Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

تمايز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات إلى مجموعات الجزر المنتجة للأنسولين

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/64840
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2, 3, 1,2,4
1Department of Cellular & Physiological Sciences, Life Science Institute, University of British Columbia, 2School of Biomedical Engineering, University of British Columbia, 3STEMCELL Technologies Inc, 4Department of Surgery, University of British Columbia
* These authors contributed equally

Summary

يوفر تمايز الخلايا الجذعية إلى خلايا جزرية حلا بديلا لعلاج مرض السكري التقليدي ونمذجة الأمراض. وصفنا بروتوكولا مفصلا لزراعة الخلايا الجذعية يجمع بين مجموعة تمايز تجارية وطريقة تم التحقق من صحتها مسبقا للمساعدة في إنتاج الجزر المشتقة من الخلايا الجذعية التي تفرز الأنسولين في طبق.

Abstract

يوفر تمايز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) إلى خلايا بيتا التي تفرز الأنسولين مادة للتحقيق في وظيفة خلايا بيتا وعلاج مرض السكري. ومع ذلك ، لا تزال هناك تحديات في الحصول على خلايا بيتا المشتقة من الخلايا الجذعية التي تحاكي بشكل كاف خلايا بيتا البشرية الأصلية. بناء على الدراسات السابقة ، تم إنشاء خلايا جزرية مشتقة من hPSC لإنشاء بروتوكول مع تحسين نتائج التمايز والاتساق. يستخدم البروتوكول الموصوف هنا مجموعة سلفية للبنكرياس خلال المراحل 1-4 ، متبوعا ببروتوكول معدل من ورقة نشرت سابقا في عام 2014 (تسمى "بروتوكول R" فيما بعد) خلال المراحل 5-7. يتم تضمين الإجراءات التفصيلية لاستخدام مجموعة السلف البنكرياسي وألواح microwell بقطر 400 ميكرومتر لتوليد مجموعات السلف البنكرياسي ، وبروتوكول R لتمايز الغدد الصماء في شكل تعليق ثابت 96 بئرا ، والتوصيف في المختبر والتقييم الوظيفي للجزر المشتقة من hPSC. يستغرق البروتوكول الكامل 1 أسبوع لتوسيع hPSC الأولي متبوعا ب ~ 5 أسابيع للحصول على جزر hPSC المنتجة للأنسولين. يمكن للأفراد الذين لديهم تقنيات زراعة الخلايا الجذعية الأساسية والتدريب على المقايسات البيولوجية إعادة إنتاج هذا البروتوكول.

Introduction

تفرز خلايا بيتا البنكرياسية الإنسولين استجابة لارتفاع مستويات الجلوكوز في الدم. عادة ما يتم علاج المرضى الذين يفتقرون إلى إنتاج الأنسولين الكافي بسبب تدمير المناعة الذاتية لخلايا بيتا في مرض السكري من النوع الأول (T1D) 1 ، أو بسبب خلل خلايا بيتا في مرض السكري من النوع 2 (T2D) 2 ، بإعطاء الأنسولين الخارجي. على الرغم من هذا العلاج المنقذ للحياة ، فإنه لا يمكن أن يتطابق بدقة مع التحكم الرائع في نسبة الجلوكوز في الدم كما يتحقق من خلال إفراز الأنسولين الديناميكي من خلايا بيتا حسنة النية. على هذا النحو ، غالبا ما يعاني المرضى من عواقب نوبات نقص السكر في الدم التي تهدد الحياة والمضاعفات الأخرى الناتجة عن رحلات ارتفاع السكر في الدم المزمنة. ينجح زرع الجزر البشرية في استعادة السيطرة الصارمة على نسبة السكر في الدم لدى مرضى T1D ولكنه محدود بسبب توفر المتبرعين بالجزر والصعوبات في تنقية الجزر الصحية للزرع 3,4. يمكن حل هذا التحدي ، من حيث المبدأ ، باستخدام hPSCs كمواد انطلاق بديلة.

غالبا ما تهدف الاستراتيجيات الحالية لتوليد الجزر التي تفرز الأنسولين من hPSCs في المختبر إلى محاكاة عملية تطور البنكرياس الجنيني في الجسم الحي 5,6. وهذا يتطلب معرفة مسارات الإشارات المسؤولة والإضافة الموقوتة للعوامل القابلة للذوبان المقابلة لمحاكاة المراحل الحرجة من البنكرياس الجنيني النامي. يبدأ برنامج البنكرياس بالالتزام في الأديم الباطن النهائي ، والذي يتميز بعوامل النسخ صندوق شوكة A2 (FOXA2) ومنطقة تحديد الجنس Y-box 17 (SOX17) 7. يتضمن التمايز المتتالي للأديم الباطن النهائي تكوين أنبوب أمعاء بدائي ، ونمط في الأمعاء الأمامية الخلفية التي تعبر عن الصندوق المثلي للبنكرياس والاثني عشر 1 (PDX1) 7،8،9 ، والتوسع الظهاري في أسلاف البنكرياس التي تعبر عن PDX1 و NK6 homeobox 1 (NKX6.1) 10,11.

يرافق المزيد من الالتزام بخلايا جزيرة الغدد الصماء التعبير العابر للمنظم الرئيسي المؤيد للغدد الصماء neurogenin-3 (NGN3) 12 والحث المستقر لعوامل النسخ الرئيسية التمايز العصبي 1 (NEUROD1) و NK2 homeobox 2 (NKX2.2) 13. تتم برمجة الخلايا الرئيسية المعبرة عن الهرمونات ، مثل خلايا بيتا المنتجة للأنسولين ، وخلايا ألفا المنتجة للجلوكاجون ، وخلايا دلتا المنتجة للسوماتوستاتين ، وخلايا PPY المنتجة للببتيد البنكرياس. مع هذه المعرفة ، بالإضافة إلى الاكتشافات من دراسات فحص الأدوية المكثفة وعالية الإنتاجية ، مكنت التطورات الحديثة من توليد جزر hPSC بخلايا تشبه خلايا بيتا قادرة على إفراز الأنسولين14،15،16،17،18،19.

تم الإبلاغ عن بروتوكولات تدريجية لتوليد خلايا بيتا المستجيبة للجلوكوز6،14،18،19. بناء على هذه الدراسات ، يتضمن البروتوكول الحالي استخدام مجموعة سلفية للبنكرياس لتوليد خلايا سلف البنكرياس PDX1 + / NKX6.1 + في ثقافة مستوية ، متبوعة بتجميع صفائح microwell في مجموعات موحدة الحجم والمزيد من التمايز نحو جزر hPSC التي تفرز الأنسولين مع بروتوكول R في ثقافة تعليق 3D ثابتة. يتم إجراء تحليلات مراقبة الجودة ، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي ، والتلطيخ المناعي ، والتقييم الوظيفي ، من أجل التوصيف الدقيق للخلايا المميزة. تقدم هذه الورقة وصفا تفصيليا لكل خطوة من خطوات التمايز الموجه وتحدد مناهج التوصيف في المختبر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يعتمد هذا البروتوكول على العمل مع خطوط hPSC ، بما في ذلك H1 و HUES4 PDXeG و Mel1 INSGFP / W ، في ظروف خالية من وحدة التغذية. يتم تفصيل إجراء خطوة بخطوة في هذا القسم ، مع بيانات داعمة من تمايز Mel1 INSGFP / W في قسم النتائج التمثيلية. نوصي بالحاجة إلى مزيد من التحسين عند العمل مع خطوط hPSC الأخرى غير المذكورة هنا. انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع الكواشف والحلول المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. إعداد وسائط التمايز والحلول

ملاحظة: انظر الجدول 1 للاطلاع على جميع الحلول التي يتعين إعدادها والجدول 2 للاطلاع على وسائط التمايز.

