Summary
Differentieringen av stamceller till ö-celler ger en alternativ lösning till konventionell diabetesbehandling och sjukdomsmodellering. Vi beskriver ett detaljerat stamcellsodlingsprotokoll som kombinerar ett kommersiellt differentieringskit med en tidigare validerad metod för att hjälpa till att producera insulinfrisättande, stamcellshärledda öar i en maträtt.
Abstract
Differentiering av humana pluripotenta stamceller (hPSCs) till insulinfrisättande betaceller ger material för att undersöka betacellsfunktion och diabetesbehandling. Utmaningar kvarstår dock när det gäller att få fram stamcellshärledda betaceller som på ett adekvat sätt efterliknar de ursprungliga mänskliga betacellerna. Med utgångspunkt i tidigare studier har hPSC-härledda ö-celler genererats för att skapa ett protokoll med förbättrade differentieringsresultat och konsistens. Protokollet som beskrivs här använder ett pankreasprogenitor-kit under steg 1-4, följt av ett protokoll modifierat från en artikel som tidigare publicerats 2014 (nedan kallat "R-protokoll") under steg 5-7. Detaljerade procedurer för användning av pankreasprogenitorkit och mikrobrunnsplattor med en diameter på 400 μm för att generera pankreasprogenitorkluster, R-protokoll för endokrin differentiering i ett 96-brunnars statiskt suspensionsformat, och in vitro-karakterisering och funktionell utvärdering av hPSC-härledda öar, ingår. Det fullständiga protokollet tar 1 vecka för initial hPSC-expansion följt av ~5 veckor för att erhålla insulinproducerande hPSC-öar. Personal med grundläggande stamcellsodlingstekniker och utbildning i biologiska analyser kan reproducera detta protokoll.
Introduction
Betacellerna i bukspottkörteln utsöndrar insulin som svar på stigande blodsockernivåer. Patienter som saknar tillräcklig insulinproduktion på grund av autoimmun nedbrytning av betaceller vid typ 1-diabetes (T1D)1, eller på grund av betacellsdysfunktion vid typ 2-diabetes (T2D)2, behandlas vanligtvis med administrering av exogent insulin. Trots denna livräddande behandling kan den inte exakt matcha den utsökta kontroll av blodsockret som uppnås genom dynamisk insulinutsöndring från äkta betaceller. Som sådan lider patienter ofta av konsekvenserna av livshotande hypoglykemiska episoder och andra komplikationer till följd av kroniska hyperglykemiska utflykter. Transplantation av humana liköar återställer framgångsrikt strikt glykemisk kontroll hos patienter med typ 1-diabetes, men begränsas av tillgången på ö-donatorer och svårigheter att rena friska öar för transplantation 3,4. Denna utmaning kan i princip lösas genom att använda hPSCs som ett alternativt utgångsmaterial.
Nuvarande strategier för att generera insulinfrisättande öar från hPSCs in vitro syftar ofta till att efterlikna processen för embryonal bukspottkörtelutveckling in vivo 5,6. Detta kräver kunskap om de ansvariga signalvägarna och tidsbestämd tillsats av motsvarande lösliga faktorer för att efterlikna kritiska stadier i den embryonala bukspottkörteln under utveckling. Bukspottkörtelprogrammet inleds med åtagandet i definitiv endoderm, som kännetecknas av transkriptionsfaktorerna forkhead box A2 (FOXA2) och könsbestämmande region Y-box 17 (SOX17)7. Successiv differentiering av definitiv endoderm involverar bildandet av ett primitivt tarmrör, som mönstras till en bakre framtarm som uttrycker pankreas- och duodenal homeobox 1 (PDX1)7,8,9, och epitelexpansion till pankreasprogenitorer som samuttrycker PDX1 och NK6 homeobox 1 (NKX6.1)10,11.
Ytterligare engagemang för endokrina ö-celler åtföljs av det transienta uttrycket av pro-endokrin huvudregulator neurogenin-3 (NGN3)12 och stabil induktion av nyckeltranskriptionsfaktorer, neuronal differentiering 1 (NEUROD1) och NK2 homeobox 2 (NKX2.2)13. Därefter programmeras de viktigaste hormonuttryckande cellerna, såsom insulinproducerande betaceller, glukagonproducerande alfaceller, somatostatinproducerande deltaceller och pankreaspolypeptidproducerande PPY-celler. Med denna kunskap, såväl som upptäckter från omfattande läkemedelsscreeningstudier med hög kapacitet, har de senaste framstegen möjliggjort generering av hPSC-öar med celler som liknar betaceller som kan utsöndra insulin 14,15,16,17,18,19.
Stegvisa protokoll har rapporterats för generering av glukosresponsiva betaceller 6,14,18,19. Baserat på dessa studier involverar detta protokoll användning av ett pankreasstamcellskit för att generera PDX1+/NKX6.1+ pankreasstamceller i en plan kultur, följt av aggregering av mikrobrunnsplattor i kluster av enhetlig storlek och ytterligare differentiering mot insulinfrisättande hPSC-öar med R-protokollet i en statisk 3D-suspensionskultur. Kvalitetskontrollanalyser, inklusive flödescytometri, immunfärgning och funktionsbedömning, utförs för rigorös karakterisering av de differentierande cellerna. Detta dokument ger en detaljerad beskrivning av varje steg i den riktade differentieringen och beskriver in vitro-karakteriseringsmetoderna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll är baserat på arbete med hPSC-linjer, inklusive H1, HUES4 PDXeG och Mel1 INSGFP/W, under matarfria förhållanden. En steg-för-steg-procedur beskrivs i detta avsnitt, med stödjande data från differentieringen av Mel1 INSGFP/W i avsnittet om representativa resultat. Vi rekommenderar att ytterligare optimering behövs när du arbetar med andra hPSC-linjer som inte anges här. Se materialtabellen för detaljer relaterade till alla reagenser och lösningar som används i detta protokoll.
1. Beredning av differentieringsmedier och lösningar
OBS: Se tabell 1 för alla lösningar som ska beredas och tabell 2 för differentieringsmediet.
- Förbered alla medier och reagenser för cellodling i ett sterilt biosäkerhetsskåp. Värm upp cellodlingsrelaterade lösningar och basala medier kort till 37 °C i ett bad före användning.
