Summary
Detta protokoll beskriver den kirurgiska exponeringen av dorsalrotganglion (DRG) följt av GCaMP3 (genetiskt kodad Ca2+ indikator; Grönt fluorescerande protein-kalmodulin-M13-protein 3) Ca2+ avbildning av neuronensemblerna med hjälp av Pirt-GCaMP3-möss samtidigt som man applicerar en mängd olika stimuli på den ipsilaterala baktassen.
Abstract
Ca 2+ avbildning kan användas som en proxy för cellulär aktivitet, inklusive åtgärdspotentialer och olika signalmekanismer som involverar Ca 2+ inträde i cytoplasman eller frisättning av intracellulära Ca 2+ butiker. Pirt-GCaMP3-baserad Ca2+ avbildning av primära sensoriska neuroner i dorsalrotganglion (DRG) hos möss erbjuder fördelen med samtidig mätning av ett stort antal celler. Upp till 1 800 neuroner kan övervakas, vilket gör att neuronala nätverk och somatosensoriska processer kan studeras som en ensemble i deras normala fysiologiska sammanhang på populationsnivå in vivo. Det stora antalet neuroner som övervakas möjliggör detektering av aktivitetsmönster som skulle vara utmanande att upptäcka med andra metoder. Stimuli kan appliceras på musens bakpot, vilket gör att de direkta effekterna av stimuli på DRG-neuronensemblen kan studeras. Antalet neuroner som producerar Ca 2+ transienter samt amplituden för Ca2+ transienter indikerar känslighet för specifika sensoriska modaliteter. Diametern hos neuroner ger bevis på aktiverade fibertyper (icke-skadliga mechano vs. skadliga smärtfibrer, Aβ, Aδ och C-fibrer). Neuroner som uttrycker specifika receptorer kan märkas genetiskt med td-tomat och specifika Cre-rekombinaser tillsammans med Pirt-GCaMP. Därför ger Pirt-GCaMP3 Ca2+ avbildning av DRG ett kraftfullt verktyg och modell för analys av specifika sensoriska modaliteter och neuronsubtyper som fungerar som en ensemble på populationsnivå för att studera smärta, klåda, beröring och andra somatosensoriska signaler.
Introduction
Primära sensoriska neuroner innerverar huden direkt och bär somatosensorisk information tillbaka till centrala nervsystemet 1,2. Dorsala rotganglier (DRG) är cellkroppskluster av 10 000-15 000 primära sensoriska neuroner 3,4. DRG-neuroner presenterar olika storlek, myeliniseringsnivåer och gen- och receptoruttrycksmönster. Neuroner med mindre diameter inkluderar smärtavkännande neuroner och neuroner med större diameter svarar vanligtvis på icke-smärtsamma mekaniska stimuli 5,6. Störningar i de primära sensoriska neuronerna som skada, kronisk inflammation och perifera neuropatier kan sensibilisera dessa neuroner för olika stimuli och bidra till kronisk smärta, allodyni och smärtöverkänslighet 7,8. Därför är studien av DRG-neuroner viktig för att förstå både somatosensation i allmänhet och många smärt- och klådastörningar.
Neuroner som skjuter in vivo är viktiga för somatosensation, men tills nyligen har verktyg för att studera intakta ganglier in vivo varit begränsade till relativt litet antal celler9. Här beskriver vi en kraftfull metod för att studera nervcellers aktionspotentialer eller aktiviteter på populationsnivå in vivo som ensemble. Metoden använder avbildning baserad på cytoplasmatisk Ca2+ dynamik. De känsliga fluorescerande indikatorerna Ca 2+ är bra proxyvariabler för att mäta cellulär aktivitet på grund av den normalt låga koncentrationen av cytoplasmatisk Ca2+. Dessa indikatorer har möjliggjort samtidig övervakning av hundratals till flera tusen primära sensoriska neuroner hos möss 9,10,11,12,13,14,15,16 och råttor 17. Metoden för in vivo Ca2+ avbildning som beskrivs i denna studie kan användas för att direkt observera svar på populationsnivå på mekaniska, kalla, termiska och kemiska stimuli.
Det fosfoinositidbindande membranproteinet Pirt uttrycks i höga nivåer i nästan alla (>95%) primära sensoriska neuroner18,19 och kan användas för att driva uttrycket av Ca 2+ sensorn, GCaMP3, för att övervaka neuronaktivitet in vivo20. I detta protokoll beskrivs tekniker för att utföra in vivo DRG-kirurgi, Ca2+ avbildning och analys i höger sida ländrygg 5 (L5) DRG av Pirt-GCaMP3-möss14 med hjälp av konfokal laserskanningsmikroskopi (LSM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer som beskrivs här utfördes i enlighet med ett protokoll som godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee vid University of Texas Health Science Center i San Antonio.
OBS: När djurkirurgi (steg 1) och bilddiagnostik (steg 2) har påbörjats måste de slutföras kontinuerligt. Dataanalys (steg 3) kan utföras senare.
1. Kirurgi och säkring av djuret för höger sida L5 DRG-avbildning
OBS: Både manliga och kvinnliga Pirt-GCaMP3 C57BL / 6J-möss 8 veckor eller äldre användes i denna studie. Medan båda könen kan avbildas lika bra, bör möss vara minst 8 veckor gamla på grund av svagt eller intermittent Pirt -uttryck hos yngre möss. Pirt-GCaMP3 C57BL / 6J-mössen genererades vid Johns Hopkins University14. DRG på båda sidor kan avbildas och andra DRG i ländryggen (t.ex. ländrygg 4) kan avbildas. De angivna tiderna är uppskattningar för en erfaren kirurg. Enstaka tekniska problem som ökad blödning kan öka den tid som krävs.
- Bered en steril saltlösning innehållande 40 mg/ml ketamin och 6 mg/ml xylazin. Den totala volymen bör vara minst 9 μl/g kroppsmassa för både kirurgi och eutanasi efter avbildning.
VARNING: Ketamin är skadligt om det injiceras, sväljs eller när det kommer i kontakt med ögat. Hantera varsamt. - Se till att alla kirurgiska verktyg är rena och steriliserade genom autoklavering eller annan NIH-guide för vård och användning av laboratoriedjur-godkänd metod.
- Mellan 15 och 25 minuter före operationen, injicera en Pirt-GCaMP3-mus intraperitonealt (i.p.) med ~ 2,25 μL ketamin/xylazin för varje gram kroppsvikt (90 mg / kg ketamin, 13,5 mg / kg xylazin). Överskrid inte 120 mg/kg ketamin.
- Inom 15 till 25 minuter efter injektion av anestesi (steg 1.3), kontrollera om musen har nått det kirurgiska anestesiplanet genom att nypa den kontralaterala baktassen (inte den ipsilaterala/högra baktassen). Frånvaron av bakbenets abstinensreflex säkerställer att ett kirurgiskt anestesiplan uppnås.
OBS: Hindlimb abstinensreflex används under hela experimentet för att övervaka anestesi. Använd alltid den kontralaterala bakpoten. - Placera musen på en uppvärmd dyna för att hålla kroppstemperaturen vid 37 °C.
OBS: Det kan vara bra att hålla musens huvud på plats med en stereotaxisk ram (se materialförteckning) eller en annan ram baserat på forskarens önskemål. - Lokalisera ländryggsförstoringen genom att känna efter musens bäckenben. Raka musens baksida ovanför ländryggsförstoringsområdet. Detta steg bör ta ~ 90 s.
Musen kan tas bort kort från den uppvärmda dynan för rakning. - Gör ett tresidigt rektangulärt snitt (8 mm x 20 mm) ovanför ländryggsförstoringen med sax och vik bort huden med pincett (figur 1A). Detta steg tar ~ 2 min.
OBS: Forskare kan också använda hemostatpincett eller en retraktor för att hålla snittet öppet. Detta är inte en överlevnadsoperation, så ytterligare rengöring av det kirurgiska området är inte nödvändigt. Det kan dock göras med povidon-jod. Den största acceptabla snittstorleken ges här. Ett mindre snitt är att föredra framför ett större snitt. - Använd 13 mm fjäderdissektionssaxen för att göra 3-4 mm snitt på höger sida av ryggraden. Använd sax för att skära tillbaka huden och musklerna åt sidorna för att exponera ryggraden (figur 1B). Detta steg tar ~3 min.
- Använd 8 mm sax för att rengöra den tvärgående processen på höger sida L5 DRG genom att skära bort muskeln och bindväven medan du försöker minimera blödningen. Använd bomull och / eller gelfoam för att absorbera blodet. L5-kotan är den första ryggkotan rostral till bäckenbenet.
OBS: Detta steg tar ~ 3 min och kan ta extra tid om djuret blöder mer än normalt. - Skär upp den högra sidan L5 tvärgående processen med Friedman-Pearson rongeurs eller starka fina pincett. Var försiktig så att du inte vidrör DRG (bild 1C).
OBS: Detta steg tar ~ 2 min men kan ta extra tid om djuret blöder mer än normalt. - Fortsätt inte förrän blödningen slutar helt. Förhindra blödning på DRG-ytan med gelskum eller bomull. Detta steg tar 1-4 min.
- Flytta musen och värmedynan till den anpassade scenen (bild 2A,B). Använd scentejp för att säkra djuret och värmedynan på plats. Placera djurets nos i noskonen så att djuret kan få kontinuerlig isofluranbedövning. Säkra den högra bakpoten som sticker ut från scenen så att stimuli lätt kan appliceras på tassen. Detta steg tar 3 min.
- Säkra ryggraden på plats med scenklämmorna över huden på kotorna och/eller bäckenbenet bara rostralt och kaudalt till L5 DRG. Justera klämmorna och scenen för att göra DRG-ytan så jämn som möjligt (figur 2B,C).
OBS: Det kan vara nödvändigt att trimma vävnaden som ligger mellan DRG och målet. - Placera steget under mikroskopet så att målet är 8 mm direkt ovanför DRG när det sänks (figur 3A, B). Sätt i rektaltermometern.
OBS: Avståndet från DRG till målet kan variera beroende på målet, mikroskopet och djuret. - Anslut kraftledningarna till värmedynan och rektaltermometern. Anslut noskon till isoflurangasledningarna.
Figur 1: Exempel på DRG-exponeringskirurgi . (A) Ett litet område rakades och huden skars och viktes tillbaka. Snittet är ~ 10 mm på rostral-caudala axeln. (B) Ett snitt gjordes på höger sida av ryggraden och muskler och bindväv skars bort, vilket exponerade L5 höger sida tvärgående process. Blod absorberades med gelfoam. (C) Den tvärgående processen rengjordes och benet över DRG avlägsnades. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 2: Montera musen på en anpassad scen för DRG-avbildning . (A) Den anpassade fasen visas. Den består av en basplatta och en platta för djuret. Djurmonteringsplattan är på en låskula och svängfog. En noskon med linjer för tillförsel av syre / isofluranblandning och en avgasledning tillsammans med en aluminiumfolielindad värmedyna är tejpade på djurets monteringsplatta. Två armar, vardera tillverkade av tre låskulor och svängfogar, är bultade på bottenplattan. Varje arm har en klämma gjord av pincett med en skruv för åtdragning och lossning. (B) Djuret är monterat på djurets monteringsplatta. Näsan placeras i näskonen. Klämmor placeras över huden som håller ryggraden och bäckenbenet. Den högra (ipsilaterala) baktassen är tejpad för att sticka ut för enkel åtkomst för applicering av stimuli. (C) En närbild av den fastspända ryggraden och bäckenbenet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Djur på anpassad scen placeras under mikroskopmålet . (A) En vidvinkelvy av scenen, djuret och mikroskopet. Ledningar till DC-temperaturregulatorn och ledningar till syre / isofluranintag och avgasledning syns till vänster. (B) En närbild av djuret under mikroskopmålet. DRG är ~8 mm under målet. Den rektala termometern sätts in och näsan är inne i näskonen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
2. DRG-avbildning
- Använd ett upprätt konfokalmikroskop 10x/0.4 DIC-mål och tillhörande programvara (se Materialförteckning) för avbildning. Använd inställningarna för grönt filter (FITC): excitation 495 nm, emission 519 nm, detekteringsvåglängd 500-580 nm, GaAsP-Pmt1-bildenhet, GaAsP-PMT-detektor.
OBS: För andra mikroskop använd tillverkarens rekommenderade inställningar. - Hitta ytan på DRG med mikroskopet. Justera klämmorna på scenen så att DRG-ytan är så jämn som möjligt och att den maximala ytan visualiseras i fokalplanet.
OBS: Valet av mål kan variera beroende på mikroskopet som används och användarens preferenser. Valet av programvara beror på mikroskopet. En nivå DRG resulterar i tydligare bilder, gör att programvaran kan konstruera tydligare filmer, möjliggör avbildning av fler neuroner och gör analysen enklare och mer exakt. - Tillför 1% -1,5% isofluran i syreflöde till näskonen för att säkerställa att musen förblir bedövad. Övervaka djuret noggrant under hela proceduren för att upprätthålla isoflurananestesi utan överdosering.
OBS: Mängden isofluran som behövs för att upprätthålla anestesi kan variera beroende på enskilt djur och stimulus. Vanligtvis är 1,5% tillräckligt. Om djuret rör sig under stimulus bör isofluran ökas. Om andningen blir ytlig ska isofluran minskas. Före varje stimulans, testa bakbenets dragreflex på den kontralaterala bakpoten.
VARNING: Isofluran kan vara skadligt eller orsaka yrsel eller dåsighet vid inandning. Undvik inandning och använd endast i ett väl ventilerat område. - Ladda mikroskopets snabbskanningsprotokoll.
- Använd de typiska inställningarna för snabbskanning: voxelstorlek 2,496 μm x 2,496 μm x 16 μm, 512 x 512 pixlar, 10 optiska segment Z-stack, 1 luftig enhet (AU)/32 μm, 1% 488 nm lasereffekt 5 mW, pixeltid 1,52 μs, linjetid 0,91 ms, bildtid 465 ms, LSM-skanningshastighet 8, dubbelriktad skanning, GaAsP-PMT-detektorförstärkning 650 V, digital förstärkning 1. Optimala inställningar kan variera beroende på mikroskop och djur.
- För att ställa in ett snabbskanningsprotokoll, klicka på fliken Förvärv . Under Förvärvsparametrar klickar du på fliken Ramar . Klicka på Förinställningar > 512 x 512 för att ställa in mikroskopet för att spela in en bild på 512 pixlar x 512 pixlar. Detta kommer i sin tur att ställa in X- och Y-värdena för voxelstorleken baserat på bildstorleken, som bestäms av mikroskopprogramvaran.
- Under Förvärvsparametrar klickar du på fliken Kanaler . Klicka på rutan Track2 . Använd rullgardinsmenyn bredvid rutan Track2 för att välja Grön (FITC). En ny flik öppnas under Track2.
- Bredvid Lasrar klickar du på rutan 488 . Detta kommer att ställa in excitations- och emissionsvåglängderna.
- Bredvid 488 nm-reglaget ställer du in Laser Power på 1%. Klicka på knappen 1 AU för att ställa in aperaturen för 1 Airy-enhet. Under FITC ställer du in Master Gain på 650 V, Digital Offset på 0 och Digital Gain på 1.
- Under fliken Förvärv markerar du rutan Z-Stack. Klicka på Live-knappen för att se en levande bild av ganglion. Vrid upp fokalplansvredet tills endast en liten båge av neuroner är synliga.
- Under Förvärvsparametrar klickar du på fliken Z-Stack > knappen Ange sista . Vrid ner fokalplansvredet tills endast en liten båge av neuroner är synliga. Under Förvärvsparametrar klickar du på fliken Z-Stack > knappen Ange först . Klicka på Live-knappen för att stänga av livebilden.
- Under Förvärvsparametrar klickar du på fliken Z-Stack . Fyll i fältet Segment med 10. Detta ställer in 10 optiska skivor och bestämmer automatiskt voxeldjupet.
- Under fliken Förvärv klickar du på rutan Tidsserie . En ny flik Tidsserier visas under Förvärvsparametrar. Klicka på fliken Tidsserie > fältet Cykler med antalet cykler du vill ta härnäst. I det här fallet är det 8.
- Ställ in skanningshastighet och riktning. Under Förvärvsparametrar > > fliken Förvärvsläge Riktning > Dubbelriktad pil för dubbelriktad skanning. Välj fliken Förvärvsläge > Frame > Scan Speed Slider > 8.
OBS: Normalt kan man ladda inställningar från ett tidigare experiment och behöver bara justera lasereffekten om bilden är för ljus eller svag och justera Z-Stack Set Last och Set First.
- Ta en kort 8-cykelsökning av DRG genom att klicka på Starta experiment under fliken Förvärv . Skapa en film genom att göra en ortogonal projektion av skanningar (en skanning per bildruta) över tid och kontrollera manuellt om bilden är klar och avbilda artefakter som "vågor" av ljusstyrka som passerar DRG. Justera klämpositionen och den optiska sektionstjockleken och upprepa detta steg tills en klar film av hög kvalitet uppnås.
OBS: Detta steg bör upprepas om djuret rör sig eller flyttas av prövaren. Problem att leta efter inkluderar områden av ganglion (inte bara enstaka neuroner) som verkar bli ljusare och mörkare under experimentets gång, vilket skapar ett vågigt utseende eller orsakar att områden försvinner eller blir ljusare. Rörelse större än ungefär hälften av en liten neurons diameter (<20 μm) är ett annat stort problem. Vågighet kan ofta fixas genom att föra den första och sista positionen för Z-Stack närmare varandra (se steg 2.4.4 ovan) och minska den optiska skivans tjocklek. Film 1 ger ett exempel på vågiga ganglier innan du utjämnar och ställer in rätt optisk segmenttjocklek. Film 2 är efter korrigering av nivellering och optisk skivtjocklek. Skillnaden är subtil, men den har en enorm effekt på analysen. - Ladda mikroskopets högupplösta skanningsprotokoll.
- Använd de typiska inställningarna för högupplöst skanning: voxelstorlek 1,248 μm x 1,248 μm x 14 μm, 1024 x 1024 pixlar, 6 optiska segment Z-stack, 1,2 luftig enhet (AU)/39 μm, 5% 488 nm lasereffekt/25 mW, pixeltid 2,06 μs, linjetid 4,95 ms, bildtid 5,06 s, LSM-skanningshastighet 6, dubbelriktad skanning, GaAsP-PMT-detektorförstärkning 650 V, digital förstärkning 1. Optimala inställningar kan variera beroende på mikroskop och djur.
- För att ställa in ett högupplöst skanningsprotokoll, klicka på fliken Förvärv . Under Förvärvsparametrar klickar du på fliken Ramar . Klicka på Förinställningar > 1024 x 1024 för att ställa in mikroskopet för att spela in en bild på 1024 pixlar x 1024 pixlar. Detta kommer i sin tur att ställa in X- och Y-värdena för voxelstorleken baserat på bildstorleken, som bestäms av mikroskopprogramvaran.
- Under Förvärvsparametrar klickar du på fliken Kanaler . Klicka på rutan Track2 . Använd rullgardinsmenyn bredvid rutan Track2 för att välja Grön (FITC). En ny flik öppnas under Track2.
- Bredvid Lasrar klickar du på rutan 488 . Detta kommer att ställa in excitations- och emissionsvåglängderna. Klicka på rutan High Intensity Laser Range .
- Bredvid 488 nm-reglaget ställer du in Laser Power på 5%. Klicka på knappen 1 AU för att ställa in aperaturen för 1 Airy-enhet. Under FITC ställer du in Master Gain på 650 V, Digital Offset på 0 och Digital Gain på 1.
- Under fliken Förvärv markerar du rutan Z-Stack. Klicka på Live-knappen för att se en levande bild av ganglion. Vrid upp fokalplansvredet tills endast en liten båge av neuroner är synliga.
- Under Förvärvsparametrar klickar du på fliken Z-Stack > knappen Ange sista . Vrid ner fokalplansvredet tills endast en liten båge av neuroner är synliga. Under Förvärvsparametrar klickar du på fliken Z-Stack > knappen Ange först . Klicka på Live-knappen för att stänga av livebilden.
- Under Förvärvsparametrar klickar du på fliken Z-Stack . Fyll i fältet Segment med 6. Detta ställer in 6 optiska skivor och bestämmer automatiskt voxeldjupet.
- Under fliken Förvärv kontrollerar du att rutan Tidsserie är avmarkerad (ingen tidsserie ).
- Ställ in skanningshastighet och riktning. Under Förvärvsparametrar klickar du på fliken Förvärvsläge > Ram > Förinställningar > 1024 x 1024. Välj fliken Förvärvsläge > Bildruta > Riktning > dubbelriktad pil för dubbelriktad skanning. Välj fliken Förvärvsläge > Frame > Scan Speed Slider > 6.
- Om cellerna är märkta med td-tomat, ställ in mikroskopet för att skanna den röda kanalen 592 nm excitation / 614 nm emission, detektion våglängd 600-700 nm förutom den gröna kanalen. Ställ in detta genom att gå till Förvärvsparametrar och klicka på fliken Kanaler > rutan Track1 . Använd rullgardinsmenyn bredvid rutan Track1 för att välja Röd (Texas Red). Följ samma process som i steg 2.6.3, förutom att klicka på 561-rutan istället för 488-rutan . Ställ in Laser Power på 1%. Td-Tomato är mycket ljusare än GCaMP3 och kräver lägre lasereffekt.
- Gör en högupplöst bild av DRG genom att klicka på knappen Starta experiment under fliken Förvärv .
- Ladda protokollet för snabbskanning i mikroskop (se steg 2.4). Registrera spontan aktivitet i DRG under 80 cykler (cirka 10 min). Generera en ortogonal projektionsfilm och kontrollera att bilden är av tillräcklig kvalitet för analys.
Kvalitetsöverväganden är desamma som i steg 2.5. - För att applicera stimuli, ställ in mikroskopet för att utföra 15-20 skanningar. Vänta tills genomsökningarna 1–5 har slutförts för att skapa baslinjen. Applicera stimulansen under skanningar 6-10. Vänta minst 5 minuter efter varje stimulans innan du applicerar nästa stimulans för att förhindra desensibilisering.
NOTERA: Mekaniska stimuli bör appliceras först, och sedan kalla, termiska och kemiska stimuli. Svagare stimuli (t.ex. låg mekanisk kraft, temperaturer närmare rumstemperatur) bör appliceras före starkare stimuli (t.ex. högre mekanisk kraft, temperaturer längre från rumstemperatur). När du applicerar stimuli, var noga med att inte orsaka någon rörelse av DRG. För starka termiska stimuli i synnerhet är det ofta nödvändigt att applicera 2% isofluran i 1-2 min innan stimulansen påbörjas. På mikroskopet som används i denna studie kan varje skanning höras tydligt, så att forskaren enkelt kan identifiera slutet på skanningen, vilket möjliggör stimulansapplikation omedelbart efter skanning 5. Men alla metoder som underlättar applicering av stimuli vid en konsekvent tidpunkt kommer att fungera. - För en mekanisk press, håll algometerns pincher med tassen mellan paddlarna utan att röra tassen och nyp med början omedelbart efter slutet av skanning 5 och stoppa omedelbart efter skanning 10. Övervaka presskraften med en algometer (se Materialförteckning). Håll presskraften så nära önskad kraft (här använder vi en 100 g pressstimulans) som möjligt och se till att den inte överstiger 10 g över önskad kraft.
OBS: Man kan upptäcka stimuli med så lite som 0,07 g von Frey-filament och så mycket som 600 g presskraft. - För kalla och termiska stimuli, kyla eller värm en bägare med vatten till strax under (för kall) eller över (för termisk) önskad temperatur och börja skanna. Använd här en stimulans på 45 °C. När vattnet har rätt temperatur, applicera stimulansen omedelbart efter skanning 5 genom att nedsänka tassen i vattnet. Dra bort bägaren omedelbart efter skanning 10.
OBS: Temperaturen bör ligga inom 1 °C från önskad temperatur vid skanning 5. Om bägartemperaturen är felaktig, applicera inte stimulansen eftersom detta kan desensibilisera neuronerna. Kyl istället om eller värm upp vattnet och försök igen. Vi har uppmätt temperaturer så låga som 0 °C (isvatten) och så höga som 95 °C. Kom dock ihåg att temperaturer över 50 ° C kan skada vävnader och förvirra senare experiment. På samma sätt är vissa kemikalier (t.ex. tetrodotoxin, capsaicin) irreversibla eller kan inte tvättas ut och kan förhindra ytterligare försök på djuret. - Efter att alla stimuli har applicerats och registrerats, avliva djuret genom överdosering med ketamin/xylazin (200 mg/kg ketamin, 30 mg/kg xylazin eller 5 μl per gram kroppsmassa av lösning beredd i steg 1.1) följt av halshuggning.
3. Analys av data
- Öppna bildfilerna genom att dra och släppa i ImageJ. När du har öppnat filen väljer du bildtyp under Bild > Typ > RGB-färg.
OBS: StackReg21-plugin under Plugins > StackReg är användbart för att korrigera och justera rörelseartefakter. ImageJ kan läsa de flesta filformat för mikroskopprogram. Valet av bildtyp beror på användarens preferenser. RGB förenklar produktionen av färgbilder för publicering. Programvarupaket från mikroskoptillverkaren eller cytoNet22 kan också hjälpa till med analys. Det är inte nödvändigt att ladda ner, installera och använda StackReg, men det rekommenderas. - Använd verktyget region of interest (ROI) för att välja aktiva neuroner under Analysera > Tool > ROI Manager. Rita ROI med hjälp av ellips - eller rektangelverktygen i verktygsfältet och placera dem i ROI-filen genom att trycka på knappen Lägg till under Lägg till i ROI-hanteringsfönstret eller genom att trycka på "t" -tangenten.
OBS: Var noga med att ofta spara ROI-filen. Användare kan alltid återställa ROI genom att dra och släppa en ROI-fil till ImageJ och klicka på rutan Visa alla längst ner i ROI Manager-fönstret. Att spara som ett överlägg rekommenderas inte. Av erfarenhet förenklar analysen att spara som en ROI.zip-fil. - Under Analysera > Ange mått kontrollerar du att alternativet för medelgrått är markerat. avmarkera alla andra rutor under Ange mått. Använd flermåttsverktyget på ROI-chefsmenyn för att beräkna intensiteten inom ROI: erna. Mät intensiteten med ROI-fönstret under Mer > Multimeasure.
OBS: Ibland kommer intilliggande neuroner att vara för nära varandra för att dra separata ROI. Dessa nervceller kan inte användas för att mäta övergående intensitet, men kan inkluderas i antalet aktiverande nervceller. - Spara CSV-filen som genereras av Multimeasure och öppna CSV-filen med valfritt kalkylprogram.
Se Kompletterande fil 1 för ett exempel på en kalkylarksmall för att underlätta analysen. - Beräkna Ca 2+ övergående intensitet som ΔF / F 0 = (Ft- F 0) / F 0, där Ft är pixelintensiteten i en ROI vid tidpunkten för intresse, och F 0 är baslinjeintensiteten bestämd genom att medelvärdet av intensiteterna för antingen 2-4 ramar före Ca 2+ övergående för spontan aktivitet eller de första 1-5 ramarna av ROI för Ca 2+ transienter som uppstår under stimulering. Uteslut alla neuroner som producerar Ca2+ toppar före stimulansen och analysera inte aktiviteten efter att stimulansen slutar.
- För Ca2+ övergående intensitetsanalys, slumpmässigt prov ungefär lika många neuroner från varje ganglion för att undvika att vrida data mot ganglier som producerade det största antalet svarande neuroner. Uteslut toppar där ΔF / F 0 <0,15 .
OBS: Det finns alternativa publicerade metoder för analys och inklusion/exkludering av nervceller 11,12,23,24,25,26,27,28. - Mät neurondiametrar med linjeverktyget i verktygsfältet i ImageJ. Beräkna medeldiametern från linjerna ritade längs de längsta och kortaste diametrarna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4: Representativa bilder av L5 dorsalrotsganglier hos Pirt-GCaMP3-möss. (A,D) Högupplösta skanningar med en bildruta av L5-dorsalrotsganglierna hos Pirt-GCaMP3-möss visas. (B,E) . Genomsnittliga intensitetsprojektioner av 15 ramar av Pirt-GCaMP3 L5 DRG ganglier från panel A respektive panel D, i frånvaro av stimuli. Vissa neuroner som producerade spontana Ca2+ transienter ropas ut med gula pilar. (C) Projektion med genomsnittlig intensitet av två bilder före stimulus och alla fem stimulusramar av Pirt-GCaMP3-ganglion från panel A under 100 g baktasspress. Vissa neuroner som producerade Ca2+ transienter under stimulansen ropas ut med gula pilar. (F-I) Medelintensitetsprojektioner av ramar 4 och 5 (före stimulans) (paneler A och D) och ramar 6-9 (under 100 g pressstimulans) av ganglion från panel D med ramarna 4-6, ram 4 + 5 + 7, ramar 4 + 5 + 8 respektive ramar 4 + 5 + 9 av en 100 g baktasspress. (J) Fluorintensitetsspår av tre spontant aktiva nervceller från panel B (svart) motsvarande panel A ganglion och panel E (röd) motsvarande panel D ganglion. Varje neurons spår normaliseras till dess medianintensitet (visas av linjen vid Y = 0). (K) ΔF / F0 spår av tre neuroner som aktiveras som svar på 100 g press från panel C (svart) motsvarande panelen A ganglion och paneler F-I (röd) som motsvarar panelen D ganglion. Observera att X- och Y-axlarna skiljer sig från panelen J. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Avbildning av ett stort antal nervceller med konfokal skanning av Pirt-GCaMP L5 DRG
Kirurgisk L5 DRG-exponering följt av konfokalmikroskopi gjorde det möjligt att avbilda upp till 1 800 neuroner samtidigt med Pirt-GCaMP3-möss (figur 4). Detta skapar en kraftfull fördel av att samtidigt kunna observera tusentals primära sensoriska neuroner i en ensemble på populationsnivå i deras normala fysiologiska sammanhang, både i kontroll och i onormala förhållanden. Spontana Ca 2+ transienter i frånvaro av stimuli (Figur 4B, E och Film 2) och Ca2+ transienter som svar på stimuli (Figur 4C, F-I, Film 3 och Film 4) kan övervakas. Diametrarna för aktiverande neuroner är starkt korrelerade med olika nervfibergrupper.
Figur 5: Ökande intensitet av stimuli förbättrar Ca2+ svar i ganglier hos Pirt-GCaMP3-möss. (A) Grafer över antalet neuroner i L5 DRG-ganglierna som visar Ca2+ transienter som svar på stimuli från två olika pressintensiteter visas: 100 g, n = 8 ganglier; 300 g, n = 5. (B) Grafer över ΔF / F0-områden under kurvan för prover av Ca2+ transienter från två olika pressintensiteter visas: 100 g, n = 88 neuroner; 300 g, n = 104. (C) Diagram över spår av ΔF / F0 av 100 g och 300 g pressstimuli. Rött spår är medelvärdet ΔF / F0; 100 g, n = 60 neuroner; 300 g, n = 57 neuroner. (D) Diagram över antalet neuroner i L5 DRG-ganglierna som visar Ca 2+ transienter som svar på tre olika icke-skadliga och en skadlig temperatur visas:21 °C, n = 4 ganglier; 10 °C, n = 6, 45 °C, n = 7, 57 °C, n = 3. (E) Diagram över ΔF / F0-områden under kurvan för prover av Ca 2+ transienter från tre olika icke-skadliga och en skadlig temperaturstimulansintensiteter visas:21 °C, n = 40 neuroner; 10 °C, n = 60, 45 °C, n = 61, 57 °C, n = 118. (F) Diagram över spår av ΔF / F0 av 10 °C och 57 °C stimuli. Rött spår är medelvärdet ΔF / F0; 10 °C, n = 60 neuroner; 57 °C, n = 118. (G) Diagram över procentandelar av neuroner med olika diametrar (<20 μm, 20-25 μm, >25 μm) som producerar Ca2+ transienter spontant och med termiska och mekaniska stimuli. Spontan aktivitet (Spon), n = 5 ganglier; 45 °C, n = 3, 300 g, n = 3. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Stapeldiagram visar medel och SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Antal celler som producerarCa2 + transienter och Ca2+ transient area under kurvan (AUC) i närvaro av stimuli
Starka stimuli eller skadlig värme ökade Ca2+ svar. Jämfört med att pressa med 100 g ökade pressning med 300 g antalet neuroner som producerar Ca 2+ transienter (Figur 5A, Studentens t-test: t = 2.398, df = 11, p = 0.0354) och ΔF / F 0-området under kurvan för Ca 2+ transienter (Figur 5B, Welchs t-test: t = 3.243, df = 187.4, p =0.0014). På liknande sätt ökade varm värme i ett icke-skadligt temperaturområde (21 ° C och 45 ° C) antalet neuroner som producerar Ca 2+ transienter (figur 5C, enkelriktad ANOVA F 2,14 = 4,853, p = 0,0251, följt av Tukeys q = 4,380, df = 14, p = 0,0202) och ΔF / F0-området under kurvan för Ca2+ transienter (figur 5D, Brown-Forsythe ANOVA F 2 151,6 = 60,76, p = 0,0029 följt av Welchs t-test: t = 3,333, df = 96,72, p = 0,0036). Jämfört med en skadlig värmestimulans (57 °C) aktiverade icke-skadliga temperaturer (21 °C, 10 °C och 45 °C) ett mindre antal neuroner som producerade Ca 2+ transienter (figur 5E, enkelriktad ANOVA F 2,16 = 2,513, p < 0,001, Dunnetts test,21 °C: q = 9,594, df = 16, p < 0,001; 10 °C: q = 9,583, df =16, p < 0,001; 45 °C: q = 9,160, df = 16, p < 0,001) och ΔF / F 0-området under kurvan för Ca 2+ transienter vid 21 ° C och 10 ° C (figur 5D, Brown-Forsythe ANOVA F 3 268,4 = 12,98, p < 0,001, Dunnetts T3-test,21 ° C: t = 5,415, df = 128, p < 0,001; 10 °C: t =4,398, df = 174,5, p < 0,001; 45 °C: t = 2,079, df = 161,9, p = 0,1127). I detta experiment producerade neuroner med mindre och medelstor diameter Ca 2+ transienter spontant och under alla stimuli, men neuroner med större diameter producerade endast Ca2+ transienter som svar på 300 g pressstimulans (figur 5G).
Märkning av neuroner som uttrycker specifika receptorer med td-tomat i Pirt-GCaMP3-möss
Den cre-inducerbara reportern td-Tomato kan observeras under Pirt-GCaMP3-avbildning. Pirt-GCaMP3, td-Tomato-möss som uttryckte Cre under kontroll av TrpV1-promotorn visade storskalig men inte universell märkning av primära sensoriska neuroner (figur 6A, B). Spontana Ca2+ transienter observerades i både td-tomatmärkta neuroner och neuroner som inte är märkta (figur 6C). Noxious heat testades inte på detta experiment, men kommer att testas i framtida experiment.
Figur 6: Märkning av TrpV1-positiva neuroner med td-tomat hos Pirt-GCaMP3-möss. (A) Projektion med maximal intensitet av spontan aktivitet hos primära sensoriska nervceller hos en TrpV1-Cre, td-tomat, Pirt-GCaMP3-mus avbildad endast på 495 nm excitation/519 nm emissionskanal (FITC, grön). Vissa neuroner som producerar Ca2+ transienter ropas ut med gula pilar (inte märkta med td-tomat) eller röda pilar (märkta med td-tomat). (B) En projektion med medelintensitet av samma primära sensoriska nervceller som panel A endast på den röda kanalen 592 nm excitation/614 nm emission. (C) En maximal intensitetsprojektion av samtidiga röda och gröna kanaler av samma primära sensoriska neuroner som i panel A visas. Vissa neuroner som uttrycker GCaMP3 men inte td-Tomato ropas ut med gula pilar. Vita pilar indikerar GCaMP-positiv utan Ca2+ transienter och inte td-Tomat postiv. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Film 1: Spontan aktivitet hos ett Pirt-GCaMP3-ganglion som inte har planats ut ordentligt eller optimerats för optisk skivtjocklek som orsakar vågighet. 70 bilder per sekund AVI. Optisk skivtjocklek = 16 μm. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Film 2: Spontan aktivitet av samma ganglion från film 1 som har planerats ordentligt och optimerats för optisk skivtjocklek med mindre vågighet. 70 bilder per sekund AVI. Optisk skivtjocklek = 13 μm. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Film 3: 100 g baktasspress av Pirt-GCaMP3 ganglion. 3 bilder per sekund AVI. Stimulans applicerades under ramar 6-10. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Film 4: 45 °C termisk stimulans till baktass av Pirt-GCaMP3 ganglion. 3 bilder per sekund AVI. Stimulans applicerades under ramar 6-10. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Kompletterande fil 1: Exempel på analyskalkylark Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ihållande smärta är närvarande i ett brett spektrum av störningar, försvagande och / eller minskar livskvaliteten för cirka 8% av människor29. Primära sensoriska neuroner upptäcker skadliga stimuli på huden, och deras plasticitet bidrar till ihållande smärta8. Medan neuroner kan studeras i cellodling och explantat, tar det bort dem från deras normala fysiologiska sammanhang. Kirurgisk exponering av DRG, följt av Pirt-GCaMP3 Ca2+ avbildning, möjliggör studier av primära sensoriska neuroner i deras normala fysiologiska sammanhang med hjälp av stimuli applicerade på bakpoten. En stor fördel med denna metod för Ca2+ avbildning är att ett stort antal nervceller kan övervakas samtidigt. Denna metod möjliggör analys på populationsnivå av modalitet, neurondiameter och sällsynta fenomen såsom kopplad aktivering 10,11,12,13,14,15,16,17,30, vilket ger insikter i normal och patologisk somatosensation. Förutom neurondiameter som identifierare kan specifika typer av neuroner vara genetiskt märkta med en röd fluorofor såsom td-tomat för identifiering under avbildning. Denna teknik möjliggör observationer av specifika sensoriska modaliteter eller neuroner som uttrycker specifika receptorer 14,31. Andra tillämpningar inkluderar avbildning av andra sensoriska ganglier såsom trigeminusganglion24,32 eller geniculate ganglion 23,26 och avbildning av spinalhornet av primära sensoriska neuroner i explantat 19,33.
Kritiska steg i protokollet inkluderar att förhindra överdriven blödning eller blödning på DRG, kontroll av anestesi under avbildning, utjämning av DRG-ytan, val av optimal optisk skivtjocklek och förhindrande av rörelse av DRG under applicering av stimuli. Överdriven blödning kan orsaka djurets död eller artefakter på grund av fysiologiska effekter av blodförlust. Blodförlust kan orsaka ökad ljusstyrka (cytoplasmatiskt kalcium) över stora delar av DRG. Blodförlust kan också orsaka domningar, vilket minskar antalet neuroner som aktiveras som svar på stimuli. Blödning på DRG blockerar direkt avbildning, vilket begränsar antalet neuroner som framgångsrikt kan avbildas. Eftersom anestesi påverkar neuronala aktiviteter och svar bör en minimal nivå av isoflurananestesi användas. En nivå DRG och optimal optisk skivtjocklek är de mest kritiska delarna av proceduren. Felaktig utförande av dessa steg kan orsaka nervceller ur fokus och vågighet under avbildning (se film 1 och film 2) som kommer att förvirra analysen eller göra analysen omöjlig. Även små rörelser kan göra det omöjligt att spåra enskilda neuroner över ramar och / eller skapa artefakter där en neuron verkar bli mörkare eller ljusare, vilket orsakar betydande fel.
Systemet som beskrivs här har också några betydande begränsningar. Anestesi stör neuron och glial Ca 2+ svar 25. Eftersom denna metod är terminal kan samma djur inte övervakas över flera experiment. Ca2+ transienter är en indirekt proxy för neuronbränning och aktivitet. Denna metod använder Ca2+ transienter som proxy för åtgärdspotentialer. Andra signaler såsomGq-protein eller ryanodinreceptorsignalering kan dock förändra cytoplasmatiskaCa2+ koncentrationer34,35,36. Andra mekanismer har inte rapporterats orsaka Ca2+ transienter i DRG-neuroner. Applicering av kemiska stimuli på tassen är dock känt för att öka Ca2+ i spinal dorsala hornastrocyter36.
Sammanfattningsvis är intakt DRG Pirt-GCaMP3 Ca2+ avbildning ett kraftfullt verktyg för att studera somatosensation under normala och patologiska förhållanden. Resultaten som visas här är representativa för normala kontrollmöss. Kontrollmöss kan jämföras med smärt- och sjukdomsmodeller eller genetiska mutanter 10,15,17,30,31,37. Dessutom kan metoden som presenteras här anpassas till andra genetiskt kodade Ca2+ indikatorer 10,11,16 och användas för att avbilda andra sensorer såsom spänningsavkänning38,39,40 och cyklisk adenosinmonofosfatavkänning 41. Medan konfokalmikroskopi användes i denna studie kan tvåfotonmikroskopi också användas11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inte några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health Grants R01DE026677 och R01DE031477 (till Y.S.K.), UTHSCSA startup fund (Y.S.K.) och en Rising STAR Award från University of Texas system (Y.S.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anased Injection (Xylazine) | Covetrus, Akorn | 33197 | |
| C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC | Cal Zeiss | 422642-9900-000 | |
| Cotton Tipped Applicators | McKesson | 24-106-1S | |
| Curved Hemostat | Fine Science Tools | 13007-12 | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| DC Temperature Controller Heating Pad | FHC | 40-90-2-05 | |
| Dumont Ceramic Coated Forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| FHC DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Fluriso (Isoflurane) | MWI Animal Health, Piramal Group | 501017 | |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16221-14 | |
| GelFoam | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Ketaset (Ketamine) | Zoetis | KET-00002R2 | |
| Luminescent Green Stage Tape | JSITON/ Amazon | B803YW8ZWL | |
| Matrx VIP 3000 Isoflurane Vaporizer | Midmark | 91305430 | |
| Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Micro dissecting spring scissors | Fine Science Tools | 15023-10 | |
| Micro dissecting spring scissors | Roboz | RS-5677 | |
| Mini Rectal Thermistor Probe | FHC | 40-90-5D-02 | |
| Operating scissors | Roboz | RS-6812 | |
| Pirt-GCaMP3 C57BL/6J mice | Johns Hopkins University | N/A | Either sex can be imaged equally well. Mice should be at least 8 weeks old due to weak or intermittent Pirt promoter expression in younger mice. |
| SMALGO small animal algometer | Bioseb In vivo Research Instruments | BIO-SMALGO | |
| Stereotaxic frame | Kopf Model 923-B | 923-B | |
| td-Tomato C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 7909 | |
| Top Plate, 6 in x 10 in | Newport | 290-TP | |
| TrpV1-Cre C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 17769 | |
| Zeiss LSM 800 confocal microscope | Cal Zeiss | LSM800 | |
| Zeiss Zen 2.6 Blue Edition Software | Cal Zeiss | Zen (Blue Edition) 2.6 |
References
- Rivero-Melián, C., Grant, G. Distribution of lumbar dorsal root fibers in the lower thoracic and lumbosacral spinal cord of the rat studied with choleragenoid horseradish peroxidase conjugate. The Journal of Comparative Neurology. 299 (4), 470-481 (1990).
- Wessels, W. J., Marani, E. A rostrocaudal somatotopic organization in the brachial dorsal root ganglia of neonatal rats. Clinical Neurology and Neurosurgery. 95, 3-11 (1993).
- Schmalbruch, H. The number of neurons in dorsal root ganglia L4-L6 of the rat. The Anatomical Record. 219 (3), 315-322 (1987).
- Sørensen, B., Tandrup, T., Koltzenburg, M., Jakobsen, J. No further loss of dorsal root ganglion cells after axotomy in p75 neurotrophin receptor knockout mice. The Journal of Comparative Neurology. 459 (3), 242-250 (2003).
- Basbaum, A. I., Woolf, C. J. Pain. Current Biology. 9 (12), 429-431 (1999).
- Liu, Y., Ma, Q. Generation of somatic sensory neuron diversity and implications on sensory coding. Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 52-60 (2011).
- Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139 (2), 267-284 (2009).
- Stucky, C. L., Mikesell, A. R. Cutaneous pain in disorders affecting peripheral nerves. Neuroscience Letters. 765, 136233 (2021).
- Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. Calcium imaging for analgesic drug discovery. Neurobiology of Pain. 11, 100083 (2022).
- Chen, Z., et al. Adjacent intact nociceptive neurons drive the acute outburst of pain following peripheral axotomy. Scientific Reports. 9 (1), 7651 (2019).
- Chisholm, K. I., Khovanov, N., Lopes, D. M., La Russa, F., McMahon, S. B. Large scale in vivo recording of sensory neuron activity with GCaMP6. eNeuro. 5 (1), (2018).
- Emery, E. C., et al. In vivo characterization of distinct modality-specific subsets of somatosensory neurons using GCaMP. Science Advances. 2 (11), 1600990 (2016).
- Ishida, H., et al. In vivo calcium imaging visualizes incision-induced primary afferent sensitization and its amelioration by capsaicin pretreatment. The Journal of Neuroscience. 41 (41), 8494-8507 (2021).
- Kim, Y. S., et al. Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- MacDonald, D. I., et al. Silent cold-sensing neurons contribute to cold allodynia in neuropathic pain. Brain. 144 (6), 1711-1726 (2021).
- Wang, F., et al. Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold. Cell Reports. 23 (7), 2001-2013 (2018).
- Kucharczyk, M. W., et al. The impact of bone cancer on the peripheral encoding of mechanical pressure stimuli. Pain. 161 (8), 1894-1905 (2020).
- Kim, A. Y., et al. a phosphoinositide-binding protein, functions as a regulatory subunit of TRPV1. Cell. 133 (3), 475-485 (2008).
- Kim, Y. S., et al. Central terminal sensitization of TRPV1 by descending serotonergic facilitation modulates chronic pain. Neuron. 81 (4), 873-887 (2014).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Mahadevan, A. S., et al. cytoNet: Spatiotemporal network analysis of cell communities. PLoS Computational Biology. 18 (6), 1009846 (2022).
- Barretto, R. P., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).
- Leijon, S. C. M., et al. Oral thermosensing by murine trigeminal neurons: modulation by capsaicin, menthol and mustard oil. The Journal of Physiology. 597 (7), 2045-2061 (2019).
- Sekiguchi, K. J., et al. Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice. Nature Communications. 7, 11450 (2016).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6, 8171 (2015).
- Ran, C., Hoon, M. A., Chen, X. The coding of cutaneous temperature in the spinal cord. Nature Neuroscience. 19 (9), 1201-1209 (2016).
- Yarmolinsky, D. A., et al. Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system. Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).
- Torrance, N., Smith, B. H., Bennett, M. I., Lee, A. J. The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey. The Journal of Pain. 7 (4), 281-289 (2006).
- Shannonhouse, J., et al. Meclizine and metabotropic glutamate receptor agonists attenuate severe pain and Ca(2+) activity of primary sensory neurons in chemotherapy-induced peripheral neuropathy. The Journal of Neuroscience. 42 (31), 6020-6037 (2022).
- Luiz, A. P., et al. Cold sensing by Na(V)1.8-positive and Na(V)1.8-negative sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3811-3816 (2019).
- Hartung, J. E., Gold, M. S. GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons. Cell Calcium. 89, 102225 (2020).
- Chung, M. K., Wang, S., Oh, S. L., Kim, Y. S. Acute and chronic pain from facial skin and oral mucosa: Unique neurobiology and challenging treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5810 (2021).
- Chan, S. L., Mayne, M., Holden, C. P., Geiger, J. D., Mattson, M. P. Presenilin-1 mutations increase levels of ryanodine receptors and calcium release in PC12 cells and cortical neurons. The Journal of Biological Chemistry. 275 (24), 18195-18200 (2000).
- Sierra, D. A., Popov, S., Wilkie, T. M. Regulators of G-protein signaling in receptor complexes. Trends in Cardiovascular Medicine. 10 (6), 263-268 (2000).
- Yoshihara, K., et al. Astrocytic Ca(2+) responses in the spinal dorsal horn by noxious stimuli to the skin. Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 101-104 (2018).
- Tan, C. H., McNaughton, P. A. The TRPM2 ion channel is required for sensitivity to warmth. Nature. 536 (7617), 460-463 (2016).
- Akemann, W., Mutoh, H., Perron, A., Rossier, J., Knöpfel, T. Imaging brain electric signals with genetically targeted voltage-sensitive fluorescent proteins. Nature Methods. 7 (8), 643-649 (2010).
- Gong, Y., et al. High-speed recording of neural spikes in awake mice and flies with a fluorescent voltage sensor. Science. 350 (6266), 1361-1366 (2015).
- Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision. Nature Methods. 7 (5), 399-405 (2010).
- Harada, K., et al. Red fluorescent protein-based cAMP indicator applicable to optogenetics and in vivo imaging. Scientific Reports. 7 (1), 7351 (2017).
