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Developmental Biology

इंसुलिन उत्पादक आइलेट समूहों में मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल का भेदभाव

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/64840
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2, 3, 1,2,4
1Department of Cellular & Physiological Sciences, Life Science Institute, University of British Columbia, 2School of Biomedical Engineering, University of British Columbia, 3STEMCELL Technologies Inc, 4Department of Surgery, University of British Columbia
* These authors contributed equally

Summary

आइलेट कोशिकाओं में स्टेम कोशिकाओं का भेदभाव पारंपरिक मधुमेह उपचार और रोग मॉडलिंग के लिए एक वैकल्पिक समाधान प्रदान करता है। हम एक विस्तृत स्टेम सेल संस्कृति प्रोटोकॉल का वर्णन है कि इंसुलिन स्रावित उत्पादन में सहायता करने के लिए एक पहले से मान्य विधि के साथ एक वाणिज्यिक भेदभाव किट को जोड़ती है, एक डिश में स्टेम सेल व्युत्पन्न आइलेट.

Abstract

इंसुलिन-स्रावित बीटा कोशिकाओं में मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी) का भेदभाव बीटा सेल फ़ंक्शन और मधुमेह उपचार की जांच के लिए सामग्री प्रदान करता है। हालांकि, चुनौतियां स्टेम सेल-व्युत्पन्न बीटा कोशिकाओं को प्राप्त करने में बनी हुई हैं जो पर्याप्त रूप से देशी मानव बीटा कोशिकाओं की नकल करती हैं। पिछले अध्ययनों पर बिल्डिंग, एचपीएससी-व्युत्पन्न आइलेट कोशिकाओं को बेहतर भेदभाव परिणामों और स्थिरता के साथ एक प्रोटोकॉल बनाने के लिए उत्पन्न किया गया है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल चरण 1-4 के दौरान एक अग्नाशयी पूर्वज किट का उपयोग करता है, एक प्रोटोकॉल पहले से प्रकाशित एक कागज से संशोधित द्वारा पीछा 2014 (इसके बाद "आर प्रोटोकॉल" कहा जाता है) चरण 5-7 के दौरान. अग्नाशयी पूर्वज किट और 400 माइक्रोन व्यास माइक्रोवेल प्लेटों का उपयोग करने के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं अग्नाशयी पूर्वज समूहों उत्पन्न करने के लिए, एक 96 अच्छी तरह से स्थिर निलंबन प्रारूप में अंतःस्रावी भेदभाव के लिए आर प्रोटोकॉल, और इन विट्रो लक्षण वर्णन और एचपीएससी व्युत्पन्न आइलेट्स के कार्यात्मक मूल्यांकन में शामिल हैं. पूरा प्रोटोकॉल लेता है 1 प्रारंभिक एचपीएससी विस्तार के लिए सप्ताह के बाद ~ 5 सप्ताह इंसुलिन उत्पादक एचपीएससी आइलेट्स प्राप्त करने के लिए. बुनियादी स्टेम सेल संस्कृति तकनीक और जैविक assays में प्रशिक्षण के साथ कार्मिक इस प्रोटोकॉल पुन: पेश कर सकते हैं.

Introduction

अग्नाशयी बीटा कोशिकाएं रक्त शर्करा के स्तर में वृद्धि का जवाब देने वाले इंसुलिन का स्राव करती हैं। प्रकार में बीटा कोशिकाओं के autoimmune विनाश के कारण पर्याप्त इंसुलिन उत्पादन की कमी रोगियों 1 मधुमेह (T1D)1, या प्रकार में बीटा सेल की शिथिलता के कारण 2 मधुमेह (T2D)2, आमतौर पर exogenous इंसुलिन के प्रशासन के साथ इलाज कर रहे हैं. इस जीवन रक्षक चिकित्सा के बावजूद, यह रक्त शर्करा के उत्तम नियंत्रण से सटीक रूप से मेल नहीं खा सकता है जैसा कि बोना फाइड बीटा कोशिकाओं से गतिशील इंसुलिन स्राव द्वारा प्राप्त किया जाता है। जैसे, रोगियों को अक्सर जीवन-धमकाने वाले हाइपोग्लाइसेमिक एपिसोड और क्रोनिक हाइपरग्लाइसेमिक भ्रमण के परिणामस्वरूप अन्य जटिलताओं के परिणाम भुगतते हैं। मानव कैडेवरिक आइलेट्स का प्रत्यारोपण सफलतापूर्वक T1D रोगियों में तंग ग्लाइसेमिक नियंत्रण को पुनर्स्थापित करता है, लेकिन आइलेट दाताओं की उपलब्धता और प्रत्यारोपण 3,4 के लिए स्वस्थ आइलेट्स को शुद्ध करने में कठिनाइयों से सीमित है। यह चुनौती, सिद्धांत रूप में, वैकल्पिक प्रारंभिक सामग्री के रूप में एचपीएससी का उपयोग करके हल की जा सकती है।

इन विट्रो में एचपीएससी से इंसुलिन-स्रावित आइलेट्स पैदा करने के लिए वर्तमान रणनीतियों का उद्देश्य अक्सर विवो 5,6 में भ्रूण अग्न्याशय के विकास की प्रक्रिया की नकल करना होता है। इसके लिए जिम्मेदार सिग्नलिंग मार्गों के ज्ञान और विकासशील भ्रूण अग्न्याशय के महत्वपूर्ण चरणों की नकल करने के लिए संबंधित घुलनशील कारकों के समयबद्ध जोड़ की आवश्यकता होती है। अग्नाशयी कार्यक्रम निश्चित एंडोडर्म में प्रतिबद्धता के साथ शुरू होता है, जिसे प्रतिलेखन कारक फोर्कहेड बॉक्स A2 (FOXA2) और लिंग-निर्धारण क्षेत्र Y-box 17 (SOX17)7 द्वारा चिह्नित किया जाता है। निश्चित एंडोडर्म के क्रमिक भेदभाव में एक आदिम आंत ट्यूब का गठन शामिल होता है, जो एक पीछे के अग्रभाग में पैटर्न करता है जो अग्नाशयी और ग्रहणी संबंधी होमोबॉक्स 1 (पीडीएक्स 1) 7,8,9 को व्यक्त करता है, और अग्नाशयी पूर्वजों में उपकला विस्तार जो पीडीएक्स 1 और एनके 6 होमोबॉक्स 1 (एनकेएक्स 6.1) 10,11 को सह-व्यक्त करता है।

अंतःस्रावी आइलेट कोशिकाओं के लिए आगे की प्रतिबद्धता प्रो-अंतःस्रावी मास्टर नियामक न्यूरोजेनिन -3 (एनजीएन 3) 12 की क्षणिक अभिव्यक्ति और प्रमुख प्रतिलेखन कारकों न्यूरोनल भेदभाव 1 (NEUROD1) और एनके 2 होमोबॉक्स 2 (एनकेएक्स 2.2) 13 के स्थिर प्रेरण के साथ है। प्रमुख हार्मोन-व्यक्त करने वाली कोशिकाएं, जैसे इंसुलिन-उत्पादक बीटा कोशिकाएं, ग्लूकागन-उत्पादक अल्फा कोशिकाएं, सोमाटोस्टैटिन-उत्पादक डेल्टा कोशिकाएं, और अग्नाशयी पॉलीपेप्टाइड-उत्पादक पीपीवाई कोशिकाएं, बाद में प्रोग्राम की जाती हैं। इस ज्ञान के साथ-साथ व्यापक, उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग अध्ययनों से खोजों के साथ, हाल की प्रगति ने एचपीएससी-आइलेट्स की पीढ़ी को इंसुलिन स्राव 14,15,16,17,18,19 में सक्षम बीटा कोशिकाओं के समान कोशिकाओं के साथ सक्षम किया है।

ग्लूकोज-उत्तरदायी बीटा कोशिकाओंको 6,14,18,19 उत्पन्न करने के लिए चरण-वार प्रोटोकॉल की सूचना दी गई है। इन अध्ययनों पर निर्मित, वर्तमान प्रोटोकॉल में एक प्लानर संस्कृति में PDX1+/NKX6.1+ अग्नाशयी पूर्वज कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए एक अग्नाशयी पूर्वज किट का उपयोग शामिल है, इसके बाद एक समान आकार के समूहों में माइक्रोवेल प्लेट एकत्रीकरण और एक स्थिर 3D निलंबन संस्कृति में आर-प्रोटोकॉल के साथ इंसुलिन-स्रावित एचपीएससी-आइलेट्स की ओर और भेदभाव होता है। प्रवाह साइटोमेट्री, इम्यूनोस्टेनिंग और कार्यात्मक मूल्यांकन सहित गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषण, विभेदक कोशिकाओं के कठोर लक्षण वर्णन के लिए किया जाता है। यह पत्र निर्देशित भेदभाव के प्रत्येक चरण का विस्तृत विवरण प्रदान करता है और इन विट्रो लक्षण वर्णन दृष्टिकोणों की रूपरेखा तैयार करता है।