OBS: Som beskrivs nedan, gör nya differentieringsmedier dagligen genom att lägga till kosttillskott och använd dem samma dag. Alternativt ger pankreasprogenitorsatsen möjlighet att förbereda en större volym i förväg som kan användas under flera dagar enligt tillverkarens protokoll. Båda metoderna för medieberedning visar sig fungera bra. Observera att det inte rekommenderas att lämna media under en längre tid i vattenbadet. När du förbereder media färskt varje dag rekommenderas det att alikvotera kosttillskott för att undvika upprepade frys-upptiningscykler.
2. Differentiering av hPSCs till pankreas stamceller
- Upprätthåll odifferentierade hPSC:er på Matrigel-belagda kärl i mTeSR1 komplett medium och utför mediebyten dagligen. Under underhållsodling, passera hPSCs var 3-4:e dag när cellerna når ~70 % sammanflöde med hjälp av celldissociationsreagenset enligt tillverkarens protokoll. För att initiera differentiering, dissociera cellerna i enstaka celler och plantera dem på 6-brunnars eller 12-brunnars vävnadsodlingsbehandlade plattor (med medievolymer på 2 ml respektive 1 ml per brunn).
OBS: Se tabell 1 för instruktioner relaterade till förvaring av endoderm basalmedium och dess alikvoter. - Förbestryk odlingsbrunnarna med hESC-kvalificerad Matrigel (utspädd i iskall DMEM/F12 enligt tillverkarens protokoll) och placera plattan i en fuktad 37 °C, 5 % CO2 inkubator i 30 min.
- Flytta den Matrigel-belagda plattan till rumstemperatur (använd inom 3 timmar).
- Aspirera det förbrukade mediet från hPSC-kulturen och skölj en gång med DPBS. Dissociera hPSC-kulturen i enskilda celler med celldissociationsenzym vid 37 °C i 3-5 minuter. Skölj av cellerna genom att tillsätta varmt DMEM/F12-medium, överför till ett 15 ml eller 50 ml koniskt rör och centrifugera med 300 × g i 5 minuter.
- Återsuspendera cellpelleten med stamcellskomplett medium plus 10 μM Y-27632 och utför räkning av levande celler (trypanblått negativt) med en hemocytometer eller automatiserad cellräknare. Aspirera utspädd Matrigel och frö omedelbart levande celler med en densitet av 1,60-1,80 × 10 5/cm2 på Matrigel-belagda brunnar och inkubera i en fuktad 37 °C,5 % CO2 inkubator i 24 timmar. Gå vidare till steg 1.
OBS: Detta kommer att resultera i ~95 % startsammanflöde för att initiera differentiering. Enligt tillverkarens protokoll rekommenderas en såddtäthet på 2,6 × 105/cm2 . Det rekommenderas att testa olika såddtätheter för att bestämma det optimala värdet för en cellinje och för att kontrollera cellviabiliteten. Om lönsamheten är lägre än 80 % ska du inte fortsätta med differentieringen. Låg cellviabilitet kan vara ett resultat av översmältning eller övertriturering under skörd eller att celler lämnas under en längre tid i DMEM/F12-medium före sådd. - På steg 1 dag 1, värm kort endoderm basal medium till 37 °C i ett bad och tina Supplement MR och CJ. Förbered steg 1A-medium genom att tillsätta tillägg MR och CJ till endoderm basala medium. Blanda väl och använd omedelbart.
- Aspirera det förbrukade mediet från brunnar, tillsätt steg 1A medium och inkubera i en fuktad 37 °C, 5 % CO2 inkubator i 24 timmar.
OBS: Tvättsteg är onödiga. Ta bort alla celler som inte sitter fast från kulturen genom att försiktigt skaka odlingsplattan före mediebytet. Undvik att störa monolagret genom att inte vidröra pipettspetsen till brunnsbotten under borttagning av medium och genom försiktig mediumtillsats. - På steg 1 dag 2, värm endoderm basala mediet kort i ett 37 °C bad och tina Supplement CJ. Förbered steg 1B-mediet genom att tillsätta Supplement CJ till endoderm basala mediet. Blanda väl och använd omedelbart.
- Sug upp det förbrukade mediet från brunnarna, tillsätt steg 1B-medium och inkubera i en fuktad 37 °C, 5 % CO 2-inkubator i 24 timmar.
- På steg 1 dag 3, upprepa steg 2.8-2.9. Gå vidare till steg 2.
- På steg 2 dag 1, värm bukspottkörteln steg 2-4 basalt medium i ett 37 °C bad och tina Supplement 2A och 2B. Förbered steg 2A medium genom att tillsätta Tillägg 2A och 2B till bukspottkörteln Steg 2-4 Basal Medium. Blanda väl och använd omedelbart.
- Sug upp det förbrukade mediet från brunnar, tillsätt steg 2A-medium och inkubera i en fuktad 37 °C, 5 % CO2 inkubator i 24 timmar.
- På steg 2 dag 2, värm bukspottkörteln steg 2-4 Basal Medium i ett 37 °C bad och tina Supplement 2B. Förbered steg 2B medium genom att tillsätta Tillägg 2B till bukspottkörteln Steg 2-4 Basal Medium. Blanda väl och använd omedelbart.
- Sug upp det förbrukade mediet från brunnar, tillsätt steg 2B-medium och inkubera i en fuktad 37 °C, 5 % CO2 -inkubator i 24 timmar.
- På steg 2 dag 3, upprepa steg 2.13-2.14. Gå vidare till steg 3.
- På steg 3 dag 1, värm bukspottkörteln Steg 2-4 Basal Medium i ett 37 °C bad och tina Supplement 3. Förbered medium för steg 3 genom att tillsätta tillägg 3 till det basala mediet för steg 2-4 i bukspottkörteln. Blanda väl och använd omedelbart.
- Sug upp det förbrukade mediet från brunnar, tillsätt steg 3-medium och inkubera i en fuktad 37 °C, 5 % CO2 inkubator i 24 timmar.
- På steg 3 dag 2 och dag 3, upprepa steg 2.16-2.17. Gå vidare till steg 4.
- På steg 4 dag 1, värm bukspottkörteln Steg 2-4 Basal Medium i ett 37 °C bad och tina Supplement 4. Förbered medium för steg 4 genom att tillsätta tillägg 4 till det basala mediet för stadium 2-4 i bukspottkörteln. Blanda väl och använd omedelbart.
- Sug upp det förbrukade mediet från brunnar, tillsätt steg 4-medium och inkubera i en fuktad 37 °C, 5 % CO2 inkubator i 24 timmar.
- På steg 4 dag 2 till dag 4, upprepa steg 2.19-2.20. Gå vidare till aggregeringssteg.