  1. تحضير جميع الوسائط والكواشف لزراعة الخلايا في خزانة معقمة للسلامة البيولوجية. قم بتسخين المحاليل المتعلقة بزراعة الخلايا والوسائط القاعدية لفترة وجيزة إلى 37 درجة مئوية في الحمام قبل الاستخدام.
    ملاحظة: كما هو موضح أدناه ، اصنع وسائط تمايز جديدة يوميا عن طريق إضافة المكملات الغذائية واستخدامها في نفس اليوم. بدلا من ذلك ، توفر مجموعة السلف البنكرياس خيار تحضير حجم أكبر مسبقا يمكن استخدامه على مدار عدة أيام وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. كلتا الطريقتين لإعداد وسائل الإعلام تثبت أنها تعمل بشكل جيد. لاحظ أنه لا ينصح بترك الوسائط لفترة طويلة في الحمام المائي. عند تحضير الوسائط الطازجة كل يوم ، يوصى بتناول مكملات القسمة لتجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة.

2. تمايز hPSCs إلى خلايا سلف البنكرياس

  1. حافظ على hPSCs غير المتمايزة على الأوعية المطلية ب Matrigel في mTeSR1 وسط كامل وقم بإجراء تغييرات متوسطة يوميا. أثناء ثقافة الصيانة ، تمر hPSCs كل 3-4 أيام عندما تصل الخلايا إلى التقاء ~ 70٪ باستخدام كاشف تفكك الخلايا باتباع بروتوكول الشركة المصنعة. لبدء التمايز ، قم بفصل الخلايا إلى خلايا مفردة وزرعها على ألواح معالجة بزراعة الأنسجة من 6 آبار أو 12 بئرا (بأحجام وسائط تبلغ 2 مل أو 1 مل لكل بئر ، على التوالي).
    ملاحظة: انظر الجدول 1 للحصول على التعليمات المتعلقة بتخزين الوسط القاعدي للأديم الباطن وقساماته.
  2. قم بطلاء آبار الاستزراع باستخدام Matrigel المؤهل من hESC (المخفف في DMEM / F12 المثلج البارد على النحو الموصى به من قبل بروتوكول الشركة المصنعة) ووضع اللوحة في حاضنة CO 2 رطبة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 30 دقيقة.
  3. انقل اللوحة المطلية ب Matrigel إلى درجة حرارة الغرفة (استخدمها في غضون 3 ساعات).
  4. نضح الوسيط المستهلك من ثقافة hPSC واشطفه مرة واحدة باستخدام DPBS. فصل ثقافة hPSC إلى خلايا مفردة مع إنزيم تفكك الخلية عند 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق. اشطف الخلايا بإضافة وسط DMEM / F12 دافئ ، وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل أو 50 مل ، ثم قم بتدويرها على × 300 جم لمدة 5 دقائق.
  5. أعد تعليق حبيبات الخلية بوسط كامل للخلايا الجذعية بالإضافة إلى 10 ميكرومتر Y-27632 وقم بإجراء عد الخلايا الحية (التريبان الأزرق السلبي) باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي. نضح Matrigel المخفف وزرع الخلايا الحية على الفور بكثافة 1.60-1.80 × 105 / سم 2 على آبار مغطاة ب Matrigel واحتضانهافي حاضنة CO2 رطبة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. انتقل إلى المرحلة 1.
    ملاحظة: سيؤدي ذلك إلى ~ 95٪ بدء التقاء لبدء التمايز. وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ، يوصى بكثافة بذر تبلغ 2.6 × 105 / سم2 . يوصى باختبار كثافات البذر المختلفة لتحديد القيمة المثلى لخط الخلية والتحقق من صلاحية الخلية. إذا كانت الجدوى أقل من 80٪ ، فلا تتابع التمايز. يمكن أن يكون انخفاض صلاحية الخلية نتيجة لفرط الهضم أو الإفراط في الحفر أثناء الحصاد أو ترك الخلايا لفترة طويلة في وسط DMEM / F12 قبل البذر.
  6. في المرحلة 1 اليوم الأول ، قم بتدفئة الأديم الباطن القاعدي لفترة وجيزة إلى 37 درجة مئوية في الحمام وإذابة مكمل MR و CJ. تحضير المرحلة 1A المتوسطة عن طريق إضافة ملحق MR و CJ إلى الوسط القاعدي الأديم الباطن. تخلط جيدا وتستخدم على الفور.
  7. نضح الوسط المستهلك من الآبار ، وأضف وسط المرحلة 1A واحتضانه في حاضنة CO 2 رطبة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: خطوات الغسيل غير ضرورية. قم بإزالة أي خلايا غير متصلة من المزرعة عن طريق هز لوحة الثقافة برفق قبل التبادل المتوسط. تجنب تعطيل الطبقة الأحادية عن طريق عدم لمس طرف الماصة إلى أسفل البئر أثناء الإزالة المتوسطة ومن خلال الإضافة المتوسطة اللطيفة.
  8. في المرحلة 1 اليوم 2 ، قم بتسخين الوسط القاعدي للأديم الباطن لفترة وجيزة في حمام 37 درجة مئوية وإذابة مكمل CJ. تحضير المرحلة 1B المتوسطة عن طريق إضافة الملحق CJ إلى الوسط القاعدي الأديم الباطن. تخلط جيدا وتستخدم على الفور.
  9. استنشاق الوسط المستهلك من الآبار ، وإضافة وسط المرحلة 1B ، واحتضانفي حاضنة CO 2 رطبة 37 درجة مئوية ، 5٪ لمدة 24 ساعة.
  10. في المرحلة 1 اليوم 3 ، كرر الخطوات 2.8-2.9. انتقل إلى المرحلة 2.
  11. في المرحلة 2 اليوم الأول ، دافئ البنكرياس المرحلة 2-4 القاعدية المتوسطة في حمام 37 درجة مئوية وذوبان الجليد الملحق 2A و 2B. تحضير المرحلة 2A المتوسطة عن طريق إضافة الملحق 2A و 2B إلى البنكرياس المرحلة 2-4 القاعدية الوسطى. تخلط جيدا وتستخدم على الفور.
  12. نضح الوسط المستهلك من الآبار ، وأضف وسط المرحلة 2A ، واحتضانه في حاضنة CO 2 رطبة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.
  13. في المرحلة 2 اليوم الثاني ، دافئ البنكرياس المرحلة 2-4 القاعدية المتوسطة في حمام 37 درجة مئوية وذوبان الجليد الملحق 2B. تحضير المرحلة 2B المتوسطة عن طريق إضافة الملحق 2B إلى البنكرياس المرحلة 2-4 القاعدية المتوسطة. تخلط جيدا وتستخدم على الفور.
  14. نضح الوسط المستهلك من الآبار ، وأضف وسط المرحلة 2B ، واحتضن في حاضنة CO 2 رطبة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.
  15. في المرحلة 2 اليوم 3، كرر الخطوات 2.13-2.14. انتقل إلى المرحلة 3.
  16. في المرحلة 3 اليوم 1 ، دافئ البنكرياس المرحلة 2-4 القاعدية المتوسطة في حمام 37 درجة مئوية وذوبان الجليد الملحق 3. قم بإعداد المرحلة 3 المتوسطة عن طريق إضافة الملحق 3 إلى المرحلة البنكرياسية 2-4 الوسط القاعدي. تخلط جيدا وتستخدم على الفور.
  17. نضح الوسط المستهلك من الآبار ، وأضف وسط المرحلة 3 ، واحتضانهفي حاضنة CO 2 رطبة 37 درجة مئوية ، 5٪ لمدة 24 ساعة.
  18. في المرحلة 3 اليوم 2 واليوم 3 ، كرر الخطوات 2.16-2.17. انتقل إلى المرحلة 4.
  19. في المرحلة 4 اليوم 1 ، دافئ البنكرياس المرحلة 2-4 القاعدية المتوسطة في حمام 37 درجة مئوية وذوبان الجليد الملحق 4. قم بإعداد المرحلة 4 المتوسطة عن طريق إضافة الملحق 4 إلى المرحلة 2-4 من البنكرياس القاعدية. تخلط جيدا وتستخدم على الفور.
  20. نضح الوسط المستهلك من الآبار ، وأضف وسط المرحلة 4 ، واحتضن في حاضنة CO2 رطبة 37 درجة مئوية ، 5٪ لمدة 24 ساعة.
  21. في المرحلة 4 من اليوم الثاني إلى اليوم 4 ، كرر الخطوات 2.19-2.20. انتقل إلى خطوات التجميع.

