Summary
Este protocolo descreve a exposição cirúrgica do gânglio da raiz dorsal (DRG) seguida de GCaMP3 (indicador Ca2+ codificado geneticamente; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Imagem de Ca2+ dos conjuntos neuronais usando camundongos Pirt-GCaMP3 enquanto se aplica uma variedade de estímulos na pata traseira ipsilateral.
Abstract
A imagem por Ca 2+ pode ser usada como proxy da atividade celular, incluindo potenciais de ação e vários mecanismos de sinalização envolvendo a entrada de Ca 2+ no citoplasma ou a liberação de depósitos intracelulares de Ca2+. A imagem de Ca2+ baseada em Pirt-GCaMP3 de neurônios sensoriais primários do gânglio da raiz dorsal (DRG) em camundongos oferece a vantagem da medição simultânea de um grande número de células. Até 1.800 neurônios podem ser monitorados, permitindo que redes neuronais e processos somatossensoriais sejam estudados como um conjunto em seu contexto fisiológico normal em nível populacional in vivo. O grande número de neurônios monitorados permite a detecção de padrões de atividade que seriam difíceis de detectar usando outros métodos. Os estímulos podem ser aplicados na pata traseira do camundongo, permitindo que os efeitos diretos dos estímulos no conjunto de neurônios DRG sejam estudados. O número de neurônios produzindo transientes de Ca 2+, bem como a amplitude de transientes de Ca2+, indica sensibilidade a modalidades sensoriais específicas. O diâmetro dos neurônios fornece evidências de tipos de fibras ativadas (fibras mecanas não nocivas vs. fibras dolorosas nocivas, fibras Aβ, Aδ e C). Neurônios que expressam receptores específicos podem ser geneticamente marcados com td-Tomato e recombinases específicas de Cre juntamente com Pirt-GCaMP. Portanto, a imagem Pirt-GCaMP3 Ca2+ de DRG fornece uma poderosa ferramenta e modelo para a análise de modalidades sensoriais específicas e subtipos de neurônios atuando como um conjunto em nível populacional para estudar dor, coceira, toque e outros sinais somatossensoriais.
Introduction
Os neurônios sensoriais primários inervam diretamente a pele e transportam informações somatossensoriais de volta ao sistema nervoso central 1,2. Gânglios da raiz dorsal (DRGs) são aglomerados de corpos celulares de 10.000-15.000 neurônios sensoriais primários 3,4. Os neurônios DRG apresentam diversos tamanhos, níveis de mielinização e padrões de expressão gênica e receptora. Neurônios de menor diâmetro incluem neurônios sensíveis à dor e neurônios de maior diâmetro tipicamente respondem a estímulos mecânicos não dolorosos 5,6. Distúrbios nos neurônios sensoriais primários, como lesão, inflamação crônica e neuropatias periféricas, podem sensibilizar esses neurônios a vários estímulos e contribuir para dor crônica, alodínia e hipersensibilidade à dor 7,8. Portanto, o estudo dos neurônios DRG é importante na compreensão da somatosensação em geral e de muitos transtornos de dor e coceira.
Neurônios disparando in vivo são essenciais para a somatosensação, mas até recentemente, ferramentas para estudar gânglios intactos in vivo eram limitadas a um número relativamente pequeno de células 9. Aqui, descrevemos um método poderoso para estudar os potenciais de ação ou atividades de neurônios em nível populacional in vivo como um conjunto. O método emprega imagens baseadas na dinâmica citoplasmática do Ca2+. Os indicadores fluorescentes sensíveis ao Ca 2+ são bons proxies para medir a atividade celular devido à concentração normalmente baixa de Ca2+ citoplasmático. Esses indicadores têm permitido o monitoramento simultâneo de centenas a vários milhares de neurônios sensoriais primários em camundongos 9,10,11,12,13,14,15,16 e ratos 17. O método de imagem in vivo de Ca2+ descrito neste estudo pode ser usado para observar diretamente as respostas em nível populacional a estímulos mecânicos, frios, térmicos e químicos.
A proteína de membrana ligadora de fosfoinositídeos, Pirt, é expressa em níveis elevados em quase todos (>95%) neurônios sensoriais primários18,19 e pode ser usada para conduzir a expressão do sensor Ca 2+, GCaMP3, para monitorar a atividade dos neurônios in vivo20. Neste protocolo, são descritas técnicas para a realização de cirurgia DRG in vivo, imagem por Ca2+ e análise no DRG lombar 5 (L5) direito de camundongos Pirt-GCaMP314 usando microscopia confocal de varredura a laser (LSM).
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Protocol
Todos os procedimentos aqui descritos foram realizados de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Texas em San Antonio.
NOTA: Uma vez iniciadas, a cirurgia dos animais (etapa 1) e os exames de imagem (etapa 2) devem ser concluídos de forma contínua. A análise dos dados (etapa 3) poderá ser realizada posteriormente.
1. Cirurgia e fixação do animal para imagem DRG L5 do lado direito
NOTA: Camundongos machos e fêmeas Pirt-GCaMP3 C57BL/6J com 8 semanas de idade ou mais foram usados neste estudo. Embora ambos os sexos possam ser igualmente bem visualizados, os ratos devem ter pelo menos 8 semanas de idade devido à expressão fraca ou intermitente de Pirt em ratos mais jovens. Os camundongos Pirt-GCaMP3 C57BL/6J foram gerados na Universidade Johns Hopkins14. O DRG de ambos os lados pode ser obtido por imagem, e outros DRGs lombares (por exemplo, lombar 4) podem ser imageados. Os tempos dados são estimativas para um cirurgião experiente. Problemas técnicos ocasionais, como aumento do sangramento, podem aumentar o tempo necessário.
