet på den slutliga PAGE-gelén. Bandet skars ut mellan 200 nukleotider (nt) och 500 nt, i överensstämmelse med den 150 x 150 parade sekvenseringskörning som planeras för att analysera dessa bibliotek. Viktigast av allt var att adapterdimererna som körs vid ~ 150 nt separerades ut (se figur 3D).

Figure 2
Figur 3: Kontrollpunkter för in vivo DMS-MaP med virusinfekterade celler. (A) Ljusmikroskopibild av virusinfekterade HCT-8-celler, 4 dagar dpi. För att erhålla högsta möjliga utbyte av viralt RNA från det totala RNA samtidigt som de negativa effekterna på grund av celldöd minimeras, bör DMS läggas till när CPE startar eller till och med innan det, vilket ses på bilden. (B) En 1% agarosgel med sex prover med 1 μg totalt RNA. I varje körfält är två ljusa band, som står för 40S- och 60S-underenheterna, synliga, eftersom ribosomalt RNA utgör ~ 95% av totalt RNA. Obs: DMS-behandling i cellen orsakar viss RNA-fragmentering och utstrykning, men de två rRNA-banden bör fortfarande vara synliga. Mild fragmentering efter modifiering tolereras eftersom informationen som innehåller metyleringsmärket genereras och rapporterar om RNA-strukturen under DMS-inkubationen medan cellerna fortfarande lever. (C) En 1% Agarosgel av GeneRuler 1 kb plus stege DNA-markör (lane 1) totalt RNA som tidigare lagrats vid −80 ° C i 6 månader (lane 2) och ribodepleted RNA (lane 3). Vid lagring av RNA under lång tid med flera frys-tina cykler börjar RNA brytas ned och bör eventuellt inte användas för sonderingsexperiment. Dessutom, efter att ha ribodepleterat det totala RNA, börjar de två ljusa banden, som står för 40S- och 60S-underenheterna i ribosomen, blekna och ett smet av de återstående RNA börjar visa. (D) En PAGE-gel av GeneRuler 1 kb plus steg-DNA-markör (bana 1) och ett biblioteksprov av helgenomberedt RNA. Gelén bör skäras ut baserat på sekvenseringsbehoven. För en sekvensering i parat slut som sträcker sig över 150 cykler från båda sidor, bör gelén skäras ut mellan 300 bp och 500 bp. Adapterdimerer (körs vid 170 bp) ska separeras ut. Förkortningar: DMS-MaP = Mutationsprofilering med sekvensering med användning av dimetylsulfat; dpi = dagar efter infektion; CPE = cytopatisk effekt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Efter sekvenseringen analyserades .fastq-filerna genom att skicka ett jobb till DREEM-webbservern (http://rnadreem.org/) tillsammans med en .fasta-referensfil. Utdata som genereras av servern inkluderar kvalitetskontrollfiler som genereras av fastqc (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) och TrimGalore (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/), liksom andra utdatafiler som innehåller befolkningens genomsnittliga mutationsfrekvenser. Förutom diagrammet som visar mutationsfrekvenserna med ett interaktivt .html (se figur 4A) -format och en .csv-fil med de råa reaktiveringarna per bas och en struct_constraint.txt-fil, läsbar av flera RNA-strukturförutsägelseprogram, inkluderar detta också en bitvektor.txt filrapportering om de lästa mutationerna. Från dessa beräknades befolkningsmedelstrukturerna genom att skicka in .fasta- och struct_constraint.txt-filerna till RNAfold-webbservern (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi). Detta använder ViennaRNA-programvaran för att generera strukturförutsägelser baserade på minsta fria energi, som kan ses online eller laddas ner i ct- eller Wien-format. För att generera RNA-strukturmodeller skickades dessa nedladdningsbara filer till VARNA (https://varna.lri.fr/, se figur 4B). Slutligen kan bitvector.txt filer användas av den stabila versionen av DREEM (https://codeocean.com/capsule/6175523/tree/v1) för att söka efter alternativa RNA-konformationer. För att få bra strukturmodeller med DREEM bör en täckning på 10 000 läsningar per bas uppnås; För klustring kan upp till 100 000 läsningar per bas krävas. En översikt över hela arbetsflödet finns i figur 4C.