3. Aggregering till pankreasprogenitorkluster med användning av mikrobrunnsplattor med en diameter på 400 μm
- På steg 4 dag 5, förbehandla mikrobrunnarna (t.ex. 24-håls plattformat) med 500 μL Anti-Adherence Rinsing Solution per brunn.
- Förbered en vågplatta och centrifugera mikrobrunnsplattan vid 1 300 × g i 5 minuter.
OBS: Kontrollera plattan under ett mikroskop för att säkerställa att inga bubblor finns kvar i mikrobrunnarna. Centrifugera igen i ytterligare 5 minuter om bubblor förblir instängda i någon mikrobrunn. - Aspirera Anti-Adherence Rinsing Solution från brunnarna och skölj en gång med 1 ml DPBS. Aspirera DPBS från brunnarna och tillsätt 1 ml aggregeringsmedium till varje brunn.
- Ta bort det förbrukade mediet från pankreasprogenitorkulturerna och tvätta en gång med DPBS. Dissociera kulturerna i enskilda celler med dissociationsreagens vid 37 °C i 10–12 min. Skölj av cellerna med varm DMEM/F12, överför dem till ett rör och centrifugera med 300 × g i 5 minuter.
- Återsuspendera cellpelleten i aggregeringsmediet och utför live-cellräkning. Sådd 2,4-3,6 miljoner totala celler per brunn (dvs. 2 000-3 000 celler per mikrobrunn) och tillsätt aggregeringsmedium till varje brunn för att uppnå en slutlig volym på 2 ml per brunn.
- Pipettera försiktigt cellerna upp och ner flera gånger med en P1000-pipettspets för att säkerställa en jämn fördelning av cellerna i hela brunnen. För inte in bubblor i mikrobrunnar. Centrifugera mikrobrunnsplattan vid 300 × g i 5 minuter för att fånga upp cellerna i mikrobrunnarna. Inkubera mikrobrunnsplattan i en fuktad 37 °C, 5 % CO2 -inkubator för 24 timmars aggregering och fortsätt till steg 5-7 differentiering.
OBS: Var försiktig så att du inte stör plattan under aggregeringstiden. Upp till 48 timmars inkubationstid kan behövas för optimal aggregatbildning.
4. Differentiering av kit-härledda pankreasprogenitorkluster till hPSC-öar
- På steg 5 dag 1, värm steg 5-7 basalt medium i ett 37 °C bad och tina tillskott (se tabell 1 och tabell 2). Bered steg 5-medium genom att tillsätta tillskott (till slutliga arbetskoncentrationer) till steg 5-7 basalmediet. Blanda väl och använd omedelbart.
- Efter aggregatbildning, pipettera försiktigt aggregaten upp och ner flera gånger med en P1000-pipettspets för att flyta eventuella icke-aggregerade celler. Låt aggregaten sedimentera med hjälp av gravitationen (vänta i ~1 min). Ta försiktigt bort det förbrukade mediet (som innehåller de flytande icke-aggregerade cellerna) från brunnen så mycket som möjligt samtidigt som du undviker aspirerande aggregat.
- Fördela färskt medium för steg 5 kraftigt på ytan av mikrobrunnsplattan för att få bort ballast från mikrobrunnarna. Överför ballast till 6-brunnar med ultralåg infästning (ULA). Skölj en gång med steg 5-medium för att helt hämta aggregat från mikrobrunnarna.
- Samla in alla aggregat i ULA 6-brunnarna, återsuspendera aggregat i steg 5-medium och justera densiteten till 20 kluster per 100 μL (t.ex. förväntas ~1 200 kluster hämtas från varje brunn. Återsuspendera 1 200 kluster i 6 ml steg 5-medium). Använd en flerkanalspipett för att dispensera 50 μL steg 5-medium i varje brunn på en ULA-platta med platt botten med 96 brunnar. Fyll hörn- och kantbrunnarna med 200 μL DPBS.
OBS: Undvik att använda kantbrunnarna för att odla aggregat eftersom de är benägna att avdunsta mer; Annars, använd en 96-hålsplatta som är utformad för att minimera avdunstning längs kanterna (t.ex. 96-hålsplattor med inbyggda vallgravar) eller placera odlingsplattan i en mikroklimatcellkulturinkubator med hög luftfuktighet. - Tillsätt 100 μl av klusterresuspensionen till varje brunn på ULA-plattan med 96 brunnar, vilket ger totalt 150 μL odlingsmedium som innehåller i genomsnitt 20 kluster per brunn.
OBS: Blanda försiktigt klusterblandningen varje gång innan den doseras i 96-brunnar. - Placera odlingsplattorna på en plan yta i en fuktad 37 °C, 5 % CO2 inkubator i 24 timmar.
- På steg 5 dag 2, förbered steg 5 medium enligt steg 4.1.
- Använd en flerkanalspipett för att avlägsna ~90 μL av det förbrukade mediet från varje brunn och uppdatera med 100 μL steg 5-medium.
- På steg 5 dag 3, upprepa steg 4.7-4.8. Gå vidare till steg 6.
- På steg 6 dag 1, värm steg 5-7 basalt medium i ett 37 °C bad och tina tillskott (se tabell 1 och tabell 2). Bered steg 6-medium genom att tillsätta tillskott (till slutliga arbetskoncentrationer) till steg 5-7 basalmedium. Blanda väl och använd omedelbart.
- Använd en flerkanalspipett för att ta bort ~90 μL av det förbrukade mediet och uppdatera med 100 μL steg 6-medium per brunn.
- På steg 6 dag 2 till dag 8, upprepa steg 4.10-4.11. Gå vidare till steg 7.
- På steg 7 dag 1, värm steg 5-7 basalt medium i ett 37 °C bad och tina tillskott (se tabell 1 och tabell 2). Bered steg 7-medium genom att tillsätta tillskott (till slutliga arbetskoncentrationer) till steg 5-7 basalmedium. Blanda väl och använd omedelbart.
- Använd en flerkanalspipett för att avlägsna ~90 μL av det förbrukade mediet och uppdatera med 100 μL steg 7-medium per brunn.
- På steg 7 dag 2 till dag 12, upprepa steg 4.13-4.14. Fortsätt med in vitro-karakterisering.
5. Flödescytometrisk analys
- Ta bort odlingsmedia och tvätta en gång med DPBS. Separera kulturerna (plana stamceller eller differentierande kluster) till enskilda celler med dissociationsreagens genom inkubation vid 37 °C i 10–12 minuter. Skölj med FACS-buffert och centrifugera vid 300 × g i 5 minuter.