3. التجميع في مجموعات السلف البنكرياس باستخدام ألواح ميكروويل قطرها 400 ميكرومتر

  1. في المرحلة 4 ، اليوم 5 ، قم بمعالجة الآبار الدقيقة (على سبيل المثال ، شكل لوحة 24 بئرا) ب 500 ميكرولتر من محلول الشطف المضاد للالتصاق لكل بئر.
  2. قم بإعداد لوحة التوازن وأجهزة الطرد المركزي للوحة microwell عند 1300 × جم لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: افحص اللوحة تحت المجهر للتأكد من عدم ترك فقاعات في الآبار الدقيقة. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 5 دقائق أخرى إذا ظلت الفقاعات محاصرة في أي آبار صغيرة.
  3. نضح محلول الشطف المضاد للالتصاق من الآبار واشطفه مرة واحدة باستخدام 1 مل من DPBS. نضح DPBS من الآبار وإضافة 1 مل من وسط التجميع إلى كل بئر.
  4. قم بإزالة الوسط المستهلك من مزارع سلف البنكرياس واغسله مرة واحدة باستخدام DPBS. فصل الثقافات إلى خلايا مفردة مع كاشف التفكك عند 37 درجة مئوية لمدة 10-12 دقيقة. اشطف الخلايا باستخدام DMEM / F12 الدافئ ، وانقلها إلى أنبوب ، ثم قم بتدويرها بمعدل 300 × جم لمدة 5 دقائق.
  5. أعد تعليق حبيبات الخلية في وسط التجميع وقم بإجراء عد الخلايا الحية. قم بزراعة 2.4-3.6 مليون خلية إجمالية لكل بئر (أي 2000-3000 خلية لكل ميكروويل) وإضافة وسط تجميع لكل بئر لتحقيق حجم نهائي قدره 2 مل لكل بئر.
  6. ماصة بلطف الخلايا صعودا وهبوطا عدة مرات مع طرف ماصة P1000 لضمان التوزيع المتساوي للخلايا في جميع أنحاء البئر. لا تدخل الفقاعات في الآبار الصغيرة. أجهزة الطرد المركزي لوحة microwell في 300 × غرام لمدة 5 دقائق لالتقاط الخلايا في microwells. احتضان صفيحة microwellفي حاضنة CO 2 رطبة 37 درجة مئوية ، 5٪ لتجميع 24 ساعة وانتقل إلى المراحل 5-7 التمايز.
    ملاحظة: احرص على عدم إزعاج اللوحة أثناء وقت التجميع. قد تكون هناك حاجة إلى ما يصل إلى 48 ساعة من وقت الحضانة لتشكيل الركام الأمثل.

4. تمايز مجموعات السلف البنكرياس المشتقة من المجموعة إلى جزر hPSC

  1. في المرحلة 5 اليوم الأول ، قم بتسخين المرحلة 5-7 من الوسط القاعدي في حمام 37 درجة مئوية ومكملات الذوبان (انظر الجدول 1 والجدول 2). قم بإعداد المرحلة 5 المتوسطة عن طريق إضافة المكملات الغذائية (إلى تركيزات العمل النهائية) إلى المرحلة 5-7 الوسط القاعدي. تخلط جيدا وتستخدم على الفور.
  2. بعد تكوين الركام ، قم بسحب الركام برفق لأعلى ولأسفل عدة مرات باستخدام طرف ماصة P1000 لتعويم أي خلايا غير مجمعة. اسمح للمجاميع بالاستقرار عن طريق الجاذبية (انتظر ~ 1 دقيقة). قم بإزالة الوسط المستهلك برفق (الذي يحتوي على الخلايا العائمة غير المجمعة) من البئر قدر الإمكان مع تجنب استنشاق الركام.
  3. قم بتوزيع المرحلة 5 المتوسطة الطازجة بقوة على سطح لوحة البئر الدقيقة لإزاحة الركام من الآبار الدقيقة. نقل الركام إلى مرفق منخفض للغاية (ULA) 6 آبار. اشطفها مرة واحدة باستخدام وسيط المرحلة 5 لاسترداد الركام بالكامل من الآبار الدقيقة.
  4. اجمع كل الركام في آبار ULA 6 ، وأعد تعليق الركام في وسط المرحلة 5 ، واضبط الكثافة إلى 20 مجموعة لكل 100 ميكرولتر (على سبيل المثال ، من المتوقع استرداد ~ 1200 مجموعة من كل بئر. إعادة تعليق 1200 مجموعة في 6 مل من وسط المرحلة 5). استخدم ماصة متعددة القنوات لتوزيع 50 ميكرولتر من وسط المرحلة 5 في كل بئر من لوحة ULA ذات القاع المسطح 96 بئرا. املأ آبار الزاوية والحافة ب 200 ميكرولتر من DPBS.
    ملاحظة: تجنب استخدام الآبار الطرفية لزراعة الركام لأنها عرضة لمزيد من التبخر ؛ بخلاف ذلك ، استخدم صفيحة 96 بئرا مصممة لتقليل التبخر على طول الحواف (على سبيل المثال ، ألواح 96 بئرا مع خنادق مدمجة) أو ضع لوحة الاستزراع في حاضنة زراعة خلايا مناخية عالية الرطوبة.
  5. أضف 100 ميكرولتر من إعادة التعليق العنقودي إلى كل بئر من صفيحة ULA ذات القاع المسطح 96 بئرا ، مما ينتج عنه إجمالي 150 ميكرولتر وسط استزراع يحتوي على متوسط 20 مجموعة لكل بئر.
    ملاحظة: امزج إعادة تعليق الكتلة برفق في كل مرة قبل الاستغناء عنها في 96 بئرا.
  6. ضع ألواح الاستزراع على سطح مستوفي حاضنة CO 2 مرطبة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  7. في المرحلة 5 اليوم 2 ، قم بإعداد المرحلة 5 المتوسطة باتباع الخطوة 4.1.
  8. استخدم ماصة متعددة القنوات لإزالة ~ 90 ميكرولتر من الوسط المستهلك من كل بئر ، وقم بالتحديث باستخدام 100 ميكرولتر من وسيط المرحلة 5.
  9. في المرحلة 5 اليوم 3 ، كرر الخطوات 4.7-4.8. انتقل إلى المرحلة 6.
  10. في المرحلة 6 اليوم الأول ، قم بتسخين المرحلة 5-7 من الوسط القاعدي في حمام 37 درجة مئوية ومكملات الذوبان (انظر الجدول 1 والجدول 2). قم بإعداد المرحلة 6 المتوسطة عن طريق إضافة المكملات الغذائية (إلى تركيزات العمل النهائية) إلى المرحلة 5-7 الوسط القاعدي. تخلط جيدا وتستخدم على الفور.
  11. استخدم ماصة متعددة القنوات لإزالة ~ 90 ميكرولتر من الوسط المستهلك والتحديث ب 100 ميكرولتر من وسيط المرحلة 6 لكل بئر.
  12. في المرحلة 6 من اليوم 2 إلى اليوم 8 ، كرر الخطوات 4.10-4.11. انتقل إلى المرحلة 7.
  13. في المرحلة 7 اليوم الأول ، يسخن الوسط القاعدي للمرحلة 5-7 في حمام 37 درجة مئوية ومكملات الذوبان (انظر الجدول 1 والجدول 2). قم بإعداد وسط المرحلة 7 عن طريق إضافة مكملات (إلى تركيزات العمل النهائية) إلى الوسط القاعدي للمرحلة 5-7. تخلط جيدا وتستخدم على الفور.
  14. استخدم ماصة متعددة القنوات لإزالة ~ 90 ميكرولتر من الوسط المستهلك والتحديث ب 100 ميكرولتر من وسط المرحلة 7 لكل بئر.
  15. في المرحلة 7 من اليوم 2 إلى اليوم 12 ، كرر الخطوات 4.13-4.14. انتقل إلى التوصيف في المختبر .

5. تحليل التدفق الخلوي

  1. قم بإزالة وسائط الثقافة واغسلها مرة واحدة باستخدام DPBS. فصل الثقافات (الخلايا السلفية المستوية أو المجموعات المتمايزة) إلى خلايا مفردة مع كاشف التفكك عن طريق الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 10-12 دقيقة. يشطف بمحلول FACS ويعصر على حرارة 300 × جم لمدة 5 دقائق.
  2. أعد تعليق حبيبات الخلية في المخزن المؤقت FACS وقم بإجراء عد الخلايا. تدور الخلايا على 300 × غرام لمدة 5 دقائق. أعد تعليق الخلايا المفردة في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت Fix / Perm لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: أحضر المخزن المؤقت Fix / Perm إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. يحتوي المخزن المؤقت Fix / Perm على بارافورمالدهيد (PFA). تعامل بعناية مع PFA في غطاء دخان وتخلص منه وفقا للإرشادات المؤسسية.
  3. قم بالدوران عند 500 × جم لمدة 3 دقائق ، واغسله مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من 1x Perm / Wash buffer ، ثم أعد التعليق في 300 ميكرولتر من 1x Perm / Wash buffer. نقل 100 ميكرولتر من إعادة التعليق أحادي الخلية (يحتوي كل منها على 2.5-3 × 105 خلايا) إلى ثلاثة أنابيب ميكروفوج للتحكم غير الملوث ، والتحكم في النمط المتماثل ، وتلطيخ الأجسام المضادة (انظر جدول المواد للحصول على عينة من الأجسام المضادة ومعلومات التخفيف). احتضان لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتغطي مع احباط.
  4. تدور في 500 × غرام لمدة 3 دقائق. يغسل مرتين مع 500 ميكرولتر من 1x بيرم / غسل العازلة. إعادة تعليق العينات في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS وتحليل الخلايا الملطخة (انظر جدول المواد لتلطيخ العلامات داخل الخلايا في مراحل محددة) باستخدام مقياس التدفق الخلوي والبرنامج (على سبيل المثال ، FlowJo).
    ملاحظة: إذا لم يتم فحص العينات على الفور ، فقم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية محمية من الضوء. بالنسبة لاستراتيجية البوابات ، يتم أولا بوابات بيانات التدفق بواسطة خصائص التشتت (FSC-A و SSC-A) لإزالة الحطام الخلوي الصغير متبوعا بخصائص عرض FSC-A و FSC لتحديد المفردات. يتم تحديد البوابات الإيجابية والسلبية من خلال ضوابط الخلايا الجذعية و / أو ضوابط النمط المتماثل غير الملوثة.

6. كامل جبل المناعي

  1. جمع العناقيد في أنبوب microfuge. تسوية المجموعات عن طريق الجاذبية. نضح الوسط المستهلك وشطف مرة واحدة مع 1 مل من برنامج تلفزيوني (مع الكالسيوم والمغنيسيوم). ثبت المجموعات ب 1 مل من 4٪ PFA عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
  2. شطف مرة واحدة مع PBST وتخلل 20-30 مجموعة مع 500 ميكرولتر من 0.3٪ TritonX-100 في أنبوب microfuge في درجة حرارة محيطة لمدة 6 ساعات على الأقل على شاكر مائل.
    ملاحظة: هناك حاجة إلى وقت نفاذية أطول (حتى 24 ساعة) للمجموعات الكبيرة.
  3. احتضان المجموعات في 100 ميكرولتر من العازلة المانعة في درجة الحرارة المحيطة لمدة 1 ساعة على شاكر مائل. قم بإزالة المخزن المؤقت المانع واحتضان المجموعات ب 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة في محلول تخفيف الأجسام المضادة في درجة الحرارة المحيطة طوال الليل على شاكر مائل.
    ملاحظة: إذا كانت الخلفية قوية أثناء التصوير ، فقم باحتضانها بالأجسام المضادة الأولية عند 4 درجات مئوية.
  4. اغسل 3 × 30 دقيقة باستخدام 500 ميكرولتر من PBST جيدا على شاكر إمالة (زاوية الميل مضبوطة على 8 ، السرعة مضبوطة على 20).
  5. احتضان المجموعات ب 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية في مخزن تخفيف الأجسام المضادة في درجة الحرارة المحيطة طوال الليل على شاكر مائل. تغطية الأنابيب مع احباط.
    ملاحظة: إذا كانت الخلفية قوية أثناء التصوير ، احتضان الأجسام المضادة الثانوية عند 4 درجات مئوية.
  6. شطف مرة واحدة مع 500 ميكرولتر من PBST. أضف 100 ميكرولتر من محلول 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول (DAPI) (10 ميكروغرام / مل في PBST) وصمة عار في درجة الحرارة المحيطة لمدة 10-15 دقيقة. مع تغطية احباط وحماية من الضوء.
  7. اغسل 3 × 30 دقيقة باستخدام 500 ميكرولتر من PBST جيدا على شاكر قابل للإمالة. قم بتغطية الأنابيب بورق أثناء خطوة الغسيل.
  8. قم بتوصيل المجموعات بشرائح غرفة التصوير (انظر جدول المواد) المطلية مسبقا بمادة لاصقة للأنسجة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة والبروتوكولات المنشورة20,21.
  9. جبل مع وسط تطهير الأنسجة (80 ٪ الجلسرين في محلول PBS) وتغطي مع أغطية زجاجية. يحفظ بعيدا عن الضوء حتى التصوير متحد البؤر.
    ملاحظة: إذا لم يتم تصوير العينات على الفور ، فقم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية محمية من الضوء.