- Preparar uma solução salina estéril contendo 40 mg/mL de quetamina e 6 mg/mL de xilazina. O volume total deve ser de pelo menos 9 μL/g de massa corporal para cirurgia e eutanásia após exames de imagem.
CUIDADO: A cetamina é prejudicial se injetada, engolida ou quando entra em contato com o olho. Manuseie com cuidado. - Certifique-se de que todas as ferramentas cirúrgicas estejam limpas e esterilizadas por autoclavação ou outro método aprovado pelo NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
- Entre 15 e 25 minutos antes da cirurgia, injetar um camundongo Pirt-GCaMP3 por via intraperitoneal (i.p.) com ~2,25 μL de cetamina/xilazina para cada grama de peso corporal (90 mg/kg de ketamina, 13,5 mg/kg de xilazina). Não exceder 120 mg/kg de cetamina.
- Dentro de 15 a 25 minutos após a injeção de anestesia (passo 1.3), verifique se o rato atingiu o plano cirúrgico da anestesia pinçando a pata traseira contralateral (não a pata traseira ipsilateral/direita). A ausência do reflexo de retirada dos membros posteriores garante que um plano cirúrgico de anestesia seja alcançado.
NOTA: O reflexo de retirada dos membros posteriores é usado durante todo o experimento para monitorar a anestesia. Use sempre a pata traseira contralateral. - Coloque o rato numa almofada aquecida para manter a temperatura corporal a 37 °C.
NOTA: Pode ser útil manter a cabeça do mouse no lugar com um quadro estereotáxico (consulte Tabela de Materiais), ou outro quadro com base na preferência do pesquisador. - Localize o aumento lombar sentindo o osso pélvico do rato. Faça a barba na parte de trás do rato acima da área de alargamento lombar. Este passo deve levar ~ 90 s.
NOTA: O mouse pode ser brevemente removido da almofada aquecida para barbear. - Realizar incisão retangular de três lados (8 mm x 20 mm) acima do alargamento lombar com tesoura e dobrar a pele com pinça (Figura 1A). Esta etapa leva ~2 min.
OBS: Os pesquisadores também podem utilizar pinça hemostática ou afastador para manter a incisão aberta. Esta não é uma cirurgia de sobrevivência, portanto, limpeza adicional da área cirúrgica não é necessária; no entanto, pode ser feito usando iodopovidona. O maior tamanho de incisão aceitável é dado aqui. Uma incisão menor é preferível a uma incisão maior. - Use a tesoura de dissecção de mola de 13 mm para fazer incisões de 3-4 mm no lado direito da coluna. Use tesoura para cortar a pele e os músculos para os lados, a fim de expor a coluna vertebral (Figura 1B). Esta etapa leva ~3 min.
- Use uma tesoura de 8 mm para limpar o processo transversal do DRG L5 do lado direito, cortando o músculo e o tecido conjuntivo enquanto tenta minimizar o sangramento. Use algodão e/ou gelfoam para absorver o sangue. A vértebra L5 é a primeira vértebra rostral ao osso da pelvice.
NOTA: Esta etapa leva ~3 min e pode levar tempo extra se o animal sangrar mais do que o normal. - Abra o processo transversal L5 do lado direito usando rongeurs de Friedman-Pearson ou pinças finas fortes. Tenha cuidado para não tocar no DRG (Figura 1C).
NOTA: Este passo leva ~2 minutos, mas pode levar tempo extra se o animal sangrar mais do que o normal. - Não prossiga até que o sangramento pare completamente. Evite sangramento na superfície DRG usando espuma de gel ou algodão. Esta etapa leva de 1 a 4 minutos.
- Mova o mouse e a almofada de aquecimento para o palco personalizado (Figura 2A,B). Use fita adesiva para prender o animal e a almofada de aquecimento no lugar. Coloque o nariz do animal no cone nasal para que o animal possa receber anestesia contínua com isoflurano. Fixe a pata traseira direita saindo do palco para que os estímulos possam ser facilmente aplicados na pata. Esta etapa leva 3 min.
- Fixe a coluna no lugar com as pinças de estágio sobre a pele nas vértebras e/ou no osso pélvico apenas rostral e caudal ao DRG L5. Ajustar as abraçadeiras e o estágio para tornar a superfície do DRG o mais nivelada possível (Figura 2B,C).
NOTA: Pode ser necessário aparar o tecido situado entre o DRG e o objetivo. - Coloque o estágio abaixo do microscópio de modo que a objetiva fique 8 mm diretamente acima do DRG quando abaixada (Figura 3A,B). Insira o termômetro retal.
NOTA: A distância do DRG à objetiva pode variar de acordo com a objetiva, o microscópio e o animal. - Conecte as linhas de energia à almofada de aquecimento e ao termômetro retal. Conecte o cone nasal às linhas de gás isoflurano.