- Återsuspendera cellpelleten i FACS-bufferten och utför cellräkning. Centrifugera cellerna i 300 × g i 5 min. Återsuspendera enstaka celler i 500 μL Fix/Perm-buffert i 10 minuter vid rumstemperatur.
OBS: Ta Fix/Perm-bufferten till rumstemperatur före användning. Fix/Perm-bufferten innehåller paraformaldehyd (PFA). Hantera PFA försiktigt i ett dragskåp och kassera enligt institutionens riktlinjer. - Centrifugera med 500 × g i 3 minuter, tvätta två gånger med 500 μL 1x Perm/Wash-buffert och återsuspendera i 300 μL 1x Perm/Wash-buffert. Överför 100 μl encellsresuspension (var och en innehållande 2,5–3 × 105 celler) till tre mikrofugerör för ofärgad kontroll, isotypkontroll och antikroppsfärgning (se materialtabell för information om provantikroppar och spädning). Inkubera i 45 minuter i rumstemperatur och täck med folie.
- Centrifugera med 500 × g i 3 min. Tvätta två gånger med 500 μL 1x Perm/Wash-buffert. Återsuspendera proverna i 100 μL FACS-buffert och analysera de färgade cellerna (se materialtabell för intracellulär färgning av markörer i specifika steg) med en flödescytometer och programvara (t.ex. FlowJo).
OBS: Om proverna inte analyseras omedelbart, förvara dem vid 4°C skyddade från ljus. För grind-strategin är flödesdata först reglerade med spridningsegenskaper (FSC-A och SSC-A) för att ta bort små cellulära skräp följt av FSC-A- och FSC-breddegenskaper för att identifiera singlets. Positiv och negativ reglering bestäms av stamcellskontroller och/eller ofärgade isotypkontroller.
6. Immunfärgning av hela fästet
- Samla kluster i ett mikrofugerör. Sedimentera kluster med hjälp av gravitationen. Aspirera det förbrukade mediet och skölj en gång med 1 ml PBS (med kalcium och magnesium). Fixera klustren med 1 ml 4 % PFA vid 4 °C över natten.
- Skölj en gång med PBST och permeabilisera 20-30 kluster med 500 μL 0.3 % TritonX-100 i ett mikrofugerör vid omgivningstemperatur i minst 6 timmar på en lutningsskakare.
OBS: En längre permeabiliseringstid (upp till 24 timmar) behövs för stora kluster. - Inkubera klustren i 100 μl blockerande buffert vid omgivningstemperatur i 1 timme på en vippskakapparat. Ta bort blockeringsbufferten och inkubera klustren med 100 μl primära antikroppar utspädda i antikroppsutspädningsbuffert vid omgivningstemperatur över natten på en vippskakare.
OBS: Om bakgrunden är stark under avbildningen, inkubera med primära antikroppar vid 4 °C. - Tvätta 3 x 30 min med 500 μL PBST noggrant på en lutningsskakare (lutningsvinkeln inställd på 8, hastigheten inställd på 20).
- Inkubera klustren med 100 μL sekundära antikroppar i en antikroppsutspädningsbuffert vid omgivningstemperatur över natten på en tiltskakare. Täck rören med folie.
OBS: Om bakgrunden är stark under avbildningen, inkubera med sekundära antikroppar vid 4 °C. - Skölj en gång med 500 μL PBST. Tillsätt 100 μl 4',6-diamidino-2-fenylindollösning (DAPI) (10 μg/ml i PBST) och färga vid rumstemperatur i 10-15 min. Täck med folie och skydda mot ljus.
- Tvätta 3 x 30 min med 500 μL PBST noggrant på en vippskakare. Täck rören med folie under tvättsteget.
- Fäst klustren på bildkammarglas (se materialtabellen) som är förbelagda med vävnadslim enligt tillverkarens protokoll och publicerade protokoll20,21.
- Montera med vävnadsrensmedel (80% glycerol i PBS-lösning) och täck med täckglas av glas. Skydda mot ljus fram till konfokal avbildning.
OBS: Om samples inte avbildas omedelbart, förvara dem vid 4 °C skyddade från ljus.
7. Statisk GSIS-analys
- Varm Kreb's Ringer bikarbonatbuffert (3,3 G KRB) med låg glukoshalt, KRB-buffert med hög glukoshalt (16,7 G) och 30 mM KCl KRB-buffert i ett bad med 37 °C.
- Handplocka storleksmatchade kluster och skölj med 2 ml varm 3,3 G KRB-buffert. Överför klustren till icke-vävnadskulturbehandlade 6-brunnsplattor och jämvikt i 2 ml varm 3,3 G KRB-buffert i 1 timme i en fuktad 37 °C, 5 % CO 2-inkubator.
- Efter jämvikt, fyll analyskammaren (se materialtabellen) med 100 μL varm 3.3G KRB-buffert. Handplocka fem kluster och överför dem till mitten av analyskammaren. Inkubera i 30 minuter i en fuktad 37 °C, 5 % CO2 inkubator.
OBS: Använd 10 μL pipettspetsar för överföring av kluster med minimal medelvolym. - Samla försiktigt upp ~100 μl av supernatanten och förvara den vid -30 °C tills basinsulinsekretionen mäts (se steg 7.9). Torka eller tappa inte några kluster i detta steg. Tillsätt omedelbart 100 μL varm 16,7 G KRB-buffert i analyskammaren och inkubera samma kluster i 30 minuter i en fuktad 37 °C, 5 % CO2 -inkubator.
- Samla försiktigt upp ~100 μl av supernatanten och förvara den vid -30 °C tills den glukosstimulerade insulinutsöndringen mäts (se steg 7.9). Tillsätt omedelbart 100 μL varm 30 mM KCl KRB-buffert i analyskammaren och inkubera samma kluster i 30 minuter i en fuktad 37 °C, 5 % CO2 inkubator.
- Samla försiktigt upp ~100 μl av supernatanten och förvara vid -30 °C tills den KCl-stimulerade insulinutsöndringen mäts (se steg 7.9). Tillsätt omedelbart 100 μl RIPA-lysbuffert till analyskammaren och överför lysbufferten som innehåller alla fem klustren till ett mikrofugerör.
- Valfritt) Bryt klustren manuellt genom kraftig triturering med en P200-pipettspets. Virvla i 30 s och inkubera på is i 30 minuter följt av ytterligare 30 s virvlande.