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Protocol

यह प्रोटोकॉल hPSC लाइनों के साथ काम पर आधारित है, जिसमें H1, HUES4 PDXeG, और Mel1 INSGFP/W शामिल हैं, फीडर-मुक्त स्थितियों में। इस खंड में एक चरण-दर-चरण प्रक्रिया विस्तृत है, प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में Mel1 INSGFP/W के भेदभाव से सहायक डेटा के साथ। हम अनुशंसा करते हैं कि अन्य एचपीएससी लाइनों के साथ काम करते समय और अनुकूलन की आवश्यकता होती है जो यहां नहीं बताई गई हैं। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी अभिकर्मकों और समाधानों से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. भेदभाव मीडिया और समाधान की तैयारी

नोट: तैयार किए जाने वाले सभी समाधानों के लिए तालिका 1 और भेदभाव मीडिया के लिए तालिका 2 देखें।

  1. एक बाँझ जैव सुरक्षा कैबिनेट में सेल संस्कृति के लिए सभी मीडिया और अभिकर्मकों को तैयार करें। संक्षेप में सेल संस्कृति से संबंधित समाधान और बेसल मीडिया को उपयोग करने से पहले स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
    नोट: जैसा कि नीचे वर्णित है, पूरक जोड़कर दैनिक ताजा भेदभाव मीडिया बनाएं और उसी दिन उनका उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, अग्नाशयी पूर्वज किट अग्रिम में एक बड़ी मात्रा तैयार करने का विकल्प प्रदान करता है जिसका उपयोग निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद कई दिनों में किया जा सकता है। मीडिया तैयारी के लिए दोनों तरीके अच्छी तरह से काम करने के लिए साबित होते हैं। ध्यान दें कि पानी के स्नान में विस्तारित समय के लिए मीडिया छोड़ने की अनुशंसा नहीं की जाती है। जब मीडिया ताजा प्रत्येक दिन तैयारी, यह दोहराया फ्रीज पिघलना चक्र से बचने के लिए विभाज्य की खुराक के लिए सिफारिश की है.

2. अग्नाशयी पूर्वज कोशिकाओं में एचपीएससी का भेदभाव

  1. mTeSR1 पूर्ण माध्यम में मैट्रिगेल-लेपित जहाजों पर उदासीन hPSCs बनाए रखें और दैनिक मध्यम परिवर्तन करें। रखरखाव संस्कृति के दौरान, हर 3-4 दिनों में एचपीएससी पारित होता है जब कोशिकाएं निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद सेल पृथक्करण अभिकर्मक का उपयोग करके ~ 70% संगम तक पहुंचती हैं। भेदभाव आरंभ करने के लिए, एकल कोशिकाओं में कोशिकाओं को अलग करें और उन्हें 6-अच्छी तरह से या 12-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति-उपचारित प्लेटों (क्रमशः 2 एमएल या 1 एमएल प्रति अच्छी तरह से मीडिया वॉल्यूम के साथ) पर बीज दें।
    नोट: एंडोडर्म बेसल माध्यम और उसके विभाज्य के भंडारण से संबंधित निर्देशों के लिए तालिका 1 देखें।
  2. एचईएससी-योग्य मैट्रिगेल (निर्माता के प्रोटोकॉल द्वारा अनुशंसित बर्फ-ठंडे डीएमईएम/एफ 12 में पतला) के साथ प्रीकोट संस्कृति कुएं और प्लेट को 30 मिनट के लिए एक आर्द्र 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें।
  3. मैट्रिगेल-लेपित प्लेट को कमरे के तापमान पर ले जाएं (3 घंटे के भीतर उपयोग करें)।
  4. एचपीएससी संस्कृति से खर्च किए गए माध्यम को महाप्राण करें और डीपीबीएस के साथ एक बार कुल्ला। 3-5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल पृथक्करण एंजाइम के साथ एकल कोशिकाओं में एचपीएससी संस्कृति पृथक्करण. F12 माध्यम को जोड़कर कोशिकाओं को कुल्ला, 15 एमएल या 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 5 मिन के लिए 300 × ग्राम पर स्पिन करें।
  5. स्टेम सेल पूर्ण माध्यम प्लस 10 माइक्रोन Y-27632 के साथ सेल गोली को फिर से निलंबित करें और एक हेमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर के साथ लाइव सेल (ट्रिपैन ब्लू नेगेटिव) गिनती करें। एस्पिरेट पतला मैट्रिगेल और तुरंत मैट्रिगेल-लेपित कुओं पर 1.60-1.80 × 10 5/सेमी 2 के घनत्व पर जीवित कोशिकाओं को बीज दें और 24 घंटे के लिए एक आर्द्र 37 डिग्री सेल्सियस,5% सीओ2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें। स्टेज 1 पर आगे बढ़ें।
    नोट: इसके परिणामस्वरूप भेदभाव शुरू करने के लिए ~ 95% प्रारंभिक संगम होगा। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, 2.6 × 105/सेमी2 के सीडिंग घनत्व की सिफारिश की जाती है। सेल लाइन के लिए इष्टतम मूल्य निर्धारित करने और सेल व्यवहार्यता की जांच करने के लिए विभिन्न बीजारोपण घनत्व का परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है। यदि व्यवहार्यता 80% से कम है, तो भेदभाव के साथ आगे न बढ़ें। कम सेल व्यवहार्यता फसल के दौरान अतिपाचन या अतिरंजित का परिणाम हो सकती है या बीजारोपण से पहले DMEM/F12 माध्यम में विस्तारित समय के लिए कोशिकाओं को छोड़ सकती है।
  6. स्टेज 1 दिन 1 पर, संक्षेप में गर्म एंडोडर्म बेसल मध्यम से 37 डिग्री सेल्सियस तक एक स्नान और पिघलना पूरक एमआर और सीजे। एंडोडर्म बेसल माध्यम में पूरक एमआर और सीजे जोड़कर स्टेज 1 ए माध्यम तैयार करें। अच्छी तरह मिलाएं और तुरंत उपयोग करें।
  7. कुओं से खर्च किए गए माध्यम को महाप्राण करें, स्टेज 1 ए माध्यम जोड़ें और 24 घंटे के लिए एक आर्द्र 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
    नोट: धोने के कदम अनावश्यक हैं। धीरे मध्यम विनिमय से पहले संस्कृति थाली मिलाते हुए द्वारा संस्कृति से किसी भी अनासक्त कोशिकाओं निकालें. मध्यम हटाने के दौरान और कोमल मध्यम जोड़ के माध्यम से अच्छी तरह से नीचे करने के लिए विंदुक टिप को छूने से monolayer बाधित से बचें.
  8. स्टेज 1 दिन 2 पर, संक्षेप में एंडोडर्म बेसल माध्यम को 37 डिग्री सेल्सियस स्नान और पिघलना पूरक सीजे में गर्म करें। एंडोडर्म बेसल माध्यम में पूरक सीजे जोड़कर स्टेज 1 बी माध्यम तैयार करें। अच्छी तरह मिलाएं और तुरंत उपयोग करें।
  9. कुओं से खर्च किए गए माध्यम को महाप्राण करें, स्टेज 1 बी माध्यम जोड़ें, और 24 घंटे के लिए एक आर्द्र 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
  10. स्टेज 1 दिन 3 पर, चरण 2.8-2.9 दोहराएं। स्टेज 2 पर आगे बढ़ें।
  11. स्टेज 2 दिन 1 पर, 37 डिग्री सेल्सियस स्नान में गर्म अग्नाशय स्टेज 2-4 बेसल माध्यम और पिघलना पूरक 2 ए और 2 बी। अग्नाशय स्टेज 2-4 बेसल माध्यम में पूरक 2 ए और 2 बी जोड़कर स्टेज 2 ए माध्यम तैयार करें। अच्छी तरह मिलाएं और तुरंत उपयोग करें।
  12. कुओं से खर्च किए गए माध्यम को महाप्राण करें, स्टेज 2 ए माध्यम जोड़ें, और 24 घंटे के लिए एक आर्द्र 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
  13. स्टेज 2 दिन 2 पर, 37 डिग्री सेल्सियस स्नान और पिघलना पूरक 2 बी में गर्म अग्नाशयी स्टेज 2-4 बेसल मीडियम तैयार करें। अच्छी तरह मिलाएं और तुरंत उपयोग करें।
  14. कुओं से खर्च किए गए माध्यम को महाप्राण करें, स्टेज 2 बी माध्यम जोड़ें, और 24 घंटे के लिए एक आर्द्र 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
  15. स्टेज 2 दिन 3 पर, चरण 2.13-2.14 दोहराएं। स्टेज 3 पर आगे बढ़ें।
  16. स्टेज 3 दिन 1 पर, गर्म अग्नाशयी स्टेज 2-4 बेसल माध्यम में 37 डिग्री सेल्सियस स्नान और पिघलना अनुपूरक 3. अग्नाशयी चरण 2-4 बेसल माध्यम में पूरक 3 जोड़कर स्टेज 3 माध्यम तैयार करें। अच्छी तरह मिलाएं और तुरंत उपयोग करें।
  17. कुओं से खर्च किए गए माध्यम को महाप्राण करें, स्टेज 3 मध्यम जोड़ें, और 24 घंटे के लिए एक आर्द्र 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
  18. स्टेज 3 दिन 2 और दिन 3 पर, चरण 2.16-2.17 दोहराएं। स्टेज 4 पर आगे बढ़ें।
  19. स्टेज 4 दिन 1 पर, गर्म अग्नाशयी स्टेज 2-4 बेसल मीडियम में 37 डिग्री सेल्सियस स्नान और पिघलना अनुपूरक 4. अग्नाशयी चरण 4-2 बेसल माध्यम में पूरक 4 जोड़कर स्टेज 4 माध्यम तैयार करें। अच्छी तरह मिलाएं और तुरंत उपयोग करें।
  20. कुओं से खर्च किए गए माध्यम को महाप्राण करें, स्टेज 4 माध्यम जोड़ें, और 24 घंटे के लिए एक आर्द्र 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में सेते हैं।
  21. स्टेज 4 दिन 2 से दिन 4 पर, चरण 2.19-2.20 दोहराएं। एकत्रीकरण चरणों के लिए आगे बढ़ें।