Figure 4
Figur 4: Exemplifierande data erhållna från kemiska sonderingsexperiment av SARS-CoV2 5'UTR. (A) Reaktivitetsprofil för de första 300 baserna i SARS-CoV2-genomet färgat efter bas (A: röd, C: blå, U: grön, G: gul). De råa reaktiviteterna beräknas som den absoluta mutationsfrekvensen dividerad med täckningen. Baser med öppen konformation har höga reaktivitetsvärden; baser som ägnar sig åt basparning har låga reaktivitetsvärden. u och G modifieras inte av DMS och har låga reaktivitetsvärden, som härrör från polymerasotrohet. Förutsägelserna gjordes med DREEM-webbservern. (B) Strukturmodell för SARS-CoV2 5'UTR som förutsagts från reaktivitetsvärden gjorda med VARNA. Baser med höga reaktivitetsvärden är färgade i rött; Baser med låga reaktivitetsvärden är färgade i vitt. (C) Arbetsflöde för DMS-MaP-analysen som börjar med .fastq-filerna som erhållits från sekvensering. Dessa kan kvalitetskontrolleras med fastqc; adaptersekvenserna trimmas med TrimGalore och mappas sedan tillbaka till en referenssekvens med Bowtie2. Från de erhållna .bam-filerna räknar DREEM mutationerna i varje läsning, vilket skapar en mutationskarta eller .bitvector.txt fil. Dessa rapporterar mutationerna för varje läsning på ett positionsberoende sätt, baserat på vilket populationens genomsnittliga reaktivitetsprofiler kan skapas. Alternativt kan bitvektorer grupperas med DREEM för att söka efter alternativa RNA-konformationer. Slutligen visualiseras de erhållna strukturmodellerna med hjälp av programvara (t.ex. VARNA). Förkortningar: DMS-MaP = Mutationsprofilering med sekvensering med användning av dimetylsulfat; SARS-CoV2 = allvarligt akut respiratoriskt syndrom-coronavirus 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Protokollet beskriver här hur man undersöker RNA in vitro och i celler med hjälp av DMS-mutationsprofileringsexperiment. Dessutom ger den instruktioner om hur man förbereder bibliotek för Illumina-sekvensering för att generera genspecifika data och analysera de erhållna .fastq-filerna. Dessutom kan genomomfattande biblioteksmetoder användas. Genspecifik RT-PCR producerar dock högsta kvalitet och mest robusta data. Därför, om man jämför mellan prover, är det viktigt att se till att de är förberedda med identiska sekvenseringsstrategier, eftersom biblioteksgenereringen orsakar viss bias. Reproducerbarheten bör alltid mätas med hjälp av replikat.

Flera försiktighetsåtgärder
RNA är en instabil molekyl som är känslig för nedbrytning både genom förhöjda temperaturer och av RNaser. Därför rekommenderas särskilda åtgärder - användning av personlig skyddsutrustning (PPE), RNAse-fritt material och RNAse-hämmare. Viktigast av allt bör RNA hållas på is när det är möjligt. Detta gäller särskilt metylerat RNA, vilket är ännu känsligare för höga temperaturer.

Det är viktigt att bekräfta att RNA-strukturen av intresse inte är känslig för DMS-koncentrationen och buffertförhållandena. Buffertar som 100 mM Tris, 100 mM MOPS och 100 mM HEPES vid pH 7-7,5 ger en hög signal men kanske inte är tillräckliga för att bibehålla pH under reaktionen21. Eftersom DMS hydrolyserar i vatten, vilket minskar pH, är en stark buffert avgörande för att upprätthålla ett neutralt pH under modifieringsreaktionen. Tillsatsen av bicine har visat sig hjälpa till att upprätthålla pH som något grundläggande21 men resulterar i låg DMS-modifiering på Gs och Us, vilket kan vara informativt men bör analyseras separat på grund av produktionen av en mycket lägre signal än As och Cs och diskuteras inte vidare i detta protokoll.

I genspecifik RT-PCR transkriberas det modifierade RNA omvänt till DNA och förstärks i fragment av PCR. Medan storleken på RNA teoretiskt kan vara obegränsad, bör dessa PCR-fragment inte överstiga en längd av 400-500 baspar (bp) för att förhindra bias under omvänd transkriptionsreaktion. Helst bör fragmenten ligga inom ramen för sekvenseringskörningen (dvs. om sekvensering utförs med hjälp av ett 150 x 150 cykelparat sekvenseringsprogram, bör ett enda fragment inte överstiga 300 bp). När du använder sekvenseringsprogram med färre cykler kan PCR-produkterna fragmenteras med hjälp av en dsDNase. Eftersom sekvenser inom primersekvenserna inte innehåller någon strukturell information måste fragmenten dessutom överlappa varandra när det sonderade RNA består av >1 fragment. RT-reaktioner kan innehålla flera RT-primers för olika fragment (upp till 10 olika RT-primers). Beroende på sekvenserna kan sammanslagning av RT-primers göra omvänd transkription mindre effektiv men fungerar vanligtvis bra. Varje PCR-reaktion bör utföras separat.