OBS: Säkerställ fullständig lys genom virvlning och tillräcklig inkubationstid på is. - Centrifugera med 8 000 × g i 1 min. Samla upp supernatanten och förvara vid -30 °C tills den totala insulinhalten mäts (se steg 7.9).
- Mät humant insulin i supernatantproverna med hjälp av ett humant insulin ELISA-kit enligt tillverkarens protokoll och publicerade protokoll20,22.
OBS: Undvik upprepad frysning och upptining av supernatantprover. Prover med mer än tre frys- och upptiningscykler bör inte analyseras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi utvecklade en hybridstrategi för att differentiera stamceller till insulinfrisättande hPSC-öar i sju steg, som använder ett pankreasprogenitor-kit för de första fyra stadierna i plan odling, följt av ett modifierat protokoll som bygger på en tidigare rapporterad metod6 i en statisk suspensionskultur för de tre sista stadierna (Figur 1). Med detta protokoll är det avgörande att säkerställa en nära sammanflöde (90%-100%) kultur 24 timmar efter cellsådd (steg 0) för att initiera en effektiv differentiering för de flesta hPSC-linjer (Figur 2A). Att testa olika såddtätheter rekommenderas starkt för att bestämma det optimala tillståndet för en viss cellinje. Under odling i steg 1 kommer mediet sannolikt att se grumligt ut på grund av flytande döda celler, som vanligtvis observeras i detta skede. Detta äventyrar inte satsens differentieringseffektivitet så länge de anslutna cellerna helt täcker kärlytan. Under steg 2-4, när cellerna förökar sig och celldöden minskar, blir monolagren mer komprimerade och de förbrukade medierna är inte lika grumliga som under steg 1 (Figur 2A). Som visats med insulinrapportören Mel1 INSGFP/W hESCs kan minst 95 % FOXA2+/SOX17+ definitiva endodermceller i slutet av steg 1 och 80 % PDX1+/NKX6.1+ pankreasstamceller i slutet av steg 4 uppnås rutinmässigt (figur 2B-E). Övergången av pankreasprogenitorceller från plan odling till suspensionsodling har visat sig främja efterföljande endokrin cellinduktion23,24. I detta uppdaterade protokoll använder vi mikrobrunnsplattor och tillåter 24 timmars cellaggregering. Detta genererar tusentals pankreasprogenitorkluster med enhetlig storlek och morfologi åt gången (Figur 3A, B), och den genomsnittliga aggregeringseffektiviteten (genom att beräkna andelen celler som är inkorporerade i aggregat) är 74,1 % ± 4,4 % (Figur 3C). Det är viktigt att notera att uttrycket av PDX1 och NKX6.1 bibehålls på höga nivåer i dessa kluster efter aggregering (Figur 3D, E), vilket tyder på en effektiv produktion av pankreasprogenitorer in vitro med differentieringssatsen och mikrobrunnsplattan.
Därefter använder vi R-protokoll (en metod modifierad från Rezania et al.6) för den sista 3-stegsdifferentieringen i ett statiskt suspensionsodlingssystem med hjälp av ULA-plattor med platt botten från 96 brunnar för att ytterligare differentiera dessa kit-härledda pankreasförfäder mot hPSC-öar (figur 1). Insulinuttryckande celler induceras gradvis i endokrina kluster, vilket indikeras av de ökade INS-GFP-signalerna i levande kulturer över tid (Figur 4A, B). Kvantifiering av klusterstorlek visar att den genomsnittliga diametern för kluster i steg 5 är 150 μm och i steg 7 ökar den genomsnittliga diametern till 220 μm (figur 4C). Klustren behåller huvudsakligen sitt släta, sfäriska utseende när de växer mellan steg 5 och steg 7, vilket tyder på att den statiska odlingsmetoden begränsar klusterklumpning jämfört med orbital shaker-baserade suspensionskulturer (som vanligtvis genererar vissa överdimensionerade kluster)25. Upprätthållande av komprimerade kluster med slät sfärisk morfologi är en indikator på god livskraft hos de differentierande cellerna, vilket är viktigt för en framgångsrik differentiering mot funktionella hPSC-öar i slutändan.
Karakterisering av cellsammansättning visar att hPSC-öar i steg 7 som genereras av hybridprotokollet huvudsakligen är endokrina och består av fyra huvudtyper av ö-celler, inklusive insulinpositiva betaceller, glukagonpositiva alfaceller, somatostatinpositiva deltaceller och pankreaspolypeptidpositiva PPY-celler, medan enterokromaffinceller (härledda från en off-target-linje26) också är närvarande (Figur 5A-C). Noterbart är att detta hybridprotokoll till stor del genererar monohormonella ö-celler (~50 % CPEP+/GCG-/SST-celler, ~17 % GCG+/CPEP-celler och ~12 % SST+/CPEP-celler) och endast en minoritet av bihormonella celler (CPEP+/GCG+ eller CPEP+/SST+) i steg 7-kulturer (Figur 5B-D). Undersökning av flera nyckeltranskriptionsfaktorer och mogna betacellsmarkörer i stadium 7 hPSC-öar visar att differentierande betaceller uttrycker PDX1, NKX6.1, NEUROD1, MAFA och glukostransportören GLUT1 (Figur 6A). Dessutom induceras ~60 % INS+/PDX1+-celler (figur 6B) och 50 % CPEP+/NKX6.1+-celler (figur 6C) i steg 7-kulturerna, vilket tyder på en effektiv generering av funktionella betaceller med hjälp av hybridstrategin som presenteras här. Faktum är att in vitro statiska glukosstimulerade insulinutsöndringsanalyser (GSIS) visar att stadium 7 hPSC-öar kan utsöndra höga nivåer av insulin som svarar på både högt glukos och direkt depolarisering (Figur 6D). Även om denna funktion är uppmuntrande, är glukosresponsen in vitro från hPSC-öar fortfarande inte likvärdig med den hos liköar när det gäller storleken på insulinutsöndringen (Figur 6D) och den totala insulinhalten i hPSC-öar är ungefär hälften så hög som i liköar (Figur 6E). Fortsatt optimering krävs för att uppnå hPSC-öar med mer mogna betacellsfenotyper.
Figur 1: Översikt över differentieringsschema för generering av funktionella hPSC-öar in vitro. Arbetsflödesdiagrammet ger en översikt över den sjustegsprocedur som är involverad i differentieringen av hPSCs till pankreasstamceller i en plan kultur med hjälp av pankreasstamcellssatsen, aggregering till pankreasprogenitorkluster med hjälp av mikrobrunnsplattor och övergång till hPSC-öar i en statisk suspensionskultur. En insulinreporter hESC-linje, Mel1 INSGFP/W, används i hela denna studie som ett exempel för att demonstrera effektiviteten av denna hybridmetod. Förkortningar: hPSCs = humana pluripotenta stamceller; GSIS = glukosstimulerad insulinutsöndring. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Riktad differentiering av hPSCs till pankreasstamceller med hjälp av pankreasstamcellssatsen. A) Representativa faskontrastbilder som visar cellmorfologi i de angivna stadierna. Skalstaplar = 750 μm. (B, C) Representativa flödescytometridiagram för nyckelmarkörer för (B) definitiva endodermceller i steg 1 (FOXA2+/SOX17+) och (C) stadium 4 pankreasprogenitorceller (PDX1+/NKX6.1+). (D) Representativa immunfärgningsbilder av pankreasprogenitorceller för PDX1 (röd) och NKX6.1 (grön). Kärnorna färgades med DAPI (blått). Skalstapel = 200 μm. (E) Flödescytometrisk kvantifiering av PDX1+/NKX6.1+-celler i steg 4 dag 4 pankreas stamceller monolager (n = 5 biologiska replikat). Förkortningar: hPSCs = humana pluripotenta stamceller; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Aggregering till pankreasprogenitorkluster av enhetlig storlek med användning av mikrobrunnsplattor med en diameter på 400 μm. A) Representativa faskontrastbilder i slutet av steg 4 som visar klustermorfologi i mikrobrunnen och efter uttag från mikrobrunnen. Skalstreck = 300 μm. (B) Kvantifiering av klusterdiameter i slutet av steg 4 (n = 60 kluster från 3 biologiska replikat). C) Kvantifiering av aggregeringseffektiviteten i slutet av steg 4 (n = 5 biologiska replikat). (D) Representativa immunfärgningsbilder av pankreasprogenitorkluster för PDX1 (röd) och NKX6.1 (grön). Kärnorna färgades med DAPI (blått). Skalstapel = 100 μm. (E) Flödescytometrisk kvantifiering av PDX1+/NKX6.1+-celler i steg 4 dag 5 pankreasprogenitoraggregat (n = 4 biologiska replikat). Förkortning: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Differentiering av pankreas progenitorer till hPSC-öar i ett statiskt suspensionsodlingssystem . (A) Representativa faskontrastbilder (övre panelen) och fluorescerande bilder (nedre panelen) som visar klustermorfologi och insulinuttrycksmönster vid indikerade stadier. Skalstreck = 300 μm. (B) Kvantifiering av genomsnittlig fluorescerande INS-GFP-intensitet per kluster vid indikerade stadier (n = 30 kluster från två biologiska replikat). C) Kvantifiering av klusterdiametern i angivna stadier (n = 60 kluster från tre biologiska replikat). Förkortningar: hPSC = human pluripotent stamcell; INS = insulin; GFP = grönt fluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Karakterisering av cellsammansättning i hPSC-öar i stadium 7. (A) Representativa immunfärgningsbilder av hPSC-öar i stadium 7 som visar olika celltyper (SYN, pan-endokrin markör; CK19, duktal markör; INS-GFP, insulin indikeras av rapportörens GFP-signaler; Samordning av gasförsörjningen. SST; PPY; ENC färgades av SLC18A1 antikropp). Kärnorna färgades med DAPI (blått). Skalstaplar = 100 μm. (B,C) Representativa flödescytometridiagram för (B) procentandelen CPEP+- och GCG+-celler i hPSC-öar i stadium 7 och (C) procentandelen CPEP+- och SST+-celler i hPSC-öar i steg 7. (D) Flödescytometrikvantifiering av indikerade cellmarkörer i steg 7 hPSC-öar (n = 4 biologiska replikat). Förkortningar: hPSC = human pluripotent stamcell; INS = insulin; GFP = grönt fluorescerande protein; SYN = synaptofysin; GCG = glukagon; SST = somatostatin; PPY = polypeptid i bukspottkörteln, ENC = enterokromaffin, CPEP = C-peptid; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: In vitro-karakterisering och funktionsbedömning av hPSC-öar i stadium 7. (A) Representativa immunfärgningsbilder av hPSC-öar i stadium 7 som visar samuttryck av insulin (indikerat av rapportör INS-GFP-signaler) med flera viktiga betacellsmarkörer, såsom NKX6.1, MAFA, NEUROD1, PDX1 och glukostransportören GLUT1. Kärnorna färgades med DAPI (blått). Skalstaplar = 100 μm. (B,C) Representativa flödescytometridiagram för (B) procentandelen INS+/PDX1+-celler och (C) procentandelen CPEP+/NKX6.1+-celler. (D) Statiska GSIS-analyser som visar insulinfrisättning från hPSC-öar i stadium 7 (n = 6 inklusive 3 biologiska och 2 tekniska replikat) och humana öar (n = 6 inklusive 3 biologiska och 2 tekniska replikat) som svar på högt glukos (16,7 G, 16,7 mM glukos) och 30 mM KCl-depolarisering. Data presenteras som medelvärde ± SEM. Ett oparat tvåsidigt t-test (**p < 0,01) användes för att jämföra mellan två indikerade grupper. (E) Total insulinhalt i hPSC-öar i stadium 7 (n = 6 inklusive 3 biologiska och 2 tekniska replikat) och humana öar (n = 6 inklusive 3 biologiska och 2 tekniska replikat). Ett oparat tvåsidigt t-test (*p < 0,05) användes för att jämföra de två grupperna. Förkortningar: hPSC = human pluripotent stamcell; INS = insulin; GFP = grönt fluorescerande protein; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Formulering av alla lösningar och medier som används i detta protokoll. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Formulering av differentieringsmedier i steg 1-7. Tabellen innehåller receptet för att förbereda differentieringsmediet för steg 1-7. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna artikel beskriver ett hybridprotokoll i sju steg som möjliggör generering av hPSC-öar som kan utsöndra insulin vid glukosprovokation inom 40 dagar efter odling in vitro. Bland dessa flera steg tros effektiv induktion av definitiv endoderm vara en viktig utgångspunkt för de slutliga differentieringsresultaten18,27,28. I tillverkarens protokoll rekommenderas en sådddensitet på 2,6 × 105/cm2 för att initiera differentiering, och cellerna exponeras för steg 1-media i 2 dagar. För att säkerställa att cellerna når nära sammanflöde på dag 1 (90%-100%) rekommenderar vi starkt att du testar såddtätheten när du arbetar med en ny hPSC-linje eftersom den optimala såddtätheten kan variera. Till exempel, med alla tre hPSC-linjer som testades i våra händer, visade sig 1,6-1,80 × 10 5/cm 2, snarare än 2,60 × 105/cm2, vara en optimal såddtäthet. Förlängning av odlingstiden för steg 1 från 2 dagar till 3 dagar med ytterligare en dag i steg 1B-medium ökar renheten hos FOXA2+/SOX17+-celler från 80 % till > 93 % (data visas inte). Om andelen FOXA2+/SOX17+-celler är lägre än 70 % i slutet av steg 1 kommer induktion av PDX1+-celler och PDX1+/NKX6.1+-celler sannolikt att äventyras.
Det är viktigt att notera att viss celldöd kan observeras under hela steg 1-odlingen medan de bifogade cellerna måste täcka 100 % av ytan. Under steg 2-4 resulterar minskningen av celldöd samtidigt med cellproliferation i komprimerade och flerskiktade celler, vilket har rapporterats vara avgörande för effektiv induktion av pankreasprogenitormarkörerna PDX1 och NKX6.1 och deras nukleära lokalisering29,30. På den sista dagen i steg 4 dissocieras cellerna och aggregeras till kluster med hjälp av AggreWells mikrobrunnsplattor med en diameter på 400 μm. Jämfört med andra metoder, t.ex. suspenderad aggregering, manuell aggregering eller användning av 96-brunnars U-bottenplattor, genererar AggreWell-aggregering tusentals sfäriska kluster med enhetlig storlek, vilket illustrerar robustheten i denna metod.
För endokrin induktion under steg 5-7 i en statisk 3D-kultur överför vi ett genomsnittligt antal ~20 kit-härledda pankreasprogenitorkluster till varje brunn med ULA plattbottnade 96-brunnsplattor. Denna metod minskar kraftigt bildandet av överdimensionerade kluster och förbättrar cellviabiliteten, möjligen genom att begränsa klusterfusion och/eller minska skjuvspänningsmedierad cellförlust under orbital shakerodling. Om du vill ta bort flytande döda celler i förbrukade medier och samtidigt minska risken för att kluster går förlorade vid mediebyte rekommenderar vi att du uppdaterar cirka två tredjedelar av den totala medievolymen. Vi noterar att denna partiella förändring av mediet inte hämmar den endokrina differentieringen och istället kan erbjuda en mjuk övergång vid växling mellan olika stadier. Icke desto mindre kan viss celldöd fortfarande observeras under steg 5 och tidigt stadium 6 med detta hybridprotokoll vid övergång från plan odling till statisk suspensionsodling. Reporter hPSC-linjer (till exempel Mel1 INSGFP/W hESC) är användbara för att övervaka differentiering i sent stadium i levande kulturer. Löpande flödescytometri hjälper till att undersöka NKX6.1+/NEUROD1+ i slutet av steg 5, INS+/NKX6.1+ i slutet av steg 6 och CPEP+/NKX6.1+ i slutet av steg 7. Effektiv induktion av CPEP+-populationer som samuttrycks med NKX6.1 är avgörande för att uppnå glukosrespons i betaceller31,32. I detta avseende genererar detta protokoll konsekvent >50 % CPEP+/NKX6.1+-celler i de resulterande hPSC-öarna i steg 7 som kan utsöndra insulin som svar på en hög glukosutmaning in vitro.
Även om det nuvarande protokollet har visat en effektiv generering av insulinproducerande hPSC-öar, finns det begränsningar för denna metod. Differentieringseffektiviteten i slutet av steg 4 från olika hPSC-linjer, särskilt iPSC, med detta pankreasprogenitor-kit kan fortfarande vara variabel (data visas inte). Optimering bör utföras från fall till fall. Denna metod för de tre sista stadierna av differentiering bygger på användning av statisk suspensionskultur i 96-brunnars plattor, vilket är arbetsintensivt och inte skalbart, vilket begränsar dess användning till endast forskning. Även om det är uppmuntrande att uppnå insulinfrisättande förmåga, är glukosresponsen in vitro och insulinhalten hos hPSC-öar betydligt lägre än hos likhåliga öar. Framtida insatser krävs fortfarande för fortsatt protokolloptimering. Trots dessa begränsningar tror vi att det protokoll som presenteras här tillhandahåller hPSC-härledda material som är lämpliga för screening av differentieringsinducerande faktorer och regulatorer av ö-hormonutsöndring, samt för modellering av ö-cellsdysfunktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Timothy J. Kieffer var anställd av ViaCyte under utarbetandet av detta manuskript. De övriga författarna uppger att de inte har några motstridiga intressen.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för stödet från STEMCELL Technologies, Michael Smith Health Research BC, Stem Cell Network, JDRF och Canadian Institutes of Health Research. Jia Zhao och Shenghui Liang är mottagare av Michael Smith Health Research BC Trainee Award. Mitchell J.S. Braam är mottagare av Mitacs Accelerate Fellowship. Diepiriye G. Iworima är mottagare av Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship och CFUW 1989 Ecole Polytechnique Commemorative Award. Vi tackar uppriktigt Dr. Edouard G. Stanley från MCRI och Monash University för att de delar med sig av Mel1 INS GFP/W-linjen och Alberta Diabetes Institute Islet Core för att isolera och distribuera mänskliga öar. Vi tackar också för stödet från Life Sciences Institute Imaging and Flow Cytometry vid University of British Columbia. Figur 1 skapades med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma | T6397 | Thyroid hormone |
| 4% PFA solution | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Should be handled in fume hood |
| 96-Well, Ultralow Attachment, flat bottom | Corning Costar (VWR) | CLS3474 | Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 07920 | Dissociation reagent for Stage 4 cells |
| Aggrewell400 plates | STEMCELL Technologies | 34415 | 400 µm diameter microwell plates |
| Aggrewell800 plates | STEMCELL Technologies | 34815 | 800 µm diameter microwell plates |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG) | R&D Systems | IC2400G | 1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control | R&D Systems | IC108G | 1:100 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B) | BD Sciences | 566032 | 1:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype Control | R&D Systems | IC0041G | 1:500 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ) | BD Pharmingen | 565831 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565689 | 1:2,000 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 563338 | 1:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 562594 | 1:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 557714 | 1:50 in flow cytometry |
| ALK5i II | Cayman Chemicals | 14794 | TGF-beta signaling inhibitor |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies | 7010 | Microwell Rinsing Solution |
| Assay chamber | Cellvis | D35-10-1-N | For static GSIS and confocal imaging purposes |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | BP1600-100 | For immunostaining procedure |
| CK19 antibody | DAKO | M0888 | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| D-glucose | Sigma | G8769 | Medium supplement |
| DAPI | Sigma | D9542 | For nuclear counterstaining |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Matrix diluting solution |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 555 | Life technologies | A21432 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21447 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31570 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31571 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31572 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31573 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21448 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| DPBS | Sigma | D8537 | Without Ca2+ and Mg2+ |
| ELISA, insulin, human | Alpco | 80-INSHU-E01.1 | For human insulin measurement |
| Fatty acid-free BSA | Proliant | 68700 | Medium supplement |
| Fixation and Permeabilization Solution Kit | BD Sciences | 554714 | Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | For clump passaging hPSCs during maintenance culture |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | 1:400 in whole mount immunofluorescence |
| GLUT1 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA1-37782 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| GlutaMAX-I (100x) | Gibco | 35050061 | L-glutamine supplement |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G33-4 | For tissue clearing and mounting |
| GSi XX | Sigma Millipore | 565789 | Notch inhibitor |
| Heparin | Sigma | H3149 | Medium supplement |
| ITS-X (100x) | Thermo Fisher Scientific | 51500056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement |
| LDN193189 | STEMCELL Technologies | 72147 | BMP antagonist |
| MAFA antibody | Abcam | ab26405 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Matrigel, hESC-qualified | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | Extracellular matrix for vessel surface coating |
| MCDB131 medium | Life technologies | 10372019 | Base medium |
| mTeSR1 Complete Kit | STEMCELL Technologies | 85850 | stem cell medium and 5x supplement included |
| N-Cys (N-acetyl cysteine) | Sigma | A9165 | Antioxidant |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | Medium supplement |
| NEUROD1 antibody | R&D Systems | AF2746 | 1:20 in whole mount immunofluorescence |
| NKX6.1 antibody | DSHB | F55A12-c | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| Pancreatic polypeptide antibody | R&D Systems | AF6297 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PBS | Sigma | D8662 | With Ca2+ and Mg2+ |
| PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565860 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 563023 | 1:250 in flow cytometry |
| PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 562161 | 1:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| PE Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 554680 | 1:2,000 in flow cytometry |
| PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k) | BD Sciences | 564563 | 1:200 in flow cytometry |
| R428 | Cayman Chemicals | 21523 | AXL tyrosine kinase inhibitor |
| Retinoid acid, all-trans | Sigma | R2625 | Light-sensitive |
| RIPA lysis buffer, 10x | Sigma | 20-188 | For hormone extraction |
| SANT-1 | Sigma | S4572 | SHH inhibitor |
| SLC18A1 antibody | Sigma | HPA063797 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Somatostatin antibody | Sigma | HPA019472 | 1:100 in whole mount immunofluorescence |
| STEMdiff Pancreatic Progenitor Kit | STEMCELL Technologies | 05120 | Basal media and supplements included |
| Synaptophysin antibody | Novus | NB120-16659 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | For permeabilization |
| Trolox | Sigma Millipore | 648471 | Vitamin E analog |
| TrypLE Enzyme Express | Life technologies | 12604-021 | cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs |
| Trypsin1/2/3 antibody | R&D Systems | AF3586 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | ROCK inhibitor |
| Zinc sulfate | Sigma | Z0251 | Medium supplement |
References
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W.
- Petersen, M. C., Shulman, G. I.
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
- Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. The journey of islet cell transplantation and future development. Islets. 10 (2), 80-94 (2018).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
- Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
- Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
- Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
- Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
- Rukstalis, J. M., Habener, J. F. Neurogenin3: a master regulator of pancreatic islet differentiation and regeneration. Islets. 1 (3), 177-184 (2009).
- Mastracci, T. L., Anderson, K. R., Papizan, J. B., Sussel, L. Regulation of Neurod1 contributes to the lineage potential of Neurogenin3+ endocrine precursor cells in the pancreas. PLoS Genetics. 9 (2), e1003278 (2013).
- Balboa, D., et al. Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells. Nature Biotechnology. 40 (7), 1042-1055 (2022).
- Du, Y., et al. Human pluripotent stem-cell-derived islets ameliorate diabetes in non-human primates. Nature Medicine. 28 (2), 272-282 (2022).
- Hogrebe, N. J., Augsornworawat, P., Maxwell, K. G., Velazco-Cruz, L., Millman, J. R. Targeting the cytoskeleton to direct pancreatic differentiation of human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 38 (4), 460-470 (2020).
- Yoshihara, E., et al. Immune-evasive human islet-like organoids ameliorate diabetes. Nature. 586 (7830), 606-611 (2020).
- Mahaddalkar, P. U., et al. Generation of pancreatic beta cells from CD177(+) anterior definitive endoderm. Nature Biotechnology. 38 (9), 1061-1072 (2020).
- Liang, S., et al. Differentiation of stem cell-derived pancreatic progenitors into insulin-secreting islet clusters in a multiwell-based static 3D culture system. Cell Reports Methods. 3, 10046 (2023).
- Zhao, J., et al. In vivo imaging of beta-cell function reveals glucose-mediated heterogeneity of beta-cell functional development. Elife. 8, e41540 (2019).
- Zhao, J., et al. In vivo imaging of calcium activities from pancreatic beta-cells in zebrafish embryos using spinning-disc confocal and two-photon light-sheet microscopy. Bio-protocol. 11 (23), e4245 (2021).
- Liang, S., et al. Carbon monoxide enhances calcium transients and glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta-cells by activating phospholipase C signal pathway in diabetic mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 582, 1-7 (2021).
- Bruin, J. E., et al. Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice. Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).
- Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
- Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
- Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro beta-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
- D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Jiang, Y., et al. Generation of pancreatic progenitors from human pluripotent stem cells by small molecules. Stem Cell Reports. 16 (9), 2395-2409 (2021).
- Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190 (2020).
- Mamidi, A., et al. Mechanosignalling via integrins directs fate decisions of pancreatic progenitors. Nature. 564 (7734), 114-118 (2018).
- Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells. 31 (11), 2432-2442 (2013).
- Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).
