Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In vivo Calciumbilleddannelse af neuronale ensembler i netværk af primære sensoriske neuroner i intakte dorsale rodganglier

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64826
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Oral & Maxillofacial Surgery, School of Dentistry, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Programs in Integrated Biomedical Sciences, Translational Sciences, Biomedical Engineering, Radiological Sciences, University of Texas Health Science Center at San Antonio

Summary

Denne protokol beskriver den kirurgiske eksponering af dorsalrodsganglion (DRG) efterfulgt af GCaMP3 (genetisk kodet Ca2+ indikator; Grønt fluorescerende protein-calmodulin-M13-protein 3) Ca2+ billeddannelse af neuronale ensembler ved hjælp af Pirt-GCaMP3-mus, mens der påføres en række stimuli på den ipsilaterale bagpote.

Abstract

Ca 2+ billeddannelse kan bruges som en proxy for cellulær aktivitet, herunder handlingspotentialer og forskellige signalmekanismer, der involverer Ca 2+ indgang i cytoplasmaet eller frigivelse af intracellulære Ca2+ lagre. Pirt-GCaMP3-baseret Ca2+ billeddannelse af primære sensoriske neuroner i dorsalrodsganglion (DRG) hos mus giver fordelen ved samtidig måling af et stort antal celler. Op til 1.800 neuroner kan overvåges, hvilket gør det muligt at studere neuronale netværk og somatosensoriske processer som et ensemble i deres normale fysiologiske kontekst på populationsniveau in vivo. Det store antal neuroner, der overvåges, gør det muligt at detektere aktivitetsmønstre, der ville være udfordrende at opdage ved hjælp af andre metoder. Stimuli kan påføres musebagpoten, hvilket gør det muligt at undersøge de direkte virkninger af stimuli på DRG-neuronensemblet. Antallet af neuroner, der producerer Ca 2+ transienter samt amplituden af Ca2+ transienter indikerer følsomhed over for specifikke sensoriske modaliteter. Diameteren af neuroner giver bevis for aktiverede fibertyper (ikke-skadelige mechano vs. skadelige smertefibre, Aβ-, Aδ- og C-fibre). Neuroner, der udtrykker specifikke receptorer, kan genetisk mærkes med td-Tomat og specifikke Cre-rekombinaser sammen med Pirt-GCaMP. Derfor giver Pirt-GCaMP3 Ca2+ billeddannelse af DRG et kraftfuldt værktøj og en model til analyse af specifikke sensoriske modaliteter og neuronundertyper, der fungerer som et ensemble på befolkningsniveau for at studere smerte, kløe, berøring og andre somatosensoriske signaler.

Introduction

Primære sensoriske neuroner innerverer huden direkte og bærer somatosensorisk information tilbage til centralnervesystemet 1,2. Dorsalrodsganglier (DRG'er) er cellekropsklynger på 10.000-15.000 primære sensoriske neuroner 3,4. DRG-neuroner præsenterer forskellig størrelse, myelineringsniveauer og gen- og receptorekspressionsmønstre. Neuroner med mindre diameter inkluderer smertefølende neuroner, og neuroner med større diameter reagerer typisk på ikke-smertefulde mekaniske stimuli 5,6. Forstyrrelser i de primære sensoriske neuroner såsom skade, kronisk inflammation og perifere neuropatier kan sensibilisere disse neuroner til forskellige stimuli og bidrage til kronisk smerte, allodyni og smerteoverfølsomhed 7,8. Derfor er undersøgelsen af DRG-neuroner vigtig for at forstå både somatosensation generelt og mange smerte- og kløeforstyrrelser.

Neuroner, der affyres in vivo, er afgørende for somatosensation, men indtil for nylig har værktøjer til at studere intakte ganglier in vivo været begrænset til et relativt lille antal celler 9. Her beskriver vi en kraftfuld metode til at studere neuronernes handlingspotentialer eller aktiviteter på populationsniveau in vivo som et ensemble. Metoden anvender billeddannelse baseret på cytoplasmatisk Ca2+ dynamik. Ca 2+ følsomme fluorescerende indikatorer er gode proxyer til måling af cellulær aktivitet på grund af den normalt lave koncentration af cytoplasmatisk Ca2+. Disse indikatorer har muliggjort samtidig overvågning af hundreder til flere tusinde primære sensoriske neuroner i mus 9,10,11,12,13,14,15,16 og rotter 17. Metoden til in vivo Ca2+ billeddannelse beskrevet i denne undersøgelse kan bruges til direkte at observere reaktioner på populationsniveau på mekaniske, kolde, termiske og kemiske stimuli.

Det phosphoinositidbindende membranprotein, Pirt, udtrykkes i høje niveauer i næsten alle (>95%) primære sensoriske neuroner18,19 og kan bruges til at drive ekspressionen af Ca 2+ sensoren, GCaMP3, til at overvåge neuronaktivitet in vivo20. I denne protokol beskrives teknikker til udførelse af in vivo DRG-kirurgi, Ca2+ billeddannelse og analyse i højre side lændehvirvel 5 (L5) DRG af Pirt-GCaMP3 mus14 ved hjælp af konfokal laserscanningsmikroskopi (LSM).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer, der er beskrevet her, blev udført i overensstemmelse med en protokol, der er godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Texas Health Science Center i San Antonio.

BEMÆRK: Når dyrekirurgi (trin 1) og billeddannelse (trin 2) er påbegyndt, skal de gennemføres løbende. Dataanalyse (trin 3) kan udføres senere.

1. Kirurgi og sikring af dyret til højre side L5 DRG-billeddannelse

BEMÆRK: Både mandlige og kvindelige Pirt-GCaMP3 C57BL / 6J mus 8 uger eller ældre blev brugt i denne undersøgelse. Mens begge køn kan afbildes lige godt, bør mus være mindst 8 uger gamle på grund af svagt eller intermitterende Pirt-udtryk hos yngre mus. Pirt-GCaMP3 C57BL/6J-musene blev genereret på Johns Hopkins University14. Begge sider DRG kan afbildes, og andre lændehvirvel-DRG'er (f.eks. Lumbal 4) kan afbildes. De angivne tider er estimater for en erfaren kirurg. Lejlighedsvise tekniske problemer såsom øget blødning kan øge den krævede tid.