Figura 1: Exemplo de cirurgia de exposição ao DRG . (A) Uma pequena área foi raspada e a pele foi cortada e dobrada para trás. A incisão é de ~10 mm no eixo rostral-caudal. (B) Uma incisão foi feita no lado direito da coluna vertebral e o tecido muscular e conjuntivo foram cortados, expondo o processo transverso do lado direito de L5. O sangue foi absorvido com gelfoam. (C) O processo transversal foi limpo e o osso sobre o DRG foi removido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Montagem do mouse em um estágio personalizado para geração de imagens DRG . (A) O estágio personalizado é mostrado. Consiste em uma placa de base e uma placa para o animal. A placa de montagem do animal está em uma esfera de travamento e junta giratória do soquete. Um cone nasal com linhas para fornecer mistura de oxigênio / isoflurano e uma linha de gás residual juntamente com uma almofada de aquecimento envolta em folha de alumínio são colados à placa de montagem do animal. Dois braços, cada um feito de três esferas de travamento e juntas giratórias do soquete, são aparafusados à placa de base. Cada braço tem uma braçadeira feita de pinça com um parafuso para aperto e afrouxamento. (B) O animal é montado na placa de montagem do animal. Seu nariz é colocado no cone do nariz. As braçadeiras são colocadas sobre a pele segurando a coluna vertebral e o osso pélvico. A pata traseira direita (ipsilateral) é colada para ficar para fora para facilitar o acesso para a aplicação dos estímulos. (C) Imagem em close-up da coluna vertebral pinçada e do osso pélvico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Animal em estágio personalizado é colocado abaixo da objetiva do microscópio. (A) Uma visão grande angular do palco, animal e microscópio. Fios para o controlador de temperatura DC e linhas para entrada de oxigênio / isoflurano e linha de gás residual são visíveis à esquerda. (B) Uma visão de perto do animal abaixo da objetiva do microscópio. O DRG está ~8 mm abaixo da objetiva. O termômetro retal é inserido e o nariz fica dentro do cone nasal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. Imagem DRG
- Use um microscópio confocal vertical com objetiva DIC 10x/0,4 e o software associado (consulte a Tabela de Materiais) para obtenção de imagens. Use as configurações do filtro verde (FITC): excitação 495 nm, emissão 519 nm, comprimento de onda de detecção 500-580 nm, dispositivo de imagem GaAsP-Pmt1, detector GaAsP-PMT.
NOTA: Para outros microscópios, use as configurações recomendadas pelo fabricante. - Encontre a superfície do DRG com o microscópio. Ajuste as pinças no palco de modo que a superfície DRG seja o mais nivelada possível e que a área de superfície máxima seja visualizada no plano focal.
NOTA: A escolha da objetiva pode variar dependendo do microscópio utilizado e da preferência do usuário. A escolha do software depende do microscópio. Um DRG de nível resulta em imagens mais claras, permite que o software construa filmes mais claros, permite a geração de imagens de mais neurônios e torna a análise mais fácil e precisa. - Fornecer isoflurano a 1%-1,5% no fluxo de oxigênio para o cone nasal para garantir que o camundongo permaneça anestesiado. Monitorar o animal cuidadosamente durante todo o procedimento para manter a anestesia com isoflurano sem sobredosagem.
OBS: A quantidade de isoflurano necessária para manter a anestesia pode variar de acordo com o animal e o estímulo individual. Normalmente, 1,5% é suficiente. Se o animal se movimentar durante o estímulo, o isoflurano deve ser aumentado. Se a respiração se tornar superficial, o isoflurano deve ser diminuído. Antes de cada estímulo, testar o reflexo de retirada do membro posterior na pata traseira contralateral.
CUIDADO: O isoflurano pode ser prejudicial ou causar tonturas ou sonolência se inalado. Evite a inalação e use apenas em uma área bem ventilada. - Carregue o protocolo de varredura rápida do microscópio.
- Use as configurações típicas para varredura rápida: tamanho do voxel 2,496 μm x 2,496 μm x 16 μm, 512 x 512 pixels, 10 fatias ópticas Z-stack, 1 unidade arejada (AU)/32 μm, 1% 488 nm de potência do laser 5 mW, tempo de pixel 1,52 μs, tempo de linha 0,91 ms, tempo de quadro 465 ms, velocidade de varredura LSM 8, varredura bidirecional, Detector GaAsP-PMT ganho 650 V, ganho digital 1. As configurações ideais podem variar de acordo com o microscópio e o animal.
- Para configurar um protocolo de varredura rápida, clique na guia Aquisição . Em Parâmetros de Aquisição, clique na guia Quadros . Clique em Predefinições > 512 x 512 para configurar o microscópio para gravar uma imagem de 512 pixels x 512 pixels. Isso, por sua vez, definirá os valores X e Y do tamanho do voxel com base no tamanho da imagem, que é determinado pelo software do microscópio.
- Em Parâmetros de Aquisição, clique na guia Canais . Clique na caixa Track2 . Use o menu suspenso ao lado da caixa Track2 para selecionar Verde (FITC). Uma nova guia será aberta abaixo de Track2.
- Ao lado de Lasers, clique na caixa 488 . Isso definirá os comprimentos de onda de excitação e emissão.
- Ao lado do controle deslizante de 488 nm, defina a potência do laser para 1%. Clique no botão 1 UA para definir a aprovação para 1 unidade Airy. Em FITC, defina Master Gain como 650 V, Digital Offset como 0 e Digital Gain como 1.
- Na guia Aquisição , marque a caixa Z-Stack . Clique no botão Ao vivo para ver uma imagem ao vivo do gânglio. Gire o botão do plano focal até que apenas um pequeno arco de neurônios seja visível.
- Em Parâmetros de Aquisição, clique na guia Z-Stack > botão Definir Último . Gire o botão do plano focal para baixo até que apenas um pequeno arco de neurônios seja visível. Em Parâmetros de aquisição, clique na guia Z-Stack > botão Definir primeiro . Clique no botão Ao vivo para desativar a imagem ao vivo.
- Em Parâmetros de aquisição, clique na guia Z-Stack . Preencha o campo Fatias com 10. Isso definirá 10 fatias ópticas e determinará automaticamente a profundidade do voxel.
- Na guia Aquisição, clique na caixa Séries Temporais . Uma nova guia Série Temporal aparecerá em Parâmetros de Aquisição. Clique na guia Séries Temporais > campo Ciclos com o número de ciclos que deseja fazer em seguida. Neste caso, são 8.
- Defina a velocidade e a direção da varredura. Em Parâmetros de Aquisição, guia Modo de Aquisição > > Direção > Seta de Direção Dupla para varredura birdirecional. Selecione a guia Modo de Aquisição > Controle deslizante de velocidade de varredura > quadro > 8.