3. 400 माइक्रोन व्यास माइक्रोवेल प्लेटों का उपयोग करके अग्नाशयी पूर्वज समूहों में एकत्रीकरण

  1. स्टेज 4 दिन 5 पर, माइक्रोवेल्स (जैसे, 24-वेल प्लेट प्रारूप) को 500 माइक्रोन एंटी-एडहेरेंस रिंसिंग सॉल्यूशन प्रति अच्छी तरह से प्रीट्रीट करें।
  2. एक संतुलन प्लेट तैयार करें और 5 मिनट के लिए 1,300 × ग्राम पर माइक्रोवेल प्लेट अपकेंद्रित्र.
    नोट: एक खुर्दबीन के नीचे थाली की जाँच करें सुनिश्चित करने के लिए कोई बुलबुले microwells में छोड़ रहे हैं. एक और 5 मिनट के लिए फिर से अपकेंद्रित्र बुलबुले किसी भी microwells में फंस रहते हैं.
  3. कुओं से एंटी-एडहेरेंस रिंसिंग सॉल्यूशन को एस्पिरेट करें और डीपीबीएस के 1 एमएल के साथ एक बार कुल्ला। कुओं से DPBS महाप्राण और प्रत्येक अच्छी तरह से एकत्रीकरण माध्यम के 1 एमएल जोड़ें.
  4. अग्नाशयी पूर्वज संस्कृतियों से खर्च किए गए माध्यम को हटा दें और डीपीबीएस के साथ एक बार धो लें। 10-12 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पृथक्करण अभिकर्मक के साथ एकल कोशिकाओं में संस्कृतियों पृथक्करण. F12 के साथ कोशिकाओं को कुल्ला, उन्हें एक ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर स्पिन करें।
  5. एकत्रीकरण माध्यम में सेल गोली resuspended और लाइव सेल गिनती प्रदर्शन. बीज 2.4-3.6 मिलियन कुल कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से (यानी, 2,000-3,000 कोशिकाओं प्रति माइक्रोवेल) और अच्छी तरह से 2 एमएल प्रति की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से एकत्रीकरण माध्यम जोड़ें।
  6. धीरे कोशिकाओं ऊपर और नीचे एक P1000 विंदुक टिप के साथ कई बार विंदुक भर में अच्छी तरह से कोशिकाओं की एक समान वितरण सुनिश्चित करने के लिए. माइक्रोवेल्स में बुलबुले का परिचय न दें। माइक्रोवेल में कोशिकाओं को पकड़ने के लिए 5 मिन के लिए 300 × ग्राम पर माइक्रोवेल प्लेट को सेंट्रीफ्यूज करें। माइक्रोवेल प्लेट को एक आर्द्र 37 डिग्री सेल्सियस, 24 घंटे एकत्रीकरण के लिए 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें और चरण 5-7 भेदभाव के लिए आगे बढ़ें।
    नोट: एकत्रीकरण के समय थाली परेशान नहीं सावधान रहें. इष्टतम कुल गठन के लिए इनक्यूबेशन समय के 48 घंटे तक की आवश्यकता हो सकती है।

4. एचपीएससी-आइलेट्स में किट-व्युत्पन्न अग्नाशयी पूर्वज समूहों का भेदभाव

  1. स्टेज 5 दिन 1 पर, 37 डिग्री सेल्सियस स्नान और पिघलना की खुराक में गर्म स्टेज 5-7 बेसल माध्यम (तालिका 1 और तालिका 2 देखें)। स्टेज 5-7 बेसल माध्यम में पूरक (अंतिम कामकाजी सांद्रता के लिए) जोड़कर स्टेज 5 माध्यम तैयार करें। अच्छी तरह मिलाएं और तुरंत उपयोग करें।
  2. कुल गठन के बाद, धीरे किसी भी गैर एकत्रित कोशिकाओं फ्लोट करने के लिए एक P1000 विंदुक टिप के साथ कई बार समुच्चय ऊपर और नीचे विंदुक. समुच्चय गुरुत्वाकर्षण (~ 1 मिनट के लिए प्रतीक्षा) द्वारा नीचे बसने के लिए अनुमति दें. धीरे खर्च किए गए माध्यम (फ्लोटिंग गैर-एकत्रित कोशिकाओं से युक्त) को अच्छी तरह से जितना संभव हो सके हटा दें, जबकि एस्पिरेटिंग समुच्चय से बचें।
  3. माइक्रोवेल प्लेट की सतह पर ताजा स्टेज 5 मध्यम सख्ती से फैलाएं ताकि माइक्रोवेल्स से समुच्चय को हटा दिया जा सके। अल्ट्रालो अटैचमेंट (यूएलए) 6-कुओं में समुच्चय स्थानांतरित करें। पूरी तरह से microwells से समुच्चय पुनः प्राप्त करने के लिए स्टेज 5 माध्यम के साथ एक बार कुल्ला.
  4. यूएलए 6-कुओं में सभी समुच्चय एकत्र करें, स्टेज 5 माध्यम में समुच्चय को फिर से निलंबित करें, और घनत्व को 100 माइक्रोन प्रति 20 समूहों में समायोजित करें (उदाहरण के लिए, ~ 1,200 क्लस्टर प्रत्येक कुएं से पुनर्प्राप्त होने की उम्मीद है। स्टेज 5 माध्यम के 6 एमएल में 1,200 समूहों को फिर से निलंबित करें)। एक यूएलए फ्लैट नीचे 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से में स्टेज 5 माध्यम के 50 माइक्रोन बांटने के लिए एक multichannel विंदुक का प्रयोग करें. DPBS के 200 μL के साथ कोने और किनारे कुओं भरें.
    नोट: समुच्चय संवर्धन के लिए किनारे कुओं का उपयोग करने से बचें क्योंकि वे अधिक वाष्पीकरण के लिए प्रवण हैं; अन्यथा, एक 96 अच्छी तरह से थाली है कि किनारों (जैसे, निर्मित खाई के साथ 96 अच्छी तरह से प्लेटें) के साथ वाष्पीकरण को कम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है का उपयोग करें या एक उच्च आर्द्रता microclimate सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में संस्कृति थाली जगह.
  5. यूएलए फ्लैट नीचे 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में क्लस्टर resuspension के 100 माइक्रोन जोड़ें, जिसके परिणामस्वरूप कुल 150 माइक्रोन संस्कृति माध्यम में अच्छी तरह से प्रति 20 क्लस्टर का औसत होता है।
    नोट: धीरे 96 कुओं में वितरण से पहले हर बार क्लस्टर resuspension मिश्रण.
  6. एक आर्द्र 37 डिग्री सेल्सियस, 24 घंटे के लिए 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में एक स्तर की सतह पर संस्कृति प्लेटें रखें।
  7. स्टेज 5 दिन 2 पर, चरण 4.1 के बाद स्टेज 5 माध्यम तैयार करें।
  8. प्रत्येक अच्छी तरह से खर्च किए गए माध्यम के ~ 90 माइक्रोन को हटाने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें, और स्टेज 5 माध्यम के 100 माइक्रोन के साथ ताज़ा करें।
  9. स्टेज 5 दिन 3 पर, 4.7-4.8 कदम दोहराएँ. स्टेज 6 पर आगे बढ़ें।
  10. स्टेज 6 दिन 1 पर, 37 डिग्री सेल्सियस स्नान और पिघलना की खुराक में गर्म स्टेज 5-7 बेसल माध्यम (तालिका 1 और तालिका 2 देखें)। स्टेज 5-7 बेसल माध्यम में पूरक (अंतिम कामकाजी सांद्रता के लिए) जोड़कर स्टेज 6 माध्यम तैयार करें। अच्छी तरह मिलाएं और तुरंत उपयोग करें।
  11. खर्च किए गए माध्यम के ~ 90 माइक्रोन को हटाने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें और अच्छी तरह से प्रति चरण 6 माध्यम के 100 माइक्रोन के साथ ताज़ा करें।
  12. स्टेज 6 दिन 2 से दिन 8 पर, चरण 4.10-4.11 दोहराएं। स्टेज 7 पर आगे बढ़ें।
  13. स्टेज 7 दिन 1 पर, 37 डिग्री सेल्सियस स्नान और पिघलना की खुराक में गर्म स्टेज 5-7 बेसल माध्यम (तालिका 1 और तालिका 2 देखें)। स्टेज 5-7 बेसल माध्यम में पूरक (अंतिम कामकाजी सांद्रता के लिए) जोड़कर स्टेज 7 माध्यम तैयार करें। अच्छी तरह मिलाएं और तुरंत उपयोग करें।
  14. खर्च किए गए माध्यम के ~ 90 माइक्रोन को हटाने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें और अच्छी तरह से प्रति चरण 7 माध्यम के 100 माइक्रोन के साथ ताज़ा करें।
  15. स्टेज 7 दिन 2 से दिन 12 पर, चरण 4.13-4.14 दोहराएं। इन विट्रो लक्षण वर्णन में आगे बढ़ें।

5. फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण

  1. संस्कृति मीडिया निकालें और DPBS के साथ एक बार धो लें। 10-12 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन द्वारा पृथक्करण अभिकर्मक के साथ एकल कोशिकाओं में संस्कृतियों (प्लानर पूर्वज कोशिकाओं या विभेदक समूहों) को अलग करें। FACS बफर के साथ कुल्ला और 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर स्पिन।
  2. एफएसीएस बफर में सेल गोली को फिर से निलंबित करें और सेल गिनती करें। 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर स्पिन कोशिकाओं. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए फिक्स/पर्म बफर के 500 माइक्रोन में एकल कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    नोट: उपयोग करने से पहले फिक्स/पर्म बफर को कमरे के तापमान पर लाएं। फिक्स/पर्म बफर में पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) होता है। पीएफए को धूआं हुड में सावधानी से संभालें और संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार निपटान करें।
  3. 3 मिनट के लिए 500 × ग्राम पर स्पिन करें, 1x पर्म/वॉश बफर के 500 माइक्रोन के साथ दो बार धोएं, और 1x पर्म/वॉश बफर के 300 माइक्रोन में फिर से निलंबित करें। एकल सेल resuspension के 100 माइक्रोन स्थानांतरण (प्रत्येक 2.5-3 × 105 कोशिकाओं युक्त) बेदाग नियंत्रण, isotype नियंत्रण, और एंटीबॉडी धुंधला हो जाना के लिए तीन microfuge ट्यूबों के लिए (नमूना एंटीबॉडी और कमजोर पड़ने की जानकारी के लिए सामग्री की तालिकादेखें ). कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए सेते हैं और पन्नी के साथ कवर.
  4. 3 मिनट के लिए 500 × ग्राम पर स्पिन। 1x पर्म/वॉश बफर के 500 माइक्रोन के साथ दो बार धोएं। एफएसीएस बफर के 100 माइक्रोन में नमूनों को फिर से निलंबित करें और फ्लो साइटोमीटर और सॉफ्टवेयर (जैसे, फ्लोजो) के साथ सना हुआ कोशिकाओं का विश्लेषण करें (विशिष्ट चरणों में मार्करों के इंट्रासेल्युलर धुंधला होने के लिए सामग्री की तालिकादेखें )।
    नोट: यदि नमूने तुरंत परख नहीं कर रहे हैं, उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस प्रकाश से संरक्षित पर दुकान. गेटिंग रणनीति के लिए, प्रवाह डेटा को पहले स्कैटर गुणों (एफएससी-ए और एसएससी-ए) द्वारा छोटे सेलुलर मलबे को हटाने के लिए गेटेड किया जाता है, जिसके बाद एफएससी-ए और एफएससी-चौड़ाई गुणों को सिंगलेट्स की पहचान करने के लिए हटा दिया जाता है। सकारात्मक और नकारात्मक गेटिंग स्टेम सेल नियंत्रण और / या बेदाग, आइसोटाइप नियंत्रणों द्वारा निर्धारित किया जाता है।

6. पूरे माउंट immunostaining

  1. एक माइक्रोफ्यूज ट्यूब में गुच्छों को इकट्ठा करें। गुरुत्वाकर्षण द्वारा समूहों को व्यवस्थित करें। खर्च किए गए माध्यम को महाप्राण करें और पीबीएस के 1 एमएल (कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ) के साथ एक बार कुल्ला। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पीएफए के 1 एमएल के साथ समूहों को ठीक करें।
  2. पीबीएसटी के साथ एक बार कुल्ला और एक झुकाव प्रकार के बरतन पर कम से कम 6 घंटे के लिए परिवेश के तापमान पर एक माइक्रोफ्यूज ट्यूब में 0.3% ट्राइटनएक्स -100 के 500 माइक्रोन के साथ 20-30 समूहों को पारगम्य करें।
    नोट: बड़े समूहों के लिए एक लंबा पारगम्यता समय (24 घंटे तक) की आवश्यकता होती है।
  3. एक झुकाव प्रकार के बरतन पर 1 घंटे के लिए परिवेश के तापमान पर अवरुद्ध बफर के 100 माइक्रोन में समूहों को सेते हैं। अवरुद्ध बफर निकालें और एक झुकाव प्रकार के बरतन पर रात भर परिवेश के तापमान पर एंटीबॉडी कमजोर पड़ने वाले बफर में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के 100 माइक्रोन के साथ समूहों को इनक्यूबेट करें।
    नोट: यदि इमेजिंग के दौरान पृष्ठभूमि मजबूत है, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं।
  4. एक झुकाव प्रकार के बरतन पर अच्छी तरह से पीबीएसटी के 500 माइक्रोन के साथ 3 x 30 मिनट धो लें (झुकाव कोण 8 पर सेट, गति 20 पर सेट)।
  5. एक झुकाव प्रकार के बरतन पर रात भर परिवेश के तापमान पर एंटीबॉडी कमजोर पड़ने बफर में माध्यमिक एंटीबॉडी के 100 माइक्रोन के साथ समूहों को सेते हैं। पन्नी के साथ ट्यूबों को कवर करें।
    नोट: यदि इमेजिंग के दौरान पृष्ठभूमि मजबूत है, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं।
  6. पीबीएसटी के 500 माइक्रोन के साथ एक बार कुल्ला। 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल (डीएपीआई) समाधान (पीबीएसटी में 10 माइक्रोग्राम/एमएल) के 100 माइक्रोन जोड़ें और 10-15 मिनट के लिए परिवेश के तापमान पर दाग दें। पन्नी के साथ कवर करें और प्रकाश से बचाएं।
  7. एक झुकाव प्रकार के बरतन पर अच्छी तरह से पीबीएसटी के 500 माइक्रोन के साथ 3 x 30 मिनट धो लें। धोने के चरण के दौरान पन्नी के साथ ट्यूबों को कवर करें।
  8. इमेजिंग चैम्बर स्लाइड (सामग्री की तालिका देखें) निर्माता के प्रोटोकॉल और प्रकाशित प्रोटोकॉल20,21 के अनुसार ऊतक चिपकने वाला के साथ precoated पर समूहों संलग्न करें.
  9. ऊतक समाशोधन माध्यम (पीबीएस समाधान में 80% ग्लिसरॉल) के साथ माउंट करें और ग्लास कवरस्लिप के साथ कवर करें। कॉन्फोकल इमेजिंग तक प्रकाश से सुरक्षित रखें।
    नोट: यदि नमूने तुरंत imaged नहीं कर रहे हैं, उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस प्रकाश से संरक्षित पर दुकान.

7. स्टेटिक जीएसआईएस परख

  1. गर्म कम ग्लूकोज क्रेब की घंटी बाइकार्बोनेट (3.3G KRB) बफर, उच्च ग्लूकोज (16.7G) KRB बफर, और 30 मिमी KCl KRB बफर 37 डिग्री सेल्सियस स्नान में।
  2. आकार-मिलान वाले समूहों को हाथ से चुनें और गर्म 3.3G KRB बफर के 2 एमएल के साथ कुल्ला। समूहों को गैर-ऊतक संस्कृति-उपचारित 6-अच्छी प्लेट में स्थानांतरित करें और 2 एमएल ओ गर्म 3.3 जी केआरबी बफर में 1 घंटे के लिए एक आर्द्र 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में संतुलित करें।
  3. संतुलन के बाद, गर्म 3.3 जी केआरबी बफर के 100 माइक्रोन के साथ परख कक्ष ( सामग्री की तालिकादेखें) भरें। हाथ लेने पांच समूहों और परख कक्ष के केंद्र के लिए उन्हें हस्तांतरण. एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए सेते हैं.
    नोट: न्यूनतम मध्यम मात्रा के साथ क्लस्टर स्थानांतरित करने के लिए 10 माइक्रोन पिपेट युक्तियों का उपयोग करें।
  4. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला के ~ 100 माइक्रोन इकट्ठा और बेसल इंसुलिन स्राव की माप तक -30 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान (7.9 कदम देखें). इस चरण में किसी भी क्लस्टर को न सुखाएं या न खोएं। तुरंत परख कक्ष में गर्म 16.7G KRB बफर के 100 माइक्रोन जोड़ें और एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए एक ही समूहों को सेते हैं।
  5. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला के ~ 100 माइक्रोन इकट्ठा और ग्लूकोज उत्तेजित इंसुलिन स्राव की माप तक -30 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान (7.9 कदम देखें). तुरंत परख कक्ष में गर्म 30 एमएम केसीएल केआरबी बफर के 100 माइक्रोन जोड़ें और एक आर्द्र 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए एक ही क्लस्टर को इनक्यूबेट करें।
  6. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला के ~ 100 माइक्रोन इकट्ठा और KCl उत्तेजित इंसुलिन स्राव की माप तक -30 डिग्री सेल्सियस पर दुकान (7.9 कदम देखें). तुरंत परख कक्ष में आरआईपीए लाइसिस बफर के 100 माइक्रोन जोड़ें और सभी पांच समूहों वाले लाइसिस बफर को माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  7. वैकल्पिक) एक P200 विंदुक टिप के साथ जोरदार विचूर्णन द्वारा मैन्युअल रूप से समूहों को तोड़ें। 30 एस के लिए भंवर और भंवर के एक और 30 एस के बाद 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं.
    नोट: भंवर द्वारा पूर्ण lysis और बर्फ पर इनक्यूबेशन के पर्याप्त समय सुनिश्चित करें।
  8. 1 मिनट के लिए 8,000 × ग्राम पर स्पिन करें। सतह पर तैरनेवाला लीजिए और कुल इंसुलिन सामग्री की माप तक -30 डिग्री सेल्सियस पर दुकान (7.9 कदम देखें).
  9. निर्माता के प्रोटोकॉल और प्रकाशित प्रोटोकॉल20,22 के अनुसार एक मानव इंसुलिन एलिसा किट का उपयोग सतह पर तैरनेवाला नमूनों में मानव इंसुलिन उपाय.
    नोट: बार-बार फ्रीज और सतह पर तैरनेवाला नमूनों के पिघलना से बचें। तीन से अधिक फ्रीज और पिघलना चक्र के साथ नमूने परख नहीं किया जाना चाहिए.

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Representative Results

हम सात चरणों में इंसुलिन-स्रावित एचपीएससी-आइलेट्स में स्टेम कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक संकर रणनीति विकसित की, जो प्लानर संस्कृति में पहले चार चरणों के लिए एक अग्नाशयी पूर्वज किट का उपयोग करता है, इसके बाद पिछले तीन चरणों के लिए एक स्थिर निलंबन संस्कृति में पहले से रिपोर्ट की गई विधि6 पर निर्मित एक संशोधित प्रोटोकॉल (चित्र 1)). इस प्रोटोकॉल के साथ, सेल सीडिंग (स्टेज 0) के बाद 24 घंटे में एक निकट संगम (90% -100%) संस्कृति सुनिश्चित करना अधिकांश एचपीएससी लाइनों(चित्रा 2ए)के लिए एक कुशल भेदभाव शुरू करने के लिए महत्वपूर्ण है। विभिन्न बोने घनत्व का परीक्षण दृढ़ता से एक विशेष सेल लाइन के लिए इष्टतम स्थिति निर्धारित करने के लिए सिफारिश की है. स्टेज 1 संस्कृति के दौरान, मीडिया संभवतः मृत कोशिकाओं को तैरने के कारण बादल दिखाई देगा, जो आमतौर पर इस स्तर पर देखे जाते हैं। यह किट की भेदभाव दक्षता से समझौता नहीं करता है जब तक कि संलग्न कोशिकाएं पूरी तरह से पोत की सतह को कवर करती हैं। चरण 2-4 के दौरान, कोशिकाओं प्रसार और कोशिका मृत्यु कम हो जाती है के रूप में, monolayers और अधिक संकुचित हो जाते हैं और खर्च मीडिया स्टेज 1 (चित्रा 2 ए) के दौरान के रूप में के रूप में बादल नहीं हैं. जैसा कि इंसुलिन रिपोर्टर Mel1 INSGFP/W hESCs के साथ प्रदर्शित किया गया है, स्टेज 1 के अंत में कम से कम 95% FOXA2+/SOX17+ निश्चित एंडोडर्म कोशिकाएं और स्टेज 4 के अंत में 80% PDX1+/NKX6.1+ अग्नाशयी पूर्वज कोशिकाएं नियमित रूप से प्राप्त की जा सकती हैं(चित्र 2B-E)। प्लानर संस्कृति से निलंबन संस्कृति के लिए अग्नाशयी पूर्वज कोशिकाओं के संक्रमण बाद अंतःस्रावी सेल प्रेरण23,24 को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है. इस अद्यतन प्रोटोकॉल में, हम माइक्रोवेल प्लेटों का उपयोग करते हैं और सेल एकत्रीकरण के 24 घंटे के लिए अनुमति देते हैं। यह एक समय में समान आकार और आकृति विज्ञान के साथ हजारों अग्नाशयी पूर्वज समूहों को उत्पन्न करता है (चित्र 3ए, बी), और औसत एकत्रीकरण दक्षता (समुच्चय में शामिल कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना करके) 4.4% ± 74.1% है (चित्र 3सी)। महत्वपूर्ण बात, PDX1 और NKX6.1 की अभिव्यक्ति एकत्रीकरण के बाद इन समूहों में उच्च स्तर पर बनाए रखा है (चित्रा 3 डी, ई), भेदभाव किट और माइक्रोवेल प्लेट के साथ इन विट्रो में अग्नाशयी पूर्वजों के एक कुशल उत्पादन का सुझाव.

हम अगले आगे एचपीएससी-आइलेट्स (चित्रा 1) की ओर इन किट-व्युत्पन्न अग्नाशयी पूर्वजों को अलग करने के लिए यूएलए फ्लैट नीचे 96-अच्छी प्लेटों का उपयोग करके एक स्थिर निलंबन संस्कृति प्रणाली में अंतिम 3-चरण भेदभाव के लिए आर-प्रोटोकॉल (रेज़ानिया एट अल.6 से संशोधित एक विधि) का उपयोग करते हैं। इंसुलिन व्यक्त कोशिकाओं को धीरे-धीरे अंतःस्रावी समूहों के भीतर प्रेरित किया जाता है, जैसा कि समय के साथ जीवित संस्कृतियों में बढ़े हुए आईएनएस-जीएफपी संकेतों द्वारा इंगित किया गया है (चित्र 4ए, बी)। क्लस्टर आकार की मात्रा का ठहराव स्टेज 5 समूहों का औसत व्यास 150 माइक्रोन है और स्टेज 7 द्वारा, औसत व्यास 220 माइक्रोन(चित्रा 4सी)तक बढ़ जाता है। क्लस्टर मुख्य रूप से अपनी चिकनी, गोलाकार उपस्थिति को बनाए रखते हैं क्योंकि वे स्टेज 5 और स्टेज 7 के बीच बढ़ते हैं, यह सुझाव देते हुए कि स्थैतिक संस्कृति विधि कक्षीय शेकर-आधारित निलंबन संस्कृतियों (जो आमतौर पर कुछ ओवरसाइज़्ड क्लस्टर उत्पन्न करती है)25की तुलना में क्लस्टर क्लंपिंग को सीमित करती है। चिकनी गोलाकार आकारिकी के साथ संकुचित समूहों के रखरखाव विभेदक कोशिकाओं है, जो अंत में कार्यात्मक एचपीएससी-आइलेट्स की ओर एक सफल भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण है की अच्छी व्यवहार्यता का एक संकेतक है.