  1. Forbered en steril saltopløsning indeholdende 40 mg/ml ketamin og 6 mg/ml xylazin. Det samlede volumen skal være mindst 9 μL / g legemsmasse til både kirurgi og eutanasi efter billeddannelse.
    FORSIGTIG: Ketamin er skadeligt, hvis det injiceres, sluges, eller når det kommer i kontakt med øjet. Håndter forsigtigt.
  2. Sørg for, at alle kirurgiske værktøjer er rene og steriliseret ved autoklavering eller anden NIH-vejledning til pleje og brug af forsøgsdyr-godkendt metode.
  3. Mellem 15 og 25 minutter før operationen injiceres en Pirt-GCaMP3-mus intraperitonealt (i.p.) med ~2,25 μL ketamin/xylazin for hvert gram kropsvægt (90 mg/kg ketamin, 13,5 mg/kg xylazin). Overskrid ikke 120 mg/kg ketamin.
  4. Inden for 15 til 25 minutter efter injektion af anæstesi (trin 1.3) skal du kontrollere, om musen har nået anæstesiens kirurgiske plan ved at klemme den kontralaterale bagpote (ikke den ipsilaterale/højre bagpote). Fraværet af bagbensudtagningsrefleks sikrer, at der opnås et kirurgisk anæstesiplan.
    BEMÆRK: Bagbenets tilbagetrækningsrefleks bruges under hele eksperimentet til at overvåge anæstesi. Brug altid den kontralaterale bagpote.
  5. Placer musen på en opvarmet pude for at holde kropstemperaturen på 37 °C.
    BEMÆRK: Det kan være nyttigt at holde musens hoved på plads med en stereotaksisk ramme (se materialetabel) eller en anden ramme baseret på forskerens præference.
  6. Find lændeforstørrelsen ved at føle efter musens bækkenben. Barber bagsiden af musen over lændeforstørrelsesområdet. Dette trin skal tage ~ 90 s.
    BEMÆRK: Musen kan kortvarigt fjernes fra den opvarmede pude til barbering.
  7. Lav et tresidet rektangulært snit (8 mm x 20 mm) over lændeforstørrelsen ved hjælp af en saks og fold huden væk med pincet (figur 1A). Dette trin tager ~2 min.
    BEMÆRK: Forskere kan også bruge hæmostattang eller en retractor til at holde snittet åbent. Dette er ikke en overlevelsesoperation, så yderligere rengøring af det kirurgiske område er ikke nødvendigt; Det kan dog gøres ved hjælp af povidon-jod. Den største acceptable snitstørrelse er angivet her. Et mindre snit er at foretrække frem for et større snit.
  8. Brug 13 mm fjederdissektionssaksen til at lave 3-4 mm snit på højre side af rygsøjlen. Brug en saks til at skære huden og musklerne tilbage til siderne for at blotte rygsøjlen (figur 1B). Dette trin tager ~3 min.
  9. Brug en 8 mm saks til at rense den tværgående proces i højre side af L5 DRG ved at skære muskler og bindevæv væk, mens du forsøger at minimere blødning. Brug bomuld og / eller gelfoam til at absorbere blodet. L5-hvirvlen er den første hvirvel, der rostral til bækkenbenet.
    BEMÆRK: Dette trin tager ~3 min og kan tage ekstra tid, hvis dyret bløder mere end normalt.
  10. Skær L5-tværprocessen i højre side op ved hjælp af Friedman-Pearson-rongeurer eller stærke fine pincet. Pas på ikke at røre ved DRG (figur 1C).
    BEMÆRK: Dette trin tager ~ 2 minutter, men kan tage ekstra tid, hvis dyret bløder mere end normalt.
  11. Fortsæt ikke, før blødningen stopper helt. Undgå blødning på DRG-overfladen ved hjælp af gelskum eller bomuld. Dette trin trin tager 1-4 min.
  12. Flyt musen og varmepuden til den brugerdefinerede scene (figur 2A, B). Brug scenetape til at fastgøre dyret og varmepuden på plads. Placer dyrets næse i næsekeglen, så dyret kan modtage kontinuerlig isofluranbedøvelse. Fastgør den højre bagpote, der stikker ud af scenen, så stimuli let kan påføres poten. Dette trin tager 3 min.
  13. Fastgør rygsøjlen på plads med sceneklemmerne over huden på ryghvirvlerne og / eller bækkenbenet bare rostral og kaudale til L5 DRG. Juster klemmerne og trinnet for at gøre DRG'ens overflade så plan som muligt (figur 2B, C).
    BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at trimme vævet, der ligger mellem DRG og målet.
  14. Placer trinnet under mikroskopet, så målet er 8 mm direkte over DRG, når det sænkes (figur 3A, B). Indsæt det rektale termometer.
    BEMÆRK: Afstanden fra DRG til målet kan variere afhængigt af målet, mikroskopet og dyret.
  15. Tilslut kraftledningerne til varmepuden og rektaltermometeret. Tilslut næsekeglen til isoflurangasledningerne.

Figure 1
Figur 1: Eksempel på DRG-eksponeringskirurgi . (A) Et lille område blev barberet, og huden blev skåret og foldet tilbage. Snittet er ~ 10 mm på rostral-kaudale aksen. (B) Der blev foretaget et snit på højre side af rygsøjlen, og muskler og bindevæv blev skåret væk, hvilket udsatte L5 højre side tværgående proces. Blod blev absorberet med gelfoam. (C) Den tværgående proces blev renset, og knoglen over DRG blev fjernet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Montering af musen på en brugerdefineret scene til DRG-billeddannelse . (A) Den brugerdefinerede fase vises. Den består af en bundplade og en plade til dyret. Dyrets monteringsplade er på en låsekugle og stikkontakt. En næsekegle med linjer til levering af ilt / isofluranblanding og en affaldsgasledning sammen med en aluminiumsfolieindpakket varmepude tapes til dyrets monteringsplade. To arme, hver lavet af tre låsekugle- og sokkelled, er boltet til bundpladen. Hver arm har en klemme lavet af tang med en skrue til stramning og løsning. B) Dyret er monteret på dyrets monteringsplade. Dens næse er placeret i næsekeglen. Klemmer placeres over huden, der holder rygsøjlen og bækkenbenet. Den højre (ipsilaterale) bagpote er tapet til at stikke ud for nem adgang til påføring af stimuli. (C) Et nærbillede af den fastspændte rygsøjle og bækkenbenet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Dyr på brugerdefineret stadium er placeret under mikroskopmålet . (A) En vidvinkelvisning af scenen, dyret og mikroskopet. Ledninger til DC-temperaturregulatoren og ledninger til ilt / isofluranindtag og spildgasledning er synlige til venstre. B) Nærbillede af dyret under mikroskopmålet. DRG er ~ 8 mm under målet. Det rektale termometer indsættes, og næsen er inde i næsekeglen. Klik her for at se en større version af denne figur.

2. DRG-billeddannelse

  1. Brug et opretstående konfokalmikroskop 10x/0.4 DIC-mål og den tilhørende software (se materialetabel) til billeddannelse. Brug indstillingerne for det grønne filter (FITC): excitation 495 nm, emission 519 nm, detektionsbølgelængde 500-580 nm, GaAsP-Pmt1-billeddannelsesenhed, GaAsP-PMT-detektor.
    BEMÆRK: For andre mikroskoper skal du bruge producentens anbefalede indstillinger.
  2. Find overfladen af DRG med mikroskopet. Juster klemmerne på scenen, så DRG-overfladen er så plan som muligt, og at det maksimale overfladeareal visualiseres i brændplanet.
    BEMÆRK: Valget af mål kan variere afhængigt af det anvendte mikroskop og brugerens præference. Valget af software afhænger af mikroskopet. Et niveau DRG resulterer i klarere billeder, gør det muligt for softwaren at konstruere klarere film, tillader billeddannelse af flere neuroner og gør analysen lettere og mere præcis.
  3. Tilfør 1% -1,5% isofluran i iltstrømmen til næsekeglen for at sikre, at musen forbliver bedøvet. Dyret overvåges omhyggeligt under hele proceduren for at opretholde isofluranæstesi uden overdosering.
    BEMÆRK: Den mængde isofluran, der er nødvendig for at opretholde anæstesi, kan variere efter det enkelte dyr og stimulus. Normalt er 1,5% tilstrækkeligt. Hvis dyret bevæger sig under stimulus, bør isofluran øges. Hvis vejrtrækningen bliver overfladisk, skal isofluran nedsættes. Før hver stimulus skal du teste bagbenets tilbagetrækningsrefleks på den kontralaterale bagpote.
    FORSIGTIG: Isofluran kan være skadeligt eller forårsage svimmelhed eller døsighed ved indånding. Undgå indånding og brug kun i et godt ventileret område.
  4. Indlæs mikroskopets hurtige scanningsprotokol.
    1. Brug de typiske indstillinger for hurtig scanning: voxelstørrelse 2,496 μm x 2,496 μm x 16 μm, 512 x 512 pixel, 10 optisk skive Z-stack, 1 luftig enhed (AU)/32 μm, 1% 488 nm lasereffekt 5 mW, pixeltid 1,52 μs, linjetid 0,91 ms, billedtid 465 ms, LSM-scanningshastighed 8, tovejsscanning, GaAsP-PMT detektorforstærkning 650 V, digital forstærkning 1. Optimale indstillinger kan variere efter mikroskop og dyr.
    2. For at oprette en hurtig scanningsprotokol skal du klikke på fanen Erhvervelse . Under Anskaffelsesparametre skal du klikke på fanen Rammer . Klik på Forudindstillinger > 512 x 512 for at indstille mikroskopet til at optage et billede på 512 pixel x 512 pixel. Dette vil igen indstille X- og Y-værdierne for voxelstørrelsen baseret på billedstørrelsen, som bestemmes af mikroskopsoftwaren.
    3. Under Anskaffelsesparametre skal du klikke på fanen Kanaler . Klik på feltet Track2 . Brug rullemenuen ved siden af feltet Track2 til at vælge Grøn (FITC). En ny fane åbnes under Track2.
    4. Ved siden af lasere skal du klikke på 488-boksen . Dette indstiller excitations- og emissionsbølgelængderne.
    5. Ved siden af skyderen på 488 nm skal du indstille lasereffekten til 1 %. Klik på knappen 1 AU for at indstille blænden til 1 Airy-enhed. Under FITC skal du indstille Masterforstærkning til 650 V, Digital forskydning til 0 og Digital forstærkning til 1.
    6. Under fanen Erhvervelse skal du markere afkrydsningsfeltet Z-Stack . Klik på Live-knappen for at se et levende billede af ganglionen. Drej fokalplanknappen op, indtil kun en lille bue af neuroner er synlige.
    7. Under Anskaffelsesparametre skal du klikke på fanen Z-Stack > knappen Indstil sidste . Drej fokusplanknappen ned, indtil kun en lille bue af neuroner er synlige. Under Anskaffelsesparametre skal du klikke på fanen Z-Stack > knappen Indstil først . Klik på Live-knappen for at slukke for live-billedet.
    8. Under Anskaffelsesparametre skal du klikke på fanen Z-Stack . Udfyld feltet Udsnit med 10. Dette indstiller 10 optiske skiver og bestemmer automatisk voxeldybden.
    9. Under fanen Erhvervelse skal du klikke på feltet Tidsserie . En ny fane Tidsserie vises under Anskaffelsesparametre. Klik på fanen Tidsserie > feltet Cyklusser med det antal cyklusser, du ønsker at tage næste. I dette tilfælde er det 8.
    10. Indstil scanningshastighed og retning. Under Anskaffelsesparametre > > fanen Anskaffelsestilstand Retning > dobbeltpil til scanning i bidirektion. Vælg fanen Anskaffelsestilstand > skyderen Ramme > Scanningshastighed > 8.
      BEMÆRK: Normalt kan man indlæse indstillinger for et tidligere eksperiment og behøver kun at justere lasereffekten, hvis billedet er for lyst eller svagt og justere Z-Stack Set Last og Set First.
  5. Tag en kort 8-cyklusscanning af DRG ved at klikke på Start eksperiment under fanen Erhvervelse . Opret en film ved at lave en ortogonal projektion af scanninger (en scanning pr. billede) over tid, og kontroller manuelt for billedklarhed og billedartefakter såsom "bølger" af lysstyrke, der krydser DRG. Juster klemmeposition og optisk sektionstykkelse, og gentag dette trin, indtil der opnås en klar film i høj kvalitet.
    BEMÆRK: Dette trin skal gentages, hvis dyret bevæger sig eller flyttes af investigator. Problemer at kigge efter omfatter områder af ganglion (ikke kun enkelte neuroner), der ser ud til at blive lysere og mørkere i løbet af eksperimentet, hvilket skaber et bølget udseende eller får områder til at forsvinde eller blive lysere. Bevægelse større end ca. halvdelen af en lille neurons diameter (<20 μm) er et andet stort problem. Bølgeevne kan ofte løses ved at bringe den første og sidste position af Z-Stack tættere på hinanden (se trin 2.4.4 ovenfor) og indsnævre den optiske skivetykkelse. Film 1 giver et eksempel på en bølget ganglier før udjævning og indstilling af den korrekte optiske skivetykkelse. Film 2 er efter korrektion af nivellering og optisk skivetykkelse. Forskellen er subtil, men den har en enorm effekt på analysen.
  6. Indlæs mikroskopets scanningsprotokol med høj opløsning.
    1. Brug de typiske indstillinger til scanning i høj opløsning: voxelstørrelse 1,248 μm x 1,248 μm x 14 μm, 1024 x 1024 pixel, 6 optisk skive Z-stack, 1,2 luftig enhed (AU)/39 μm, 5 % 488 nm lasereffekt/25 mW, pixeltid 2,06 μs, linjetid 4,95 ms, billedtid 5,06 sek., LSM-scanningshastighed 6, tovejsscanning, GaAsP-PMT detektorforstærkning 650 V, digital forstærkning 1. Optimale indstillinger kan variere efter mikroskop og dyr.
    2. For at konfigurere en scanningsprotokol med høj opløsning skal du klikke på fanen Erhvervelse . Under Anskaffelsesparametre skal du klikke på fanen Rammer . Klik på Forudindstillinger > 1024 x 1024 for at indstille mikroskopet til at optage et billede på 1024 pixel x 1024 pixel. Dette vil igen indstille X- og Y-værdierne for voxelstørrelsen baseret på billedstørrelsen, som bestemmes af mikroskopsoftwaren.
    3. Under Anskaffelsesparametre skal du klikke på fanen Kanaler . Klik på feltet Track2 . Brug rullemenuen ved siden af feltet Track2 til at vælge Grøn (FITC). En ny fane åbnes under Track2.
    4. Ved siden af lasere skal du klikke på 488-boksen . Dette indstiller excitations- og emissionsbølgelængderne. Klik på boksen High Intensity Laser Range .
    5. Ved siden af skyderen på 488 nm skal du indstille lasereffekten til 5 %. Klik på knappen 1 AU for at indstille blænden til 1 Airy-enhed. Under FITC indstilles Master Gain til 650 V, Digital Offset til 0 og Digital Gain til 1.
    6. Under fanen Erhvervelse skal du markere afkrydsningsfeltet Z-Stack . Klik på Live-knappen for at se et levende billede af ganglionen. Drej fokalplanknappen op, indtil kun en lille bue af neuroner er synlige.
    7. Under Anskaffelsesparametre skal du klikke på fanen Z-Stack > knappen Indstil sidste . Drej fokusplanknappen ned, indtil kun en lille bue af neuroner er synlige. Under Anskaffelsesparametre skal du klikke på fanen Z-Stack > knappen Indstil først . Klik på Live-knappen for at slukke for live-billedet.
    8. Under Anskaffelsesparametre skal du klikke på fanen Z-Stack . Udfyld feltet Udsnit med 6. Dette indstiller 6 optiske skiver og bestemmer automatisk voxeldybden.
    9. Under fanen Anskaffelse skal du sørge for, at feltet Tidsserie ikke er markeret (ingen tidsserie ).
    10. Indstil scanningshastighed og retning. Under Anskaffelsesparametre skal du klikke på fanen Anskaffelsestilstand > Ramme > forudindstillinger > 1024 x 1024. Vælg fanen Anskaffelsestilstand > Ramme > retning > dobbeltpil til tovejsscanning. Vælg fanen Anskaffelsestilstand > skyderen Ramme > scanningshastighed > 6.
    11. Hvis celler er mærket med td-tomat, skal du indstille mikroskopet til at scanne den røde kanal 592 nm excitation / 614 nm emission, detektionsbølgelængde 600-700 nm ud over den grønne kanal. Indstil dette ved at gå til Anskaffelsesparametre og klikke på fanen Kanaler > feltet Spor1 . Brug rullemenuen ved siden af feltet Spor1 til at vælge Rød (Texas Rød ). Følg den samme proces som i trin 2.6.3, bortset fra at klikke på 561-boksen i stedet for 488-boksen . Indstil lasereffekten til 1 %. Td-Tomat er meget lysere end GCaMP3 og kræver lavere lasereffekt.
  7. Lav et billede i høj opløsning af DRG ved at klikke på knappen Start eksperiment under fanen Anskaffelse .
  8. Indlæs mikroskopets protokol for hurtig scanning (se trin 2.4). Optag spontan aktivitet i DRG i 80 cyklusser (ca. 10 min). Generer en ortogonal projektionsfilm, og kontroller, at billedet er af tilstrækkelig kvalitet til analyse.
    BEMÆRK: Kvalitetsovervejelser er de samme som i trin 2.5.
  9. For at anvende stimuli skal du indstille mikroskopet til at udføre 15-20 scanninger. Vent på, at scanningerne 1-5 er fuldført for at producere grundlinjen. Anvend stimulus under scanninger 6-10. Vent mindst 5 minutter efter hver stimulus, før du anvender den næste stimulus for at forhindre desensibilisering.
    BEMÆRK: Mekaniske stimuli skal anvendes først og derefter kolde, termiske og kemiske stimuli. Svagere stimuli (f.eks. lav mekanisk kraft, temperaturer tættere på stuetemperatur) bør anvendes før stærkere stimuli (f.eks. højere mekanisk kraft, temperaturer længere væk fra stuetemperatur). Når du anvender stimuli, skal du sørge for ikke at forårsage nogen bevægelse af DRG. Især for stærke termiske stimuli er det ofte nødvendigt at anvende 2% isofluran i 1-2 minutter, før stimulus påbegyndes. På mikroskopet, der anvendes i denne undersøgelse, kan hver scanning høres tydeligt, således at forskeren let kan identificere slutningen af scanningen, hvilket muliggør stimulusapplikation umiddelbart efter scanning 5. Imidlertid vil enhver metode, der letter anvendelsen af stimuli på et ensartet tidspunkt, fungere.
  10. For en mekanisk presse skal du holde algometerets pincher med poten mellem padlerne uden at røre poten og klemme starter umiddelbart efter afslutningen af scanning 5 og stopper umiddelbart efter scanning 10. Overvåg trykkraften med et algometer (se materialetabel). Hold pressekraften så tæt på den ønskede kraft (her bruger vi en 100 g pressestimulus) som muligt, og sørg for, at den ikke overstiger 10 g over den ønskede kraft.
    BEMÆRK: Man kan detektere stimuli med så lidt som 0,07 g von Frey filamenter og så meget som 600 g trykkraft.
  11. For kolde og termiske stimuli afkøles eller opvarmes et bægerglas vand til lige under (for kulde) eller over (for termisk) den ønskede temperatur og start scanningen. Her skal du bruge en 45 ° C stimulus. Når vandet har den korrekte temperatur, påføres stimulus umiddelbart efter scanning 5 ved at nedsænke poten i vandet. Træk bægerglasset væk umiddelbart efter scanning 10.
    BEMÆRK: Temperaturen skal være inden for 1 °C af den ønskede temperatur ved scanning 5. Hvis bægerglassets temperatur er forkert, skal du ikke anvende stimulus, fordi dette kan desensibilisere neuronerne. I stedet afkøles eller opvarmes vandet igen, og prøv igen. Vi har målt temperaturer helt ned til 0 °C (isvand) og helt ned til 95 °C. Husk dog, at temperaturer over 50 °C kan skade væv og forvirre senere eksperimenter. På samme måde er nogle kemikalier (f.eks. Tetrodotoxin, capsaicin) irreversible eller kan ikke vaskes ud og kan forhindre yderligere forsøg på dyret.
  12. Når alle stimuli er blevet anvendt og registreret, aflives dyret ved overdosering med ketamin/xylazin (200 mg/kg ketamin, 30 mg/kg xylazin eller 5 μL pr. gram legemsmasse af opløsningen fremstillet i trin 1.1) efterfulgt af halshugning.