Vid sondering av RNA med DMS spelar de experimentella förhållandena en ytterligare roll, eftersom många RNA är termodynamiskt instabila och ändrar deras konformation baserat på miljöfaktorer som temperatur. För att undvika oegentligheter bör de experimentella betingelserna hållas så konstanta som möjligt, även med avseende på reaktionstider. Buffertförhållandena verkar vara utbytbara till en viss grad 17,20,22,23 när de grundläggande förhållandena upprätthålls - buffringskapaciteten och närvaron av monovalenta (Na) och tvåvärda joner (Mg) - för att säkerställa korrekt vikning av RNA 24.

När det gäller biblioteksberedningen av modifierade RNA måste flera aspekter beaktas. För det första, som nämnts tidigare, är modifierade RNA mindre stabila än deras omodifierade motsvarigheter, vilket innebär att de kan kräva optimering av fragmenteringstiderna för optimal fragmentstorleksfördelning. Dessutom använder vissa RNA-biblioteksberedningssatser, liksom många andra RNAseq-metoder, slumpmässiga primers i omvänd transkriptionssats. Detta kan leda till lägre täckning av referensen, särskilt i 3 'av en gen, och i slutändan till otillräckligt täckningsdjup. Om täckningen för en viss region är för låg kan det vara nödvändigt att ta bort dessa baser från strukturförutsägelsen. Förutom RT-PCR och RNAseq-kit med hela genomet kan andra biblioteksberedningsmetoder användas. Protokoll som inkluderar ligering av 3'- och/eller 5'-adaptrar till RNA är fördelaktiga vid användning av små fragment av RNA eller när förlust av sonderingsinformation i primerregionerna måste undvikas.

Slutligen måste analysen av de kemiska sonderingsexperimenten alltid tolkas noggrant. För närvarande finns det ingen programvara som förutsäger RNA-strukturen för något RNA från sekvensen ensam med hög noggrannhet. Även om kemiska sondbegränsningar förbättrar noggrannheten avsevärt, är det fortfarande utmanande att generera bra modeller för långa RNA (> 500 nt). Dessa modeller bör testas ytterligare med andra metoder och/eller mutagenes. RNA-förutsägelseprogramvara optimerar för det maximala antalet baspar, vilket avsevärt straffar öppna konformationer, vilket kanske inte exakt representerar RNA-vikning5. Således bör den erhållna strukturmodellen testas genom att kvantifiera prediktionsavtalet med underliggande kemiska sonderingsdata (t.ex. av AUROC) och mellan replikat (t.ex. av mFMI), vilket exemplifieras av Lan et al.20.

Helst bör flera experiment i olika system för att utmana den erhållna strukturmodellen användas för att stärka sin hypotes. Dessa kan inkludera användning av in vitro - och in-cell-metoder, kompensationsmutationer och olika cellinjer och arter. Dessutom är råa reaktiviteter ofta lika eller till och med mer informativa än strukturförutsägelser, eftersom de registrerar ögonblicksbilden av "grundsanningen" av RNA-vikningsensemblen. Som sådan är råa reaktiviteter mycket lämpliga och informativa för att jämföra strukturförändringar mellan olika förhållanden. Viktigt är att de lägsta fria energistrukturerna beräknade med hjälp av kemiska sonderingsbegränsningar med beräkningsförutsägelse endast bör användas som en starthypotes mot en komplett strukturmodell.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.

Acknowledgments

Ingen

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 Kb Plus DNA Ladder 10787018 Thermo
2-mercaptoethanol M6250-250ML Sigma
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 AM9720 Thermo
Advantage PCR 639206 Takara
CloneAmp HiFi PCR Premix 639298 Takara
DMS D186309
 		 Sigma
dNTPs 10 mM each U151B Promega
E-Gel EX Agarose Gels, 2% G402022 Thermo precast agarose gels
Ethanol (200 proof) E7023-4X4L Sigma
Falcon tubes, 15 mL, 50 mL
GlycoBlue co-precipitant
HCT-8 cells  ATCC #CCL-244
Invitrogen MgCl2 (1 M) AM9530G fisherscientific
Isopropanol 278475 Sigma
Megascript T7 transcription AM1334 Thermo
NanoDrop spectrophotometer
Novex TBE Gels, 8%, 10 well EC6215BOX Thermo
OC43  ATCC #VR-1558
RiboRuler Low Range RNA Ladder SM1831 Thermo
RNAse H M0297L NEB
Sodium Cacodylate, 0.4 M, pH 7.2 102090-964 VWR
Sodium hydroxide solution S8263-150ML Sigma
SuperScript II Reverse Transcriptase for FSB and DTT 18064014 Thermo
TGIRT-III Enzyme TGIRT50 Ingex
The Oligo Clean & Concentrator D4060 Genesee
The RNA Clean & Concentrator kits are RNA clean up kits R1016 Genesee
TRIzol Reagents 15596018 Thermo RNA isolation reagent
Water, (For RNA Work) (DEPC-Treated, DNASE, RNASE free/Mol. Biol.) BP561-1 fisherscientific
xGen Broad-range RNA Library Prep 16rxn 10009865 IDT
Zymo RNA clean and concentrator columns

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, S. H., et al. Three-dimensional tertiary structure of yeast phenylalanine transfer RNA. Science. 185 (4149), 435-440 (1974).
  2. Robertus, J. D., et al. Structure of yeast phenylalanine tRNA at 3 Å resolution. Nature. 250 (467), 546-551 (1974).
  3. Zaug, A. J., Cech, T. R. In vitro splicing of the ribosomal RNA precursor in nuclei of Tetrahymena. Cell. 19 (2), 331-338 (1980).
  4. Zhao, Y., et al. NONCODE 2016: An informative and valuable data source of long non-coding RNAs. Nucleic Acids Research. 44, D203-D208 (2016).
  5. Vandivier, L. E., Anderson, S. J., Foley, S. W., Gregory, B. D. The conservation and function of RNA secondary structure in plants. Annual Review of Plant Biology. 67, 463 (2016).
  6. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  7. Das, R. RNA structure: A renaissance begins. Nature Methods. 18 (5), 439-439 (2021).
  8. Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. Selective 2′-hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct, versatile and accurate RNA structure analysis. Nature Protocols. 10 (11), 1643-1669 (2015).
  9. Mathews, D. H., et al. Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7287-7292 (2004).
  10. Zuker, M., Stiegler, P. Optimal computer folding of large RNA sequences using thermodynamics and auxiliary information. Nucleic Acids Research. 9 (1), 133-148 (1981).
  11. Lorenz, R., et al. ViennaRNA Package 2.0. Algorithms for Molecular Biology. 6, (2011).
  12. Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: Software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11, (2010).
  13. Wells, S. E., Hughes, J. M. X., Igel, A. H., Ares, M. Use of dimethyl sulfate to probe RNA structure in vivo. Methods in Enzymology. , 479-493 (2000).
  14. Tomezsko, P. J., et al. Determination of RNA structural diversity and its role in HIV-1 RNA splicing. Nature. 582 (7812), (2020).
  15. Zubradt, M., et al. DMS-MaPseq for genome-wide or targeted RNA structure probing in vivo. Nature Methods. 14 (1), (2017).
  16. Woodson, S. A. Compact intermediates in RNA folding. Annual Reviews in Biophysics. 39, (2010).
  17. Morandi, E., et al. Genome-scale deconvolution of RNA structure ensembles. Nature Methods. 18 (3), 249-252 (2021).
  18. Olson, S. W., et al. Discovery of a large-scale, cell-state-responsive allosteric switch in the 7SK RNA using DANCE-MaP. Molecular Cell. 82 (9), 1708-1723 (2022).
  19. Incarnato, D., Morandi, E., Simon, L. M., Oliviero, S. RNA Framework: An all-in-one toolkit for the analysis of RNA structures and post-transcriptional modifications. Nucleic Acids Research. 46 (16), (2018).
  20. Lan, T. C. T., et al. Secondary structural ensembles of the SARS-CoV-2 RNA genome in infected cells. Nature Communications. 13 (1), 1128 (2022).
  21. Homan, P. J., et al. Single-molecule correlated chemical probing of RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (38), 13858-13863 (2014).
  22. Yang, S. L., et al. Comprehensive mapping of SARS-CoV-2 interactions in vivo reveals functional virus-host interactions. Nature Communications. 12 (1), 5113 (2021).
  23. Manfredonia, I., et al. Genome-wide mapping of SARS-CoV-2 RNA structures identifies therapeutically-relevant elements. Nucleic Acids Research. 48 (22), 12436-12452 (2020).
  24. Fischer, N. M., Polěto, M. D., Steuer, J., vander Spoel, D. Influence of Na+ and Mg2+ ions on RNA structures studied with molecular dynamics simulations. Nucleic Acids Research. 46 (10), 4872-4882 (2018).

Tags

Biokemi utgåva 190
Sondering av RNA-struktur med dimetylsulfatmutationsprofilering med sekvensering <em>in vitro</em> och i celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dülk, S. L., Rouskin, S.… More

Dülk, S. L., Rouskin, S. Probing RNA Structure with Dimethyl Sulfate Mutational Profiling with Sequencing In Vitro and in Cells. J. Vis. Exp. (190), e64820, doi:10.3791/64820 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter