Summary
Denne protokollen beskriver kirurgisk eksponering av dorsalrotganglion (DRG) etterfulgt av GCaMP3 (genetisk kodet Ca2+ indikator; Grønt fluorescerende protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ avbildning av nevronensemblene ved bruk av Pirt-GCaMP3-mus mens du bruker en rekke stimuli til den ipsilaterale bakpoten.
Abstract
Ca 2+-avbildning kan brukes som proxy for cellulær aktivitet, inkludert aksjonspotensialer og forskjellige signalmekanismer som involverer Ca 2+ inngang i cytoplasma eller frigjøring av intracellulære Ca 2+ lagre. Pirt-GCaMP3-basert Ca2+-avbildning av primære sensoriske nevroner i dorsalrotganglion (DRG) hos mus gir fordelen av samtidig måling av et stort antall celler. Opptil 1,800 nevroner kan overvåkes, slik at nevrale nettverk og somatosensoriske prosesser kan studeres som et ensemble i sin normale fysiologiske kontekst på populasjonsnivå in vivo. Det store antallet nevroner som overvåkes, gjør det mulig å oppdage aktivitetsmønstre som ville være utfordrende å oppdage ved hjelp av andre metoder. Stimuli kan brukes på musens bakpote, slik at de direkte effektene av stimuli på DRG-nevronensemblet kan studeres. Antall nevroner som produserer Ca 2+ transienter samt amplituden til Ca2+ transienter indikerer følsomhet for spesifikke sensoriske modaliteter. Diameteren av nevroner gir bevis på aktiverte fibertyper (ikke-skadelig mekano vs. skadelige smertefibre, Aβ, Aδ og C-fibre). Nevroner som uttrykker spesifikke reseptorer kan genetisk merkes med td-tomat og spesifikke Cre-rekombinaser sammen med Pirt-GCaMP. Derfor gir Pirt-GCaMP3 Ca2+ avbildning av DRG et kraftig verktøy og modell for analyse av spesifikke sensoriske modaliteter og nevronsubtyper som fungerer som et ensemble på populasjonsnivå for å studere smerte, kløe, berøring og andre somatosensoriske signaler.
Introduction
Primære sensoriske nevroner innerverer huden direkte og bærer somatosensorisk informasjon tilbake til sentralnervesystemet 1,2. Dorsal rotganglier (DRG) er cellekroppsklynger av 10.000-15.000 primære sensoriske nevroner 3,4. DRG-nevroner presenterer forskjellig størrelse, myeliniseringsnivåer og gen- og reseptoruttrykksmønstre. Nevroner med mindre diameter inkluderer smertefølende nevroner og nevroner med større diameter reagerer vanligvis på ikke-smertefulle mekaniske stimuli 5,6. Forstyrrelser i de primære sensoriske nevronene som skade, kronisk betennelse og perifere nevropatier kan sensibilisere disse nevronene til forskjellige stimuli og bidra til kronisk smerte, allodyni og smerteoverfølsomhet 7,8. Derfor er studiet av DRG-nevroner viktig for å forstå både somatosensasjon generelt og mange smerte- og kløeforstyrrelser.
Nevroner som skyter in vivo er essensielle for somatosensasjon, men inntil nylig har verktøy for å studere intakte ganglier in vivo vært begrenset til relativt lite antall celler 9. Her beskriver vi en kraftig metode for å studere handlingspotensialene eller aktivitetene til nevroner på populasjonsnivå in vivo som et ensemble. Metoden benytter avbildning basert på cytoplasmatisk Ca2+ dynamikk. Ca 2+ følsomme fluorescerende indikatorer er gode proxyer for måling av cellulær aktivitet på grunn av den normalt lave konsentrasjonen av cytoplasmatisk Ca2+. Disse indikatorene har tillatt samtidig overvåking av hundrevis til flere tusen primære sensoriske nevroner hos mus 9,10,11,12,13,14,15,16 og rotter 17. Metoden for in vivo Ca2+-avbildning beskrevet i denne studien kan brukes til direkte å observere populasjonsnivåresponser på mekaniske, kalde, termiske og kjemiske stimuli.
Det fosfoinositidbindende membranproteinet, Pirt, uttrykkes i høye nivåer i nesten alle (>95%) primære sensoriske nevroner18,19 og kan brukes til å drive ekspresjonen av Ca 2+-sensoren, GCaMP3, for å overvåke nevronaktivitet in vivo20. I denne protokollen er teknikker beskrevet for å utføre in vivo DRG-kirurgi, Ca2+ bildebehandling og analyse i høyre side lumbal 5 (L5) DRG av Pirt-GCaMP3 mus14 ved bruk av konfokal laserskanningsmikroskopi (LSM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer beskrevet her ble utført i samsvar med en protokoll godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Texas Health Science Center i San Antonio.
MERK: Ved oppstart må dyrekirurgi (trinn 1) og bildediagnostikk (trinn 2) fullføres fortløpende. Dataanalyse (trinn 3) kan utføres senere.
1. Kirurgi og sikring av dyret for høyre side L5 DRG-avbildning
MERK: Både mannlige og kvinnelige Pirt-GCaMP3 C57BL/6J mus 8 uker eller eldre ble brukt i denne studien. Mens begge kjønn kan avbildes like godt, bør mus være minst 8 uker gamle på grunn av svakt eller intermitterende Pirt-uttrykk hos yngre mus. Pirt-GCaMP3 C57BL/6J-musene ble generert ved Johns Hopkins University14. Begge sider av DRG kan avbildes, og andre lumbale DRG (f.eks. lumbal 4) kan avbildes. De oppgitte tidene er estimater for en erfaren kirurg. Sporadiske tekniske problemer som økt blødning kan øke tiden som kreves.
- Tilbered en steril saltoppløsning inneholdende 40 mg/ml ketamin og 6 mg/ml xylazin. Totalvolumet bør være minst 9 μL/g kroppsmasse ved både kirurgi og eutanasi etter avbildning.
FORSIKTIG: Ketamin er skadelig hvis det injiseres, svelges eller når det kommer i kontakt med øyet. Håndter med forsiktighet. - Sørg for at alle kirurgiske verktøy er rene og steriliserte ved autoklavering eller annen NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals-godkjent metode.
- Mellom 15 og 25 minutter før operasjonen, injiser en Pirt-GCaMP3-mus intraperitonealt (i.p.) med ~ 2.25 μL ketamin / xylazin for hvert gram kroppsvekt (90 mg / kg ketamin, 13.5 mg / kg xylazin). Ikke overskrid 120 mg/kg ketamin.
- Innen 15 til 25 minutter etter injeksjon av anestesi (trinn 1.3), sjekk om musen har nådd anestesioperasjonsplanet ved å klemme den kontralaterale baklabben (ikke den ipsilaterale/høyre baklabben). Fraværet av tilbaketrekningsrefleks i bakbenet sikrer at et kirurgisk anestesiplan oppnås.
MERK: Tilbaketrekningsrefleks fra baklemmer brukes gjennom hele forsøket for å overvåke anestesi. Bruk alltid den kontralaterale bakpoten. - Plasser musen på en oppvarmet pute for å holde kroppstemperaturen på 37 °C.
MERK: Det kan være nyttig å holde musens hode på plass med en stereotaktisk ramme (se materialfortegnelse), eller en annen ramme basert på forskerens preferanse. - Finn lumbalforstørrelsen ved å føle for musens bekkenben. Barber baksiden av musen over lumbalforstørrelsesområdet. Dette trinnet bør ta ~ 90 s.
NOTAT: Musen kan fjernes kort fra den oppvarmede puten for barbering. - Lag et tresidig rektangulært snitt (8 mm x 20 mm) over korsryggforstørrelsen med en saks og brett huden bort med tang (figur 1A). Dette trinnet tar ~ 2 min.
MERK: Forskere kan også bruke hemostattang eller en retractor for å holde snittet åpent. Dette er ikke en overlevelsesoperasjon, så ytterligere rengjøring av det kirurgiske området er ikke nødvendig; Det kan imidlertid gjøres ved bruk av povidon-jod. Den største akseptable snittstørrelsen er gitt her. Et mindre snitt er å foretrekke fremfor et større snitt. - Bruk 13 mm fjærdisseksjonssaks til å lage 3-4 mm snitt på høyre side av ryggraden. Bruk saks til å klippe huden og musklene til sidene for å eksponere ryggraden (figur 1B). Dette trinnet tar ~ 3 min.
- Bruk 8 mm saks til å rengjøre den tverrgående prosessen på høyre side L5 DRG ved å kutte bort muskel og bindevev mens du prøver å minimere blødning. Bruk bomull og/eller gelfoam for å absorbere blodet. L5 vertebra er den første vertebra rostral til bekkenbenet.
MERK: Dette trinnet tar ~ 3 min og kan ta ekstra tid hvis dyret blør mer enn normalt. - Skjær opp den høyre siden L5 tverrgående prosessen ved hjelp av Friedman-Pearson rongeurs eller sterke fine tang. Vær forsiktig så du ikke berører DRG (figur 1C).
MERK: Dette trinnet tar ~ 2 min, men kan ta ekstra tid hvis dyret blør mer enn normalt. - Ikke fortsett før blødningen stopper helt. Forhindre blødning på DRG-overflaten ved hjelp av gelskum eller bomull. Dette trinnet tar 1-4 min.
- Flytt musen og varmeputen til det egendefinerte trinnet (figur 2A, B). Bruk scenetape for å feste dyret og varmeputen på plass. Plasser dyrets nese i nesekeglen slik at dyret kan få kontinuerlig isoflurananestesi. Fest den høyre bakpoten som stikker ut av scenen slik at stimuliene lett kan påføres poten. Dette trinnet tar 3 min.
- Fest ryggraden på plass med sceneklemmene over huden på ryggvirvlene og/eller bekkenbenet bare rostral og kaudalt til L5 DRG. Juster klemmene og trinnet for å gjøre overflaten på DRG så jevn som mulig (figur 2B,C).
MERK: Det kan være nødvendig å trimme vevet som ligger mellom DRG og målet. - Plasser trinnet under mikroskopet slik at målet er 8 mm rett over DRG når det senkes (figur 3A,B). Sett inn rektaltermometeret.
MERK: Avstanden fra DRG til målet kan variere basert på målet, mikroskopet og dyret. - Koble kraftledningene til varmeputen og rektaltermometeret. Koble nesekeglen til isoflurangassledningene.
Figur 1: Eksempel på DRG-eksponeringskirurgi . (A) Et lite område ble barbert og huden ble kuttet og brettet tilbake. Snittet er ~ 10 mm på rostral-caudal aksen. (B) Det ble gjort et snitt på høyre side av ryggsøylen og muskel og bindevev ble skåret bort, og eksponerte L5 høyre side tverrgående prosess. Blod ble absorbert med gelfoam. (C) Den tverrgående prosessen ble rengjort og benet over DRG ble fjernet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Montering av musen på et egendefinert stadium for DRG-avbildning . (A) Det egendefinerte stadiet vises. Den består av en grunnplate og en plate for dyret. Dyrets monteringsplate er på en låsekule og sokkelsvingfuge. En nesekjegle med linjer for tilførsel av oksygen / isofluran blanding og en avgassledning sammen med en aluminiumsfolie innpakket varmepute er tapet til dyrets monteringsplate. To armer, hver laget av tre låsekuler og svingbare skjøter, er boltet til bunnplaten. Hver arm har en klemme laget av tang med en skrue for stramming og løsning. (B) Dyret er montert på dyrets monteringsplate. Nesen er plassert i nesekeglen. Klemmer er plassert over huden som holder ryggraden og bekkenbenet. Den høyre (ipsilaterale) bakpoten er tapet for å stikke ut for enkel tilgang for å påføre stimuli. (C) Et nærbilde av den fastklemte ryggsøylen og bekkenbenet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Dyr på egendefinert stadium er plassert under mikroskopmålet . (A) Et vidvinkelbilde av scenen, dyret og mikroskopet. Ledninger til DC temperaturregulatoren og linjer til oksygen / isofluran inntak og avgassledning er synlige til venstre. (B) Et nærbilde av dyret under mikroskopmålet. DRG er ~ 8 mm under målet. Det rektale termometeret settes inn og nesen er inne i nesekeglen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. DRG-avbildning
- Bruk et stående konfokalmikroskop 10x/0.4 DIC-objektiv og tilhørende programvare (se Materialfortegnelse) for avbildning. Bruk innstillingene for grønt filter (FITC): eksitasjon 495 nm, utslipp 519 nm, deteksjonsbølgelengde 500-580 nm, GaAsP-Pmt1 bildebehandlingsenhet, GaAsP-PMT-detektor.
MERK: For andre mikroskoper bruk produsentens anbefalte innstillinger. - Finn overflaten av DRG med mikroskopet. Juster klemmene på scenen slik at DRG-overflaten er så jevn som mulig og at det maksimale overflatearealet visualiseres i fokalplanet.
MERK: Valg av mål kan variere avhengig av mikroskopet som brukes og brukerens preferanser. Valg av programvare avhenger av mikroskopet. Et nivå DRG resulterer i klarere bilder, lar programvaren konstruere klarere filmer, tillater avbildning av flere nevroner, og gjør analysen enklere og mer nøyaktig. - Tilfør 1% -1,5% isofluran i oksygenstrømmen til nesekjeglen for å sikre at musen forblir bedøvet. Overvåk dyret nøye under hele prosedyren for å opprettholde isoflurananestesi uten overdosering.
MERK: Mengden isofluran som er nødvendig for å opprettholde anestesi kan variere fra dyr til individ og stimulus. Vanligvis er 1,5% tilstrekkelig. Hvis dyret beveger seg under stimulus, bør isofluran økes. Dersom respirasjonen blir overfladisk, bør isofluran reduseres. Før hver stimulus, test bakbenet trekke refleks på den kontralaterale bakpoten.
FORSIKTIG: Isofluran kan være skadelig eller forårsake svimmelhet eller døsighet ved innånding. Unngå innånding og bruk bare i et godt ventilert område. - Last inn mikroskopets hurtigskanningsprotokoll.
- Bruk de typiske innstillingene for rask skanning: voxelstørrelse 2.496 μm x 2.496 μm x 16 μm, 512 x 512 piksler, 10 optisk skive Z-stack, 1 luftig enhet (AU) / 32 μm, 1% 488 nm lasereffekt 5 mW, pikseltid 1.52 μs, linjetid 0.91 ms, rammetid 465 ms, LSM-skannehastighet 8, toveis skanning, GaAsP-PMT-detektor forsterkning 650 V, digital forsterkning 1. Optimale innstillinger kan variere etter mikroskop og dyr.
- For å sette opp en hurtigskanningsprotokoll, klikk på fanen Oppkjøp . Under Oppkjøpsparametere klikker du på Rammer-fanen . Klikk på Forhåndsinnstillinger > 512 x 512 for å stille mikroskopet til å ta opp et bilde på 512 piksler x 512 piksler. Dette vil igjen sette X- og Y-verdiene for voxelstørrelsen basert på bildestørrelsen, som bestemmes av mikroskopprogramvaren.
- Under Oppkjøpsparametere klikker du på fanen Kanaler . Klikk på Track2-boksen . Bruk rullegardinmenyen ved siden av Track2-boksen for å velge Grønn (FITC). En ny fane åpnes under Spor 2.
- Ved siden av Lasere, klikk på 488-boksen . Dette vil sette eksitasjons- og utslippsbølgelengder.
- Ved siden av glidebryteren på 488 nm setter du lasereffekten til 1 %. Klikk på 1 AU-knappen for å stille inn blenderåpningen for 1 Airy-enhet. Under FITC setter du Master Gain til 650 V, Digital Offset til 0 og Digital Gain til 1.
- Under fanen Anskaffelse merker du av for Z-Stack . Klikk på Live-knappen for å se et levende bilde av ganglion. Vri fokalplanet opp til bare en liten bue av nevroner er synlige.
- Under Anskaffelsesparametere klikker du på Z-Stack-fanen > Angi siste-knappen . Vri fokalplanet ned til bare en liten bue av nevroner er synlige. Under Oppkjøpsparametere klikker du på Z-Stack-fanen > Set First-knappen . Klikk på Live-knappen for å slå av live-bildet.
- Under Anskaffelsesparametere klikker du på Z-Stack-fanen . Fyll ut Stykker-feltet med 10. Dette vil sette 10 optiske skiver og automatisk bestemme voxeldybden.
- Under fanen Anskaffelse klikker du på Tidsserie-boksen . En ny Tidsserie-fane vises under Brukeranskaffelsesparametere. Klikk på Tidsserier-fanen > Sykluser-feltet med antall sykluser du vil ta neste. I dette tilfellet er det 8.
- Still inn skannehastighet og retning. Under Brukeranskaffelsesparametere > > kategorien Anskaffelsesmodus Retning > dobbelthodet pil for birdirectional skanning. Velg kategorien Anskaffelsesmodus > Ramme > glidebryter for skannehastighet > 8.
MERK: Normalt kan man laste inn innstillinger fra et tidligere eksperiment og trenger bare å justere lasereffekten hvis bildet er for lyst eller svakt og justere Z-Stack Set Last og Set First.
- Ta en kort 8-syklusskanning av DRG ved å klikke på Start eksperiment under fanen Oppkjøp . Lag en film ved å lage en ortogonal projeksjon av skanninger (én skanning per delbilde) over tid, og kontroller manuelt for bildeklarhet og bildeartefakter, for eksempel "bølger" av lysstyrke som krysser DRG. Juster klemposisjonen og tykkelsen på de optiske delene, og gjenta dette trinnet til du oppnår en klar film av høy kvalitet.
MERK: Dette trinnet bør gjentas hvis dyret beveger seg eller flyttes av etterforskeren. Problemer å se etter inkluderer områder av ganglion (ikke bare enkelte nevroner) som ser ut til å bli lysere og mørkere i løpet av forsøket, noe som skaper et bølget utseende eller forårsaker at områder forsvinner eller blir lysere. Bevegelse større enn omtrent halvparten av et lite nevrons diameter (<20 μm) er et annet stort problem. Bølgete kan ofte løses ved å bringe den første og siste posisjonen til Z-Stack nærmere hverandre (se trinn 2.4.4 ovenfor) og begrense den optiske skivetykkelsen. Film 1 gir et eksempel på en bølget ganglia før utjevning og innstilling av riktig optisk skivetykkelse. Film 2 er etter korrigering av utjevning og optisk skivetykkelse. Forskjellen er subtil, men den har en enorm effekt på analysen. - Last inn mikroskopets skanneprotokoll med høy oppløsning.
- Bruk de typiske innstillingene for skanning med høy oppløsning: voxelstørrelse 1.248 μm x 1.248 μm x 14 μm, 1024 x 1024 piksler, 6 optisk skive Z-stack, 1.2 luftig enhet (AU) / 39 μm, 5% 488 nm lasereffekt / 25 mW, pikseltid 2.06 μs, linjetid 4.95 ms, rammetid 5.06 s, LSM-skannehastighet 6, toveis skanning, GaAsP-PMT-detektor forsterkning 650 V, digital forsterkning 1. Optimale innstillinger kan variere etter mikroskop og dyr.
- For å sette opp en skanneprotokoll med høy oppløsning, klikk på kategorien Oppkjøp . Under Oppkjøpsparametere klikker du på Rammer-fanen . Klikk på Forhåndsinnstillinger > 1024 x 1024 for å stille mikroskopet til å ta opp et bilde på 1024 piksler x 1024 piksler. Dette vil igjen sette X- og Y-verdiene for voxelstørrelsen basert på bildestørrelsen, som bestemmes av mikroskopprogramvaren.
- Under Oppkjøpsparametere klikker du på fanen Kanaler . Klikk på Track2-boksen . Bruk rullegardinmenyen ved siden av Track2-boksen for å velge Grønn (FITC). En ny fane åpnes under Spor 2.
- Ved siden av Lasere, klikk på 488-boksen . Dette vil sette eksitasjons- og utslippsbølgelengder. Klikk på boksen High Intensity Laser Range .
- Ved siden av glidebryteren på 488 nm setter du lasereffekten til 5 %. Klikk på 1 AU-knappen for å stille inn blenderåpningen for 1 Airy-enhet. Under FITC setter du Master Gain til 650 V, Digital Offset til 0 og Digital Gain til 1.
- Under fanen Anskaffelse merker du av for Z-Stack . Klikk på Live-knappen for å se et levende bilde av ganglion. Vri fokalplanet opp til bare en liten bue av nevroner er synlige.
- Under Anskaffelsesparametere klikker du på Z-Stack-fanen > Angi siste-knappen . Vri fokalplanet ned til bare en liten bue av nevroner er synlige. Under Oppkjøpsparametere klikker du på Z-Stack-fanen > Angi først-knappen . Klikk på Live-knappen for å slå av live-bildet.
- Under Anskaffelsesparametere klikker du på Z-Stack-fanen . Fyll ut Stykker-feltet med 6. Dette vil sette 6 optiske skiver og automatisk bestemme voxeldybden.
- Under Brukeranskaffelse-fanen kontrollerer du at det ikke er merket av for Tidsserier (ingen tidsserier ).
- Still inn skannehastighet og retning. Under Oppkjøpsparametere klikker du på fanen Anskaffelsesmodus > Ramme > forhåndsinnstillinger > 1024 x 1024. Velg fanen Anskaffelsesmodus > Ramme > retning > dobbelthodet pil for toveisskanning. Velg fanen Anskaffelsesmodus > Ramme > glidebryteren for skannehastighet > 6.
- Hvis celler er merket med td-Tomato, sett mikroskopet til å skanne den røde kanalen 592 nm eksitasjon / 614 nm utslipp, deteksjonsbølgelengde 600-700 nm i tillegg til den grønne kanalen. Angi dette ved å gå til Anskaffelsesparametere og klikke på Kanaler-fanen > Spor1-boksen . Bruk rullegardinmenyen ved siden av Track1-boksen for å velge Red (Texas Red ). Følg samme prosess som i trinn 2.6.3, bortsett fra å klikke på 561-boksen i stedet for 488-boksen . Sett lasereffekten til 1 %. Td-Tomato er mye lysere enn GCaMP3 og krever lavere laserkraft.
- Lag et høyoppløselig bilde av DRG ved å klikke på Start eksperiment-knappen under fanen Oppkjøp .
- Legg i mikroskopets hurtigskanningsprotokoll (se trinn 2.4). Registrer spontan aktivitet i DRG i 80 sykluser (ca. 10 minutter). Generer en ortogonal projeksjonsfilm og kontroller at bildet har tilstrekkelig kvalitet for analyse.
MERK: Kvalitetshensyn er de samme som i trinn 2.5. - For å bruke stimuli, sett mikroskopet til å utføre 15-20 skanninger. Vent til skanning 1-5 er fullført for å produsere grunnlinjen. Påfør stimulansen under skanning 6-10. Vent minst 5 minutter etter hver stimulus før du bruker neste stimulus for å forhindre desensibilisering.
MERK: Mekaniske stimuli bør brukes først, og deretter kalde, termiske og kjemiske stimuli. Svakere stimuli (f.eks. lav mekanisk kraft, temperaturer nærmere romtemperatur) bør påføres før sterkere stimuli (f.eks. høyere mekanisk kraft, temperaturer lenger fra romtemperatur). Når du bruker stimuli, må du ikke forårsake bevegelse av DRG. Spesielt ved sterke termiske stimuli er det ofte nødvendig å påføre 2% isofluran i 1-2 minutter før stimulansen startes. På mikroskopet som brukes i denne studien, kan hver skanning høres tydelig, slik at forskeren enkelt kan identifisere slutten av skanningen, slik at stimulusapplikasjon umiddelbart etter skanning 5. Imidlertid vil enhver metode som letter anvendelse av stimuli på et konsistent tidspunkt fungere. - For et mekanisk trykk, hold algometerets pincher med poten mellom padlene uten å berøre poten, og knip starter umiddelbart etter slutten av skanning 5 og stopper umiddelbart etter skanning 10. Overvåk pressestyrken med et algometer (se materialfortegnelse). Hold pressekraften så nær ønsket kraft (her bruker vi en 100 g pressestimulus) som mulig og sørg for at den ikke overstiger 10 g over ønsket kraft.
MERK: Man kan oppdage stimuli med så lite som 0,07 g von Frey-filamenter og så mye som 600 g pressekraft. - For kalde og termiske stimuli, avkjøl eller varm opp et beger med vann til like under (for kulde) eller over (for termisk) ønsket temperatur og begynn å skanne. Her bruker du en stimulans på 45 °C. Når vannet har riktig temperatur, bruk stimulansen umiddelbart etter skanning 5 ved å senke poten i vannet. Trekk begeret vekk umiddelbart etter skanning 10.
MERK: Temperaturen skal være innenfor 1 °C av ønsket temperatur ved skanning 5. Hvis begertemperaturen er feil, må du ikke bruke stimulansen fordi dette kan desensibilisere nevronene. I stedet avkjøles eller varmes vannet på nytt og prøv igjen. Vi har målt temperaturer helt ned til 0 °C (isvann) og så høye som 95 °C. Husk imidlertid at temperaturer over 50 °C kan skade vev og forvirre senere eksperimenter. På samme måte er noen kjemikalier (f.eks. tetrodotoksin, kapsaicin) irreversible eller kan ikke vaskes ut og kan forhindre ytterligere eksperimenter på dyret. - Etter at alle stimuli er påført og registrert, avlives dyret ved overdosering med ketamin/xylazin (200 mg/kg ketamin, 30 mg/kg xylazin eller 5 μL per gram kroppsmasse oppløsning fremstilt i trinn 1.1) etterfulgt av halshogging.
3. Dataanalyse
- Åpne bildefilene ved å dra og slippe inn i ImageJ. Når du har åpnet filen, velger du bildetypen under Bilde > Type > RGB-farge.
NOTAT: StackReg21-pluginet under Plugins > StackReg er nyttig for å korrigere og justere bevegelsesartefakter. ImageJ kan lese de fleste filformater for mikroskopprogramvare. Valget av bildetype avhenger av brukerens preferanser. RGB gjør det enklere å produsere fargebilder for publisering. Programvarepakker fra mikroskopprodusenten eller cytoNet22 kan også hjelpe til med analyse. Det er ikke nødvendig å laste ned, installere og bruke StackReg, men det anbefales. - Bruk verktøyet for interesseregion (ROI) til å velge aktive nevroner under Analyser > verktøy > ROI Manager. Tegn avkastning ved hjelp av ellipse - eller rektangelverktøyene på verktøylinjen, og plasser dem i ROI-filen ved å trykke på Legg til-knappen under Legg til i ROI-behandlingsvinduet, eller ved å trykke på "t" -tasten.
MERK: Pass på at du lagrer avkastningsfilen ofte. Brukere kan alltid gjenopprette avkastningen ved å dra og slippe en ROI-fil i ImageJ og klikke på Vis alle-boksen nederst i ROI Manager-vinduet. Det anbefales ikke å lagre som et overlegg. Av erfaring forenkler lagring som en ROI.zip-fil analysen. - Under Analyser > angi mål kontrollerer du at det er merket av for gjennomsnittlig grå verdi . Fjern merket for alle andre bokser under Angi mål. Bruk flermålingsverktøyet på ROI-administrasjonsmenyen til å beregne intensiteten innenfor avkastningen. Mål intensitet ved hjelp av ROI-vinduet under Mer > Multimeasure.
MERK: Noen ganger vil tilstøtende nevroner være for nær hverandre til å trekke separate avkastninger. Disse nevronene kan ikke brukes til å måle forbigående intensitet, men kan inngå i tellinger av aktiverende nevroner. - Lagre CSV-filen generert av Multimeasure og åpne CSV-filen med hvilken som helst regnearkprogramvare.
MERK: Se tilleggsfil 1 for et eksempel på regnearkmal for å hjelpe analysen. - Beregn Ca 2+ forbigående intensitet som ΔF / F 0 = (F t- F 0) / F 0, hvor Ft er pikselintensiteten i en avkastning på tidspunktet av interesse, og F 0 er grunnlinjeintensiteten bestemt ved å beregne gjennomsnittet av intensiteten til enten 2-4 bilder før Ca 2+ transienten for spontan aktivitet eller de første 1-5 bildene av avkastningen for Ca 2+ transienter som oppstår under stimulering. Ekskluder nevroner som produserer Ca2+ topper før stimulansen og ikke analyser aktivitet etter at stimulansen er avsluttet.
- For Ca2+ forbigående intensitetsanalyse, tilfeldig prøve omtrent like mange nevroner fra hver ganglion for å unngå å forvrenge dataene mot ganglier som produserte det største antallet responderende nevroner. Ekskluder topper der ΔF / F 0 < 0,15.
MERK: Det finnes alternative publiserte metoder for analyse og inkludering/ekskludering av nevroner 11,12,23,24,25,26,27,28. - Mål nevrondiametre ved hjelp av linjeverktøyet på verktøylinjen i ImageJ. Beregn gjennomsnittlig diameter fra linjene trukket langs de lengste og korteste diametrene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4: Representative bilder av L5 dorsalrotganglier av Pirt-GCaMP3-mus. (A,D) Enkeltramme høyoppløselige skanninger av L5 dorsale rotganglier av Pirt-GCaMP3-mus er vist. (B,E) . Gjennomsnittlig intensitetsprojeksjoner av 15 bilder Pirt-GCaMP3 L5 DRG ganglier fra henholdsvis panel A og panel D, i fravær av stimuli. Noen nevroner som produserte spontane Ca2+ transienter kalles ut med gule piler. (C) Gjennomsnittlig intensitetsprojeksjon av to rammer før stimulus og alle fem rammer med stimulus av Pirt-GCaMP3 ganglion fra panel A under 100 g bakpotepresse. Noen nevroner som produserte Ca2+ transienter under stimulansen, kalles ut med gule piler. (F-I) Gjennomsnittlig intensitetsprojeksjoner av ramme 4 og 5 (før stimulus) (panel A og D) og rammer 6-9 (under 100 g pressestimulus) av ganglion fra panel D med rammene 4-6, ramme 4 + 5 + 7, rammer 4 + 5 + 8 og rammer 4 + 5 + 9 av henholdsvis en 100 g bakpotepresse. (J) Fluoresensintensitetsspor av tre spontant aktive nevroner fra panel B (svart) som svarer til panelet A ganglion og panel E (rød) som svarer til panelet D ganglion. Hvert nevrons spor normaliseres til medianintensiteten (vist ved linjen ved Y = 0). (K) ΔF / F0 spor av tre nevroner som aktiveres som respons på 100 g trykk fra panel C (svart) som tilsvarer panelet A ganglion og panelene F-I (rød) som tilsvarer panelet D ganglion. Merk at X- og Y-aksene er annerledes enn i panel J. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Avbildning av et stort antall nevroner ved bruk av konfokal skanning av Pirt-GCaMP L5 DRG
Kirurgisk L5 DRG-eksponering etterfulgt av konfokal mikroskopi tillot at opptil 1,800 nevroner ble avbildet samtidig ved hjelp av Pirt-GCaMP3-mus (figur 4). Dette skaper en kraftig fordel ved samtidig å kunne observere tusenvis av primære sensoriske nevroner i et ensemble på populasjonsnivå i sin normale fysiologiske kontekst, både i kontroll og under unormale forhold. Spontane Ca 2+-transienter i fravær av stimuli (figur 4B, E og film 2) og Ca2+-transienter som respons på stimuli (figur 4C, F-I, film 3 og film 4) kan overvåkes. Diameterne til aktiverende nevroner er sterkt korrelert med forskjellige nervefibergrupper.
Figur 5: Økende intensitet av stimuli forbedrer Ca2+ responser i ganglier av Pirt-GCaMP3 mus. (A) Grafer over antall nevroner i L5 DRG-ganglier som viser Ca2+ transienter som respons på stimuli fra to forskjellige trykkintensiteter vises: 100 g, n = 8 ganglier; 300 g, n = 5. (B) Grafer over ΔF / F0 områder under kurven for prøver av Ca2+ transienter fra to forskjellige trykkintensiteter vises: 100 g, n = 88 nevroner; 300 g, n = 104. (C) Grafer av spor av ΔF / F0 på 100 g og 300 g pressestimuli. Rødt spor er gjennomsnittet ΔF / F0; 100 g, n = 60 nevroner; 300 g, n = 57 nevroner. (D) Grafer over antall nevroner i L5 DRG-ganglier som viser Ca 2+ transienter som respons på tre forskjellige ikke-skadelige og en skadelig temperatur er vist:21 °C, n = 4 ganglier; 10 °C, n = 6; 45 °C, n = 7; 57 °C, n = 3. (E) Grafer over ΔF / F0 områder under kurven for prøver av Ca 2+ transienter fra tre forskjellige ikke-skadelige og en skadelig temperaturstimulusintensiteter vises:21 ° C, n = 40 nevroner; 10 °C, n = 60; 45 °C, n = 61; 57 °C, n = 118. (F) Grafer av spor av ΔF / F0 av 10 ° C og 57 ° C stimuli. Rødt spor er gjennomsnittet ΔF / F0; 10 °C, n = 60 nevroner; 57 °C, n = 118. (G) Graf over prosentandeler av nevroner med forskjellige diametre (<20 μm, 20-25 μm, >25 μm) som produserer Ca2+ transienter spontant og med termiske og mekaniske stimuli. Spontan aktivitet (Spon), n = 5 ganglier; 45 °C, n = 3; 300 g, n = 3. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Søylediagrammer viser gjennomsnittet og SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Antall celler som produserer Ca 2+ transienter og Ca2+ forbigående område under kurven (AUC) i nærvær av stimuli
Sterke stimuli eller skadelig varme økte Ca2+ responser. Sammenlignet med å trykke med 100 g, økte pressing med 300 g antall nevroner som produserte Ca 2+ transienter (figur 5A, Student t-test: t = 2,398, df = 11, p = 0,0354) og ΔF / F 0-området under kurven for Ca 2+ transienter (figur 5B, Welchs t-test: t =3,243, df = 187,4, p =0,0014). Tilsvarende økte varm varme i et ikke-skadelig temperaturområde (21 °C og 45 °C) antall nevroner som produserte Ca 2+ transienter (figur 5C, enveis ANOVA F 2,14 = 4,853, p = 0,0251, etterfulgt av Tukeys q = 4,380, df = 14, p = 0,0202) og ΔF / F0-området under kurven til Ca2+ transienter (figur 5D, Brown-Forsythe ANOVA F 2,151,6 = 60,76, p = 0,0029 etterfulgt av Welchs t-test: t = 3,333, df = 96,72, p = 0,0036). Sammenlignet med en skadelig varmestimulus (57 °C), aktiverte ikke-skadelige temperaturer (21 °C, 10 °C og 45 °C) et mindre antall nevroner som produserte Ca 2+ transienter (figur 5E, enveis ANOVA F 2,16 = 2,513, p < 0,001, Dunnetts test,21 °C: q = 9,594, df = 16, p < 0,001; 10 °C: q = 9,583, df = 16, p <0,001; 45 °C: q = 9,160, df = 16, p < 0,001) og ΔF / F 0 areal under kurven til Ca 2+ transienter ved 21 °C og 10 °C (figur 5D, Brown-Forsythe ANOVA F3,268,4 = 12,98, p < 0,001, Dunnetts T3-test,21 °C: t = 5,415, df = 128, p < 0,001; 10 °C: t = 4,398, df = 174,5, p < 0,001; 45 °C: t = 2,079, df = 161,9, p = 0,1127). I dette eksperimentet produserte nevroner med mindre og middels diameter Ca 2+ transienter spontant og under alle stimuli, men nevroner med større diameter produserte bare Ca2+ transienter som respons på 300 g pressestimulus (figur 5G).
Merking av nevroner som uttrykker spesifikke reseptorer med td-tomat i Pirt-GCaMP3-mus
Den cre-induserbare reporteren td-Tomato kan observeres under Pirt-GCaMP3-avbildning. Pirt-GCaMP3, td-tomatmus som uttrykte Cre under kontroll av TrpV1-promotoren viste bred skala, men ikke universell merking av primære sensoriske nevroner (figur 6A, B). Spontane Ca2+ -transienter ble observert i både td-tomatmerkede nevroner og nevroner som ikke er merket (figur 6C). Skadelig varme ble ikke testet på dette eksperimentet, men vil bli testet i fremtidige eksperimenter.
Figur 6: Merking av TrpV1-positive nevroner med td-tomat i Pirt-GCaMP3-mus. (A) En maksimal intensitetsprojeksjon av spontan aktivitet av primære sensoriske nevroner av en TrpV1-Cre, td-Tomato, Pirt-GCaMP3-mus avbildet kun på 495 nm eksitasjon / 519 nm utslipp (FITC, grønn) kanal. Noen nevroner som produserer Ca2+ transienter kalles ut med gule piler (ikke merket med td-tomat) eller røde piler (merket med td-tomat). (B) En gjennomsnittlig intensitetsprojeksjon av de samme primære sensoriske nevronene som panel A på 592 nm eksitasjon / 614 nm utslipp rød kanal bare. (C) En maksimal intensitetsprojeksjon av samtidige røde og grønne kanaler av de samme primære sensoriske nevronene som i panel A vises. Noen nevroner som uttrykker GCaMP3, men ikke td-Tomato, kalles ut med gule piler. Hvite piler indikerer GCaMP positiv uten Ca2+ transienter og ikke td-Tomat postive. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Film 1: Spontan aktivitet av en Pirt-GCaMP3 ganglion som ikke er riktig jevnet eller optimalisert for optisk skivetykkelse forårsaker bølgete. 70 bilder per sekund AVI. Optisk skivetykkelse = 16 μm. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Film 2: Spontan aktivitet av samme ganglion fra film 1 som er riktig jevnet og optimalisert for optisk skivetykkelse med mindre bølgete. 70 bilder per sekund AVI. Optisk skivetykkelse = 13 μm. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Film 3: 100 g bakpotetrykk av Pirt-GCaMP3 ganglion. 3 bilder per sekund AVI. Stimulus ble påført under rammene 6-10. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Film 4: 45 °C termisk stimulans til baklabb av Pirt-GCaMP3 ganglion. 3 bilder per sekund AVI. Stimulus ble påført under rammene 6-10. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Tilleggsfil 1: Eksempel på regneark for analyse Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vedvarende smerte er tilstede i et bredt spekter av lidelser, svekkende og / eller reduserer livskvaliteten for ca 8% av mennesker29. Primære sensoriske nevroner oppdager skadelige stimuli på huden, og deres plastisitet bidrar til vedvarende smerte8. Mens nevroner kan studeres i cellekultur og eksplanter, fjerner det dem fra sin normale fysiologiske kontekst. Kirurgisk eksponering av DRG, etterfulgt av Pirt-GCaMP3 Ca2+ avbildning, tillater studiet av primære sensoriske nevroner i deres normale fysiologiske sammenheng ved hjelp av stimuli påført bakpoten. En stor fordel med denne metoden for Ca2+ avbildning er at et stort antall nevroner kan overvåkes samtidig. Denne metoden tillater analyse på et populasjonsnivå av modalitet, nevrondiameter og sjeldne fenomener som koblet aktivering 10,11,12,13,14,15,16,17,30, og gir innsikt i normal og patologisk somatosensasjon. I tillegg til nevrondiameter som identifikator, kan spesifikke typer nevroner genetisk merkes med en rød fluorofor som td-tomat for identifikasjon under avbildning. Denne teknikken tillater observasjoner av spesifikke sensoriske modaliteter eller av nevroner som uttrykker spesifikke reseptorer 14,31. Andre bruksområder inkluderer avbildning av andre sensoriske ganglier som trigeminal ganglion24,32 eller geniculate ganglion 23,26 og avbildning av spinal dorsalhorn av primære sensoriske nevroner i explants19,33.
Kritiske trinn i protokollen inkluderer å forhindre overdreven blødning eller blødning på DRG, kontroll av anestesi under avbildning, utjevning av DRG-overflaten, valg av optimal optisk skivetykkelse og forebygging av bevegelse av DRG under påføring av stimuli. Overdreven blødning kan føre til død av dyret eller gjenstander på grunn av fysiologiske effekter av blodtap. Blodtap kan føre til økt lysstyrke (cytoplasmatisk kalsium) over store områder av DRG. Blodtap kan også forårsake nummenhet, redusere antall nevroner som aktiveres som respons på stimuli. Blødning på DRG blokkerer bildebehandling direkte, og begrenser antall nevroner som med hell kan avbildes. Siden anestesi påvirker nevronale aktiviteter og responser, bør et minimalt nivå av isoflurananestesi brukes. Et nivå DRG og optimal optisk skivetykkelse er de mest kritiske delene av prosedyren. Feil utførelse av disse trinnene kan forårsake nevroner og bredde ute av fokus under avbildning (se film 1 og film 2) som vil forvirre analysen eller gjøre analysen umulig. Selv små bevegelser kan gjøre sporing av individuelle nevroner over rammer umulig og / eller skape gjenstander der et nevron ser ut til å bli mørkere eller lysere, noe som forårsaker betydelige feil.
Systemet som beskrives her har også noen betydelige begrensninger. Anestesi forstyrrer nevron og glial Ca 2+ responser25. Fordi denne metoden er terminal, kan ikke det samme dyret overvåkes over flere eksperimenter. Ca2+ transienter er en indirekte proxy for nevronavfyring og aktivitet. Denne metoden bruker Ca2+ transienter som en proxy for handlingspotensialer. Imidlertid kan andre signaler som Gq-protein eller ryanodinreseptorsignalering endre cytoplasmatisk Ca2+ konsentrasjoner34,35,36. Andre mekanismer har ikke blitt rapportert å forårsake Ca2+ transienter i DRG-nevroner. Imidlertid er anvendelse av kjemiske stimuli til poten kjent for å øke Ca2+ i spinal dorsal horn astrocytter36.
Avslutningsvis er intakt DRG Pirt-GCaMP3 Ca2+ avbildning et kraftig verktøy for å studere somatosensasjon under normale og patologiske forhold. Resultatene vist her er representative for normale kontrollmus. Kontrollmus kan sammenlignes med smerte- og sykdomsmodeller eller genetiske mutanter 10,15,17,30,31,37. Videre kan metoden som presenteres her tilpasses andre genetisk kodede Ca2+ indikatorer 10,11,16 og brukes til å avbilde andre sensorer som spenningsføling38,39,40 og syklisk adenosinmonofosfatavkjenning 41. Mens konfokalmikroskopi ble brukt i denne studien, kan to-foton mikroskopi også brukes11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grants R01DE026677 og R01DE031477 (til YSK), UTHSCSA oppstartsfond (YSK), og en Rising STAR Award fra University of Texas-systemet (YSK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anased Injection (Xylazine) | Covetrus, Akorn | 33197 | |
| C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC | Cal Zeiss | 422642-9900-000 | |
| Cotton Tipped Applicators | McKesson | 24-106-1S | |
| Curved Hemostat | Fine Science Tools | 13007-12 | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| DC Temperature Controller Heating Pad | FHC | 40-90-2-05 | |
| Dumont Ceramic Coated Forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| FHC DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Fluriso (Isoflurane) | MWI Animal Health, Piramal Group | 501017 | |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16221-14 | |
| GelFoam | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Ketaset (Ketamine) | Zoetis | KET-00002R2 | |
| Luminescent Green Stage Tape | JSITON/ Amazon | B803YW8ZWL | |
| Matrx VIP 3000 Isoflurane Vaporizer | Midmark | 91305430 | |
| Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Micro dissecting spring scissors | Fine Science Tools | 15023-10 | |
| Micro dissecting spring scissors | Roboz | RS-5677 | |
| Mini Rectal Thermistor Probe | FHC | 40-90-5D-02 | |
| Operating scissors | Roboz | RS-6812 | |
| Pirt-GCaMP3 C57BL/6J mice | Johns Hopkins University | N/A | Either sex can be imaged equally well. Mice should be at least 8 weeks old due to weak or intermittent Pirt promoter expression in younger mice. |
| SMALGO small animal algometer | Bioseb In vivo Research Instruments | BIO-SMALGO | |
| Stereotaxic frame | Kopf Model 923-B | 923-B | |
| td-Tomato C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 7909 | |
| Top Plate, 6 in x 10 in | Newport | 290-TP | |
| TrpV1-Cre C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 17769 | |
| Zeiss LSM 800 confocal microscope | Cal Zeiss | LSM800 | |
| Zeiss Zen 2.6 Blue Edition Software | Cal Zeiss | Zen (Blue Edition) 2.6 |
References
- Rivero-Melián, C., Grant, G. Distribution of lumbar dorsal root fibers in the lower thoracic and lumbosacral spinal cord of the rat studied with choleragenoid horseradish peroxidase conjugate. The Journal of Comparative Neurology. 299 (4), 470-481 (1990).
- Wessels, W. J., Marani, E. A rostrocaudal somatotopic organization in the brachial dorsal root ganglia of neonatal rats. Clinical Neurology and Neurosurgery. 95, 3-11 (1993).
- Schmalbruch, H. The number of neurons in dorsal root ganglia L4-L6 of the rat. The Anatomical Record. 219 (3), 315-322 (1987).
- Sørensen, B., Tandrup, T., Koltzenburg, M., Jakobsen, J. No further loss of dorsal root ganglion cells after axotomy in p75 neurotrophin receptor knockout mice. The Journal of Comparative Neurology. 459 (3), 242-250 (2003).
- Basbaum, A. I., Woolf, C. J. Pain. Current Biology. 9 (12), 429-431 (1999).
- Liu, Y., Ma, Q. Generation of somatic sensory neuron diversity and implications on sensory coding. Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 52-60 (2011).
- Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139 (2), 267-284 (2009).
- Stucky, C. L., Mikesell, A. R. Cutaneous pain in disorders affecting peripheral nerves. Neuroscience Letters. 765, 136233 (2021).
- Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. Calcium imaging for analgesic drug discovery. Neurobiology of Pain. 11, 100083 (2022).
- Chen, Z., et al. Adjacent intact nociceptive neurons drive the acute outburst of pain following peripheral axotomy. Scientific Reports. 9 (1), 7651 (2019).
- Chisholm, K. I., Khovanov, N., Lopes, D. M., La Russa, F., McMahon, S. B. Large scale in vivo recording of sensory neuron activity with GCaMP6. eNeuro. 5 (1), (2018).
- Emery, E. C., et al. In vivo characterization of distinct modality-specific subsets of somatosensory neurons using GCaMP. Science Advances. 2 (11), 1600990 (2016).
- Ishida, H., et al. In vivo calcium imaging visualizes incision-induced primary afferent sensitization and its amelioration by capsaicin pretreatment. The Journal of Neuroscience. 41 (41), 8494-8507 (2021).
- Kim, Y. S., et al. Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- MacDonald, D. I., et al. Silent cold-sensing neurons contribute to cold allodynia in neuropathic pain. Brain. 144 (6), 1711-1726 (2021).
- Wang, F., et al. Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold. Cell Reports. 23 (7), 2001-2013 (2018).
- Kucharczyk, M. W., et al. The impact of bone cancer on the peripheral encoding of mechanical pressure stimuli. Pain. 161 (8), 1894-1905 (2020).
- Kim, A. Y., et al. a phosphoinositide-binding protein, functions as a regulatory subunit of TRPV1. Cell. 133 (3), 475-485 (2008).
- Kim, Y. S., et al. Central terminal sensitization of TRPV1 by descending serotonergic facilitation modulates chronic pain. Neuron. 81 (4), 873-887 (2014).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Mahadevan, A. S., et al. cytoNet: Spatiotemporal network analysis of cell communities. PLoS Computational Biology. 18 (6), 1009846 (2022).
- Barretto, R. P., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).
- Leijon, S. C. M., et al. Oral thermosensing by murine trigeminal neurons: modulation by capsaicin, menthol and mustard oil. The Journal of Physiology. 597 (7), 2045-2061 (2019).
- Sekiguchi, K. J., et al. Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice. Nature Communications. 7, 11450 (2016).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6, 8171 (2015).
- Ran, C., Hoon, M. A., Chen, X. The coding of cutaneous temperature in the spinal cord. Nature Neuroscience. 19 (9), 1201-1209 (2016).
- Yarmolinsky, D. A., et al. Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system. Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).
- Torrance, N., Smith, B. H., Bennett, M. I., Lee, A. J. The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey. The Journal of Pain. 7 (4), 281-289 (2006).
- Shannonhouse, J., et al. Meclizine and metabotropic glutamate receptor agonists attenuate severe pain and Ca(2+) activity of primary sensory neurons in chemotherapy-induced peripheral neuropathy. The Journal of Neuroscience. 42 (31), 6020-6037 (2022).
- Luiz, A. P., et al. Cold sensing by Na(V)1.8-positive and Na(V)1.8-negative sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3811-3816 (2019).
- Hartung, J. E., Gold, M. S. GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons. Cell Calcium. 89, 102225 (2020).
- Chung, M. K., Wang, S., Oh, S. L., Kim, Y. S. Acute and chronic pain from facial skin and oral mucosa: Unique neurobiology and challenging treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5810 (2021).
- Chan, S. L., Mayne, M., Holden, C. P., Geiger, J. D., Mattson, M. P. Presenilin-1 mutations increase levels of ryanodine receptors and calcium release in PC12 cells and cortical neurons. The Journal of Biological Chemistry. 275 (24), 18195-18200 (2000).
- Sierra, D. A., Popov, S., Wilkie, T. M. Regulators of G-protein signaling in receptor complexes. Trends in Cardiovascular Medicine. 10 (6), 263-268 (2000).
- Yoshihara, K., et al. Astrocytic Ca(2+) responses in the spinal dorsal horn by noxious stimuli to the skin. Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 101-104 (2018).
- Tan, C. H., McNaughton, P. A. The TRPM2 ion channel is required for sensitivity to warmth. Nature. 536 (7617), 460-463 (2016).
- Akemann, W., Mutoh, H., Perron, A., Rossier, J., Knöpfel, T. Imaging brain electric signals with genetically targeted voltage-sensitive fluorescent proteins. Nature Methods. 7 (8), 643-649 (2010).
- Gong, Y., et al. High-speed recording of neural spikes in awake mice and flies with a fluorescent voltage sensor. Science. 350 (6266), 1361-1366 (2015).
- Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision. Nature Methods. 7 (5), 399-405 (2010).
- Harada, K., et al. Red fluorescent protein-based cAMP indicator applicable to optogenetics and in vivo imaging. Scientific Reports. 7 (1), 7351 (2017).