7. مقايسة GSIS الثابتة

  1. عازلة كريب رينجر (3.3 جيجا KRB) العازلة الدافئة منخفضة الجلوكوز (16.7 جم) ، وعازلة KRB عالية الجلوكوز (16.7 جم) ، وعازلة 30 مللي متر KCl KRB في حمام 37 درجة مئوية.
  2. اختر يدويا المجموعات المتطابقة الحجم واشطفها ب 2 مل من المخزن المؤقت الدافئ KRB سعة 3.3 جرام. انقل المجموعات إلى صفيحة 6 آبار غير معالجة بزراعة الأنسجة وقم بموازنتها في 2 مل أو مخزن مؤقت دافئ 3.3 جرام KRB لمدة 1 ساعةفي حاضنة CO 2 مرطبة 37 درجة مئوية ، 5٪.
  3. بعد التوازن ، املأ غرفة الفحص (انظر جدول المواد) ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت الدافئ 3.3G KRB. اختر يدويا خمس مجموعات وانقلها إلى مركز غرفة الفحص. احتضان لمدة 30 دقيقةفي حاضنة CO 2 مرطبة 37 درجة مئوية ، 5٪.
    ملاحظة: استخدم أطراف ماصة سعة 10 ميكرولتر لنقل المجموعات ذات الحجم المتوسط الأدنى.
  4. اجمع بعناية ~ 100 ميكرولتر من المادة الطافية وقم بتخزينها في -30 درجة مئوية حتى قياس إفراز الأنسولين الأساسي (انظر الخطوة 7.9). لا تجف أو تفقد أي مجموعات في هذه الخطوة. أضف على الفور 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت الدافئ 16.7G KRB إلى غرفة الفحص واحتضان نفس المجموعات لمدة 30 دقيقةفي حاضنة CO 2 مرطبة 37 درجة مئوية ، 5٪.
  5. اجمع بعناية ~ 100 ميكرولتر من المادة الطافية وقم بتخزينها عند -30 درجة مئوية حتى قياس إفراز الأنسولين المحفز بالجلوكوز (انظر الخطوة 7.9). أضف على الفور 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت الدافئ 30 mM KCl KRB إلى غرفة الفحص واحتضان نفس المجموعات لمدة 30 دقيقةفي حاضنة CO 2 مرطبة 37 درجة مئوية ، 5٪.
  6. اجمع بعناية ~ 100 ميكرولتر من المادة الطافية واحفظها عند -30 درجة مئوية حتى قياس إفراز الأنسولين المحفز ب KCl (انظر الخطوة 7.9). أضف على الفور 100 ميكرولتر من محلول تحلل RIPA إلى غرفة الفحص وانقل المخزن المؤقت للتحلل الذي يحتوي على جميع المجموعات الخمس إلى أنبوب microfuge.
  7. اختياري) قم بكسر المجموعات يدويا عن طريق التثليج القوي باستخدام طرف ماصة P200. دوامة لمدة 30 ثانية واحتضانها على الجليد لمدة 30 دقيقة تليها 30 ثانية أخرى من الدوامة.
    ملاحظة: تأكد من التحلل الكامل عن طريق الدوامة والوقت الكافي للحضانة على الجليد.
  8. تدور في 8000 × غرام لمدة 1 دقيقة. اجمع المادة الطافية واحفظها في درجة حرارة -30 درجة مئوية حتى قياس إجمالي محتوى الأنسولين (انظر الخطوة 7.9).
  9. قم بقياس الأنسولين البشري في العينات الطافية باستخدام مجموعة الأنسولين البشري ELISA وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة والبروتوكولات المنشورة20,22.
    ملاحظة: تجنب التجميد والذوبان المتكرر للعينات الطافية. لا ينبغي فحص العينات التي تحتوي على أكثر من ثلاث دورات تجميد وذوبان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لقد طورنا استراتيجية هجينة لتمييز الخلايا الجذعية إلى جزر hPSC التي تفرز الأنسولين في سبع خطوات ، والتي تستخدم مجموعة سلفية للبنكرياس للمراحل الأربع الأولى في الثقافة المستوية ، متبوعة ببروتوكول معدل مبني على الطريقة6 المبلغ عنها سابقا في ثقافة تعليق ثابتة للمراحل الثلاث الأخيرة (الشكل 1). باستخدام هذا البروتوكول ، يعد ضمان وجود ثقافة قريبة من الالتقاء (90٪ -100٪) عند 24 ساعة بعد بذر الخلية (المرحلة 0) أمرا بالغ الأهمية لبدء تمايز فعال لمعظم خطوط hPSC (الشكل 2 أ). يوصى بشدة باختبار كثافات البذر المختلفة لتحديد الحالة المثلى لخط خلية معين. خلال ثقافة المرحلة 1 ، من المحتمل أن تظهر الوسائط غائمة بسبب الخلايا الميتة العائمة ، والتي يتم ملاحظتها بشكل شائع في هذه المرحلة. هذا لا يضر بكفاءة التمايز للمجموعة طالما أن الخلايا المرفقة تغطي سطح الوعاء بالكامل. خلال المراحل 2-4 ، مع تكاثر الخلايا وتناقص موت الخلايا ، تصبح الطبقات الأحادية أكثر انضغاطا ولا تكون الوسائط المستهلكة غائمة كما كانت خلال المرحلة 1 (الشكل 2 أ). كما هو موضح مع مراسل الأنسولين Mel1 INSGFP / W hESCs ، يمكن تحقيق ما لا يقل عن 95٪ من خلايا الأديم الباطن النهائية FOXA2 + / SOX17 + في نهاية المرحلة 1 و 80٪ PDX1 + / NKX6.1 + خلايا البنكرياس السلفية في نهاية المرحلة 4 بشكل روتيني (الشكل 2B-E). لقد ثبت أن انتقال الخلايا السلفية للبنكرياس من الثقافة المستوية إلى ثقافة التعليق يعزز تحريض خلايا الغدد الصماء اللاحقة23,24. في هذا البروتوكول المحدث ، نستخدم ألواح microwell ونسمح بتجميع الخلايا لمدة 24 ساعة. هذا يولد الآلاف من مجموعات السلف البنكرياس ذات الحجم الموحد والتشكل في وقت واحد (الشكل 3 أ ، ب) ، ومتوسط كفاءة التجميع (عن طريق حساب النسبة المئوية للخلايا المدمجة في المجاميع) هو 74.1٪ ± 4.4٪ (الشكل 3C). الأهم من ذلك ، يتم الحفاظ على التعبير عن PDX1 و NKX6.1 عند مستويات عالية في هذه المجموعات بعد التجميع (الشكل 3D ، E) ، مما يشير إلى إنتاج فعال لأسلاف البنكرياس في المختبر مع مجموعة التمايز ولوحة microwell.

نستخدم بعد ذلك بروتوكول R (طريقة معدلة من Rezania et al.6) للتمايز الأخير المكون من 3 مراحل في نظام ثقافة تعليق ثابت باستخدام ألواح ULA ذات القاع المسطح ذات 96 بئرا لزيادة التمييز بين أسلاف البنكرياس المشتقة من المجموعة نحو hPSC-islandlets (الشكل 1). يتم تحفيز الخلايا المعبرة للأنسولين تدريجيا داخل مجموعات الغدد الصماء ، كما يتضح من زيادة إشارات INS-GFP في الثقافات الحية بمرور الوقت (الشكل 4A ، B). يكشف القياس الكمي لحجم الكتلة أن متوسط قطر مجموعات المرحلة 5 هو 150 ميكرومتر وبحلول المرحلة 7 ، يزيد متوسط القطر إلى 220 ميكرومتر (الشكل 4C). تحافظ العناقيد في الغالب على مظهرها الكروي السلس أثناء نموها بين المرحلة 5 والمرحلة 7 ، مما يشير إلى أن طريقة الاستزراع الثابت تحد من التكتل العنقودي مقارنة بثقافات التعليق القائمة على الهزاز المداري (والتي تولد عادة بعض العناقيد كبيرة الحجم)25. تعد صيانة المجموعات المضغوطة ذات التشكل الكروي السلس مؤشرا على الصلاحية الجيدة للخلايا المتمايزة ، وهو أمر مهم للتمايز الناجح نحو جزر hPSC الوظيفية في النهاية.

يظهر توصيف تكوين الخلية أن المرحلة 7 hPSC-Islands الناتجة عن البروتوكول الهجين هي في المقام الأول من الغدد الصماء وتتألف من أربعة أنواع رئيسية من الخلايا الجزيرية ، بما في ذلك خلايا بيتا إيجابية الأنسولين ، وخلايا ألفا إيجابية الجلوكاجون ، وخلايا دلتا إيجابية السوماتوستاتين ، وخلايا PPY إيجابية الببتيد البنكرياس ، في حين أن الخلايا المعوية (المشتقة من سلالة خارج الهدف26) موجودة أيضا (الشكل 5A-C). والجدير بالذكر أن هذا البروتوكول الهجين يولد خلايا جزرية أحادية الهرمونات إلى حد كبير (~ 50٪ خلايا CPEP + / GCG- / SST ، ~ 17٪ خلايا GCG + / CPEP ، و ~ 12٪ خلايا SST + / CPEP) وأقلية فقط من الخلايا ثنائية الهرمونات (CPEP + / GCG + أو CPEP + / SST +) في ثقافات المرحلة 7 (الشكل 5B-D). يكشف فحص العديد من عوامل النسخ الرئيسية وعلامات خلايا بيتا الناضجة في المرحلة 7 hPSC-Islands أن تمايز خلايا بيتا يعبر عن PDX1 و NKX6.1 و NEUROD1 و MAFA وناقل الجلوكوز GLUT1 (الشكل 6 أ). علاوة على ذلك ، يتم تحفيز ~ 60٪ INS + / PDX1 + خلايا (الشكل 6B) و 50٪ خلايا CPEP + / NKX6.1 + (الشكل 6C) في ثقافات المرحلة 7 ، مما يشير إلى توليد فعال لخلايا بيتا الوظيفية باستخدام الإستراتيجية الهجينة كما هو موضح هنا. في الواقع ، تظهر فحوصات إفراز الأنسولين المحفز بالجلوكوز (GSIS) في المختبر أن المرحلة 7 hPSC-Islands يمكن أن تفرز مستويات عالية من الأنسولين تستجيب لكل من الجلوكوز المرتفع وإزالة الاستقطاب المباشر (الشكل 6D). في حين أن هذه الوظيفة مشجعة ، فإن استجابة الجلوكوز في المختبر من جزر hPSC لا تزال غير مكافئة لتلك الموجودة في الجزر الجثة من حيث حجم إفراز الأنسولين (الشكل 6D) ومحتوى الأنسولين الكلي لجزر hPSC هو ما يقرب من نصف الكمية الموجودة في الجزر الجثثية (الشكل 6E). مطلوب التحسين المستمر لتحقيق hPSC-microlets مع الأنماط الظاهرية لخلايا بيتا الأكثر نضجا.

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة على مخطط التمايز لتوليد جزر hPSC الوظيفية في المختبر. يوفر مخطط سير العمل نظرة عامة على الإجراء المكون من سبع خطوات المتضمن في تمايز hPSCs إلى خلايا سلفية للبنكرياس في مزرعة مستوية باستخدام مجموعة السلف البنكرياسي ، والتجميع في مجموعات السلف البنكرياس باستخدام لوحات microwell ، والانتقال نحو hPSC-islandlets في ثقافة تعليق ثابتة. يتم استخدام خط hESC لمراسل الأنسولين ، Mel1 INSGFP / W ، طوال هذه الدراسة كمثال لإثبات فعالية هذه الطريقة الهجينة. الاختصارات: hPSCs = الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. GSIS = إفراز الأنسولين المحفز بالجلوكوز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التمايز الموجه ل hPSCs إلى خلايا سلف البنكرياس باستخدام مجموعة السلف البنكرياس. (أ) صور تباين الطور التمثيلي التي توضح مورفولوجيا الخلية في المراحل المشار إليها. قضبان المقياس = 750 ميكرومتر. (B ، C) مخططات قياس التدفق الخلوي التمثيلية للعلامات الرئيسية لخلايا الأديم الباطن النهائية (FOXA2 + / SOX17 +) و (C) المرحلة 4 من خلايا البنكرياس السلفية (PDX1 + / NKX6.1 +). (د) صور تلطيخ مناعية تمثيلية للخلايا السلفية البنكرياسية ل PDX1 (أحمر) و NKX6.1 (أخضر). كانت النوى ملطخة ب DAPI (أزرق). شريط المقياس = 200 ميكرومتر. (ه) القياس الكمي الخلوي للتدفق لخلايا PDX1 + / NKX6.1 + في المرحلة 4 اليوم الرابع من خلايا البنكرياس السلفية أحادية الطبقة (n = 5 مكررات بيولوجية). الاختصارات: hPSCs = الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. DAPI = 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التجميع في مجموعات سلفية بنكرياسية موحدة الحجم باستخدام ألواح ميكروويل قطرها 400 ميكرومتر. (أ) صور تباين الطور التمثيلية في نهاية المرحلة 4 تظهر مورفولوجيا العنقود في البئر الصغير وبعد استرجاعها من البئر الصغير. قضبان المقياس = 300 ميكرومتر. (ب) التحديد الكمي لقطر الكتلة في نهاية المرحلة 4 (ن = 60 مجموعة من 3 مكررات بيولوجية). (ج) التحديد الكمي لكفاءة التجميع في نهاية المرحلة 4 (ن = 5 مكررات بيولوجية). (د) صور مناعية تمثيلية لمجموعات السلف البنكرياسي ل PDX1 (أحمر) و NKX6.1 (أخضر). كانت النوى ملطخة ب DAPI (أزرق). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ه) القياس الكمي الخلوي للتدفق لخلايا PDX1 + / NKX6.1 + في المرحلة الرابعة من اليوم الخامس من مجاميع السلف البنكرياسي (n = 4 مكررات بيولوجية). اختصار: DAPI = 4',6-دياميدينو-2-فينيليندول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تمايز أسلاف البنكرياس إلى جزر hPSC في نظام زراعة معلق ثابت . (أ) صور تباين الطور التمثيلي (اللوحة العلوية) وصور الفلورسنت (اللوحة السفلية) التي توضح مورفولوجيا الكتلة ونمط تعبير الأنسولين في المراحل المشار إليها. أشرطة المقياس = 300 ميكرومتر. (ب) التحديد الكمي لمتوسط شدة الفلورسنت INS-GFP لكل مجموعة في المراحل المشار إليها (ن = 30 مجموعة من مكررين بيولوجيين). (ج) التحديد الكمي لقطر الكتلة في المراحل المشار إليها (ن = 60 مجموعة من ثلاث مكررات بيولوجية). الاختصارات: hPSC = الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. INS = الأنسولين. GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: توصيف تكوين الخلية في المرحلة 7 hPSC-islands. (أ) صور مناعية تمثيلية لجزر hPSC من المرحلة 7 تظهر أنواعا مختلفة من الخلايا (SYN ، علامة الغدد الصماء الشاملة ؛ CK19 ، علامة الأقنية ؛ INS-GFP ، يشار إلى الأنسولين من خلال إشارات GFP المراسل ؛ جي سي جي. SST. PPY. تم تلطيخ ENC بجسم مضاد SLC18A1). كانت النوى ملطخة ب DAPI (أزرق). أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. (B ، C) مخططات قياس التدفق الخلوي التمثيلية للنسبة المئوية (B) لخلايا CPEP + و GCG + في المرحلة 7 hPSC-islandlets و (C) النسبة المئوية لخلايا CPEP + و SST + في المرحلة 7 hPSC-Islands. (د) القياس الكمي لقياس التدفق الخلوي لعلامات الخلايا المشار إليها في المرحلة 7 hPSC-islandlets (n = 4 مكررات بيولوجية). الاختصارات: hPSC = الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. INS = الأنسولين. GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر ؛ SYN = المشبك العصبي. GCG = الجلوكاجون ؛ SST = السوماتوستاتين. PPY = ببتيد البنكرياس. ENC = إنتيكرومافين. CPEP = C- الببتيد ؛ DAPI = 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: التوصيف في المختبر والتقييم الوظيفي للمرحلة 7 hPSC-Islands. (أ) صور مناعية تمثيلية للمرحلة 7 hPSC-microslets تظهر التعبير المشترك للأنسولين (المشار إليه بواسطة إشارات INS-GFP للمراسل) مع العديد من علامات خلايا بيتا الرئيسية ، مثل NKX6.1 و MAFA و NEUROD1 و PDX1 وناقل الجلوكوز GLUT1. كانت النوى ملطخة ب DAPI (أزرق). قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. (B ، C) مخططات قياس التدفق الخلوي التمثيلية للنسبة المئوية (B) لخلايا INS + / PDX1 + والنسبة المئوية (C) لخلايا CPEP + / NKX6.1 +. (د) مقايسات GSIS الثابتة التي تظهر إطلاق الأنسولين من المرحلة 7 hPSC-الجزر (ن = 6 بما في ذلك 3 مكررات بيولوجية و 2 تقنية) والجزر البشرية (ن = 6 بما في ذلك 3 مكررات بيولوجية و 2 تقنية) استجابة لارتفاع الجلوكوز (16.7 جم ، 16.7 مللي مول جلوكوز) وإزالة استقطاب 30 مللي مول KCl. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SEM. تم استخدام اختبار t ثنائي الذيل غير المزاوج (** p < 0.01) للمقارنة بين مجموعتين محددتين. (ه) إجمالي محتوى الأنسولين في المرحلة 7 من hPSC-microlets (n = 6 بما في ذلك 3 نسخ بيولوجية و 2 تقنية) والجزر البشرية (n = 6 بما في ذلك 3 نسخ بيولوجية و 2 تقنية). تم استخدام اختبار t ثنائي الطرف غير المزاوج (* p < 0.05) لمقارنة المجموعتين. الاختصارات: hPSC = الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. INS = الأنسولين. GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر ؛ DAPI = 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: صياغة جميع المحاليل والوسائط المستخدمة في هذا البروتوكول. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: صياغة وسائط تمايز المراحل 1-7. يوفر الجدول وصفة لتحضير وسائط التمايز للمراحل 1-7. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تصف هذه الورقة بروتوكولا هجينا من سبع مراحل يسمح بتوليد جزر hPSC قادرة على إفراز الأنسولين عند تحدي الجلوكوز في غضون 40 يوما من الثقافة في المختبر. من بين هذه الخطوات المتعددة ، يعتقد أن الحث الفعال للأديم الباطن النهائي يضع نقطة انطلاق مهمة لنتائج التمايز النهائية18،27،28. في بروتوكول الشركة المصنعة ، يوصى بكثافة البذر عند 2.6 × 105 / سم2 لبدء التمايز ، وتتعرض الخلايا لوسائط المرحلة 1 لمدة يومين. لضمان وصول الخلايا إلى ما يقرب من التقاء في اليوم الأول (90٪ -100٪) ، نوصي بشدة باختبار كثافات البذر عند العمل على خط hPSC جديد حيث قد تختلف كثافة البذر المثلى. على سبيل المثال ، مع اختبار جميع خطوط hPSC الثلاثة في أيدينا ، تم العثور على 1.6-1.80 × 105 / سم 2 ، بدلا من 2.60 × 105 / سم2 ، لتكون كثافة البذر المثلى. يؤدي تمديد مدة الاستزراع للمرحلة 1 من يومين إلى 3 أيام مع يوم إضافي واحد في وسط المرحلة 1B إلى زيادة نقاء خلايا FOXA2 + / SOX17 + من 80٪ إلى > 93٪ (البيانات غير معروضة). إذا كانت نسبة خلايا FOXA2 + / SOX17 + أقل من 70٪ في نهاية المرحلة الأولى ، فمن المحتمل أن يتم اختراق تحريض خلايا PDX1 + وخلايا PDX1 + / NKX6.1 +.

من المهم ملاحظة أنه يمكن ملاحظة بعض موت الخلايا خلال ثقافة المرحلة 1 بأكملها بينما يلزم أن تغطي الخلايا المرفقة 100٪ من مساحة السطح. خلال المراحل 2-4 ، يؤدي الانخفاض في موت الخلايا المتزامن مع تكاثر الخلايا إلى خلايا مضغوطة ومتعددة الطبقات ، والتي تم الإبلاغ عنها لتكون حاسمة للتحريض الفعال لعلامات السلف البنكرياسي PDX1 و NKX6.1 وتوطينها النووي29,30. في اليوم الأخير من المرحلة 4 ، يتم فصل الخلايا وتجميعها في مجموعات باستخدام ألواح Microwell التي يبلغ قطرها AggreWell 400 ميكرومتر. بالمقارنة مع الأساليب الأخرى مثل التجميع المعلق أو التجميع اليدوي أو استخدام ألواح بئر 96 ذات قاع U ، يولد تجميع AggreWell الآلاف من المجموعات الكروية ذات الحجم الموحد ، مما يوضح متانة هذه الطريقة.

لتحريض الغدد الصماء خلال المراحل 5-7 في ثقافة ثلاثية الأبعاد ثابتة ، نقوم بنقل متوسط عدد ~ 20 مجموعة من مجموعات السلف البنكرياس المشتقة من المجموعة إلى كل بئر من ألواح ULA ذات القاع المسطح 96 بئرا. تقلل هذه الطريقة بشكل كبير من تكوين مجموعات كبيرة الحجم وتحسن صلاحية الخلية ، ربما عن طريق الحد من الاندماج العنقودي و / أو تقليل فقدان الخلايا بوساطة إجهاد القص أثناء زراعة شاكر المدار. لإزالة الخلايا الميتة العائمة في الوسائط المستهلكة مع تقليل مخاطر فقدان المجموعات أثناء تغيير الوسائط ، نوصي بتحديث حوالي ثلثي إجمالي الحجم المتوسط. نلاحظ أن هذا التغير الجزئي في الوسط لا يعيق تمايز الغدد الصماء، وبدلا من ذلك قد يوفر انتقالا لطيفا عند التبديل بين المراحل المختلفة. ومع ذلك ، لا يزال من الممكن ملاحظة بعض موت الخلايا خلال المرحلة 5 والمرحلة المبكرة 6 مع هذا البروتوكول الهجين عند الانتقال من الثقافة المستوية إلى ثقافة التعليق الثابت. تعد خطوط hPSC للمراسل (على سبيل المثال ، Mel1 INSGFP / W hESCs) مفيدة لرصد التمايز في المرحلة المتأخرة في الثقافات الحية. سيساعد قياس التدفق الخلوي الجاري في فحص NKX6.1 + / NEUROD1 + في نهاية المرحلة 5 ، و INS + / NKX6.1 + في نهاية المرحلة 6 ، و CPEP + / NKX6.1 + في نهاية المرحلة 7. يعد الحث الفعال لمجموعات CPEP + التي يتم التعبير عنها بشكل مشترك مع NKX6.1 أمرا بالغ الأهمية لتحقيق استجابة الجلوكوز في خلايا بيتا31,32. في هذا الصدد ، يولد هذا البروتوكول باستمرار خلايا >50٪ CPEP + / NKX6.1 + في المرحلة 7 من hPSC الناتجة التي يمكنها إفراز الأنسولين استجابة لتحدي الجلوكوز العالي في المختبر.

على الرغم من أن البروتوكول الحالي قد أظهر توليدا فعالا لجزر hPSC المنتجة للأنسولين ، إلا أن هناك قيودا على هذه الطريقة. يمكن أن تظل كفاءات التمايز في نهاية المرحلة 4 من خطوط hPSC المختلفة ، وخاصة iPSCs ، مع مجموعة السلف البنكرياسية هذه متغيرة (البيانات غير معروضة). يجب إجراء التحسين على أساس كل حالة على حدة. تعتمد هذه الطريقة للمراحل الثلاث الأخيرة من التمايز على استخدام ثقافة التعليق الساكن في ألواح 96 بئرا ، وهي كثيفة العمالة وغير قابلة للتطوير ، مما يقصر استخدامها على البحث فقط. في حين أنه من المشجع الحصول على القدرة على إفراز الأنسولين ، فإن استجابة الجلوكوز في المختبر ومحتوى الأنسولين في جزر hPSC أقل بكثير من تلك الموجودة في الجزر الجثث. لا تزال هناك حاجة إلى جهود مستقبلية لمواصلة تحسين البروتوكول. على الرغم من هذه القيود ، نعتقد أن البروتوكول المقدم هنا يوفر مواد مشتقة من hPSC مناسبة لفحص العوامل المسببة للتمايز ومنظمات إفراز هرمون الجزيرة ، وكذلك لنمذجة خلل الخلايا الجزيرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

كان تيموثي جيه كيفر موظفا في ViaCyte أثناء إعداد هذه المخطوطة. يعلن المؤلفون الآخرون عدم وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgments

نحن نقدر بامتنان الدعم المقدم من STEMCELL Technologies و Michael Smith Health Research BC و Stem Cell Network و JDRF والمعاهد الكندية للبحوث الصحية. حصل جيا تشاو وشينغهوي ليانغ على جائزة مايكل سميث للبحوث الصحية في كولومبيا البريطانية للمتدربين. ميتشل ج. س. برام حاصل على زمالة Mitacs Accelerate. حصلت Diepiriye G. Iworima على منحة ألكسندر جراهام بيل الكندية للدراسات العليا وجائزة CFUW 1989 Ecole Polytechnique التذكارية. نشكر بصدق الدكتور إدوارد ج. ستانلي من MCRI وجامعة موناش لمشاركة خط Mel1 INS GFP / W ومعهد ألبرتا للسكري Islet Core لعزل وتوزيع الجزر البشرية. كما نعترف بالدعم المقدم من مرافق التصوير وقياس التدفق الخلوي التابعة لمعهد علوم الحياة في جامعة كولومبيا البريطانية. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) Sigma T6397 Thyroid hormone
4% PFA solution Santa Cruz Biotechnology sc-281692 Should be handled in fume hood
96-Well, Ultralow Attachment, flat bottom Corning Costar (VWR) CLS3474 Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages
Accutase STEMCELL Technologies 07920 Dissociation reagent for Stage 4 cells
Aggrewell400 plates STEMCELL Technologies 34415 400 µm diameter microwell plates
Aggrewell800 plates STEMCELL Technologies 34815 800 µm diameter microwell plates
Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG) R&D Systems IC2400G 1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells
Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control R&D Systems IC108G 1:100 in flow cytometry
Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B) BD Sciences 566032 1:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype Control R&D Systems IC0041G 1:500 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ) BD Pharmingen 565831 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ) BD Sciences 565689 1:2,000 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ) BD Sciences 563338 1:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ) BD Sciences 562594 1:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells
Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype Control BD Sciences 557714 1:50 in flow cytometry
ALK5i II Cayman Chemicals 14794 TGF-beta signaling inhibitor
Anti-Adherence Rinsing Solution  STEMCELL Technologies 7010 Microwell Rinsing Solution
Assay chamber Cellvis D35-10-1-N For static GSIS and confocal imaging purposes
Bovine serum albumin (BSA) Thermo Fisher Scientific BP1600-100 For immunostaining procedure
CK19 antibody DAKO M0888 1:50 in whole mount immunofluorescence
D-glucose Sigma G8769 Medium supplement
DAPI Sigma D9542 For nuclear counterstaining
DMEM/F12, HEPES Thermo Fisher Scientific 11330032 Matrix diluting solution
Donkey anti-goat Alexa Fluor 555 Life technologies A21432 1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-goat Alexa Fluor 647 Life technologies A21447 1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555 Life technologies A31570 1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 Life technologies A31571 1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555 Life technologies A31572 1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647 Life technologies A31573 1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647 Life technologies A21448 1:500 in whole mount immunofluorescence
DPBS Sigma D8537 Without Ca2+ and Mg2+
ELISA, insulin, human Alpco 80-INSHU-E01.1 For human insulin measurement
Fatty acid-free BSA Proliant 68700 Medium supplement
Fixation and Permeabilization Solution Kit BD Sciences 554714 Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included
Gentle Cell Dissociation Reagent STEMCELL Technologies 7174 For clump passaging hPSCs during maintenance culture
Glucagon antibody Sigma G2654 1:400 in whole mount immunofluorescence
GLUT1 antibody Thermo Fisher Scientific PA1-37782 1:200 in whole mount immunofluorescence
GlutaMAX-I (100x) Gibco 35050061 L-glutamine supplement
Glycerol Thermo Fisher Scientific G33-4 For tissue clearing and mounting
GSi XX Sigma Millipore 565789 Notch inhibitor
Heparin Sigma H3149 Medium supplement
ITS-X (100x) Thermo Fisher Scientific 51500056 Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement
LDN193189  STEMCELL Technologies 72147 BMP antagonist
MAFA antibody Abcam ab26405 1:200 in whole mount immunofluorescence
Matrigel, hESC-qualified Thermo Fisher Scientific 08-774-552 Extracellular matrix for vessel surface coating
MCDB131 medium Life technologies 10372019 Base medium
mTeSR1 Complete Kit STEMCELL Technologies 85850 stem cell medium and 5x supplement included
N-Cys (N-acetyl cysteine) Sigma A9165 Antioxidant
NaHCO3 Sigma S6297 Medium supplement
NEUROD1 antibody R&D Systems AF2746 1:20 in whole mount immunofluorescence
NKX6.1 antibody DSHB F55A12-c 1:50 in whole mount immunofluorescence
Pancreatic polypeptide antibody R&D Systems AF6297 1:200 in whole mount immunofluorescence
PBS Sigma D8662 With Ca2+ and Mg2+
PDX1 antibody Abcam ab47267 1:200 in whole mount immunofluorescence
PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ) BD Sciences 565860 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k) BD Sciences 563023 1:250 in flow cytometry
PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k) BD Sciences 562161 1:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells
PE Mouse IgG1κ Isotype Control BD Sciences 554680 1:2,000 in flow cytometry
PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k) BD Sciences 564563 1:200 in flow cytometry
R428  Cayman Chemicals 21523 AXL tyrosine kinase inhibitor
Retinoid acid, all-trans Sigma R2625 Light-sensitive
RIPA lysis buffer, 10x Sigma 20-188 For hormone extraction
SANT-1 Sigma S4572 SHH inhibitor
SLC18A1 antibody Sigma HPA063797 1:200 in whole mount immunofluorescence
Somatostatin antibody Sigma HPA019472 1:100 in whole mount immunofluorescence
STEMdiff Pancreatic Progenitor Kit STEMCELL Technologies 05120 Basal media and supplements included
Synaptophysin antibody Novus NB120-16659 1:25 in whole mount immunofluorescence
Triton X-100 Sigma X100 For permeabilization
Trolox  Sigma Millipore 648471 Vitamin E analog
TrypLE Enzyme Express Life technologies 12604-021 cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs
Trypsin1/2/3 antibody R&D Systems AF3586 1:25 in whole mount immunofluorescence
Y-27632 STEMCELL Technologies 72304 ROCK inhibitor
Zinc sulfate Sigma Z0251 Medium supplement

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).
  2. Petersen, M. C., Shulman, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
  3. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
  4. Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. The journey of islet cell transplantation and future development. Islets. 10 (2), 80-94 (2018).
  5. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  6. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  7. Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
  8. Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
  9. Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
  10. Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
  11. Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
  12. Rukstalis, J. M., Habener, J. F. Neurogenin3: a master regulator of pancreatic islet differentiation and regeneration. Islets. 1 (3), 177-184 (2009).
  13. Mastracci, T. L., Anderson, K. R., Papizan, J. B., Sussel, L. Regulation of Neurod1 contributes to the lineage potential of Neurogenin3+ endocrine precursor cells in the pancreas. PLoS Genetics. 9 (2), e1003278 (2013).
  14. Balboa, D., et al. Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells. Nature Biotechnology. 40 (7), 1042-1055 (2022).
  15. Du, Y., et al. Human pluripotent stem-cell-derived islets ameliorate diabetes in non-human primates. Nature Medicine. 28 (2), 272-282 (2022).
  16. Hogrebe, N. J., Augsornworawat, P., Maxwell, K. G., Velazco-Cruz, L., Millman, J. R. Targeting the cytoskeleton to direct pancreatic differentiation of human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 38 (4), 460-470 (2020).
  17. Yoshihara, E., et al. Immune-evasive human islet-like organoids ameliorate diabetes. Nature. 586 (7830), 606-611 (2020).
  18. Mahaddalkar, P. U., et al. Generation of pancreatic beta cells from CD177(+) anterior definitive endoderm. Nature Biotechnology. 38 (9), 1061-1072 (2020).
  19. Liang, S., et al. Differentiation of stem cell-derived pancreatic progenitors into insulin-secreting islet clusters in a multiwell-based static 3D culture system. Cell Reports Methods. 3, 10046 (2023).
  20. Zhao, J., et al. In vivo imaging of beta-cell function reveals glucose-mediated heterogeneity of beta-cell functional development. Elife. 8, e41540 (2019).
  21. Zhao, J., et al. In vivo imaging of calcium activities from pancreatic beta-cells in zebrafish embryos using spinning-disc confocal and two-photon light-sheet microscopy. Bio-protocol. 11 (23), e4245 (2021).
  22. Liang, S., et al. Carbon monoxide enhances calcium transients and glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta-cells by activating phospholipase C signal pathway in diabetic mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 582, 1-7 (2021).
  23. Bruin, J. E., et al. Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice. Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).
  24. Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
  25. Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
  26. Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro beta-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
  27. D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
  28. Jiang, Y., et al. Generation of pancreatic progenitors from human pluripotent stem cells by small molecules. Stem Cell Reports. 16 (9), 2395-2409 (2021).
  29. Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190 (2020).
  30. Mamidi, A., et al. Mechanosignalling via integrins directs fate decisions of pancreatic progenitors. Nature. 564 (7734), 114-118 (2018).
  31. Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells. 31 (11), 2432-2442 (2013).
  32. Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).

Tags

علم الأحياء التنموي ، العدد 196 ، إنتاج الأنسولين ، مجموعات الجزر ، خلايا بيتا ، علاج مرض السكري ، البروتوكول ، مجموعة السلف البنكرياس ، بروتوكول R ، ألواح Microwell ، تمايز الغدد الصماء ، تنسيق التعليق الثابت 96 بئرا ، التوصيف في المختبر ، التقييم الوظيفي ، الجزر المشتقة من HPSC ، تقنيات زراعة الخلايا الجذعية ، المقايسات البيولوجية
تمايز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات إلى مجموعات الجزر المنتجة للأنسولين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, J., Liang, S., Braam, M. J.… More

Zhao, J., Liang, S., Braam, M. J. S., Baker, R. K., Iworima, D. G., Quiskamp, N., Kieffer, T. J. Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-Producing Islet Clusters. J. Vis. Exp. (196), e64840, doi:10.3791/64840 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter