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Neuroscience

Vivo में बरकरार पृष्ठीय रूट गैन्ग्लिया में प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स के नेटवर्क में न्यूरोनल एन्सेंबल की कैल्शियम इमेजिंग

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64826
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Oral & Maxillofacial Surgery, School of Dentistry, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Programs in Integrated Biomedical Sciences, Translational Sciences, Biomedical Engineering, Radiological Sciences, University of Texas Health Science Center at San Antonio

Summary

यह प्रोटोकॉल पृष्ठीय जड़ नाड़ीग्रन्थि (डीआरजी) के सर्जिकल एक्सपोजर का वर्णन करता है, जिसके बाद जीसीएएमपी 3 (आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सीए2 + संकेतक; ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन-कैलमोडुलिन-एम 13 प्रोटीन 3) पिछले पंजे पर विभिन्न प्रकार की उत्तेजनाओं को लागू करते हुए पीर्ट-जीसीएएमपी 3 चूहों का उपयोग करके न्यूरोनल एन्सेंबल की सीए2 + इमेजिंग।

Abstract

सीए2 + इमेजिंग का उपयोग सेलुलर गतिविधि के लिए प्रॉक्सी के रूप में किया जा सकता है, जिसमें कार्रवाई क्षमता और विभिन्न सिग्नलिंग तंत्र शामिल हैं जिसमें साइटोप्लाज्म में सीए2 + प्रवेश या इंट्रासेल्युलर सीए2 + स्टोर की रिहाई शामिल है। चूहों में पृष्ठीय जड़ नाड़ीग्रन्थि (डीआरजी) के प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स की पीआरटी-जीसीएएमपी 3-आधारित सीए2 + इमेजिंग बड़ी संख्या में कोशिकाओं के एक साथ माप का लाभ प्रदान करती है। 1,800 न्यूरॉन्स तक की निगरानी की जा सकती है, जिससे न्यूरोनल नेटवर्क और सोमाटोसेंसरी प्रक्रियाओं को विवो में जनसंख्या स्तर पर उनके सामान्य शारीरिक संदर्भ में एक पहनावा के रूप में अध्ययन किया जा सकता है। निगरानी किए गए न्यूरॉन्स की बड़ी संख्या गतिविधि पैटर्न का पता लगाने की अनुमति देती है जो अन्य तरीकों का उपयोग करके पता लगाना चुनौतीपूर्ण होगा। उत्तेजनाओं को माउस हिंडपाव पर लागू किया जा सकता है, जिससे डीआरजी न्यूरॉन पहनावा पर उत्तेजनाओं के प्रत्यक्ष प्रभावों का अध्ययन किया जा सकता है। सीए2 + ट्रांसिएंट्स का उत्पादन करने वाले न्यूरॉन्स की संख्या के साथ-साथ सीए2 + ट्रांसिएंट्स का आयाम विशिष्ट संवेदी तौर-तरीकों के प्रति संवेदनशीलता को इंगित करता है। न्यूरॉन्स का व्यास सक्रिय फाइबर प्रकारों (गैर-हानिकारक मेचानो बनाम हानिकारक दर्द फाइबर, ए, ए, और सी फाइबर) के प्रमाण प्रदान करता है। विशिष्ट रिसेप्टर्स को व्यक्त करने वाले न्यूरॉन्स को आनुवंशिक रूप से टीडी-टमाटर और विशिष्ट क्रे रिकॉम्बिनेस के साथ पीर्ट-जीसीएएमपी के साथ लेबल किया जा सकता है। इसलिए, डीआरजी की पीआरटी-जीसीएएमपी 3 सीए2 + इमेजिंग दर्द, खुजली, स्पर्श और अन्य सोमाटोसेंसरी संकेतों का अध्ययन करने के लिए जनसंख्या स्तर पर एक पहनावा के रूप में कार्य करने वाले विशिष्ट संवेदी तौर-तरीकों और न्यूरॉन उपप्रकारों के विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण और मॉडल प्रदान करती है।

Introduction

प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स सीधे त्वचा को आंतरिक करते हैं और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र 1,2 में सोमाटोसेंसरी जानकारी वापस ले जाते हैं। पृष्ठीय रूट गैन्ग्लिया (डीआरजी) 10,000-15,000 प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स 3,4 के सेल बॉडी क्लस्टर हैं। डीआरजी न्यूरॉन्स विविध आकार, माइलिनेशन स्तर और जीन और रिसेप्टर अभिव्यक्ति पैटर्न पेश करते हैं। छोटे व्यास न्यूरॉन्स में दर्द-संवेदन न्यूरॉन्स शामिल हैं और बड़े व्यास के न्यूरॉन्स आमतौर पर गैर-दर्दनाक यांत्रिक उत्तेजनाओं का जवाब देते हैं 5,6. चोट, पुरानी सूजन और परिधीय न्यूरोपैथियों जैसे प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स में विकार इन न्यूरॉन्स को विभिन्न उत्तेजनाओं के प्रति संवेदनशील बना सकते हैं और पुराने दर्द, एलोडोनिया और दर्द अतिसंवेदनशीलता 7,8 में योगदान कर सकते हैं। इसलिए, डीआरजी न्यूरॉन्स का अध्ययन आम तौर पर सोमाटोसेंसेशन और कई दर्द और खुजली विकारों दोनों को समझने में महत्वपूर्ण है।

विवो में न्यूरॉन्स फायरिंग सोमाटोसेंसेशन के लिए आवश्यक हैं, लेकिन हाल ही में, विवो में बरकरार गैन्ग्लिया का अध्ययन करने के लिए उपकरण अपेक्षाकृत कम संख्या में कोशिकाओंतक सीमित हैं। यहां, हम एक पहनावा के रूप में विवो में जनसंख्या स्तर पर न्यूरॉन्स की कार्रवाई क्षमता या गतिविधियों का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली विधि का वर्णन करते हैं। विधि साइटोप्लाज्मिक सीए2 + गतिशीलता के आधार पर इमेजिंग को नियोजित करती है। सीए2 + संवेदनशील फ्लोरोसेंट संकेतक साइटोप्लाज्मिक सीए2 + की सामान्य रूप से कम सांद्रता के कारण सेलुलर गतिविधि को मापने के लिए अच्छे प्रॉक्सी हैं। इन संकेतकों ने चूहों 9,10,11,12,13,14,15,16 और चूहों 17 में सैकड़ों से कई हजारों प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स की एक साथ निगरानी की अनुमति दीहै। इस अध्ययन में वर्णित विवो सीए2 + इमेजिंग की विधि का उपयोग यांत्रिक, ठंडे, थर्मल और रासायनिक उत्तेजनाओं के लिए जनसंख्या स्तर की प्रतिक्रियाओं का सीधे निरीक्षण करने के लिए किया जा सकता है।

फॉस्फोइनोसिटाइड-बाइंडिंग मेम्ब्रेन प्रोटीन, पीर्ट को लगभग सभी (>95%) प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स18,19 में उच्च स्तर पर व्यक्त किया जाता है और इसका उपयोग विवो20 में न्यूरॉन गतिविधि की निगरानी के लिए सीए2 + सेंसर, जीसीएएमपी 3 की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, विवो डीआरजी सर्जरी, सीए2 + इमेजिंग, और कॉनफोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (एलएसएम) का उपयोग करके पीआरटी-जीसीएएमपी 3 चूहों 14 के दाईं ओर काठ 5 (एल 5) डीआरजी में प्रदर्शन करने के लिएतकनीकों का वर्णन किया गया है।

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Protocol

यहां वर्णित सभी प्रक्रियाओं को सैन एंटोनियो में टेक्सास स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया था।

नोट: एक बार शुरू होने के बाद, पशु सर्जरी (चरण 1) और इमेजिंग (चरण 2) को निरंतर तरीके से पूरा किया जाना चाहिए। डेटा विश्लेषण (चरण 3) बाद में किया जा सकता है।

1. सर्जरी और दाहिने तरफ एल 5 डीआरजी इमेजिंग के लिए जानवर को सुरक्षित करना

नोट: इस अध्ययन में 8 सप्ताह या उससे अधिक उम्र के नर और मादा दोनों पिंट-जीसीएएमपी 3 सी 57बीएल / 6 जे चूहों का उपयोग किया गया था। जबकि या तो सेक्स को समान रूप से अच्छी तरह से चित्रित किया जा सकता है, छोटे चूहों में कमजोर या आंतरायिक पीर्ट अभिव्यक्ति के कारण चूहों को कम से कम 8 सप्ताह का होना चाहिए। पीआरटी-जीसीएएमपी 3 सी 57बीएल / 6 जे चूहों को जॉन्स हॉपकिंस विश्वविद्यालय14 में उत्पन्न किया गया था। दोनों तरफ डीआरजी को चित्रित किया जा सकता है, और अन्य काठ डीआरजी (जैसे, काठ 4) को चित्रित किया जा सकता है। दिए गए समय एक अनुभवी सर्जन के लिए अनुमान हैं। कभी-कभी तकनीकी मुद्दे जैसे रक्तस्राव में वृद्धि आवश्यक समय को बढ़ा सकती है।

  1. 40 मिलीग्राम / एमएल केटामाइन और 6 मिलीग्राम / एमएल ज़ाइलज़िन युक्त एक बाँझ खारा घोल तैयार करें। इमेजिंग के बाद सर्जरी और इच्छामृत्यु दोनों के लिए कुल मात्रा कम से कम 9 μL / g शरीर द्रव्यमान होनी चाहिए।
    चेतावनी: केटामाइन हानिकारक है यदि इंजेक्शन दिया जाता है, निगल लिया जाता है, या जब यह आंख के संपर्क में आता है। सावधानी से संभालें।
  2. सुनिश्चित करें कि प्रयोगशाला पशु-अनुमोदित विधि की देखभाल और उपयोग के लिए ऑटोक्लेविंग या अन्य एनआईएच गाइड द्वारा सभी सर्जिकल उपकरण साफ और निष्फल हैं।
  3. सर्जरी से पहले 15 से 25 मिनट के बीच, शरीर के वजन के प्रत्येक ग्राम (90 मिलीग्राम / किग्रा केटामाइन, 13.5 मिलीग्राम / किग्रा ज़ाइलज़िन) के लिए ~ 2.25 μL के साथ एक Pirt-GCaMP3 माउस इंट्रापरिटोनियल (यानी) इंजेक्ट करें। 120 मिलीग्राम / किग्रा केटामाइन से अधिक न करें।
  4. एनेस्थीसिया (चरण 1.3) के इंजेक्शन के बाद 15 से 25 मिनट के भीतर, जांचें कि माउस विपरीत पिछले पंजे (ऊपर / दाएं पंजे को नहीं) को दबाकर संज्ञाहरण के सर्जिकल विमान तक पहुंच गया है या नहीं। हिंदलिम्ब वापसी रिफ्लेक्स की अनुपस्थिति यह सुनिश्चित करती है कि संज्ञाहरण का एक सर्जिकल विमान प्राप्त किया जाता है।
    नोट: एनेस्थीसिया की निगरानी के लिए पूरे प्रयोग में हिंदलिम्ब वापसी रिफ्लेक्स का उपयोग किया जाता है। हमेशा पिछले पंजे का उपयोग करें।
  5. शरीर के तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखने के लिए माउस को गर्म पैड पर रखें।
    नोट: माउस के सिर को स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम ( सामग्री की तालिका देखें), या शोधकर्ता की वरीयता के आधार पर एक और फ्रेम के साथ पकड़ना सहायक हो सकता है।
  6. माउस की श्रोणि हड्डी के लिए महसूस करके काठ के विस्तार का पता लगाएं। काठ के इज़ाफ़ा क्षेत्र के ऊपर माउस के पिछले हिस्से को शेव करें। इस कदम को ~ 90 सेकंड लेना चाहिए।
    नोट: माउस को शेविंग के लिए गर्म पैड से संक्षेप में हटाया जा सकता है।
  7. कैंची का उपयोग करके काठ के विस्तार के ऊपर तीन तरफा आयताकार चीरा (8 मिमी x 20 मिमी) बनाएं और त्वचा को बल से दूर मोड़ें (चित्रा 1 ए)। यह कदम ~ 2 मिनट लगता है।
    नोट: शोधकर्ता चीरा को खुला रखने के लिए हेमोस्टैट फोर्स या रिट्रैक्टर का भी उपयोग कर सकते हैं। यह एक उत्तरजीविता सर्जरी नहीं है, इसलिए सर्जिकल क्षेत्र की अतिरिक्त सफाई आवश्यक नहीं है; हालांकि, यह पोविडोन-आयोडीन का उपयोग करके किया जा सकता है। सबसे बड़ा स्वीकार्य चीरा आकार यहां दिया गया है। एक छोटा चीरा एक बड़े चीरे की तुलना में बेहतर है।
  8. रीढ़ की दाईं ओर 3-4 मिमी चीरे लगाने के लिए 13 मिमी स्प्रिंग विच्छेदन कैंची का उपयोग करें। रीढ़ की हड्डी को उजागर करने के लिए त्वचा और मांसपेशियों को किनारों पर वापस काटने के लिए कैंची का उपयोग करें (चित्रा 1 बी)। इस कदम में ~ 3 मिनट लगते हैं।
  9. रक्तस्राव को कम करने की कोशिश करते हुए मांसपेशियों और संयोजी ऊतक को काटकर दाईं ओर एल 5 डीआरजी की अनुप्रस्थ प्रक्रिया को साफ करने के लिए 8 मिमी कैंची का उपयोग करें। रक्त को अवशोषित करने के लिए कपास और / या जेलफोम का उपयोग करें। एल 5 कशेरुका श्रोणि की हड्डी के लिए पहला कशेरुका रोस्ट्रल है।
    नोट: इस चरण में ~ 3 मिनट लगते हैं और यदि जानवर सामान्य से अधिक खून बहाता है तो अतिरिक्त समय लग सकता है।
  10. फ्रीडमैन-पियरसन रोंगर्स या मजबूत महीन बल का उपयोग करके दाईं ओर एल 5 अनुप्रस्थ प्रक्रिया को खोलें। डीआरजी (चित्रा 1 सी) को छूने के लिए सावधान रहें।
    नोट: इस चरण में ~ 2 मिनट लगते हैं लेकिन अतिरिक्त समय लग सकता है यदि जानवर सामान्य से अधिक खून बहाता है।
  11. तब तक आगे न बढ़ें जब तक रक्तस्राव पूरी तरह से बंद न हो जाए। जेल फोम या कपास का उपयोग करके डीआरजी सतह पर रक्तस्राव को रोकें। इस चरण में 1-4 मिनट लगते हैं।
  12. माउस और हीटिंग पैड को कस्टम स्टेज (चित्रा 2 ए, बी) पर ले जाएं। जगह में जानवर और हीटिंग पैड को सुरक्षित करने के लिए स्टेज टेप का उपयोग करें। जानवर की नाक को नाक शंकु में रखें ताकि जानवर को निरंतर आइसोफ्लुरेन संज्ञाहरण प्राप्त हो सके। दाहिने हिंडपाव को मंच से बाहर चिपकाकर सुरक्षित करें ताकि उत्तेजनाओं को पंजे पर आसानी से लागू किया जा सके। इस कदम में 3 मिनट लगते हैं।
  13. रीढ़ की हड्डी को रीढ़ की हड्डी पर और / या पेल्विक हड्डी पर त्वचा पर चरण क्लैंप के साथ सुरक्षित करें जो एल 5 डीआरजी के लिए रोस्ट्रल और पुच्छल है। डीआरजी की सतह को यथासंभव स्तर बनाने के लिए क्लैंप और चरण को समायोजित करें (चित्रा 2 बी, सी)।
    नोट: डीआरजी और उद्देश्य के बीच पड़े ऊतक को ट्रिम करना आवश्यक हो सकता है।
  14. माइक्रोस्कोप के नीचे चरण रखें ताकि कम होने पर उद्देश्य सीधे डीआरजी के ऊपर 8 मिमी हो (चित्रा 3 ए, बी)। रेक्टल थर्मामीटर डालें।
    नोट: डीआरजी से उद्देश्य तक की दूरी उद्देश्य, माइक्रोस्कोप और जानवर के आधार पर भिन्न हो सकती है।
  15. बिजली लाइनों को हीटिंग पैड और रेक्टल थर्मामीटर से कनेक्ट करें। नाक शंकु को आइसोफ्लुरेन गैस लाइनों से कनेक्ट करें।

Figure 1
चित्र 1: DRG एक्सपोज़र सर्जरी का उदाहरण। (A) एक छोटे से क्षेत्र को मुंडाया गया था और त्वचा को काट दिया गया था और वापस मोड़ दिया गया था। रोस्ट्रल-पुच्छल अक्ष पर चीरा ~ 10 मिमी है। (बी) रीढ़ की हड्डी के स्तंभ के दाईं ओर एक चीरा लगाया गया था और मांसपेशियों और संयोजी ऊतक को काट दिया गया था, जिससे एल 5 दाईं ओर अनुप्रस्थ प्रक्रिया उजागर हुई थी। रक्त को जेलफोम के साथ अवशोषित किया गया था। (सी) अनुप्रस्थ प्रक्रिया को साफ किया गया था और डीआरजी के ऊपर की हड्डी को हटा दिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: डीआरजी इमेजिंग के लिए कस्टम स्टेज पर माउस को माउंट करना। (A) कस्टम स्टेज दिखाया गया है। इसमें जानवर के लिए एक बेस प्लेट और एक प्लेट होती है। पशु माउंटिंग प्लेट एक लॉकिंग बॉल और सॉकेट स्विवेल जोड़ पर है। ऑक्सीजन/आइसोफ्लुरेन मिश्रण देने के लिए लाइनों के साथ एक नाक शंकु और एल्यूमीनियम पन्नी लपेटा हुआ हीटिंग पैड के साथ एक अपशिष्ट गैस लाइन जानवरों की माउंटिंग प्लेट पर टैप की जाती है। दो भुजाएं, जिनमें से प्रत्येक तीन लॉकिंग बॉल और सॉकेट स्विवेल जोड़ों से बनी होती हैं, बेस प्लेट पर रखी जाती हैं। प्रत्येक हाथ में कसने और ढीला करने के लिए एक पेंच के साथ फोर्सप्स से बना एक क्लैंप होता है। (बी) जानवर को जानवरों की बढ़ती प्लेट पर रखा जाता है। इसकी नाक नाक के शंकु में रखी जाती है। रीढ़ की हड्डी के स्तंभ और श्रोणि हड्डी को पकड़ने वाली त्वचा पर क्लैंप लगाए जाते हैं। उत्तेजनाओं को लागू करने के लिए आसान पहुंच के लिए दाईं ओर (ऊपर) हिंडपाव को चिपकादिया जाता है। (सी) क्लैंप रीढ़ की हड्डी के स्तंभ और श्रोणि हड्डी की एक क्लोजअप छवि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: कस्टम स्टेज पर जानवर को माइक्रोस्कोप उद्देश्य के नीचे रखा जाता है। (A) चरण, जानवर और माइक्रोस्कोप का एक विस्तृत कोण दृश्य। डीसी तापमान नियंत्रक के तार और ऑक्सीजन / आइसोफ्लुरेन सेवन और अपशिष्ट गैस लाइन की लाइनें बाईं ओर दिखाई देती हैं। (बी) माइक्रोस्कोप उद्देश्य के नीचे जानवर का एक करीबी दृश्य। डीआरजी उद्देश्य से ~ 8 मिमी नीचे है। रेक्टल थर्मामीटर डाला जाता है और नाक नाक शंकु के अंदर होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

2. डीआरजी इमेजिंग

  1. इमेजिंग के लिए एक सीधा कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप 10x/0.4 DIC उद्देश्य और संबंधित सॉफ़्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें। ग्रीन फिल्टर (एफआईटीसी) सेटिंग्स का उपयोग करें: उत्तेजना 495 एनएम, उत्सर्जन 519 एनएम, डिटेक्शन तरंग दैर्ध्य 500-580 एनएम, जीएएएसपी-पीएमटी 1 इमेजिंग डिवाइस, जीएएसपी-पीएमटी डिटेक्टर।
    नोट: अन्य माइक्रोस्कोप के लिए निर्माता की अनुशंसित सेटिंग्स का उपयोग करें।
  2. माइक्रोस्कोप के साथ डीआरजी की सतह का पता लगाएं। मंच पर क्लैंप को समायोजित करें जैसे कि डीआरजी सतह यथासंभव स्तर पर है और फोकल प्लेन में अधिकतम सतह क्षेत्र की कल्पना की जाती है।
    नोट: उद्देश्य की पसंद उपयोग किए गए माइक्रोस्कोप और उपयोगकर्ता वरीयता के आधार पर भिन्न हो सकती है। सॉफ्टवेयर की पसंद माइक्रोस्कोप पर निर्भर करती है। एक स्तर डीआरजी स्पष्ट छवियों में परिणाम देता है, सॉफ्टवेयर को स्पष्ट फिल्मों का निर्माण करने की अनुमति देता है, अधिक न्यूरॉन्स की इमेजिंग की अनुमति देता है, और विश्लेषण को आसान और अधिक सटीक बनाता है।
  3. नाक शंकु को ऑक्सीजन प्रवाह में 1% -1.5% आइसोफ्लुरेन की आपूर्ति करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि माउस एनेस्थेटाइज्ड रहे। ओवरडोज के बिना आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया को बनाए रखने के लिए पूरी प्रक्रिया में जानवर की सावधानीपूर्वक निगरानी करें।
    नोट: संज्ञाहरण को बनाए रखने के लिए आवश्यक आइसोफ्लुरेन की मात्रा व्यक्तिगत पशु और उत्तेजना से भिन्न हो सकती है। आमतौर पर, 1.5% पर्याप्त है। यदि उत्तेजना के दौरान जानवर चलता है, तो आइसोफ्लुरेन को बढ़ाया जाना चाहिए। यदि श्वास उथला हो जाता है, तो आइसोफ्लुरेन को कम किया जाना चाहिए। प्रत्येक उत्तेजना से पहले, पिछले पंजे पर हिंडलिंब वापसी रिफ्लेक्स का परीक्षण करें।
    चेतावनी: आइसोफ्लुरेन हानिकारक हो सकता है या साँस लेने पर चक्कर आना या उनींदापन पैदा कर सकता है। साँस लेने से बचें और केवल एक अच्छी तरह से हवादार क्षेत्र में उपयोग करें।
  4. माइक्रोस्कोप रैपिड स्कैनिंग प्रोटोकॉल लोड करें।
    1. रैपिड स्कैनिंग के लिए विशिष्ट सेटिंग्स का उपयोग करें: voxel आकार 2.496 μm x 2.496 μm x 16 μm, 512 x 512 पिक्सेल, 10 ऑप्टिकल स्लाइस Z-stack, 1 एयरी यूनिट (AU)/32 μm, 1% 488 nm लेजर पावर 5 mW, पिक्सेल समय 1.52μs, लाइन समय 0.91 ms, फ्रेम समय 465 ms, LSM स्कैन गति 8, द्विदिश स्कैनिंग, GAAsP-PMT डिटेक्टर 650 V हासिल करता है, डिजिटल लाभ 1. इष्टतम सेटिंग्स माइक्रोस्कोप और जानवर द्वारा भिन्न हो सकती हैं।
    2. रैपिड स्कैनिंग प्रोटोकॉल सेट करने के लिए, अधिग्रहण टैब पर क्लिक करें। अधिग्रहण पैरामीटर के अंतर्गत, फ़्रेम टैब पर क्लिक करें. 512 पिक्सेल x 512 पिक्सेल छवि रिकॉर्ड करने के लिए माइक्रोस्कोप सेट करने के लिए प्रीसेट > 512 x 512 पर क्लिक करें। यह बदले में छवि आकार के आधार पर वोक्सेल आकार के एक्स और वाई मानों को सेट करेगा, जो माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर द्वारा निर्धारित किया जाता है।
    3. अधिग्रहण पैरामीटर के अंतर्गत, चैनल टैब पर क्लिक करें. Track2 बॉक्स पर क्लिक करें. Green (FITC) का चयन करने के लिए Track2 बॉक्स के बगल में ड्रॉप-डाउन मेनू का उपयोग करें। Track2 के नीचे एक नया टैब खुलेगा।
    4. लेजर के बगल में, 488 बॉक्स पर क्लिक करें। यह उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य निर्धारित करेगा।
    5. 488 एनएम स्लाइडर के बगल में, लेजर पावर को 1% पर सेट करें। 1 एयरी यूनिट के लिए अपेराचर सेट करने के लिए 1 एयू बटन पर क्लिक करें। एफआईटीसी के तहत, मास्टर गेन को 650 वी, डिजिटल ऑफसेट को 0 और डिजिटल गेन को 1 पर सेट करें।
    6. अधिग्रहण टैब के तहत , Z-Stack बॉक्स की जाँच करें। गैंग्लियन की लाइव छवि देखने के लिए लाइव बटन पर क्लिक करें। फोकल प्लेन नॉब को तब तक चालू करें जब तक कि न्यूरॉन्स का केवल एक छोटा चाप दिखाई न दे।
    7. अधिग्रहण पैरामीटर के अंतर्गत, अंतिम सेट करें बटन > Z-Stack टैब पर क्लिक करें। फोकल प्लेन नॉब को तब तक नीचे घुमाएं जब तक कि न्यूरॉन्स का केवल एक छोटा चाप दिखाई न दे। अधिग्रहण पैरामीटर के अंतर्गत, Z-Stack टैब > पहले सेट करें बटन पर क्लिक करें. लाइव छवि को बंद करने के लिए लाइव बटन पर क्लिक करें।
    8. अधिग्रहण पैरामीटर के अंतर्गत, Z-Stack टैब पर क्लिक करें. स्लाइस फ़ील्ड को 10 से भरें। यह 10 ऑप्टिकल स्लाइस सेट करेगा और स्वचालित रूप से वोक्सेल गहराई निर्धारित करेगा।
    9. अधिग्रहण टैब के तहत, समय श्रृंखला बॉक्स पर क्लिक करें। अधिग्रहण पैरामीटर के अंतर्गत एक नया समय श्रृंखला टैब दिखाई देगा. समय श्रृंखला टैब पर क्लिक करें > चक्र फ़ील्ड के साथ उन चक्रों की संख्या के साथ जिन्हें आप आगे लेना चाहते हैं। इस मामले में, यह 8 है।
    10. स्कैन की गति और दिशा सेट करें। अधिग्रहण पैरामीटर के तहत, द्विदिश स्कैनिंग के लिए डबल हेडेड एरो > दिशा > > अधिग्रहण मोड टैब। फ़्रेम > स्कैन स्पीड स्लाइडर > 8 > अधिग्रहण मोड टैब का चयन करें।
      नोट: आम तौर पर कोई पूर्व प्रयोग की सेटिंग्स लोड कर सकता है और केवल लेजर पावर को समायोजित करना होगा यदि छवि बहुत उज्ज्वल या मंद है और जेड-स्टैक सेट लास्ट और सेट फर्स्ट को समायोजित करना है।
  5. अधिग्रहण टैब के तहत स्टार्ट एक्सपेरिमेंट पर क्लिक करके डीआरजी का एक छोटा 8 चक्र स्कैन लें। समय के साथ स्कैन (प्रति फ्रेम एक स्कैन) का ऑर्थोगोनल प्रक्षेपण करके एक फिल्म बनाएं और मैन्युअल रूप से छवि स्पष्टता और इमेजिंग कलाकृतियों जैसे कि डीआरजी को पार करने वाली चमक की "तरंगें" की जांच करें। क्लैंप स्थिति और ऑप्टिकल सेक्शन मोटाई समायोजित करें और इस चरण को तब तक दोहराएं जब तक कि एक स्पष्ट, उच्च गुणवत्ता वाली फिल्म प्राप्त न हो जाए।
    नोट: इस चरण को दोहराया जाना चाहिए यदि जानवर चलता है या अन्वेषक द्वारा स्थानांतरित किया जाता है। देखने के लिए समस्याओं में गैंग्लियन (न केवल एकल न्यूरॉन्स) के क्षेत्र शामिल हैं जो प्रयोग के दौरान हल्के और गहरे रंग के हो जाते हैं, जिससे एक लहरदार उपस्थिति बनती है या क्षेत्र गायब हो जाते हैं या उज्ज्वल हो जाते हैं। एक छोटे न्यूरॉन के व्यास के लगभग आधे से अधिक आंदोलन (<20 μm) एक और बड़ी समस्या है। लहर को अक्सर जेड-स्टैक की पहली और अंतिम स्थिति को एक साथ लाकर ठीक किया जा सकता है (ऊपर चरण 2.4.4 देखें) और ऑप्टिकल स्लाइस मोटाई को संकुचित करके। मूवी 1 सही ऑप्टिकल स्लाइस मोटाई को समतल करने और सेट करने से पहले एक लहरदार गैन्ग्लिया का एक उदाहरण प्रदान करता है। मूवी 2 लेवलिंग और ऑप्टिकल स्लाइस मोटाई को सही करने के बाद है। अंतर सूक्ष्म है, लेकिन इसका विश्लेषण पर जबरदस्त प्रभाव पड़ता है।
  6. माइक्रोस्कोप उच्च रिज़ॉल्यूशन स्कैनिंग प्रोटोकॉल लोड करें।
    1. उच्च रिज़ॉल्यूशन स्कैनिंग के लिए विशिष्ट सेटिंग्स का उपयोग करें: voxel आकार 1.248 μm x 1.248 μm x 14 μm, 1024 x 1024 पिक्सेल, 6 ऑप्टिकल स्लाइस Z-stack, 1.2 हवादार इकाई (AU)/39 μm, 5% 488 nm लेजर पावर / 25 mW, पिक्सेल समय 2.06 μs, लाइन समय 4.95 ms, फ्रेम समय 5.06 s, LSM स्कैन गति 6, द्विदिश स्कैनिंग, GAAsP-PMT डिटेक्टर 650 V हासिल करता है, डिजिटल लाभ 1. इष्टतम सेटिंग्स माइक्रोस्कोप और जानवर द्वारा भिन्न हो सकती हैं।
    2. उच्च रिज़ॉल्यूशन स्कैनिंग प्रोटोकॉल सेट करने के लिए, अधिग्रहण टैब पर क्लिक करें। अधिग्रहण पैरामीटर के अंतर्गत, फ़्रेम टैब पर क्लिक करें. 1024 पिक्सेल x 1024 पिक्सेल छवि रिकॉर्ड करने के लिए माइक्रोस्कोप सेट करने के लिए प्रीसेट > 1024 x 1024 पर क्लिक करें। यह बदले में छवि आकार के आधार पर वोक्सेल आकार के एक्स और वाई मानों को सेट करेगा, जो माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर द्वारा निर्धारित किया जाता है।
    3. अधिग्रहण पैरामीटर के अंतर्गत, चैनल टैब पर क्लिक करें. Track2 बॉक्स पर क्लिक करें. Green (FITC) का चयन करने के लिए Track2 बॉक्स के बगल में ड्रॉप-डाउन मेनू का उपयोग करें। Track2 के नीचे एक नया टैब खुलेगा।
    4. लेजर के बगल में, 488 बॉक्स पर क्लिक करें। यह उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य निर्धारित करेगा। उच्च तीव्रता लेजर रेंज बॉक्स पर क्लिक करें।
    5. 488 एनएम स्लाइडर के बगल में, लेजर पावर को 5% पर सेट करें। 1 एयरी यूनिट के लिए अपेराचर सेट करने के लिए 1 एयू बटन पर क्लिक करें। एफआईटीसी के तहत मास्टर गेन को 650 वी, डिजिटल ऑफसेट को 0 और डिजिटल गेन को 1 पर सेट किया गया है।
    6. अधिग्रहण टैब के तहत , Z-Stack बॉक्स की जाँच करें। गैंग्लियन की लाइव छवि देखने के लिए लाइव बटन पर क्लिक करें। फोकल प्लेन नॉब को तब तक चालू करें जब तक कि न्यूरॉन्स का केवल एक छोटा चाप दिखाई न दे।
    7. अधिग्रहण पैरामीटर के अंतर्गत, अंतिम सेट करें बटन > Z-Stack टैब पर क्लिक करें. फोकल प्लेन नॉब को तब तक नीचे घुमाएं जब तक कि न्यूरॉन्स का केवल एक छोटा चाप दिखाई न दे। अधिग्रहण पैरामीटर के तहत, Z-Stack टैब > पहले सेट करें बटन पर क्लिक करें। लाइव छवि को बंद करने के लिए लाइव बटन पर क्लिक करें।
    8. अधिग्रहण पैरामीटर के अंतर्गत, Z-Stack टैब पर क्लिक करें. स्लाइस फ़ील्ड को 6 से भरें। यह 6 ऑप्टिकल स्लाइस सेट करेगा और स्वचालित रूप से वोक्सेल गहराई निर्धारित करेगा।
    9. अधिग्रहण टैब के तहत , सुनिश्चित करें कि समय श्रृंखला बॉक्स अनियंत्रित है (कोई समय श्रृंखला नहीं)।
    10. स्कैन की गति और दिशा सेट करें। अधिग्रहण पैरामीटर के अंतर्गत, फ़्रेम > प्रीसेट > 1024 x 1024 > अधिग्रहण मोड टैब पर क्लिक करें. द्विदिश स्कैनिंग के लिए डबल हेडेड तीर > फ्रेम > दिशा > अधिग्रहण मोड टैब का चयन करें। फ़्रेम > स्कैन स्पीड स्लाइडर > 6 > अधिग्रहण मोड टैब का चयन करें।
    11. यदि कोशिकाओं को टीडी-टमाटर के साथ लेबल किया जाता है, तो लाल चैनल 592 एनएम उत्तेजना / 614 एनएम उत्सर्जन को स्कैन करने के लिए माइक्रोस्कोप सेट करें, हरे चैनल के अलावा तरंग दैर्ध्य 600-700 एनएम का पता लगाएं। अधिग्रहण पैरामीटर पर जाकर इसे सेट करें और ट्रैक 1 बॉक्स > चैनल टैब पर क्लिक करें। Red (टेक्सास रेड) का चयन करने के लिए Track1 बॉक्स के बगल में ड्रॉप डाउन मेनू का उपयोग करें। चरण 2.6.3 के समान प्रक्रिया का पालन करें, सिवाय 488 बॉक्स के बजाय 561 बॉक्स पर क्लिक करें। लेजर पावर को 1% पर सेट करें। टीडी-टमाटर जीसीएएमपी 3 की तुलना में बहुत उज्जवल है और कम लेजर शक्ति की आवश्यकता होती है।
  7. अधिग्रहण टैब के तहत प्रारंभ प्रयोग बटन पर क्लिक करके डीआरजी की एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवि बनाएं।
  8. माइक्रोस्कोप रैपिड स्कैनिंग प्रोटोकॉल लोड करें (चरण 2.4 देखें)। 80 चक्रों (लगभग 10 मिनट) के लिए डीआरजी में सहज गतिविधि रिकॉर्ड करें। एक ऑर्थोगोनल प्रोजेक्शन मूवी उत्पन्न करें और सत्यापित करें कि छवि विश्लेषण के लिए पर्याप्त गुणवत्ता की है।
    नोट: गुणवत्ता के विचार चरण 2.5 के समान हैं।
  9. उत्तेजनाओं को लागू करने के लिए, माइक्रोस्कोप को 15-20 स्कैन करने के लिए सेट करें। बेसलाइन का उत्पादन करने के लिए स्कैन पूरा करने के लिए 1-5 तक प्रतीक्षा करें। स्कैन 6-10 के दौरान उत्तेजना लागू करें। डिसेन्सिटाइजेशन को रोकने के लिए अगली उत्तेजना लागू करने से पहले प्रत्येक उत्तेजना के बाद कम से कम 5 मिनट प्रतीक्षा करें।
    नोट: यांत्रिक उत्तेजनाओं को पहले लागू किया जाना चाहिए, और फिर ठंडा, थर्मल और रासायनिक उत्तेजनाएं। कमजोर उत्तेजनाओं (जैसे, कम यांत्रिक बल, कमरे के तापमान के करीब तापमान) को मजबूत उत्तेजनाओं (जैसे, उच्च यांत्रिक बल, कमरे के तापमान से दूर तापमान) से पहले लागू किया जाना चाहिए। उत्तेजनाओं को लागू करते समय, सुनिश्चित करें कि डीआरजी के किसी भी आंदोलन का कारण न बनें। विशेष रूप से मजबूत थर्मल उत्तेजनाओं के लिए, उत्तेजना शुरू करने से पहले 1-2 मिनट के लिए 2% आइसोफ्लुरेन लागू करना अक्सर आवश्यक होता है। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले माइक्रोस्कोप पर, प्रत्येक स्कैन को स्पष्ट रूप से सुना जा सकता है, जैसे कि शोधकर्ता स्कैन के अंत की आसानी से पहचान कर सकता है, स्कैन 5 के तुरंत बाद उत्तेजना आवेदन की अनुमति देता है। हालांकि, कोई भी विधि जो एक सुसंगत समय बिंदु पर उत्तेजनाओं के आवेदन की सुविधा प्रदान करती है, काम करेगी।
  10. एक यांत्रिक प्रेस के लिए, पंजे को छुए बिना पैडल के बीच पंजे के साथ एल्गोमीटर के पिंचर को पकड़ें, और स्कैन 5 के अंत के तुरंत बाद शुरू करें और स्कैन 10 के तुरंत बाद रुक जाएं। एल्गोमीटर के साथ प्रेस बल की निगरानी करें ( सामग्री की तालिका देखें)। प्रेस बल को वांछित बल के करीब रखें (यहां हम 100 ग्राम प्रेस उत्तेजना का उपयोग करते हैं) और सुनिश्चित करें कि यह वांछित बल पर 10 ग्राम से अधिक न हो।
    नोट: कोई भी 0.07 ग्राम वॉन फ्रे फिलामेंट्स और 600 ग्राम प्रेस बल के रूप में उत्तेजनाओं का पता लगा सकता है।
  11. ठंड और थर्मल उत्तेजनाओं के लिए, वांछित तापमान के ठीक नीचे (ठंड के लिए) या ऊपर (थर्मल के लिए) पानी के बीकर को ठंडा या गर्म करें और स्कैनिंग शुरू करें। यहां, 45 डिग्री सेल्सियस उत्तेजना का उपयोग करें। जब पानी सही तापमान हो, तो पंजे को पानी में डुबोकर स्कैन 5 के तुरंत बाद उत्तेजना लागू करें। स्कैन 10 के तुरंत बाद बीकर को दूर खींचें।
    नोट: तापमान स्कैन 5 पर वांछित तापमान के 1 डिग्री सेल्सियस के भीतर होना चाहिए। यदि बीकर का तापमान गलत है, तो उत्तेजना को लागू न करें क्योंकि यह न्यूरॉन्स को डिसेंसिटाइज कर सकता है। इसके बजाय पानी को फिर से उबालें या गर्म करें और फिर से प्रयास करें। हमने तापमान को 0 डिग्री सेल्सियस (बर्फ का पानी) और 95 डिग्री सेल्सियस तक मापा है। हालांकि, याद रखें कि 50 डिग्री सेल्सियस से ऊपर का तापमान ऊतकों को नुकसान पहुंचा सकता है और बाद के प्रयोगों को भ्रमित कर सकता है। इसी तरह, कुछ रसायन (जैसे टेट्रोडोटॉक्सिन, कैप्साइसिन) अपरिवर्तनीय हैं या धोए नहीं जा सकते हैं और जानवर पर आगे के प्रयोगों को रोक सकते हैं।
  12. सभी उत्तेजनाओं को लागू करने और दर्ज करने के बाद, केटामाइन / ज़ाइलाज़िन (200 मिलीग्राम / किग्रा केटामाइन, 30 मिलीग्राम / किग्रा ज़ाइलज़िन, या चरण 1.1 में तैयार समाधान के 5 μL प्रति ग्राम शरीर द्रव्यमान) के साथ ओवरडोज करके जानवर को इच्छामृत्यु दें।

3. डेटा विश्लेषण

  1. ImageJ में खींचकर और ड्रॉप करके छवि फ़ाइलें खोलें. फ़ाइल खोलने के बाद, छवि > प्रकार > RGB रंग के तहत छवि प्रकार का चयन करें।
    नोट: स्टैकरेग > प्लगइन्स के तहत स्टैकरेग 21 प्लगइन आंदोलन कलाकृतियों को सही करने और संरेखित करने के लिए उपयोगी है। ImageJ अधिकांश माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर फ़ाइल प्रारूपों को पढ़ सकता है। छवि प्रकार की पसंद उपयोगकर्ता वरीयता पर निर्भर करती है। आरजीबी प्रकाशन के लिए रंगीन छवियों के निर्माण को सरल बनाता है। माइक्रोस्कोप निर्माता या साइटोनेट22 से सॉफ्टवेयर पैकेज विश्लेषण में भी सहायता कर सकते हैं। स्टैकरेग को डाउनलोड, इंस्टॉल और उपयोग करना आवश्यक नहीं है, लेकिन इसकी सिफारिश की जाती है।
  2. RoI प्रबंधक के विश्लेषण > उपकरण के तहत सक्रिय न्यूरॉन्स का चयन करने के लिए रुचि के क्षेत्र ( ROI) उपकरण > उपयोग करें। टूलबार पर दीर्घवृत्त या आयत उपकरण का उपयोग करके ROIs खींचें और ROI प्रबंधक विंडो पर जोड़ें के तहत जोड़ें बटन दबाकर या "t" कुंजी दबाकर उन्हें ROI फ़ाइल में रखें।
    नोट: ROI फ़ाइल को अक्सर सहेजना सुनिश्चित करें। उपयोगकर्ता हमेशा एक ROI फ़ाइल को ImageJ में खींचकर और छोड़कर और ROI प्रबंधक विंडो के निचले भाग में सभी दिखाएँ बॉक्स पर क्लिक करके ROIs को पुनर्स्थापित कर सकते हैं। ओवरले के रूप में बचत की सिफारिश नहीं की जाती है। अनुभव से, ROI.zip फ़ाइल के रूप में सहेजना विश्लेषण को सरल बनाता है।
  3. विश्लेषण > सेट माप के तहत, सुनिश्चित करें कि औसत ग्रे मान विकल्प की जांच की गई है; सेट माप के तहत अन्य सभी बक्से अनचेक करें। ROIs के भीतर तीव्रता की गणना करने के लिए ROI प्रबंधक मेनू पर बहु-माप उपकरण का उपयोग करें। अधिक > मल्टीमेजर के तहत आरओआई विंडो का उपयोग करके तीव्रता मापें।
    नोट: कभी-कभी आसन्न न्यूरॉन्स अलग-अलग आरओआई खींचने के लिए एक साथ बहुत करीब होंगे। इन न्यूरॉन्स का उपयोग क्षणिक तीव्रता को मापने के लिए नहीं किया जा सकता है, लेकिन सक्रिय न्यूरॉन्स की गिनती में शामिल किया जा सकता है।
  4. Multimeasure द्वारा जेनरेट की गई CSV फ़ाइल सहेजें और CSV फ़ाइल को किसी भी स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर के साथ खोलें।
    नोट: विश्लेषण में सहायता के लिए एक उदाहरण स्प्रेडशीट टेम्पलेट के लिए पूरक फ़ाइल 1 देखें।
  5. Ca2+ क्षणिक तीव्रता की गणना 3F/ F0 = (Ft- F0) / F0 के रूप में कीजिये, जहां Ft रुचि के समय पर ROI में पिक्सेल तीव्रता है, और F0 सहज गतिविधि के लिए Ca 2+ क्षणिक या Ca 2+ के लिए ROI के पहले 1-5 फ्रेम से पहले2-4 फ्रेम की तीव्रता को औसत करके निर्धारित आधारभूत तीव्रता है। उत्तेजना के दौरान होने वाले क्षणिक। उत्तेजना से पहले सीए2 + चोटियों का उत्पादन करने वाले किसी भी न्यूरॉन्स को बाहर रखें और उत्तेजना समाप्त होने के बाद गतिविधि का विश्लेषण न करें।
  6. सीए2 + क्षणिक तीव्रता विश्लेषण के लिए, यादृच्छिक रूप से प्रत्येक नाड़ीग्रन्थि से लगभग समान संख्या में न्यूरॉन्स का नमूना लें ताकि डेटा को गैन्ग्लिया की ओर मोड़ने से बचा जा सके जो प्रतिक्रिया देने वाले न्यूरॉन्स की सबसे बड़ी संख्या का उत्पादन करता है। उन चोटियों को छोड़ दें जहां F / F0 0.15 <।
    नोट: न्यूरॉन्स 11,12,23,24,25,26,27,28 के विश्लेषण और समावेश / बहिष्करण के वैकल्पिक प्रकाशित तरीके हैं।
  7. ImageJ में टूलबार पर लाइन टूल का उपयोग करके न्यूरॉन व्यास को मापें। सबसे लंबे और सबसे छोटे व्यास के साथ खींची गई रेखाओं से औसत व्यास की गणना करें।

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Representative Results

Figure 4
चित्र 4: पीर्ट-जीसीएएमपी 3 चूहों के एल 5 पृष्ठीय रूट गैन्ग्लिया की प्रतिनिधि छवियां। (ए, डी) पीर्ट-जीसीएएमपी 3 चूहों के एल 5 पृष्ठीय रूट गैन्ग्लिया के एकल फ्रेम उच्च रिज़ॉल्यूशन स्कैन दिखाए गए हैं। (B, E) . उत्तेजनाओं की अनुपस्थिति में पैनल ए और पैनल डी से क्रमशः पीर्ट-जीसीएएमपी 3 एल 5 डीआरजी गैन्ग्लिया के 15 फ्रेम की औसत तीव्रता अनुमान। कुछ न्यूरॉन्स जो सहज सीए2 + क्षणिक का उत्पादन करते हैं, उन्हें पीले तीर के साथ बुलाया जाता है। (सी) उत्तेजना से पहले दो फ्रेम का औसत तीव्रता प्रक्षेपण और 100 ग्राम हिंडपाव प्रेस के दौरान पैनल ए से पर्ट-जीसीएएमपी 3 गैंग्लियन के उत्तेजना के सभी पांच फ्रेम। उत्तेजना के दौरान सीए2 + ट्रांसिएंट्स का उत्पादन करने वाले कुछ न्यूरॉन्स को पीले तीरों के साथ बुलाया जाता है। (F-I) फ्रेम 4 और 5 (उत्तेजना से पहले) (पैनल ए और डी) और फ्रेम 6-9 (100 ग्राम प्रेस उत्तेजना के दौरान) के औसत तीव्रता अनुमान क्रमशः फ्रेम 4-6, फ्रेम 4 + 5 + 7, फ्रेम 4 + 5 + 8, और फ्रेम 4 + 5 + 9 के साथ पैनल डी से 100 ग्राम हिंदपाव प्रेस के फ्रेम 4 + 5 + 9। (जे) पैनल बी (काले) से पैनल डी गैंग्लियन के अनुरूप पैनल ए गैंग्लियन और पैनल ई (लाल) के अनुरूप तीन सहज सक्रिय न्यूरॉन्स के फ्लोरेसेंस तीव्रता के निशान। प्रत्येक न्यूरॉन का ट्रेस इसकी औसत तीव्रता (वाई = 0 पर रेखा द्वारा दिखाया गया है) के लिए सामान्यीकृत किया जाता है। पैनल ए गैंग्लियन और पैनल एफ-आई (लाल) के अनुरूप पैनल सी (काले) से 100 ग्राम प्रेस के जवाब में सक्रिय होने वाले तीन न्यूरॉन्सके निशान। ध्यान दें कि X और Y अक्ष पैनल J की तुलना में भिन्न हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Pirt-GCaMP L5 DRG के कॉन्फोकल स्कैनिंग का उपयोग करके बड़ी संख्या में न्यूरॉन्स की इमेजिंग
सर्जिकल एल 5 डीआरजी एक्सपोजर के बाद कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी ने पीर्ट-जीसीएएमपी 3 चूहों (चित्रा 4) का उपयोग करके एक बार में 1,800 न्यूरॉन्स को चित्रित करने की अनुमति दी। यह नियंत्रण और असामान्य स्थितियों दोनों में, अपने सामान्य शारीरिक संदर्भ में जनसंख्या स्तर पर एक पहनावा में हजारों प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स का एक साथ निरीक्षण करने में सक्षम होने का एक शक्तिशाली लाभ बनाता है। उत्तेजनाओं की अनुपस्थिति में सहज सीए2 + क्षणिक (चित्रा 4 बी, ई और मूवी 2) और उत्तेजनाओं के जवाब में सीए2 + क्षणिक (चित्रा 4 सी, एफ-आई, मूवी 3, और मूवी 4) की निगरानी की जा सकती है। सक्रिय न्यूरॉन्स के व्यास विभिन्न तंत्रिका फाइबर समूहों के साथ अत्यधिक सहसंबद्ध हैं।

Figure 5
चित्रा 5: उत्तेजनाओं की बढ़ती तीव्रता पीर्ट-जीसीएएमपी 3 चूहों के गैन्ग्लिया में सीए2 + प्रतिक्रियाओं को बढ़ाती है। (ए) एल 5 डीआरजी गैन्ग्लिया में न्यूरॉन्स की संख्या के ग्राफ दो अलग-अलग प्रेस तीव्रता से उत्तेजनाओं के जवाब में सीए2 + क्षणिक दिखाते हैं: 100 ग्राम, एन = 8 गैन्ग्लिया; 300 ग्राम, एन = 5। (बी) दो अलग-अलग प्रेस तीव्रता से सीए2 + ट्रांसिएंट्स के नमूनों के वक्र के तहत एएफ / एफ0 क्षेत्रों के ग्राफ दिखाए गए हैं: 100 ग्राम, एन = 88 न्यूरॉन्स; 300 ग्राम, एन = 104। (सी)100 ग्राम और 300 ग्राम प्रेस उत्तेजनाओं के एएफ / एफ 0 के निशान के ग्राफ। लाल निशान औसत एएफ / एफ0 है; 100 ग्राम, एन = 60 न्यूरॉन्स; 300 ग्राम, एन = 57 न्यूरॉन्स। (डी) एल 5 डीआरजी गैन्ग्लिया में न्यूरॉन्स की संख्या के ग्राफ ़ तीन अलग-अलग गैर-हानिकारक और एक हानिकारक तापमान के जवाब में सीए2 + क्षणिक दिखाते हैं: 21 डिग्री सेल्सियस, एन = 4 गैन्ग्लिया; 10 डिग्री सेल्सियस, एन = 6; 45 डिग्री सेल्सियस, एन = 7; 57 °C, n = 3. (E) तीन अलग-अलग गैर-हानिकारक और एक हानिकारक तापमान उत्तेजना तीव्रता से Ca2+ क्षणिकों के नमूनों के वक्र के तहत ऍF / F0 क्षेत्रों के ग्राफ दिखाए गए हैं: 21 ° C, n = 40 न्यूरॉन्स; 10 डिग्री सेल्सियस, एन = 60; 45 डिग्री सेल्सियस, एन = 61; 57 °C, n = 118. (च)10 डिग्री सेल्सियस और 57 डिग्री सेल्सियस उत्तेजनाओं के ऍफ़ / एफ 0 के निशान के ग्राफ। लाल निशान औसत एएफ / एफ0 है; 10 डिग्री सेल्सियस, एन = 60 न्यूरॉन्स; 57 °C, n = 118. (छ) विभिन्न व्यास (<20 μm, 20-25 μm, >25 μm) के न्यूरॉन्स के प्रतिशत का ग्राफ अनायास और थर्मल और यांत्रिक उत्तेजनाओं के साथCa2+ क्षणिक ों का उत्पादन करता है। सहज गतिविधि (स्पॉन), एन = 5 गैन्ग्लिया; 45 डिग्री सेल्सियस, एन = 3; 300 ग्राम, एन = 3। * पी < 0.05, ** पी < 0.01, *** पी < 0.001। बार ग्राफ़ साधन और SEM दिखाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

उत्तेजनाओं की उपस्थिति में वक्र (AUC ) के तहत Ca 2+ क्षणिक और Ca2+ क्षणिक क्षेत्र का उत्पादन करने वाली कोशिकाओं की संख्या
मजबूत उत्तेजनाओं या हानिकारक गर्मी ने सीए2 + प्रतिक्रियाओं में वृद्धि की। 100 ग्राम के साथ दबाने की तुलना में, 300 ग्राम के साथ दबाने से सीए2 + ट्रांसिएंट्स का उत्पादन करने वाले न्यूरॉन्स की संख्या में वृद्धि हुई (चित्रा 5 ए, छात्र का टी-टेस्ट: टी = 2.398, डीएफ = 11, पी =0.0354) और सीए2 + ट्रांसिएंट्स के वक्र के तहत एएफ / एफ 0 क्षेत्र (चित्रा 5 बी, वेल्च का टी-टेस्ट: टी = 3.243, डीएफ = 187.4, पी = 0.00)। इसी तरह, एक गैर-हानिकारक तापमान सीमा (21 डिग्री सेल्सियस और 45 डिग्री सेल्सियस) में गर्म गर्मी ने सीए2 + ट्रांसिएंट्स का उत्पादन करने वाले न्यूरॉन्स की संख्या में वृद्धि की (चित्रा 5 सी, एक तरफा एनोवा एफ2,14 = 4.853, पी = 0.0251, इसके बाद टुकी का क्यू = 4.380, डीएफ = 14, पी =0.0202) और एएफ / एफ0 क्षेत्र के तहत p = 0.0029 के बाद वेल्च का t-test: t = 3.333, df = 96.72, p = 0.0036)। हानिकारक गर्मी उत्तेजना (57 डिग्री सेल्सियस) की तुलना में, गैर-हानिकारक तापमान (21 डिग्री सेल्सियस, 10 डिग्री सेल्सियस, और 45 डिग्री सेल्सियस) ने सीए2 + ट्रांसिएंट्स का उत्पादन करने वाले न्यूरॉन्स की एक छोटी संख्या को सक्रिय किया (चित्रा 5 ई, एक तरफ़ा एनोवा एफ2,16 = 2.513, पी < 0.001, डनेट का परीक्षण, 21 डिग्री सेल्सियस: क्यू = 9.594, डीएफ = 16, पी < < 0.001; 10 डिग्री सेल्सियस: 10 डिग्री सेल्सियस: 10 डिग्री सेल्सियस, 10 डिग्री सेल्सियस) q = 9.160, df = 16, p <0.001) और त्रिभुजF / F 0 क्षेत्र Ca2 + क्षणिकों के वक्र के तहत 21 °C और 10 °C (चित्र 5D, Brown-Forsythe ANOVA F3,268.4 = 12.98, p < 0.001, डंनेट का T3 परीक्षण, 21 °C: t = 5.415, df = 128, p < 001, p < 001, p < 001, p < 001, p < 001, p < 0001, p < 001, p < 001, p < 001, p < 001, p < 001, p < 001, p < 001, p < 001, p < 001, p < 001, p < 001, p < 001, p < 001, p < 001, p < 001, p < 0001, p < 0001, p < 001, p < 0001, p < 001, p < 001, p < 001, p < 001, p < 001, p < 001, p < 001, p < 0001, p < 001, p < 001, p < 001, p < 001, p < 001, p < 001, p < 001, p < 001, p < 001, p < 001, p < 001, p < 0001, p < 001, p < 000 t = 2.079, df = 161.9, p = 0.1127)। इस प्रयोग में, छोटे और मध्यम व्यास के न्यूरॉन्स ने अनायास और सभी उत्तेजनाओं के तहत सीए2 + क्षणिक ों का उत्पादन किया, लेकिन बड़े व्यास के न्यूरॉन्स ने केवल 300 ग्राम प्रेस उत्तेजना (चित्रा 5 जी) के जवाब में सीए2 + क्षणिक का उत्पादन किया।

पीआरटी-जीसीएएमपी 3 चूहों में टीडी-टमाटर के साथ विशिष्ट रिसेप्टर्स व्यक्त करने वाले न्यूरॉन्स की लेबलिंग
सीआरई-इंड्यूसेबल रिपोर्टर टीडी-टोमैटो को पीआरटी-जीसीएएमपी 3 इमेजिंग के दौरान देखा जा सकता है। पीआरटी-जीसीएएमपी 3, टीडी-टमाटर चूहों ने टीआरपीवी 1 प्रमोटर के नियंत्रण में सीआरई व्यक्त किया, जिसमें व्यापक पैमाने पर दिखाया गया लेकिन प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स की सार्वभौमिक लेबलिंग नहीं (चित्रा 6ए, बी)। सहज सीए2 + क्षणिक टीडी-टमाटर-लेबल न्यूरॉन्स और न्यूरॉन्स दोनों में देखे गए थे जो लेबल नहीं किए गए हैं (चित्रा 6 सी)। इस प्रयोग पर हानिकारक गर्मी का परीक्षण नहीं किया गया था, लेकिन भविष्य के प्रयोगों में परीक्षण किया जाएगा।

Figure 6
चित्र 6: पीआरटी-जीसीएएमपी 3 चूहों में टीडी-टमाटर के साथ TrpV1-पॉजिटिव न्यूरॉन्स की लेबलिंग। (A) TrpV1-Cre, td-Tomato, Pirt-GCaMP3 माउस के प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स की सहज गतिविधि का अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण केवल 495 nm उत्तेजना/519 nm उत्सर्जन (FITC, हरा) चैनल पर चित्रित किया गया है। सीए2 + ट्रांसिएंट्स का उत्पादन करने वाले कुछ न्यूरॉन्स को पीले तीर (टीडी-टमाटर के साथ लेबल नहीं) या लाल तीर (टीडी-टमाटर के साथ लेबल) के साथ बुलाया जाता है। (बी) केवल 592 एनएम उत्तेजना / 614 एनएम उत्सर्जन लाल चैनल पर पैनल ए के समान प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स का औसत तीव्रता प्रक्षेपण। (सी) पैनल ए के समान प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स के एक साथ लाल और हरे चैनलों का अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण दिखाया गया है। जीसीएएमपी 3 को व्यक्त करने वाले कुछ न्यूरॉन्स लेकिन टीडी-टमाटर नहीं, पीले तीरों के साथ बुलाए जाते हैं। सफेद तीर जीसीएएमपी पॉजिटिव का संकेत देते हैं जिसमें कोई सीए2 + ट्रांसिएंट्स नहीं होता है और टीडी-टोमैटो पोस्टिव नहीं होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मूवी 1: एक पीर्ट-जीसीएएमपी 3 गैंग्लियन की सहज गतिविधि जिसे ऑप्टिकल स्लाइस मोटाई के लिए ठीक से समतल या अनुकूलित नहीं किया गया है। 70 फ्रेम प्रति सेकंड एवीआई। ऑप्टिकल स्लाइस मोटाई = 16 μm. कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

मूवी 2: फिल्म 1 से एक ही नाड़ीग्रन्थि की सहज गतिविधि जिसे कम नमी के साथ ऑप्टिकल स्लाइस मोटाई के लिए ठीक से समतल और अनुकूलित किया गया है। 70 फ्रेम प्रति सेकंड एवीआई। ऑप्टिकल स्लाइस मोटाई = 13 μm. कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

मूवी 3: 100 ग्राम हिंडपाव प्रेस पीर्ट-जीसीएएमपी 3 गैंग्लियन। 3 फ्रेम प्रति सेकंड AVI. स्टिमुलस को फ्रेम 6-10 के दौरान लागू किया गया था। कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

मूवी 4: पिर्ट-जीसीएएमपी 3 गैंग्लियन के हिंदपाव के लिए 45 डिग्री सेल्सियस थर्मल उत्तेजना। 3 फ्रेम प्रति सेकंड AVI. स्टिमुलस को फ्रेम 6-10 के दौरान लागू किया गया था। कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: उदाहरण विश्लेषण स्प्रेडशीट कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

लगातार दर्द विकारों की एक विस्तृत श्रृंखला में मौजूद है, दुर्बल करता है और / या29 के लगभग 8% लोगों के लिए जीवन की गुणवत्ता को कम करता है। प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स त्वचा पर हानिकारक उत्तेजनाओं का पता लगाते हैं, और उनकी प्लास्टिसिटी लगातार दर्दमें योगदान देती है। जबकि न्यूरॉन्स का अध्ययन सेल कल्चर और एक्सप्लेंट में किया जा सकता है, ऐसा करने से उन्हें उनके सामान्य शारीरिक संदर्भ से हटा दिया जाता है। डीआरजी का सर्जिकल एक्सपोजर, इसके बाद पीर्ट-जीसीएएमपी 3 सीए2 + इमेजिंग, हिंदपाव पर लागू उत्तेजनाओं का उपयोग करके अपने सामान्य शारीरिक संदर्भ में प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स के अध्ययन की अनुमति देता है। सीए2 + इमेजिंग की इस विधि का एक बड़ा लाभ यह है कि बड़ी संख्या में न्यूरॉन्स की एक साथ निगरानी की जा सकती है। यह विधि साधन, न्यूरॉन व्यास और युग्मित सक्रियण 10,11,12,13,14,15,16,17,30 जैसी दुर्लभ घटनाओं के जनसंख्या स्तर पर विश्लेषण की अनुमति देती है, जो सामान्य और पैथोलॉजिकल सोमाटोसेंसेशन में अंतर्दृष्टि प्रदान करती है। एक पहचानकर्ता के रूप में न्यूरॉन व्यास के अलावा, विशिष्ट प्रकार के न्यूरॉन्स को इमेजिंग के दौरान पहचान के लिए टीडी-टमाटर जैसे लाल फ्लोरोफोरे के साथ आनुवंशिक रूप से लेबल किया जा सकता है। यह तकनीक विशिष्ट संवेदी तौर-तरीकों या विशिष्ट रिसेप्टर्स14,31 को व्यक्त करने वाले न्यूरॉन्स के अवलोकन की अनुमति देती है। अन्य अनुप्रयोगों में अन्य संवेदी गैन्ग्लिया जैसे ट्राइजेमिनल गैंग्लियन24,32 या जेनिकुलेट गैंग्लियन23,26 की इमेजिंग और19,33 में प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स द्वारा रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय सींग के इमेजिंग संक्रमण शामिल हैं।

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदमों में डीआरजी पर अत्यधिक रक्तस्राव या रक्तस्राव को रोकना, इमेजिंग के दौरान संज्ञाहरण का नियंत्रण, डीआरजी सतह का समतलीकरण, इष्टतम ऑप्टिकल स्लाइस मोटाई का चयन करना और उत्तेजनाओं के आवेदन के दौरान डीआरजी के आंदोलन को रोकना शामिल है। अत्यधिक रक्तस्राव रक्त हानि के शारीरिक प्रभावों के कारण जानवर या कलाकृतियों की मृत्यु का कारण बन सकता है। रक्त की कमी से डीआरजी के विशाल क्षेत्रों में चमक (साइटोप्लाज्मिक कैल्शियम) में वृद्धि हो सकती है। रक्त की कमी भी सुन्नता का कारण बन सकती है, उत्तेजनाओं के जवाब में सक्रिय न्यूरॉन्स की संख्या को कम कर सकती है। डीआरजी पर रक्तस्राव सीधे इमेजिंग को अवरुद्ध करता है, न्यूरॉन्स की संख्या को सीमित करता है जिन्हें सफलतापूर्वक चित्रित किया जा सकता है। चूंकि संज्ञाहरण न्यूरोनल गतिविधियों और प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करता है, इसलिए आइसोफ्लुरेन संज्ञाहरण का न्यूनतम स्तर उपयोग किया जाना चाहिए। एक स्तर डीआरजी और इष्टतम ऑप्टिकल स्लाइस मोटाई प्रक्रिया के सबसे महत्वपूर्ण भाग हैं। इन चरणों को गलत तरीके से करने से इमेजिंग के दौरान फोकस न्यूरॉन्स और भारीपन हो सकता है ( मूवी1 और मूवी 2 देखें) जो विश्लेषण को भ्रमित करेगा या विश्लेषण को असंभव बना देगा। यहां तक कि छोटे आंदोलन फ्रेम में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स को ट्रैक करना असंभव बना सकते हैं और / या कलाकृतियों का निर्माण कर सकते हैं जहां एक न्यूरॉन गहरा या उज्जवल हो जाता है, जिससे महत्वपूर्ण त्रुटियां होती हैं।

यहां वर्णित प्रणाली की कुछ महत्वपूर्ण सीमाएं भी हैं। संज्ञाहरण न्यूरॉन और ग्लियल सीए2 + प्रतिक्रियाओं में हस्तक्षेप करताहै। क्योंकि यह विधि टर्मिनल है, एक ही जानवर को कई प्रयोगों पर निगरानी नहीं की जा सकती है। सीए2 + क्षणिक न्यूरॉन फायरिंग और गतिविधि के लिए एक अप्रत्यक्ष प्रॉक्सी हैं। यह विधि कार्रवाई क्षमता के लिए प्रॉक्सी के रूप में सीए2 + ट्रांसिएंट्स का उपयोग करती है। हालांकि, जीक्यू प्रोटीन या रेयानोडिन रिसेप्टर सिग्नलिंग जैसे अन्य संकेत साइटोप्लाज्मिक सीए2 + सांद्रता 34,35,36 को बदल सकते हैं। अन्य तंत्रों को डीआरजी न्यूरॉन्स में सीए2 + क्षणिक ों का कारण नहीं बताया गया है। हालांकि, पंजे के लिए रासायनिक उत्तेजनाओं का अनुप्रयोग रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय सींग एस्ट्रोसाइट्स36 में सीए2 + को बढ़ाने के लिए जाना जाता है।

निष्कर्ष में, बरकरार डीआरजी पिंट-जीसीएएमपी 3 सीए2 + इमेजिंग सामान्य और रोग संबंधी स्थितियों के तहत सोमाटोसेंसेशन का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। यहां दिखाए गए परिणाम सामान्य नियंत्रण चूहों के प्रतिनिधि हैं। नियंत्रित चूहों की तुलना दर्द और रोग मॉडल या आनुवंशिक उत्परिवर्ती 10,15,17,30,31,37 से की जा सकती है। इसके अलावा, यहां प्रस्तुत विधि को अन्य आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सीए2 + संकेतक10,11,16 के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और वोल्टेज सेंसिंग 38,39,40 और चक्रीय एडेनोसिन मोनोफॉस्फेट सेंसिंग 41 जैसे अन्य सेंसर की छवि के लिए उपयोग किया जा सकता है। जबकि इस अध्ययन में कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया गया था, दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी का भी उपयोग किया जा सकताहै।

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Disclosures

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान R01DE026677 और R01DE031477 (Y.S.K.), UTHSCSA स्टार्टअप फंड (Y.S.K.), और टेक्सास विश्वविद्यालय प्रणाली (Y.S.K.) से राइजिंग स्टार अवार्ड द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anased Injection (Xylazine) Covetrus, Akorn 33197
C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC Cal Zeiss 422642-9900-000
Cotton Tipped Applicators McKesson 24-106-1S
Curved Hemostat Fine Science Tools 13007-12
DC Temperature Controller FHC 40-90-8D
DC Temperature Controller Heating Pad FHC 40-90-2-05
Dumont Ceramic Coated Forceps Fine Science Tools 11252-50
FHC DC Temperature Controller FHC 40-90-8D
Fluriso (Isoflurane) MWI Animal Health, Piramal Group 501017
Friedman-Pearson Rongeurs Fine Science Tools 16221-14
GelFoam Pfizer 09-0353-01
Ketaset (Ketamine) Zoetis KET-00002R2
Luminescent Green Stage Tape JSITON/ Amazon B803YW8ZWL
Matrx VIP 3000 Isoflurane Vaporizer Midmark 91305430
Micro dissecting scissors Roboz RS-5882
Micro dissecting spring scissors Fine Science Tools 15023-10
Micro dissecting spring scissors Roboz RS-5677
Mini Rectal Thermistor Probe FHC 40-90-5D-02
Operating scissors Roboz RS-6812
Pirt-GCaMP3 C57BL/6J mice Johns Hopkins University N/A Either sex can be imaged equally well. Mice should be at least 8 weeks old due to weak or intermittent Pirt promoter expression in younger mice.
SMALGO small animal algometer Bioseb In vivo Research Instruments BIO-SMALGO
Stereotaxic frame Kopf Model 923-B 923-B
td-Tomato C57BL/6J mice Jackson Laboratory 7909
Top Plate, 6 in x 10 in Newport 290-TP
TrpV1-Cre C57BL/6J mice Jackson Laboratory 17769
Zeiss LSM 800 confocal microscope Cal Zeiss LSM800
Zeiss Zen 2.6 Blue Edition Software Cal Zeiss Zen (Blue Edition) 2.6

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References

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<em>Vivo में</em> बरकरार पृष्ठीय रूट गैन्ग्लिया में प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स के नेटवर्क में न्यूरोनल एन्सेंबल की कैल्शियम इमेजिंग
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Shannonhouse, J., Gomez, R., Son,… More

Shannonhouse, J., Gomez, R., Son, H., Zhang, Y., Kim, Y. S. In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia. J. Vis. Exp. (192), e64826, doi:10.3791/64826 (2023).

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