NOTA: Normalmente, pode-se carregar as configurações de um experimento anterior e só é preciso ajustar a potência do laser se a imagem for muito brilhante ou fraca e ajustar o Z-Stack Set Last and Set First.
- Faça uma varredura curta de 8 ciclos do DRG clicando em Iniciar experimento na guia Aquisição . Crie um filme fazendo uma projeção ortogonal de varreduras (uma varredura por quadro) ao longo do tempo e verifique manualmente a clareza da imagem e artefatos de imagem, como "ondas" de brilho cruzando o DRG. Ajuste a posição da braçadeira e a espessura da seção óptica e repita essa etapa até obter uma película clara e de alta qualidade.
NOTA: Este passo deve ser repetido se o animal se mover ou for movido pelo investigador. Os problemas a procurar incluem áreas do gânglio (não apenas neurônios individuais) que parecem se tornar mais claras e escuras ao longo do experimento, criando uma aparência ondulada ou fazendo com que as áreas desapareçam ou se tornem mais brilhantes. O movimento maior que cerca da metade do diâmetro de um pequeno neurônio (<20 μm) é outro grande problema. A oscilação pode muitas vezes ser corrigida aproximando a primeira e a última posição do Z-Stack (ver passo 2.4.4 acima) e estreitando a espessura da fatia óptica. O filme 1 fornece um exemplo de um gânglio ondulado antes de nivelar e definir a espessura de corte óptica correta. O filme 2 é depois de corrigir o nivelamento e a espessura da fatia óptica. A diferença é sutil, mas tem um efeito tremendo na análise. - Carregue o protocolo de varredura de alta resolução do microscópio.
- Use as configurações típicas para digitalização de alta resolução: tamanho do voxel 1,248 μm x 1,248 μm x 14 μm, 1024 x 1024 pixels, 6 fatias ópticas Z-stack, 1,2 unidade arejada (AU)/39 μm, 5% 488 nm de potência do laser/25 mW, tempo de pixel 2,06 μs, tempo de linha 4,95 ms, tempo de quadro 5,06 s, velocidade de varredura LSM 6, varredura bidirecional, Detector GaAsP-PMT ganho 650 V, ganho digital 1. As configurações ideais podem variar de acordo com o microscópio e o animal.
- Para configurar um protocolo de digitalização de alta resolução, clique na guia Aquisição . Em Parâmetros de Aquisição, clique na guia Quadros . Clique em Predefinições > 1024 x 1024 para configurar o microscópio para gravar uma imagem de 1024 pixels x 1024 pixels. Isso, por sua vez, definirá os valores X e Y do tamanho do voxel com base no tamanho da imagem, que é determinado pelo software do microscópio.
- Em Parâmetros de Aquisição, clique na guia Canais . Clique na caixa Track2 . Use o menu suspenso ao lado da caixa Track2 para selecionar Verde (FITC). Uma nova guia será aberta abaixo de Track2.
- Ao lado de Lasers, clique na caixa 488 . Isso definirá os comprimentos de onda de excitação e emissão. Clique na caixa High Intensity Laser Range .
- Ao lado do controle deslizante de 488 nm, defina a potência do laser para 5%. Clique no botão 1 UA para definir a aprovação para 1 unidade Airy. Sob FITC, defina Master Gain para 650 V, Digital Offset para 0 e Digital Gain para 1.
- Na guia Aquisição , marque a caixa Z-Stack . Clique no botão Ao vivo para ver uma imagem ao vivo do gânglio. Gire o botão do plano focal até que apenas um pequeno arco de neurônios seja visível.
- Em Parâmetros de aquisição, clique na guia Z-Stack > botão Definir último . Gire o botão do plano focal para baixo até que apenas um pequeno arco de neurônios seja visível. Em Parâmetros de Aquisição, clique na guia Z-Stack > botão Definir Primeiro . Clique no botão Ao vivo para desativar a imagem ao vivo.
- Em Parâmetros de aquisição, clique na guia Z-Stack . Preencha o campo Fatias com 6. Isso definirá 6 fatias ópticas e determinará automaticamente a profundidade do voxel.
- Na guia Aquisição , verifique se a caixa Série Temporal está desmarcada (sem série temporal).
- Defina a velocidade e a direção da varredura. Em Parâmetros de Aquisição, clique na guia Modo de Aquisição > Predefinições de > de Quadro > 1024 x 1024. Selecione a guia Modo de Aquisição > Direção do > do Quadro > Seta de Direção Dupla para varredura bidirecional. Selecione a guia Modo de Aquisição > Controle Deslizante de Velocidade de Digitalização > Quadro > 6.
- Se as células forem marcadas com td-Tomato, ajuste o microscópio para escanear o canal vermelho de excitação de 592 nm/emissão de 614 nm, comprimento de onda de detecção de 600-700 nm, além do canal verde. Defina isso indo para Parâmetros de aquisição e clique na guia Canais > caixa Track1 . Use o menu suspenso ao lado da caixa Track1 para selecionar Vermelho (Texas Red). Siga o mesmo processo da etapa 2.6.3, exceto clicar na caixa 561 em vez da caixa 488 . Ajuste a potência do laser para 1%. Td-Tomato é muito mais brilhante do que GCaMP3 e requer menor potência de laser.
- Faça uma imagem de alta resolução do DRG clicando no botão Iniciar experimento na guia Aquisição .
- Carregue o protocolo de varredura rápida do microscópio (ver etapa 2.4). Registrar a atividade espontânea no DRG por 80 ciclos (aproximadamente 10 min). Gere um filme de projeção ortogonal e verifique se a imagem é de qualidade suficiente para análise.
Observação : considerações de qualidade são as mesmas que na etapa 2.5. - Para aplicar estímulos, ajuste o microscópio para realizar 15-20 varreduras. Aguarde a conclusão das varreduras de 1 a 5 para produzir a linha de base. Aplicar o estímulo durante os exames 6-10. Aguarde pelo menos 5 min após cada estímulo antes de aplicar o próximo estímulo para evitar dessensibilização.
OBS: Os estímulos mecânicos devem ser aplicados primeiro e, em seguida, estímulos frios, térmicos e químicos. Estímulos mais fracos (por exemplo, baixa força mecânica, temperaturas mais próximas da temperatura ambiente) devem ser aplicados antes de estímulos mais fortes (por exemplo, maior força mecânica, temperaturas mais distantes da temperatura ambiente). Ao aplicar estímulos, certifique-se de não causar nenhum movimento do DRG. Para estímulos térmicos fortes, em particular, muitas vezes é necessário aplicar isoflurano a 2% por 1-2 minutos antes de iniciar o estímulo. No microscópio utilizado neste estudo, cada exame pode ser ouvido claramente, de modo que o pesquisador pode identificar facilmente o final do exame, permitindo a aplicação do estímulo imediatamente após o exame5. No entanto, qualquer método que facilite a aplicação de estímulos em um ponto de tempo consistente funcionará. - Para uma prensa mecânica, segure o pincher do algômetro com a pata entre as pás sem tocar a pata e aperte começando imediatamente após o final da varredura 5 e parando imediatamente após a varredura 10. Monitore a força de pressão com um algômetro (consulte Tabela de Materiais). Mantenha a força de pressão o mais próximo possível da força desejada (aqui usamos um estímulo de pressão de 100 g) e certifique-se de que ela não exceda 10 g acima da força desejada.
NOTA: Pode-se detectar estímulos com filamentos de von Frey de apenas 0,07 g e até 600 g de força de pressão. - Para estímulos frios e térmicos, resfrie ou aqueça um copo de água para um pouco abaixo (para frio) ou acima (para térmico) da temperatura desejada e inicie a varredura. Aqui, use um estímulo de 45 °C. Quando a água estiver na temperatura correta, aplique o estímulo imediatamente após a varredura 5 mergulhando a pata na água. Puxe o copo imediatamente após a varredura 10.
NOTA: A temperatura deve estar dentro de 1 °C da temperatura desejada na varredura 5. Se a temperatura do copo estiver incorreta, não aplique o estímulo, pois isso poderia dessensibilizar os neurônios. Em vez disso, resfrie ou reaqueça a água e tente novamente. Medimos temperaturas tão baixas quanto 0 °C (água gelada) e tão altas quanto 95 °C. No entanto, lembre-se de que temperaturas acima de 50 °C podem danificar os tecidos e confundir experimentos posteriores. Da mesma forma, alguns produtos químicos (por exemplo, tetrodotoxina, capsaicina) são irreversíveis ou não podem ser eliminados e podem impedir novas experiências no animal. - Após a aplicação e registo de todos os estímulos, eutanásia do animal por sobredosagem com cetamina/xilazina (200 mg/kg de cetamina, 30 mg/kg de xilazina ou 5 μL por grama de massa corporal da solução preparada no passo 1.1) seguida de decapitação.
3. Análise dos dados
- Abra os arquivos de imagem arrastando e soltando no ImageJ. Depois de abrir o arquivo, selecione o tipo de imagem em Imagem > Tipo > cor RGB.
NOTA: O plugin StackReg21 em Plugins > StackReg é útil para corrigir e alinhar artefatos de movimento. O ImageJ pode ler a maioria dos formatos de arquivo de software de microscópio. A escolha do tipo de imagem depende da preferência do usuário. RGB simplifica a produção de imagens coloridas para publicação. Pacotes de software do fabricante do microscópio ou do cytoNet22 também podem ajudar na análise. Não é necessário baixar, instalar e usar o StackReg, mas é recomendado. - Use a ferramenta de região de interesse (ROI) para selecionar neurônios ativos em Analisar ferramenta > > ROI Manager. Desenhe ROIs usando as ferramentas de elipse ou retângulo na barra de ferramentas e coloque-as no arquivo ROI pressionando o botão Adicionar em Adicionar na janela do gerenciador de ROI ou pressionando a tecla "t".
NOTA: Certifique-se de salvar com frequência o arquivo ROI. Os usuários sempre podem restaurar ROIs arrastando e soltando um arquivo ROI no ImageJ e clicando na caixa Mostrar Tudo na parte inferior da janela do ROI Manager. Salvar como uma sobreposição não é recomendado. Por experiência, salvar como um arquivo ROI.zip simplifica a análise. - Em Analisar > Definir Medidas, verifique se a opção de valor cinza médio está marcada; desmarque todas as outras caixas em Definir medidas. Use a ferramenta de várias medidas no menu do gerenciador de ROI para calcular a intensidade dentro dos ROIs. Meça a intensidade usando a janela ROI em Mais > Multimedida.
NOTA: Às vezes, os neurônios adjacentes estarão muito próximos para desenhar ROIs separados. Esses neurônios não podem ser usados para medir a intensidade transitória, mas podem ser incluídos na contagem de neurônios ativadores. - Salve o arquivo CSV gerado pelo Multimeasure e abra o arquivo CSV com qualquer software de planilha.
Observação : consulte o arquivo suplementar 1 para um modelo de planilha de exemplo para ajudar a análise. - Calcule a intensidade transitória de Ca 2+ como ΔF / F 0 = (F t- F 0) / F 0, onde Ft é a intensidade de pixel em uma ROI no ponto de tempo de interesse, e F 0 é a intensidade basal determinada pela média das intensidades dos 2-4 quadros antes do Ca 2+ transitório para atividade espontânea ou dos primeiros 1-5 quadros da ROI para Ca 2+ transitórios que ocorrem durante a estimulação. Excluir quaisquer neurônios que produzam picos de Ca2+ antes do estímulo e não analisar a atividade após o término do estímulo.