3. Analyse af data

  1. Åbn billedfilerne ved at trække og slippe ind i ImageJ. Når du har åbnet filen, skal du vælge billedtypen under Billede > Skriv > RGB-farve.
    BEMÆRK: StackReg21-plugin'et under Plugins > StackReg er nyttigt til at korrigere og justere bevægelsesartefakter. ImageJ kan læse de fleste mikroskopsoftwarefilformater. Valget af billedtype afhænger af brugerens præference. RGB forenkler produktion af farvebilleder til offentliggørelse. Softwarepakker fra mikroskopproducenten eller cytoNet22 kan også hjælpe med analyse. Det er ikke nødvendigt at downloade, installere og bruge StackReg, men det anbefales.
  2. Brug værktøjet ROI (Region of Interest) til at vælge aktive neuroner under Analysér > værktøj > ROI Manager. Tegn ROI'er ved hjælp af ellipse - eller rektangelværktøjerne på værktøjslinjen, og placer dem i ROI-filen ved at trykke på knappen Tilføj under Tilføj i ROI-managervinduet eller ved at trykke på "t"-tasten.
    BEMÆRK: Sørg for ofte at gemme ROI-filen. Brugere kan altid gendanne ROI'er ved at trække og slippe en ROI-fil i ImageJ og klikke på feltet Vis alle nederst i ROI Manager-vinduet. Det anbefales ikke at gemme som en overlejring. Erfaringsmæssigt forenkler lagring som ROI.zip fil analysen.
  3. Under Analysér > Indstil målinger skal du sørge for, at indstillingen for gennemsnitlig grå værdi er markeret. Fjern markeringen i alle andre felter under Indstil mål. Brug værktøjet til flere målinger i menuen ROI-styring til at beregne intensiteten inden for ROI'erne. Mål intensitet ved hjælp af vinduet ROI under Mere > Multimeasure.
    BEMÆRK: Nogle gange vil tilstødende neuroner være for tæt på hinanden til at tegne separate ROI'er. Disse neuroner kan ikke bruges til at måle forbigående intensitet, men kan indgå i antallet af aktiverende neuroner.
  4. Gem CSV-filen genereret af Multimeasure, og åbn CSV-filen med ethvert regnearkssoftware.
    BEMÆRK: Se Supplerende fil 1 for et eksempel på regnearksskabelon til analyse.
  5. Beregn Ca 2+ transient intensitet som ΔF / F 0 = (F t- F 0) / F 0, hvor Ft er pixelintensiteten i et ROI på tidspunktet for interessepunktet, og F 0 er baselineintensiteten bestemt ved at beregne gennemsnittet af intensiteterne af enten de 2-4 billeder før Ca 2+ transient for spontan aktivitet eller de første 1-5 billeder af ROI for Ca 2+ transienter, der forekommer under stimulering. Ekskluder eventuelle neuroner, der producerer Ca2+ toppe før stimulus, og analyser ikke aktivitet, når stimulus slutter.
  6. Til Ca2+ forbigående intensitetsanalyse skal du tilfældigt prøve omtrent lige mange neuroner fra hver ganglion for at undgå at skæve dataene mod ganglier, der producerede det største antal responderende neuroner. Ekskluder toppe, hvor ΔF / F 0 < 0,15.
    BEMÆRK: Der er alternative offentliggjorte metoder til analyse og inklusion / udelukkelse af neuroner 11,12,23,24,25,26,27,28.
  7. Mål neurondiametre ved hjælp af linjeværktøjet på værktøjslinjen i ImageJ. Beregn den gennemsnitlige diameter ud fra linjerne trukket langs de længste og korteste diametre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figure 4
Figur 4: Repræsentative billeder af L5 dorsale rodganglier af Pirt-GCaMP3-mus. (A,D) Single frame højopløsningsscanninger af L5 dorsale rodganglier hos Pirt-GCaMP3-mus vises. (B,E) . Gennemsnitlige intensitetsfremskrivninger af 15 billeder af Pirt-GCaMP3 L5 DRG-ganglier fra henholdsvis panel A og panel D i fravær af stimuli. Nogle neuroner, der producerede spontane Ca2+ transienter, kaldes ud med gule pile. (C) Gennemsnitlig intensitetsprojektion af to billeder før stimulus og alle fem stimulusrammer af Pirt-GCaMP3 ganglion fra panel A under 100 g bagpotepresse. Nogle neuroner, der producerede Ca2+ transienter under stimulus, kaldes ud med gule pile. (F-I) Gennemsnitlige intensitetsfremskrivninger af rammer 4 og 5 (før stimulus) (paneler A og D) og rammer 6-9 (under 100 g pressestimulus) af ganglion fra panel D med henholdsvis rammerne 4-6, ramme 4 + 5 + 7, rammer 4 + 5 + 8 og rammer 4 + 5 + 9 af en 100 g bagpotepresse. (J) Fluoresensintensitetsspor af tre spontant aktive neuroner fra panel B (sort) svarende til panel A ganglion og panel E (rød) svarende til panel D ganglion. Hver neurons spor normaliseres til dens medianintensitet (vist ved linjen ved Y = 0). (K) ΔF / F0 spor af tre neuroner, der aktiveres som reaktion på 100 g tryk fra panel C (sort) svarende til panel A ganglion og paneler F-I (rød) svarende til panel D ganglion. Bemærk, at X- og Y-akserne er forskellige fra i panel J. Klik her for at se en større version af denne figur.

Billeddannelse af et stort antal neuroner ved hjælp af konfokal scanning af Pirt-GCaMP L5 DRG
Kirurgisk L5 DRG-eksponering efterfulgt af konfokal mikroskopi gjorde det muligt at afbilde op til 1.800 neuroner på én gang ved hjælp af Pirt-GCaMP3-mus (figur 4). Dette skaber en stærk fordel ved samtidig at kunne observere tusindvis af primære sensoriske neuroner i et ensemble på populationsniveau i deres normale fysiologiske kontekst, både i kontrol og under unormale forhold. Spontane Ca 2+ transienter i fravær af stimuli (figur 4B, E og film 2) og Ca2+ transienter som reaktion på stimuli (figur 4C, F-I, film 3 og film 4) kan overvåges. Diameterne af aktiverende neuroner er stærkt korreleret med forskellige nervefibergrupper.