सेल संरचना की विशेषता से पता चलता है कि हाइब्रिड प्रोटोकॉल द्वारा उत्पन्न स्टेज 7 एचपीएससी-आइलेट्स मुख्य रूप से अंतःस्रावी हैं और इंसुलिन पॉजिटिव बीटा कोशिकाओं, ग्लूकागन-पॉजिटिव अल्फा कोशिकाओं, सोमैटोस्टैटिन-पॉजिटिव डेल्टा कोशिकाओं और अग्नाशयी पॉलीपेप्टाइड-पॉजिटिव पीपीवाई कोशिकाओं सहित चार प्रमुख आइलेट सेल प्रकारों से युक्त हैं, जबकि एंटरोक्रोमाफिन कोशिकाएं (एक ऑफ-टारगेट वंश26 से व्युत्पन्न) भी मौजूद हैं (चित्र 5ए-सी). विशेष रूप से, यह हाइब्रिड प्रोटोकॉल बड़े पैमाने पर मोनोहोर्मोन आइलेट कोशिकाओं (~ 50% सीपीईपी + / जीसीजी / एसएसटी- कोशिकाओं, ~ 17% जीसीजी + / सीपीईपी- कोशिकाओं, और ~ 12% एसएसटी + / सीपीईपी- कोशिकाओं) और केवल द्वि-हार्मोनल कोशिकाओं का अल्पसंख्यक उत्पन्न करता है (सीपीईपी + / जीसीजी + या सीपीईपी + / एसएसटी +) स्टेज 7 संस्कृतियों में (चित्रा 5 बी-डी)। स्टेज 7 एचपीएससी-आइलेट्स में कई प्रमुख प्रतिलेखन कारकों और परिपक्व बीटा सेल मार्करों की परीक्षा से पता चलता है कि बीटा कोशिकाओं को अलग करने से पीडीएक्स 1, एनकेएक्स 6.1, NEUROD1, एमएएफए और ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर जीयूटी 1 (चित्रा 6ए)व्यक्त होता है। इसके अलावा, ~ 60% आईएनएस+/पीडीएक्स 1+ कोशिकाओं (चित्रा 6बी) और 50% सीपीईपी +/एनकेएक्स 6.1+ कोशिकाओं (चित्रा 6सी) स्टेज 7 संस्कृतियों में प्रेरित होते हैं, यहां प्रस्तुत हाइब्रिड रणनीति का उपयोग करके कार्यात्मक बीटा कोशिकाओं की एक कुशल पीढ़ी का सुझाव देते हैं। दरअसल, इन विट्रो स्थैतिक ग्लूकोज-उत्तेजित इंसुलिन स्राव (जीएसआईएस) परख में पता चलता है कि स्टेज 7 एचपीएससी-आइलेट्स उच्च ग्लूकोज और प्रत्यक्ष विध्रुवण(चित्रा 6डी)दोनों का जवाब देने वाले इंसुलिन के उच्च स्तर का स्राव कर सकते हैं। जबकि यह समारोह उत्साहजनक है, एचपीएससी-आइलेट्स से इन विट्रो ग्लूकोज जवाबदेही अभी भी इंसुलिन स्राव (चित्रा 6डी) की भयावहता के संदर्भ में कैडेवरिक आइलेट्स के बराबर नहीं है और एचपीएससी-आइलेट्स की कुल इंसुलिन सामग्री कैडवेरिक आइलेट्स (चित्रा 6ई) में लगभग आधी मात्रा है। अधिक परिपक्व बीटा-सेल फेनोटाइप के साथ एचपीएससी-आइलेट्स को प्राप्त करने के लिए निरंतर अनुकूलन की आवश्यकता होती है।

Figure 1
चित्रा 1: इन विट्रो में कार्यात्मक एचपीएससी-आइलेट्स पैदा करने के लिए भेदभाव योजना का अवलोकन। वर्कफ़्लो आरेख अग्नाशयी पूर्वज किट का उपयोग करके एक प्लानर संस्कृति में अग्नाशयी पूर्वज कोशिकाओं में एचपीएससी के भेदभाव में शामिल सात-चरण प्रक्रिया का अवलोकन प्रदान करता है, माइक्रोवेल प्लेटों का उपयोग करके अग्नाशयी पूर्वज समूहों में एकत्रीकरण, और एक स्थिर निलंबन संस्कृति में एचपीएससी-आइलेट्स की ओर संक्रमण। एक इंसुलिन रिपोर्टर hESC लाइन, Mel1 INSGFP/W, इस पूरे अध्ययन में इस हाइब्रिड विधि की प्रभावकारिता को प्रदर्शित करने के लिए एक उदाहरण के रूप में उपयोग किया जाता है। संक्षिप्ताक्षर: एचपीएससी = मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल; जीएसआईएस = ग्लूकोज-उत्तेजित इंसुलिन स्राव। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: अग्नाशयी पूर्वज किट का उपयोग अग्नाशयी पूर्वज कोशिकाओं में एचपीएससी के निर्देशित भेदभाव। (ए) प्रतिनिधि चरण विपरीत छवियों संकेत चरणों में सेल आकृति विज्ञान दिखा रहा है. स्केल बार = 750 माइक्रोन। (बी, सी) (बी) स्टेज 1 निश्चित एंडोडर्म कोशिकाओं (FOXA2+/SOX17+) और (सी) स्टेज 4 अग्नाशयी पूर्वज कोशिकाओं (PDX1+/NKX6.1+) के प्रमुख मार्करों के लिए प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री भूखंड। (डी)PDX1 (लाल) और NKX6.1 (हरा) के लिए अग्नाशयी पूर्वज कोशिकाओं के प्रतिनिधि immunostaining छवियों. नाभिक को डीएपीआई (नीला) के साथ दाग दिया गया था। स्केल बार = 200 माइक्रोन। (ई) चरण 1 दिन 4 अग्नाशयी पूर्वज मोनोलेयर कोशिकाओं (एन = 5 जैविक प्रतिकृतियों) में पीडीएक्स 1 +/एनकेएक्स 6.1+ कोशिकाओं का प्रवाह साइटोमेट्रिक मात्रा का ठहराव। संक्षिप्ताक्षर: एचपीएससी = मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: 400 माइक्रोन व्यास माइक्रोवेल प्लेटों का उपयोग करके वर्दी आकार के अग्नाशयी पूर्वज समूहों में एकत्रीकरण। (ए) स्टेज 4 के अंत में प्रतिनिधि चरण विपरीत छवियां माइक्रोवेल में क्लस्टर आकृति विज्ञान दिखा रही हैं और माइक्रोवेल से पुनर्प्राप्ति के बाद। स्केल बार = 300 माइक्रोन। (बी) स्टेज 4 के अंत में क्लस्टर व्यास की मात्रा का ठहराव (एन = 3 जैविक प्रतिकृति से 60 क्लस्टर)। (सी) चरण 4 के अंत में एकत्रीकरण दक्षता की मात्रा का ठहराव (एन = 5 जैविक प्रतिकृतियां)। (डी)PDX1 (लाल) और NKX6.1 (हरा) के लिए अग्नाशयी पूर्वज समूहों के प्रतिनिधि immunostaining छवियों. नाभिक को डीएपीआई (नीला) के साथ दाग दिया गया था। स्केल बार = 100 माइक्रोन। (ई) स्टेज 4 दिन 5 अग्नाशयी पूर्वज समुच्चय (एन = 4 जैविक प्रतिकृतियां) में पीडीएक्स 1 +/एनकेएक्स 6.1+ कोशिकाओं का प्रवाह साइटोमेट्रिक मात्रा का ठहराव। संक्षिप्त: DAPI = 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एक स्थिर निलंबन संस्कृति प्रणाली में एचपीएससी-आइलेट्स में अग्नाशयी पूर्वज का भेदभाव। (ए) प्रतिनिधि चरण विपरीत छवियों (शीर्ष पैनल) और फ्लोरोसेंट छवियों (नीचे पैनल) संकेत चरणों में क्लस्टर आकृति विज्ञान और इंसुलिन अभिव्यक्ति पैटर्न दिखा रहा है. स्केल बार = 300 माइक्रोन। (बी) संकेतित चरणों में प्रति क्लस्टर मतलब आईएनएस-जीएफपी फ्लोरोसेंट तीव्रता की मात्रा का ठहराव (एन = दो जैविक प्रतिकृतियों से 30 समूह)। (सी) संकेतित चरणों में क्लस्टर व्यास की मात्रा का ठहराव (एन = तीन जैविक प्रतिकृतियों से 60 समूह)। संक्षिप्ताक्षर: एचपीएससी = मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल; आईएनएस = इंसुलिन; GFP = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: स्टेज 7 एचपीएससी-आइलेट्स में सेल संरचना की विशेषता। (ए) स्टेज 7 एचपीएससी-आइलेट्स की प्रतिनिधि इम्यूनोस्टेनिंग छवियां विभिन्न सेल प्रकार दिखा रही हैं (एसवाईएन, पैन-एंडोक्राइन मार्कर; CK19, डक्टल मार्कर; आईएनएस-जीएफपी, इंसुलिन रिपोर्टर जीएफपी संकेतों द्वारा इंगित किया गया है; जीसीजी; एसएसटी; पीपीवाई; ईएनसी SLC18A1 एंटीबॉडी द्वारा दाग दिया गया था)। नाभिक को डीएपीआई (नीला) के साथ दाग दिया गया था। स्केल बार = 100 माइक्रोन। (बी, सी) स्टेज 7 एचपीएससी-आइलेट्स में सीपीईपी + और जीसीजी + कोशिकाओं के (बी) प्रतिशत और (सी) चरण 7 एचपीएससी-आइलेट्स में सीपीईपी + और एसएसटी + कोशिकाओं का प्रतिशत प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री प्लॉट। (डी)स्टेज 7 एचपीएससी-आइलेट्स (एन = 4 जैविक प्रतिकृतियां) में संकेतित सेल मार्करों का प्रवाह साइटोमेट्री मात्रा का ठहराव। संक्षिप्ताक्षर: एचपीएससी = मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल; आईएनएस = इंसुलिन; GFP = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; SYN = सिनैप्टोफिसिन; GCG = ग्लूकागन; एसएसटी = सोमाटोस्टैटिन; पीपीवाई = अग्नाशयी पॉलीपेप्टाइड; ईएनसी = एंटरोक्रोमैफिन; सीपीईपी = सी-पेप्टाइड; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: इन विट्रो लक्षण वर्णन और स्टेज 7 एचपीएससी-आइलेट्स के कार्यात्मक मूल्यांकन। (ए) स्टेज 7 एचपीएससी-आइलेट्स की प्रतिनिधि इम्यूनोस्टेनिंग छवियां इंसुलिन की सह-अभिव्यक्ति दिखा रही हैं (रिपोर्टर आईएनएस-जीएफपी संकेतों द्वारा इंगित) एनकेएक्स 6.1, एमएएफए, NEUROD1, पीडीएक्स 1 और ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर जीएलयूटी 1 जैसे कई प्रमुख बीटा मार्करों के साथ। नाभिक को डीएपीआई (नीला) के साथ दाग दिया गया था। स्केल बार = 100 माइक्रोन। (बी, सी) आईएनएस+/पीडीएक्स1+ कोशिकाओं के (बी) प्रतिशत और सीपीईपी+/एनकेएक्स 6.1+ कोशिकाओं के (सी) प्रतिशत के प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री प्लॉट। (डी) उच्च ग्लूकोज (16.7 जी, 16.7 एमएम ग्लूकोज) और 30 एमएम केसीएल विध्रुवण के जवाब में स्टेज 7 एचपीएससी-आइलेट्स (एन = 6 जिसमें 3 जैविक और 2 तकनीकी प्रतिकृतियां शामिल हैं) और मानव आइलेट्स (एन = 6 3 जैविक और 2 तकनीकी प्रतिकृतियां शामिल हैं) से इंसुलिन रिलीज दिखाते हुए स्टेटिक जीएसआईएस परख। डेटा को माध्य ± SEM के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। दो संकेतित समूहों के बीच तुलना करने के लिए एक अयुग्मित दो-पूंछ वाले टी-टेस्ट (** पी < 0.01) का उपयोग किया गया था। (ई) चरण 7 एचपीएससी-आइलेट्स (एन = 6 जिसमें 3 जैविक और 2 तकनीकी प्रतिकृतियां शामिल हैं) और मानव आइलेट्स (एन = 6 जिसमें 3 जैविक और 2 तकनीकी प्रतिकृतियां शामिल हैं) की कुल इंसुलिन सामग्री। दो समूहों की तुलना करने के लिए एक अयुग्मित दो-पूंछ वाले टी-टेस्ट (* पी < 0.05) का उपयोग किया गया था। संक्षिप्ताक्षर: एचपीएससी = मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल; आईएनएस = इंसुलिन; GFP = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी समाधान और मीडिया का निर्माण। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 2: चरण 1-7 भेदभाव मीडिया का निर्माण। तालिका चरण 1-7 भेदभाव मीडिया तैयार करने के लिए नुस्खा प्रदान करती है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह पत्र एक सात चरण हाइब्रिड प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो एचपीएससी आइलेट्स की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है जो इन विट्रो में संस्कृति के 40 दिनों के भीतर ग्लूकोज चुनौती पर इंसुलिन को स्रावित करने में सक्षम है। इन कई चरणों के अलावा, निश्चित endoderm के कुशल प्रेरण अंतिम भेदभाव परिणामों 18,27,28 के लिए एक महत्वपूर्ण प्रारंभिक बिंदु निर्धारित करने के लिए माना जाता है. निर्माता के प्रोटोकॉल में, 2.6 × 105/सेमी 2 पर एक सीडिंग घनत्व भेदभाव शुरू करने की सिफारिश की है, और कोशिकाओं को2 दिनों के लिए स्टेज 1 मीडिया के संपर्क में लाया जाता है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाएं दिन 1 (90% -100%) पर संगम के पास पहुंचती हैं, हम एक नई एचपीएससी लाइन पर काम करते समय सीडिंग घनत्व का परीक्षण करने की अत्यधिक अनुशंसा करते हैं क्योंकि इष्टतम सीडिंग घनत्व भिन्न हो सकता है। उदाहरण के लिए, हमारे हाथों में परीक्षण की गई सभी तीन एचपीएससी लाइनों के साथ, 1.6-1.80 × 10 5/सेमी2, 2.60 × 105/सेमी2 के बजाय, एक इष्टतम बीजारोपण घनत्व पाया गया। स्टेज 1B माध्यम में एक अतिरिक्त दिन के साथ स्टेज 1 की संस्कृति अवधि को 2 दिनों से 3 दिनों तक बढ़ाने से FOXA2+/SOX17+ कोशिकाओं की शुद्धता 80% से > 93% (डेटा नहीं दिखाया गया) बढ़ जाती है। यदि चरण 2 के अंत में FOXA17+/SOX1+ कोशिकाओं का अनुपात 70% से कम है, तो PDX1+ कोशिकाओं और PDX1+/NKX6.1+ कोशिकाओं के प्रेरण से समझौता होने की संभावना है।

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि कुछ कोशिका मृत्यु पूरे चरण 1 संस्कृति के दौरान देखी जा सकती है, जबकि संलग्न कोशिकाओं को सतह क्षेत्र के 100% को कवर करने की आवश्यकता होती है। चरण 2-4 के दौरान, सेल प्रसार के साथ समवर्ती कोशिका मृत्यु में कमी के परिणामस्वरूप कॉम्पैक्ट और बहुस्तरीय कोशिकाएं, जो अग्नाशयी पूर्वज मार्करों PDX1 और NKX6.1 और उनके परमाणु स्थानीयकरण29,30 के कुशल प्रेरण के लिए महत्वपूर्ण बताई गई हैं। स्टेज 4 के अंतिम दिन, कोशिकाओं को अलग कर दिया जाता है और एग्रीवेल 400 माइक्रोन व्यास माइक्रोवेल प्लेटों का उपयोग करके समूहों में एकत्रित किया जाता है। निलंबित एकत्रीकरण, मैनुअल एकत्रीकरण, या यू-बॉटम 96-वेल प्लेटों का उपयोग करने जैसे अन्य दृष्टिकोणों की तुलना में, एग्रीवेल एकत्रीकरण हजारों गोलाकार वर्दी आकार के क्लस्टर उत्पन्न करता है, जो इस पद्धति की मजबूती को दर्शाता है।

एक स्थिर 3 डी संस्कृति में चरण 5-7 के दौरान अंतःस्रावी प्रेरण के लिए, हम ~ 20 किट व्युत्पन्न अग्नाशय पूर्वज समूहों की एक औसत संख्या यूएलए फ्लैट नीचे 96 अच्छी तरह से प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह से में हस्तांतरण. यह विधि ओवरसाइज़्ड क्लस्टर के गठन को बहुत कम कर देती है और सेल व्यवहार्यता में सुधार करती है, संभवतः क्लस्टर संलयन को सीमित करके और / या कक्षीय शेकर संस्कृति के दौरान कतरनी तनाव-मध्यस्थता सेल हानि को कम करके। मीडिया परिवर्तन के दौरान क्लस्टर खोने के जोखिम को कम करते हुए खर्च किए गए मीडिया में फ्लोटिंग मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए, हम कुल मध्यम मात्रा के लगभग दो-तिहाई को ताज़ा करने की सलाह देते हैं। हम ध्यान दें कि यह आंशिक माध्यम परिवर्तन अंतःस्रावी भेदभाव में बाधा नहीं डालता है और इसके बजाय विभिन्न चरणों के बीच स्विच करते समय एक कोमल संक्रमण की पेशकश कर सकता है। फिर भी, कुछ कोशिका मृत्यु अभी भी स्टेज 5 और प्रारंभिक चरण 6 के दौरान इस हाइब्रिड प्रोटोकॉल के साथ देखी जा सकती है जब प्लानर संस्कृति से स्थिर निलंबन संस्कृति में संक्रमण होता है। रिपोर्टर एचपीएससी लाइनें (उदाहरण के लिए, Mel1 आईएनएसजीएफपी / डब्ल्यू एचईएससी) जीवित संस्कृतियों में देर से चरण भेदभाव की निगरानी के लिए उपयोगी हैं। रनिंग फ्लो साइटोमेट्री स्टेज 6.1 के अंत में NKX5+/NEUROD1+, स्टेज 6 के अंत में INS+/NKX6.1+ और स्टेज 7 के अंत में CPEP+/NKX6.1+ की जांच करने में मदद करेगी। एनकेएक्स 6.1 के साथ सह-व्यक्त सीपीईपी + आबादी का कुशल प्रेरण बीटा कोशिकाओं31,32में ग्लूकोज जवाबदेही प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस संबंध में, यह प्रोटोकॉल परिणामी चरण 7 एचपीएससी-आइलेट्स में लगातार >50% सीपीईपी+/एनकेएक्स6.1+ कोशिकाएं उत्पन्न करता है जो इन विट्रो में उच्च ग्लूकोज चुनौती के जवाब में इंसुलिन का स्राव कर सकते हैं।

हालांकि वर्तमान प्रोटोकॉल इंसुलिन उत्पादन एचपीएससी आइलेट्स की एक कुशल पीढ़ी का प्रदर्शन किया है, इस विधि के लिए सीमाएं हैं. चरण के अंत में भेदभाव क्षमता 4 विभिन्न एचपीएससी लाइनों से, विशेष रूप से आईपीएससी, इस अग्नाशयी पूर्वज किट के साथ अभी भी परिवर्तनशील हो सकता है (डेटा नहीं दिखाया गया है). अनुकूलन मामला-दर-मामला आधार पर किया जाना चाहिए। भेदभाव के अंतिम तीन चरणों के लिए यह विधि 96-अच्छी प्लेटों में स्थिर निलंबन संस्कृति के उपयोग पर निर्भर करती है, जो श्रम-गहन है और स्केलेबल नहीं है, इस प्रकार इसका उपयोग केवल अनुसंधान तक सीमित है। जबकि यह इंसुलिन-स्रावित क्षमता प्राप्त करने के लिए उत्साहजनक है, इन विट्रो ग्लूकोज प्रतिक्रिया और एचपीएससी आइलेट्स की इंसुलिन सामग्री कैडेवरिक आइलेट्स की तुलना में काफी कम है। निरंतर प्रोटोकॉल अनुकूलन के लिए भविष्य के प्रयासों की अभी भी आवश्यकता है। इन सीमाओं के बावजूद, हम मानते हैं कि प्रोटोकॉल यहाँ प्रस्तुत भेदभाव उत्प्रेरण कारकों और आइलेट हार्मोन स्राव के नियामकों स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त एचपीएससी-व्युत्पन्न सामग्री प्रदान करता है, साथ ही आइलेट सेल रोग मॉडलिंग के लिए.

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Disclosures

टिमोथी जे कीफर इस पांडुलिपि की तैयारी के दौरान ViaCyte के एक कर्मचारी थे। अन्य लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

हम कृतज्ञतापूर्वक STEMCELL टेक्नोलॉजीज, माइकल स्मिथ हेल्थ रिसर्च बीसी, स्टेम सेल नेटवर्क, JDRF, और कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान से समर्थन स्वीकार करते हैं। जिया झाओ और शेंघुई लियांग माइकल स्मिथ हेल्थ रिसर्च बीसी ट्रेनी अवार्ड के प्राप्तकर्ता हैं। मिशेल जेएस ब्राम मितक्स एक्सीलरेट फैलोशिप के प्राप्तकर्ता हैं। Diepiriye G. Iworima अलेक्जेंडर ग्राहम बेल कनाडा ग्रेजुएट स्कॉलरशिप और CFUW 1989 इकोले पॉलिटेक्निक स्मारक पुरस्कार के प्राप्तकर्ता हैं। हम ईमानदारी से एमसीआरआई और मोनाश विश्वविद्यालय से डॉ. एडौर्ड जी स्टेनली को Mel1 INS GFP/W लाइन और अल्बर्टा डायबिटीज इंस्टीट्यूट आइलेट कोर को मानव आइलेट्स को अलग करने और वितरित करने के लिए धन्यवाद देते हैं। हम ब्रिटिश कोलंबिया विश्वविद्यालय में लाइफ साइंसेज इंस्टीट्यूट इमेजिंग और फ्लो साइटोमेट्री सुविधाओं से समर्थन को भी स्वीकार करते हैं। चित्रा 1 BioRender.com के साथ बनाया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) Sigma T6397 Thyroid hormone
4% PFA solution Santa Cruz Biotechnology sc-281692 Should be handled in fume hood
96-Well, Ultralow Attachment, flat bottom Corning Costar (VWR) CLS3474 Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages
Accutase STEMCELL Technologies 07920 Dissociation reagent for Stage 4 cells
Aggrewell400 plates STEMCELL Technologies 34415 400 µm diameter microwell plates
Aggrewell800 plates STEMCELL Technologies 34815 800 µm diameter microwell plates
Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG) R&D Systems IC2400G 1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells
Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control R&D Systems IC108G 1:100 in flow cytometry
Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B) BD Sciences 566032 1:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype Control R&D Systems IC0041G 1:500 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ) BD Pharmingen 565831 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ) BD Sciences 565689 1:2,000 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ) BD Sciences 563338 1:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ) BD Sciences 562594 1:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells
Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype Control BD Sciences 557714 1:50 in flow cytometry
ALK5i II Cayman Chemicals 14794 TGF-beta signaling inhibitor
Anti-Adherence Rinsing Solution  STEMCELL Technologies 7010 Microwell Rinsing Solution
Assay chamber Cellvis D35-10-1-N For static GSIS and confocal imaging purposes
Bovine serum albumin (BSA) Thermo Fisher Scientific BP1600-100 For immunostaining procedure
CK19 antibody DAKO M0888 1:50 in whole mount immunofluorescence
D-glucose Sigma G8769 Medium supplement
DAPI Sigma D9542 For nuclear counterstaining
DMEM/F12, HEPES Thermo Fisher Scientific 11330032 Matrix diluting solution
Donkey anti-goat Alexa Fluor 555 Life technologies A21432 1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-goat Alexa Fluor 647 Life technologies A21447 1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555 Life technologies A31570 1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 Life technologies A31571 1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555 Life technologies A31572 1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647 Life technologies A31573 1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647 Life technologies A21448 1:500 in whole mount immunofluorescence
DPBS Sigma D8537 Without Ca2+ and Mg2+
ELISA, insulin, human Alpco 80-INSHU-E01.1 For human insulin measurement
Fatty acid-free BSA Proliant 68700 Medium supplement
Fixation and Permeabilization Solution Kit BD Sciences 554714 Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included
Gentle Cell Dissociation Reagent STEMCELL Technologies 7174 For clump passaging hPSCs during maintenance culture
Glucagon antibody Sigma G2654 1:400 in whole mount immunofluorescence
GLUT1 antibody Thermo Fisher Scientific PA1-37782 1:200 in whole mount immunofluorescence
GlutaMAX-I (100x) Gibco 35050061 L-glutamine supplement
Glycerol Thermo Fisher Scientific G33-4 For tissue clearing and mounting
GSi XX Sigma Millipore 565789 Notch inhibitor
Heparin Sigma H3149 Medium supplement
ITS-X (100x) Thermo Fisher Scientific 51500056 Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement
LDN193189  STEMCELL Technologies 72147 BMP antagonist
MAFA antibody Abcam ab26405 1:200 in whole mount immunofluorescence
Matrigel, hESC-qualified Thermo Fisher Scientific 08-774-552 Extracellular matrix for vessel surface coating
MCDB131 medium Life technologies 10372019 Base medium
mTeSR1 Complete Kit STEMCELL Technologies 85850 stem cell medium and 5x supplement included
N-Cys (N-acetyl cysteine) Sigma A9165 Antioxidant
NaHCO3 Sigma S6297 Medium supplement
NEUROD1 antibody R&D Systems AF2746 1:20 in whole mount immunofluorescence
NKX6.1 antibody DSHB F55A12-c 1:50 in whole mount immunofluorescence
Pancreatic polypeptide antibody R&D Systems AF6297 1:200 in whole mount immunofluorescence
PBS Sigma D8662 With Ca2+ and Mg2+
PDX1 antibody Abcam ab47267 1:200 in whole mount immunofluorescence
PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ) BD Sciences 565860 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k) BD Sciences 563023 1:250 in flow cytometry
PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k) BD Sciences 562161 1:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells
PE Mouse IgG1κ Isotype Control BD Sciences 554680 1:2,000 in flow cytometry
PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k) BD Sciences 564563 1:200 in flow cytometry
R428  Cayman Chemicals 21523 AXL tyrosine kinase inhibitor
Retinoid acid, all-trans Sigma R2625 Light-sensitive
RIPA lysis buffer, 10x Sigma 20-188 For hormone extraction
SANT-1 Sigma S4572 SHH inhibitor
SLC18A1 antibody Sigma HPA063797 1:200 in whole mount immunofluorescence
Somatostatin antibody Sigma HPA019472 1:100 in whole mount immunofluorescence
STEMdiff Pancreatic Progenitor Kit STEMCELL Technologies 05120 Basal media and supplements included
Synaptophysin antibody Novus NB120-16659 1:25 in whole mount immunofluorescence
Triton X-100 Sigma X100 For permeabilization
Trolox  Sigma Millipore 648471 Vitamin E analog
TrypLE Enzyme Express Life technologies 12604-021 cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs
Trypsin1/2/3 antibody R&D Systems AF3586 1:25 in whole mount immunofluorescence
Y-27632 STEMCELL Technologies 72304 ROCK inhibitor
Zinc sulfate Sigma Z0251 Medium supplement

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References

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 196 इंसुलिन उत्पादन आइलेट क्लस्टर बीटा सेल मधुमेह उपचार प्रोटोकॉल अग्नाशयी पूर्वज किट आर-प्रोटोकॉल माइक्रोवेल प्लेट्स अंतःस्रावी भेदभाव 96-अच्छी तरह से स्थैतिक निलंबन प्रारूप इन विट्रो लक्षण वर्णन कार्यात्मक मूल्यांकन एचपीएससी-व्युत्पन्न आइलेट्स स्टेम सेल संस्कृति तकनीक जैविक परख
इंसुलिन उत्पादक आइलेट समूहों में मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल का भेदभाव
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