- Para a análise de intensidade transitória de Ca2+ , amostrar aleatoriamente um número aproximadamente igual de neurônios de cada gânglio para evitar distorcer os dados em direção aos gânglios que produziram o maior número de neurônios respondedores. Exclua picos onde ΔF / F 0 <0,15 .
OBS: Existem métodos alternativos publicados de análise e inclusão/exclusão de neurônios11,12,23,24,25,26,27,28. - Meça os diâmetros dos neurônios usando a ferramenta de linha na barra de ferramentas do ImageJ. Calcule o diâmetro médio a partir das linhas traçadas ao longo dos diâmetros mais longos e mais curtos.
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Representative Results
Figura 4: Imagens representativas dos gânglios da raiz dorsal L5 de camundongos Pirt-GCaMP3. (A,D) Imagens de alta resolução de quadro único de gânglios da raiz dorsal L5 de camundongos Pirt-GCaMP3 são mostrados. (B,E) . Projeções de intensidade média de 15 quadros dos gânglios do Pirt-GCaMP3 L5 DRG do painel A e do painel D, respectivamente, na ausência de estímulos. Alguns neurônios que produziram transitórios espontâneos de Ca2+ são chamados com setas amarelas. (C) Projeção de intensidade média de dois quadros antes do estímulo e todos os cinco quadros de estímulo do gânglio Pirt-GCaMP3 do painel A durante prensa de pata traseira de 100 g. Alguns neurônios que produziram Ca2+ transitórios durante o estímulo são chamados com setas amarelas. (F-I) Projeções de intensidade média dos quadros 4 e 5 (antes do estímulo) (painéis A e D) e dos quadros 6-9 (durante estímulo de pressão de 100 g) do gânglio do painel D com os quadros 4-6, quadro 4 + 5 + 7, quadros 4 + 5 + 8 e quadros 4 + 5 + 9 de uma prensa traseira de 100 g, respectivamente. (J) Traços de intensidade de fluorescência de três neurônios espontaneamente ativos do painel B (preto) correspondente ao painel A ganglionar e painel E (vermelho) correspondente ao painel D ganglionar. O traço de cada neurônio é normalizado para sua intensidade mediana (mostrada pela linha em Y = 0). (K) ΔF / F0 traços de três neurônios ativados em resposta à prensa de 100 g do painel C (preto) correspondente ao gânglio do painel A e dos painéis F-I (vermelho) correspondentes ao painel do gânglio D. Observe que os eixos X e Y são diferentes do painel J. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Imagem de um grande número de neurônios usando varredura confocal de Pirt-GCaMP L5 DRG
A exposição cirúrgica ao DRG L5 seguida de microscopia confocal permitiu que até 1.800 neurônios fossem fotografados de uma só vez usando camundongos Pirt-GCaMP3 (Figura 4). Isso cria uma vantagem poderosa de ser capaz de observar simultaneamente milhares de neurônios sensoriais primários em um conjunto em um nível populacional em seu contexto fisiológico normal, tanto no controle quanto em condições anormais. Os transientes espontâneos de Ca 2+ na ausência de estímulos (Figura 4B,E e Filme 2) e os transitórios de Ca2+ em resposta aos estímulos (Figura 4C,F-I, Filme 3 e Filme 4) podem ser monitorados. Os diâmetros dos neurônios ativadores estão altamente correlacionados com diferentes grupos de fibras nervosas.
Figura 5: O aumento da intensidade dos estímulos aumenta as respostas de Ca2+ nos gânglios de camundongos Pirt-GCaMP3. (A) Gráficos do número de neurônios nos gânglios DRG L5 mostrando os transientes de Ca2+ em resposta a estímulos de duas intensidades de imprensa diferentes são mostrados: 100 g, n = 8 gânglios; 300 g, n = 5. (B) Gráficos das áreas ΔF / F0 sob a curva de amostras de transientes de Ca2+ de duas intensidades de prensa diferentes são mostrados: 100 g, n = 88 neurônios; 300 g, n = 104. (C) Gráficos de traços de ΔF/F0 de estímulos de pressão de 100 g e 300 g. Traço vermelho é a média ΔF / F0; 100 g, n = 60 neurônios; 300 g, n = 57 neurônios. (D) Gráficos do número de neurônios nos gânglios DRG L5 mostrando Ca 2+ transitórios em resposta a três diferentes temperaturas não nocivas e uma nociva são mostrados:21 °C, n = 4 gânglios; 10 °C, n = 6; 45 °C, n = 7; 57 °C, n = 3. (E) Gráficos das áreas ΔF / F0 sob a curva de amostras de Ca 2+ transientes de três diferentes intensidades de estímulo não nocivo e um nocivo à temperatura são mostrados:21 °C, n = 40 neurônios; 10 °C, n = 60; 45 °C, n = 61; 57 °C, n = 118. (F) Gráficos de traços de estímulos ΔF/F0 de 10 °C e 57 °C. Traço vermelho é a média ΔF / F0; 10 °C, n = 60 neurônios; 57 °C, n = 118. (G) Gráfico das porcentagens de neurônios de diferentes diâmetros (<20 μm, 20-25 μm, >25 μm) produzindo Ca2+ transientes espontaneamente e com estímulos térmicos e mecânicos. Atividade espontânea (Spon), n = 5 gânglios; 45 °C, n = 3; 300 g, n = 3. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Os gráficos de barras mostram as médias e o MEV. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Número de células produzindo Ca 2+ transientes e Ca2+ área transitória sob a curva (AUC) na presença de estímulos
Estímulos fortes ou calor nocivo aumentaram as respostas de Ca2+. Comparada à prensagem com 100 g, a prensagem com 300 g aumentou o número de neurônios produtores de Ca 2+ transitórios (Figura 5A, teste t de Student: t = 2,398, df = 11, p = 0,0354) e a área ΔF / F0 sob a curva de transientes Ca 2+ (Figura 5B, teste t de Welch: t = 3,243, df = 187,4, p = 0,0014). Da mesma forma, o calor quente em uma faixa de temperatura não nociva (21 °C e 45 °C) aumentou o número de neurônios produzindo Ca 2+ transientes (Figura 5C, ANOVA one-way F 2,14 = 4,853, p = 0,0251, seguido pelo q de Tukey = 4,380, df = 14, p = 0,0202) e a área ΔF / F0 sob a curva de transientes Ca2+ (Figura 5D, ANOVA F de Brown-Forsythe F2.151,6 = 60,76, p = 0,0029 seguido do teste t de Welch: t = 3,333, df = 96,72, p = 0,0036). Em comparação com um estímulo térmico nocivo (57 °C), temperaturas não nocivas (21 °C, 10 °C e 45 °C) ativaram um número menor de neurônios produzindo Ca 2+ transientes (Figura 5E, ANOVA one-way F 2,16 = 2,513, p < 0,001, teste de Dunnett,21°C: q = 9,594, df = 16, p < 0,001; 10 °C: q = 9,583, df =16, p < 0,001; 45 °C: q = 9,160, df = 16, p < 0,001) e ΔF / F 0 área sob a curva de transientes Ca 2+ a 21 °C e 10 °C (Figura 5D, ANOVA Brown-Forsythe F3.268,4 = 12,98, p < 0,001, teste T3 de Dunnett,21 °C: t = 5,415, df = 128, p < 0,001; 10 °C: t = 4,398, df = 174,5, p < 0,001; 45 °C: t = 2,079, df = 161,9, p = 0,1127). Neste experimento, neurônios de menor e médio diâmetro produziram transientes de Ca 2+ espontaneamente e sob todos os estímulos, mas neurônios de maior diâmetro produziram apenas transientes de Ca2+ em resposta ao estímulo de pressão de 300 g (Figura 5G).
Marcação de neurônios expressando receptores específicos com td-Tomato em camundongos Pirt-GCaMP3
O repórter cre-induzível td-Tomato pode ser observado durante a imagem de Pirt-GCaMP3. Camundongos Pirt-GCaMP3, td-Tomato que expressaram Cre sob o controle do promotor TrpV1 mostraram marcação em larga escala, mas não universal, de neurônios sensoriais primários (Figura 6A,B). Transitórios espontâneos de Ca2+ foram observados tanto em neurônios marcados com td-Tomato quanto em neurônios não marcados (Figura 6C). O calor nocivo não foi testado neste experimento, mas será testado nos experimentos futuros.
Figura 6: Marcação de neurônios TrpV1-positivos com td-Tomato em camundongos Pirt-GCaMP3. (A) Uma projeção de intensidade máxima da atividade espontânea de neurônios sensoriais primários de um camundongo TrpV1-Cre, td-Tomato, Pirt-GCaMP3 fotografado apenas no canal de excitação/emissão de 519 nm (FITC, verde) de 495 nm. Alguns neurônios que produzem Ca2+ transitórios são chamados com setas amarelas (não marcadas com td-Tomate) ou setas vermelhas (marcadas com td-Tomate). (B) Uma projeção de intensidade média dos mesmos neurônios sensoriais primários do painel A apenas no canal vermelho de excitação de 592 nm/emissão de 614 nm. (C) Uma projeção de intensidade máxima de canais vermelhos e verdes simultâneos dos mesmos neurônios sensoriais primários do painel A é mostrada. Alguns neurônios que expressam GCaMP3, mas não td-Tomate, são chamados com setas amarelas. As setas brancas indicam GCaMP positivo sem transientes de Ca2+ e sem td-Tomato postive. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1: Atividade espontânea de um gânglio Pirt-GCaMP3 que não foi devidamente nivelado ou otimizado para espessura de corte óptico causando ondulação. 70 quadros por segundo AVI. Espessura de corte óptico = 16 μm. Por favor, clique aqui para baixar este filme.
Filme 2: Atividade espontânea do mesmo gânglio do filme 1 que foi devidamente nivelado e otimizado para espessura de corte óptico com menos ondulação. 70 quadros por segundo AVI. Espessura de corte óptico = 13 μm. Por favor, clique aqui para baixar este filme.
Filme 3: 100 g de prensa traseira do gânglio Pirt-GCaMP3. 3 quadros por segundo AVI. O estímulo foi aplicado durante os quadros 6-10. Por favor, clique aqui para baixar este filme.
Filme 4: Estímulo térmico de 45 °C à pata traseira do gânglio Pirt-GCaMP3. 3 quadros por segundo AVI. O estímulo foi aplicado durante os quadros 6-10. Por favor, clique aqui para baixar este filme.
Arquivo Suplementar 1: Exemplo de planilha de análise Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
A dor persistente está presente em uma ampla gama de distúrbios, debilitando e/ou reduzindo a qualidade de vida de cerca de 8% das pessoas29. Os neurônios sensoriais primários detectam estímulos nocivos na pele, e sua plasticidade contribui para a dor persistente8. Enquanto os neurônios podem ser estudados em cultura celular e explantes, fazê-lo os remove de seu contexto fisiológico normal. A exposição cirúrgica do DRG, seguida de Pirt-GCaMP3 Ca2+, permite o estudo de neurônios sensoriais primários em seu contexto fisiológico normal utilizando estímulos aplicados à pata traseira. Uma grande vantagem deste método de imagem de Ca2+ é que um grande número de neurônios pode ser monitorado simultaneamente. Este método permite a análise em nível populacional da modalidade, diâmetro do neurônio e fenômenos raros como ativação acoplada 10,11,12,13,14,15,16,17,30, fornecendo informações sobre a somatosensação normal e patológica. Além do diâmetro do neurônio como identificador, tipos específicos de neurônios podem ser geneticamente marcados com um fluoróforo vermelho, como o td-Tomate, para identificação durante exames de imagem. Essa técnica permite observar modalidades sensoriais específicas ou de neurônios que expressam receptores específicos14,31. Outras aplicações incluem a obtenção de imagens de outros gânglios sensoriais, como o gânglio trigeminal24,32 ou o gânglio geniculado23,26 e a inervação por imagem do corno dorsal espinhal por neurônios sensoriais primários em explantes19,33.
As etapas críticas do protocolo incluem a prevenção de sangramento excessivo ou sangramento no DRG, o controle da anestesia durante a aquisição de imagens, o nivelamento da superfície do DRG, a seleção da espessura ideal do corte óptico e a prevenção do movimento do DRG durante a aplicação dos estímulos. O sangramento excessivo pode causar a morte do animal ou artefatos devido aos efeitos fisiológicos da perda de sangue. A perda de sangue pode causar aumentos no brilho (cálcio citoplasmático) em vastas áreas do DRG. A perda de sangue também pode causar dormência, reduzindo o número de neurônios ativados em resposta a estímulos. O sangramento no DRG bloqueia diretamente a imagem, limitando o número de neurônios que podem ser fotografados com sucesso. Como a anestesia afeta as atividades e respostas neuronais, um nível mínimo de anestesia com isoflurano deve ser usado. Um DRG de nível e espessura de corte óptico ideal são as partes mais críticas do procedimento. A execução incorreta dessas etapas pode causar neurônios fora de foco e oscilações durante a geração de imagens (veja Filme 1 e Filme 2) que confundirão a análise ou impossibilitarão a análise. Mesmo pequenos movimentos podem impossibilitar o rastreamento de neurônios individuais através de quadros e/ou criar artefatos onde um neurônio parece se tornar mais escuro ou mais brilhante, causando erros significativos.
O sistema descrito aqui também tem algumas limitações significativas. A anestesia interfere nas respostas neuronais e gliais de Ca 2+ 25. Como esse método é terminal, o mesmo animal não pode ser monitorado em vários experimentos. Os transientes Ca2+ são um proxy indireto para o disparo e a atividade dos neurônios. Esse método usa transientes Ca2+ como proxy para potenciais de ação. Entretanto, outros sinais, como a proteína Gq ou a sinalização do receptor de rianodina, podem alterar as concentrações citoplasmáticas de Ca2+ 34,35,36. Outros mecanismos não foram relatados para causar Ca2+ transientes em neurônios DRG. No entanto, sabe-se que a aplicação de estímulos químicos na pata aumenta o Ca2+ nos astrócitos do corno dorsal da coluna vertebral36.
Em conclusão, a imagem intacta DRG Pirt-GCaMP3 Ca2+ é uma ferramenta poderosa para estudar a somatosensação em condições normais e patológicas. Os resultados mostrados aqui são representativos para camundongos controles normais. Camundongos controle podem ser comparados a modelos de dor e doença ou a mutantes genéticos 10,15,17,30,31,37. Além disso, o método aqui apresentado pode ser adaptado a outros indicadores de Ca2+ codificados geneticamente 10,11,16 e utilizado para obtenção de imagens de outros sensores, como sensor de voltagem38,39,40 e sensor de adenosina monofosfato cíclico 41. Embora a microscopia confocal tenha sido utilizada neste estudo, a microscopia de dois fótons também pode ser utilizada11.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelos National Institutes of Health Grants R01DE026677 e R01DE031477 (para Y.S.K.), UTHSCSA startup fund (Y.S.K.) e um Rising STAR Award da University of Texas system (Y.S.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anased Injection (Xylazine) | Covetrus, Akorn | 33197 | |
| C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC | Cal Zeiss | 422642-9900-000 | |
| Cotton Tipped Applicators | McKesson | 24-106-1S | |
| Curved Hemostat | Fine Science Tools | 13007-12 | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| DC Temperature Controller Heating Pad | FHC | 40-90-2-05 | |
| Dumont Ceramic Coated Forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| FHC DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Fluriso (Isoflurane) | MWI Animal Health, Piramal Group | 501017 | |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16221-14 | |
| GelFoam | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Ketaset (Ketamine) | Zoetis | KET-00002R2 | |
| Luminescent Green Stage Tape | JSITON/ Amazon | B803YW8ZWL | |
| Matrx VIP 3000 Isoflurane Vaporizer | Midmark | 91305430 | |
| Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Micro dissecting spring scissors | Fine Science Tools | 15023-10 | |
| Micro dissecting spring scissors | Roboz | RS-5677 | |
| Mini Rectal Thermistor Probe | FHC | 40-90-5D-02 | |
| Operating scissors | Roboz | RS-6812 | |
| Pirt-GCaMP3 C57BL/6J mice | Johns Hopkins University | N/A | Either sex can be imaged equally well. Mice should be at least 8 weeks old due to weak or intermittent Pirt promoter expression in younger mice. |
| SMALGO small animal algometer | Bioseb In vivo Research Instruments | BIO-SMALGO | |
| Stereotaxic frame | Kopf Model 923-B | 923-B | |
| td-Tomato C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 7909 | |
| Top Plate, 6 in x 10 in | Newport | 290-TP | |
| TrpV1-Cre C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 17769 | |
| Zeiss LSM 800 confocal microscope | Cal Zeiss | LSM800 | |
| Zeiss Zen 2.6 Blue Edition Software | Cal Zeiss | Zen (Blue Edition) 2.6 |
References
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