Figure 5
Figur 5: Stigende intensitet af stimuli forbedrer Ca2+ responser i ganglier hos Pirt-GCaMP3 mus. (A) Grafer over antallet af neuroner i L5 DRG-ganglier, der viser Ca2+ transienter som reaktion på stimuli fra to forskellige presseintensiteter, vises: 100 g, n = 8 ganglier; 300 g, n = 5. (B) Grafer over ΔF / F0-områder under kurven for prøver afCa2+ -transienter fra to forskellige presseintensiteter vises: 100 g, n = 88 neuroner; 300 g, n = 104. (C) Grafer over spor af ΔF / F0 på 100 g og300 g tryk stimuli. Rødt spor er middelværdien ΔF / F0; 100 g, n = 60 neuroner; 300 g, n = 57 neuroner. (D) Grafer over antallet af neuroner i L5 DRG-ganglier, der viser Ca 2+ transienter som reaktion på tre forskellige ikke-skadelige og en skadelig temperatur, vises:21 °C, n = 4 ganglier; 10 °C, n = 6; 45 °C, n = 7; 57 °C, n = 3. (E) Grafer over ΔF / F0-områder under kurven for prøver af Ca 2+ transienter fra tre forskellige ikke-skadelige og en skadelig temperaturstimulusintensiteter vises:21 ° C, n = 40 neuroner; 10 °C, n = 60; 45 °C, n = 61 57 °C, n = 118. F) Grafer over spor af ΔF / F0 af10 °C og 57 °C stimuli. Rødt spor er middelværdien ΔF / F0; 10 °C, n = 60 neuroner; 57 °C, n = 118. (G) Graf over procentdele af neuroner med forskellige diametre (<20 μm, 20-25 μm >25 μm), der producerer Ca2+ transienter spontant og med termiske og mekaniske stimuli. Spontan aktivitet (Spon), n = 5 ganglier; 45 °C, n = 3; 300 g, n = 3. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Søjlediagrammer viser midlerne og SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.

Antal celler, der producerer Ca 2+ transienter og Ca2+ transient areal under kurven (AUC) ved tilstedeværelse af stimuli
Stærke stimuli eller skadelig varme øgede Ca2+ responserne. Sammenlignet med at trykke med 100 g øgede presning med 300 g antallet af neuroner, der producerede Ca 2+ transienter (figur 5A, Studentens t-test: t = 2.398, df = 11, p = 0.0354) og ΔF / F 0-området under kurven for Ca 2+ transienter (figur 5B, Welchs t-test: t = 3.243, df = 187.4, p =0.0014). Tilsvarende øgede varm varme i et ikke-skadeligt temperaturområde (21 °C og 45 °C) antallet af neuroner, der producerede Ca 2+ transienter (figur 5C, envejs ANOVA F 2,14 = 4,853, p = 0,0251, efterfulgt af Tukeys q = 4,380, df = 14, p = 0,0202) og ΔF / F0-området under kurven for Ca2+ transienter (figur 5D, Brown-Forsythe ANOVA F 2,151,6 = 60,76, p = 0,0029 efterfulgt af Welchs t-test: t = 3,333, df = 96,72, p = 0,0036). Sammenlignet med en skadelig varmestimulus (57 °C) aktiverede ikke-skadelige temperaturer (21 °C, 10 °C og 45 °C) et mindre antal neuroner, der produceredeCa2+-transienter (figur 5E, envejs ANOVA F 2,16 = 2,513, p < 0,001, Dunnetts test, 21 °C: q = 9,594, df = 16, p < 0,001; 10 °C: q = 9,583, df =16, p < 0,001; 45 °C: q = 9,160, df = 16, p < 0,001) og ΔF / F 0 areal under kurven for Ca 2+ transienter ved 21 °C og 10 °C (figur 5D, Brown-Forsythe ANOVA F3,268,4 = 12,98, p < 0,001, Dunnetts T3-test,21 °C: t = 5,415, df = 128, p < 0,001; 10 °C: t = 4,398, df = 174,5, p < 0,001; 45 °C: t = 2, 079, df = 161, 9, p = 0, 1127). I dette eksperiment producerede neuroner med mindre og medium diameter Ca 2+ transienter spontant og under alle stimuli, men neuroner med større diameter producerede kun Ca2+ transienter som reaktion på 300 g pressestimulus (figur 5G).

Mærkning af neuroner, der udtrykker specifikke receptorer med td-Tomat i Pirt-GCaMP3-mus
Den cre-inducerbare reporter td-Tomat kan observeres under Pirt-GCaMP3-billeddannelse. Pirt-GCaMP3, td-tomatmus, der udtrykte Cre under kontrol af TrpV1-promotoren, viste bred, men ikke universel mærkning af primære sensoriske neuroner (figur 6A, B). Spontane Ca2+ transienter blev observeret i både td-tomatmærkede neuroner og neuroner, der ikke er mærket (figur 6C). Skadelig varme blev ikke testet på dette eksperiment, men vil blive testet i fremtidige eksperimenter.

Figure 6
Figur 6: Mærkning af TrpV1-positive neuroner med td-tomat i Pirt-GCaMP3-mus. (A) En maksimal intensitetsprojektion af spontan aktivitet af primære sensoriske neuroner af en TrpV1-Cre, td-tomat, Pirt-GCaMP3-mus afbildet kun på 495 nm excitationskanalen / 519 nm (FITC, grøn). Nogle neuroner, der producerer Ca2+ transienter, kaldes ud med gule pile (ikke mærket med td-tomat) eller røde pile (mærket med td-tomat). (B) En gennemsnitlig intensitetsprojektion af de samme primære sensoriske neuroner som panel A kun på 592 nm excitation/614 nm emission rød kanal. (C) En maksimal intensitetsprojektion af samtidige røde og grønne kanaler af de samme primære sensoriske neuroner som i panel A vises. Nogle neuroner, der udtrykker GCaMP3, men ikke td-Tomato, kaldes ud med gule pile. Hvide pile angiver GCaMP-positiv uden Ca2+ transienter og ikke td-tomatpostiv. Klik her for at se en større version af denne figur.

Film 1: Spontan aktivitet af en Pirt-GCaMP3-ganglion, der ikke er korrekt nivelleret eller optimeret til optisk skivetykkelse, der forårsager bølgethed. 70 billeder pr. sekund AVI. Optisk skivetykkelse = 16 μm. Klik her for at downloade denne film.

Film 2: Spontan aktivitet af den samme ganglion fra film 1, der er korrekt nivelleret og optimeret til optisk skivetykkelse med mindre bølgethed. 70 billeder pr. sekund AVI. Optisk skivetykkelse = 13 μm. Klik her for at downloade denne film.

Film 3: 100 g bagpote presse af Pirt-GCaMP3 ganglion. 3 billeder pr. sekund AVI. Stimulus blev anvendt under rammer 6-10. Klik her for at downloade denne film.

Film 4: 45 °C termisk stimulus til bagpote af Pirt-GCaMP3 ganglion. 3 billeder pr. sekund AVI. Stimulus blev anvendt under rammer 6-10. Klik her for at downloade denne film.

Supplerende fil 1: Eksempel på analyseregneark Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vedvarende smerter er til stede i en lang række lidelser, invaliderende og / eller reducerer livskvaliteten for omkring 8% af mennesker29. Primære sensoriske neuroner registrerer skadelige stimuli på huden, og deres plasticitet bidrager til vedvarende smerte8. Mens neuroner kan studeres i cellekultur og eksplanter, fjerner det dem fra deres normale fysiologiske kontekst. Kirurgisk eksponering af DRG efterfulgt af Pirt-GCaMP3 Ca2+ billeddannelse tillader undersøgelse af primære sensoriske neuroner i deres normale fysiologiske sammenhæng ved hjælp af stimuli påført bagpoten. En stor fordel ved denne metode til Ca2+ billeddannelse er, at et stort antal neuroner kan overvåges samtidigt. Denne metode tillader analyse på populationsniveau af modalitet, neurondiameter og sjældne fænomener såsom koblet aktivering 10,11,12,13,14,15,16,17,30, hvilket giver indsigt i normal og patologisk somatosensation. Ud over neurondiameter som identifikator kan specifikke typer neuroner genetisk mærkes med en rød fluorofor, såsom td-tomat, til identifikation under billeddannelse. Denne teknik muliggør observationer af specifikke sensoriske modaliteter eller af neuroner, der udtrykker specifikke receptorer14,31. Andre anvendelser omfatter billeddannelse af andre sensoriske ganglier såsom trigeminusganglion24,32 eller genikuleret ganglion 23,26 og billeddannelse innervering af rygmarvet dorsalhorn ved primære sensoriske neuroner i explants 19,33.

Kritiske trin i protokollen inkluderer forebyggelse af overdreven blødning eller blødning på DRG, kontrol af anæstesi under billeddannelse, udjævning af DRG-overfladen, valg af optimal optisk skivetykkelse og forebyggelse af bevægelse af DRG under anvendelse af stimuli. Overdreven blødning kan forårsage dyrets eller artefakternes død på grund af fysiologiske virkninger af blodtab. Blodtab kan forårsage stigninger i lysstyrke (cytoplasmatisk calcium) på tværs af store områder af DRG. Blodtab kan også forårsage følelsesløshed, hvilket reducerer antallet af neuroner, der aktiveres som reaktion på stimuli. Blødning på DRG blokerer direkte billeddannelse, hvilket begrænser antallet af neuroner, der med succes kan afbildes. Da anæstesi påvirker neuronale aktiviteter og reaktioner, bør der anvendes et minimalt niveau af isofluranæstesi. Et niveau DRG og optimal optisk skivetykkelse er de mest kritiske dele af proceduren. Forkert udførelse af disse trin kan forårsage neuroner og bølgeevne ude af fokus under billeddannelse (se film 1 og film 2), der vil forvirre analysen eller gøre analysen umulig. Selv små bevægelser kan gøre sporing af individuelle neuroner på tværs af rammer umulig og / eller skabe artefakter, hvor en neuron ser ud til at blive mørkere eller lysere, hvilket forårsager betydelige fejl.

Det system, der beskrives her, har også nogle væsentlige begrænsninger. Anæstesi interfererer med neuron og glial Ca 2+ svar 25. Fordi denne metode er terminal, kan det samme dyr ikke overvåges over flere forsøg. Ca2+ transienter er en indirekte proxy for neuronaffyring og aktivitet. Denne metode bruger Ca2+ transienter som en proxy for handlingspotentialer. Imidlertid kan andre signaler såsom Gq-protein eller ryanodinreceptorsignalering ændre cytoplasmatiskeCa2+-koncentrationer34,35,36. Andre mekanismer er ikke rapporteret at forårsage Ca2+ transienter i DRG neuroner. Imidlertid er anvendelse af kemiske stimuli på poten kendt for at øge Ca2+ i spinal dorsal horn astrocytter36.

Afslutningsvis er intakt DRG Pirt-GCaMP3 Ca2+ billeddannelse et kraftfuldt værktøj til at studere somatosensation under normale og patologiske forhold. Resultaterne vist her er repræsentative for normale kontrolmus. Kontrolmus kan sammenlignes med smerte- og sygdomsmodeller eller genetiske mutanter 10,15,17,30,31,37. Desuden kan metoden, der præsenteres her, tilpasses andre genetisk kodede Ca2+ indikatorer 10,11,16 og bruges til at afbilde andre sensorer såsom spændingsregistrering38,39,40 og cyklisk adenosinmonophosphatdetektion 41. Mens konfokal mikroskopi blev anvendt i denne undersøgelse, kan to-fotonmikroskopi også anvendes11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health Grants R01DE026677 og R01DE031477 (til Y.S.K.), UTHSCSA startup fund (Y.S.K.) og en Rising Star Award fra University of Texas system (Y.S.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anased Injection (Xylazine) Covetrus, Akorn 33197
C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC Cal Zeiss 422642-9900-000
Cotton Tipped Applicators McKesson 24-106-1S
Curved Hemostat Fine Science Tools 13007-12
DC Temperature Controller FHC 40-90-8D
DC Temperature Controller Heating Pad FHC 40-90-2-05
Dumont Ceramic Coated Forceps Fine Science Tools 11252-50
FHC DC Temperature Controller FHC 40-90-8D
Fluriso (Isoflurane) MWI Animal Health, Piramal Group 501017
Friedman-Pearson Rongeurs Fine Science Tools 16221-14
GelFoam Pfizer 09-0353-01
Ketaset (Ketamine) Zoetis KET-00002R2
Luminescent Green Stage Tape JSITON/ Amazon B803YW8ZWL
Matrx VIP 3000 Isoflurane Vaporizer Midmark 91305430
Micro dissecting scissors Roboz RS-5882
Micro dissecting spring scissors Fine Science Tools 15023-10
Micro dissecting spring scissors Roboz RS-5677
Mini Rectal Thermistor Probe FHC 40-90-5D-02
Operating scissors Roboz RS-6812
Pirt-GCaMP3 C57BL/6J mice Johns Hopkins University N/A Either sex can be imaged equally well. Mice should be at least 8 weeks old due to weak or intermittent Pirt promoter expression in younger mice.
SMALGO small animal algometer Bioseb In vivo Research Instruments BIO-SMALGO
Stereotaxic frame Kopf Model 923-B 923-B
td-Tomato C57BL/6J mice Jackson Laboratory 7909
Top Plate, 6 in x 10 in Newport 290-TP
TrpV1-Cre C57BL/6J mice Jackson Laboratory 17769
Zeiss LSM 800 confocal microscope Cal Zeiss LSM800
Zeiss Zen 2.6 Blue Edition Software Cal Zeiss Zen (Blue Edition) 2.6

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rivero-Melián, C., Grant, G. Distribution of lumbar dorsal root fibers in the lower thoracic and lumbosacral spinal cord of the rat studied with choleragenoid horseradish peroxidase conjugate. The Journal of Comparative Neurology. 299 (4), 470-481 (1990).
  2. Wessels, W. J., Marani, E. A rostrocaudal somatotopic organization in the brachial dorsal root ganglia of neonatal rats. Clinical Neurology and Neurosurgery. 95, 3-11 (1993).
  3. Schmalbruch, H. The number of neurons in dorsal root ganglia L4-L6 of the rat. The Anatomical Record. 219 (3), 315-322 (1987).
  4. Sørensen, B., Tandrup, T., Koltzenburg, M., Jakobsen, J. No further loss of dorsal root ganglion cells after axotomy in p75 neurotrophin receptor knockout mice. The Journal of Comparative Neurology. 459 (3), 242-250 (2003).
  5. Basbaum, A. I., Woolf, C. J. Pain. Current Biology. 9 (12), 429-431 (1999).
  6. Liu, Y., Ma, Q. Generation of somatic sensory neuron diversity and implications on sensory coding. Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 52-60 (2011).
  7. Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139 (2), 267-284 (2009).
  8. Stucky, C. L., Mikesell, A. R. Cutaneous pain in disorders affecting peripheral nerves. Neuroscience Letters. 765, 136233 (2021).
  9. Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. Calcium imaging for analgesic drug discovery. Neurobiology of Pain. 11, 100083 (2022).
  10. Chen, Z., et al. Adjacent intact nociceptive neurons drive the acute outburst of pain following peripheral axotomy. Scientific Reports. 9 (1), 7651 (2019).
  11. Chisholm, K. I., Khovanov, N., Lopes, D. M., La Russa, F., McMahon, S. B. Large scale in vivo recording of sensory neuron activity with GCaMP6. eNeuro. 5 (1), (2018).
  12. Emery, E. C., et al. In vivo characterization of distinct modality-specific subsets of somatosensory neurons using GCaMP. Science Advances. 2 (11), 1600990 (2016).
  13. Ishida, H., et al. In vivo calcium imaging visualizes incision-induced primary afferent sensitization and its amelioration by capsaicin pretreatment. The Journal of Neuroscience. 41 (41), 8494-8507 (2021).
  14. Kim, Y. S., et al. Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
  15. MacDonald, D. I., et al. Silent cold-sensing neurons contribute to cold allodynia in neuropathic pain. Brain. 144 (6), 1711-1726 (2021).
  16. Wang, F., et al. Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold. Cell Reports. 23 (7), 2001-2013 (2018).
  17. Kucharczyk, M. W., et al. The impact of bone cancer on the peripheral encoding of mechanical pressure stimuli. Pain. 161 (8), 1894-1905 (2020).
  18. Kim, A. Y., et al. a phosphoinositide-binding protein, functions as a regulatory subunit of TRPV1. Cell. 133 (3), 475-485 (2008).
  19. Kim, Y. S., et al. Central terminal sensitization of TRPV1 by descending serotonergic facilitation modulates chronic pain. Neuron. 81 (4), 873-887 (2014).
  20. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  21. Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  22. Mahadevan, A. S., et al. cytoNet: Spatiotemporal network analysis of cell communities. PLoS Computational Biology. 18 (6), 1009846 (2022).
  23. Barretto, R. P., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).
  24. Leijon, S. C. M., et al. Oral thermosensing by murine trigeminal neurons: modulation by capsaicin, menthol and mustard oil. The Journal of Physiology. 597 (7), 2045-2061 (2019).
  25. Sekiguchi, K. J., et al. Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice. Nature Communications. 7, 11450 (2016).
  26. Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6, 8171 (2015).
  27. Ran, C., Hoon, M. A., Chen, X. The coding of cutaneous temperature in the spinal cord. Nature Neuroscience. 19 (9), 1201-1209 (2016).
  28. Yarmolinsky, D. A., et al. Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system. Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).
  29. Torrance, N., Smith, B. H., Bennett, M. I., Lee, A. J. The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey. The Journal of Pain. 7 (4), 281-289 (2006).
  30. Shannonhouse, J., et al. Meclizine and metabotropic glutamate receptor agonists attenuate severe pain and Ca(2+) activity of primary sensory neurons in chemotherapy-induced peripheral neuropathy. The Journal of Neuroscience. 42 (31), 6020-6037 (2022).
  31. Luiz, A. P., et al. Cold sensing by Na(V)1.8-positive and Na(V)1.8-negative sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3811-3816 (2019).
  32. Hartung, J. E., Gold, M. S. GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons. Cell Calcium. 89, 102225 (2020).
  33. Chung, M. K., Wang, S., Oh, S. L., Kim, Y. S. Acute and chronic pain from facial skin and oral mucosa: Unique neurobiology and challenging treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5810 (2021).
  34. Chan, S. L., Mayne, M., Holden, C. P., Geiger, J. D., Mattson, M. P. Presenilin-1 mutations increase levels of ryanodine receptors and calcium release in PC12 cells and cortical neurons. The Journal of Biological Chemistry. 275 (24), 18195-18200 (2000).
  35. Sierra, D. A., Popov, S., Wilkie, T. M. Regulators of G-protein signaling in receptor complexes. Trends in Cardiovascular Medicine. 10 (6), 263-268 (2000).
  36. Yoshihara, K., et al. Astrocytic Ca(2+) responses in the spinal dorsal horn by noxious stimuli to the skin. Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 101-104 (2018).
  37. Tan, C. H., McNaughton, P. A. The TRPM2 ion channel is required for sensitivity to warmth. Nature. 536 (7617), 460-463 (2016).
  38. Akemann, W., Mutoh, H., Perron, A., Rossier, J., Knöpfel, T. Imaging brain electric signals with genetically targeted voltage-sensitive fluorescent proteins. Nature Methods. 7 (8), 643-649 (2010).
  39. Gong, Y., et al. High-speed recording of neural spikes in awake mice and flies with a fluorescent voltage sensor. Science. 350 (6266), 1361-1366 (2015).
  40. Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision. Nature Methods. 7 (5), 399-405 (2010).
  41. Harada, K., et al. Red fluorescent protein-based cAMP indicator applicable to optogenetics and in vivo imaging. Scientific Reports. 7 (1), 7351 (2017).

Tags

Denne måned i JoVE nummer 192
<em>In vivo</em> Calciumbilleddannelse af neuronale ensembler i netværk af primære sensoriske neuroner i intakte dorsale rodganglier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shannonhouse, J., Gomez, R., Son,… More

Shannonhouse, J., Gomez, R., Son, H., Zhang, Y., Kim, Y. S. In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia. J. Vis. Exp. (192), e64826, doi:10.3791/64826 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter