Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Differensiering av humane pluripotente stamceller i insulinproduserende øyklynger

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/64840
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2, 3, 1,2,4
1Department of Cellular & Physiological Sciences, Life Science Institute, University of British Columbia, 2School of Biomedical Engineering, University of British Columbia, 3STEMCELL Technologies Inc, 4Department of Surgery, University of British Columbia
* These authors contributed equally

Summary

Differensiering av stamceller til øyceller gir en alternativ løsning til konvensjonell diabetesbehandling og sykdomsmodellering. Vi beskriver en detaljert stamcellekulturprotokoll som kombinerer et kommersielt differensieringssett med en tidligere validert metode for å hjelpe til med å produsere insulinutskillende, stamcelleavledede øyer i en tallerken.

Abstract

Differensiering av humane pluripotente stamceller (hPSCs) til insulinutskillende betaceller gir materiale for å undersøke betacellefunksjon og diabetesbehandling. Imidlertid gjenstår det utfordringer med å skaffe stamcelleavledede betaceller som tilstrekkelig etterligner innfødte humane betaceller. Basert på tidligere studier har hPSC-avledede øyceller blitt generert for å lage en protokoll med forbedrede differensieringsresultater og konsistens. Protokollen beskrevet her benytter et bukspyttkjertelprogenitorsett i trinn 1-4, etterfulgt av en protokoll modifisert fra et papir som tidligere ble publisert i 2014 (kalt "R-protokoll" heretter) under trinn 5-7. Detaljerte prosedyrer for bruk av pankreatisk stamcellesett og 400 μm diameter mikrobrønnplater for å generere bukspyttkjertelstamklynger, R-protokoll for endokrin differensiering i et 96-brønns statisk suspensjonsformat, og in vitro-karakterisering og funksjonell evaluering av hPSC-avledede øyer, er inkludert. Den komplette protokollen tar 1 uke for innledende hPSC-utvidelse etterfulgt av ~ 5 uker for å oppnå insulinproduserende hPSC-øyer. Personell med grunnleggende stamcellekulturteknikker og opplæring i biologiske analyser kan gjengi denne protokollen.

Introduction

Beta-celler i bukspyttkjertelen utskiller insulin som reagerer på økninger i blodsukkernivået. Pasienter som mangler tilstrekkelig insulinproduksjon på grunn av autoimmun ødeleggelse av betaceller i type 1 diabetes (T1D)1, eller på grunn av betacelledysfunksjon ved type 2 diabetes (T2D)2, behandles vanligvis med eksogent insulin. Til tross for denne livreddende behandlingen, kan den ikke nøyaktig matche den utsøkte kontrollen av blodsukker som oppnås ved dynamisk insulinsekresjon fra bona fide betaceller. Som sådan lider pasienter ofte konsekvensene av livstruende hypoglykemiske episoder og andre komplikasjoner som følge av kroniske hyperglykemiske utflukter. Transplantasjon av humane kadaveriske øyer gjenoppretter vellykket stramt glykemisk kontroll hos T1D-pasienter, men er begrenset av tilgjengeligheten av øydonorer og vanskeligheter med å rense sunne øyer for transplantasjon 3,4. Denne utfordringen kan i prinsippet løses ved å bruke hPSC som et alternativt utgangsmateriale.

Nåværende strategier for å generere insulinutskillende øyer fra hPSCs in vitro tar ofte sikte på å etterligne prosessen med embryonal bukspyttkjertelutvikling in vivo 5,6. Dette krever kunnskap om de ansvarlige signalveiene og tidsbestemt tilsetning av tilsvarende løselige faktorer for å etterligne kritiske stadier av den utviklende embryonale bukspyttkjertelen. Bukspyttkjertelprogrammet starter med forpliktelsen til definitiv endoderm, som er preget av transkripsjonsfaktorer gaffelhodeboks A2 (FOXA2) og kjønnsbestemmende region Y-boks 17 (SOX17) 7. Suksessiv differensiering av definitiv endoderm innebærer dannelse av et primitivt tarmrør, mønster i en bakre fortarm som uttrykker bukspyttkjertelen og duodenal homeobox 1 (PDX1) 7,8,9, og epitelekspansjon til bukspyttkjertelprogenitorer som samtidig uttrykker PDX1 og NK6 homeobox 1 (NKX6.1) 10,11.

Videre forpliktelse til endokrine øyceller ledsages av forbigående ekspresjon av pro-endokrine masterregulatorneurogenin-3 (NGN3)12 og stabil induksjon av viktige transkripsjonsfaktorer: nevrondifferensiering 1 (NEUROD1) og NK2-homøoboks 2 (NKX2.2)13. De viktigste hormonuttrykkende cellene, som insulinproduserende betaceller, glukagonproduserende alfaceller, somatostatinproduserende deltaceller og pankreaspolypeptidproduserende PPY-celler, blir deretter programmert. Med denne kunnskapen, så vel som funn fra omfattende, high-throughput drug screening studier, har nyere fremskritt gjort det mulig å generere hPSC-øyer med celler som ligner betaceller i stand til insulinsekresjon 14,15,16,17,18,19.

Trinnvise protokoller har blitt rapportert for generering av glukoseresponsive betaceller 6,14,18,19. Bygget på disse studiene innebærer denne protokollen bruk av et pankreasprogenitorsett for generering av PDX1 + / NKX6.1+ pankreasprogenitorceller i en plan kultur, etterfulgt av mikrobrønnplateaggregering i ensartede klynger og ytterligere differensiering mot insulinutskillende hPSC-øyer med R-protokollen i en statisk 3D-suspensjonskultur. Kvalitetskontrollanalyser, inkludert flowcytometri, immunfarging og funksjonsvurdering, utføres for streng karakterisering av de differensierende cellene. Dette papiret gir en detaljert beskrivelse av hvert trinn i den rettede differensieringen og skisserer in vitro-karakteriseringsmetodene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokollen er basert på arbeid med hPSC-linjer, inkludert H1, HUES4 PDXeG og Mel1 INSGFP/W, under materfrie forhold. En trinnvis prosedyre er beskrevet i denne delen, med støttedata fra differensieringen av Mel1 INSGFP/W i delen om representative resultater. Vi anbefaler at ytterligere optimalisering er nødvendig når du arbeider med andre hPSC-linjer som ikke er angitt her. Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle reagenser og løsninger som brukes i denne protokollen.

1. Utarbeidelse av differensieringsmedier og løsninger

MERK: Se tabell 1 for alle løsninger som skal utarbeides og tabell 2 for differensieringsmediene.

  1. Forbered alle medier og reagenser for cellekultur i et sterilt biosikkerhetsskap. Varm opp cellekulturrelaterte løsninger og basalmedier kort til 37 °C i et bad før bruk.
    MERK: Som beskrevet nedenfor, gjør friske differensieringsmedier daglig ved å legge til kosttilskudd og bruk dem samme dag. Alternativt gir bukspyttkjertelen stamfar kit muligheten til å forberede et større volum på forhånd som kan brukes over flere dager etter produsentens protokoll. Begge metodene for medieforberedelse viser seg å fungere godt. Merk at det ikke anbefales å forlate media i lengre tid i vannbadet. Når du forbereder media fersk hver dag, anbefales det å aliquot kosttilskudd for å unngå gjentatte fryse-tine sykluser.

2. Differensiering av hPSCs i bukspyttkjertelen stamceller

  1. Oppretthold udifferensierte hPSCs på Matrigel-belagte kar i mTeSR1 komplett medium og utfør middels endringer daglig. Under vedlikeholdskultur, passere hPSCs hver 3-4 dager når celler når ~ 70% sammenløp ved hjelp av celledissosiasjonsreagenset etter produsentens protokoll. For å initiere differensiering, dissosiere cellene i enkeltceller og frø dem på 6-brønns eller 12-brønns vevskulturbehandlede plater (med medievolum på henholdsvis 2 ml eller 1 ml per brønn).
    MERK: Se tabell 1 for instruksjoner relatert til oppbevaring av endoderm basalmedium og dets alikoter.
  2. Precoat kultur brønner med hESC-kvalifisert Matrigel (fortynnet i iskald DMEM / F12 som anbefalt av produsentens protokoll) og plasser platen i en fuktet 37 ° C, 5% CO2 inkubator i 30 minutter.
  3. Flytt den Matrigel-belagte platen til romtemperatur (bruk innen 3 timer).
  4. Aspirer det brukte mediet fra hPSC-kulturen og skyll en gang med DPBS. Desosiere hPSC-kulturen til enkeltceller med celledissosiasjonsenzym ved 37 °C i 3-5 minutter. Skyll cellene av ved å tilsette varmt DMEM/F12 medium, overfør til et 15 ml eller 50 ml konisk rør, og spinn ved 300 × g i 5 minutter.
  5. Resuspender cellepelleten med stamcelle komplett medium pluss 10 μM Y-27632 og utfør levende celletelling (trypan blue negative) med et hemocytometer eller automatisert celleteller. Aspirat fortynnet Matrigel og frø umiddelbart levende celler med en tetthet på 1,60-1,80 × 10 5/cm 2 på Matrigel-belagte brønner og inkubere i en fuktet 37 ° C,5% CO2 inkubator i 24 timer. Gå videre til trinn 1.
    MERK: Dette vil resultere i ~ 95% startkonfluens for å starte differensiering. I henhold til produsentens protokoll anbefales en såtetthet på 2,6 × 105/cm2 . Det anbefales å teste forskjellige såtettheter for å bestemme den optimale verdien for en cellelinje og for å kontrollere cellens levedyktighet. Hvis levedyktigheten er under 80%, ikke fortsett med differensiering. Lav celle levedyktighet kan være et resultat av overfordøyelse eller overtriturering under høsting eller forlater celler i lengre tid i DMEM / F12 medium før såing.
  6. På trinn 1 dag 1, varm kort endoderm basal medium til 37 ° C i et bad og tine Supplement MR og CJ. Forbered trinn 1A medium ved å legge til supplement MR og CJ til endoderm basalmedium. Bland godt og bruk umiddelbart.
  7. Aspirer det brukte mediet fra brønner, tilsett trinn 1A-medium og inkuber i en fuktet 37 °C, 5% CO2 -inkubator i 24 timer.
    MERK: Vasketrinn er unødvendig. Fjern eventuelle ufestede celler fra kulturen ved å riste kulturplaten forsiktig før medieutvekslingen. Unngå å forstyrre monolaget ved ikke å berøre pipettespissen mot brønnbunnen under middels fjerning og gjennom forsiktig tilsetning av middels middels.
  8. På trinn 1 dag 2, varm endoderm basalmediet kort i et bad på 37 °C og tine tilskudd CJ. Forbered trinn 1B medium ved å legge til supplement CJ til endoderm basalmedium. Bland godt og bruk umiddelbart.
  9. Aspirer det brukte mediet fra brønnene, tilsett trinn 1B-medium og inkuber i en fuktet 37 °C, 5% CO2 -inkubator i 24 timer.
  10. På trinn 1 dag 3, gjenta trinn 2.8-2.9. Gå videre til trinn 2.
  11. På trinn 2 dag 1, varm bukspyttkjertel trinn 2-4 basal medium i et 37 ° C bad og tine tillegg 2A og 2B. Forbered trinn 2A medium ved å legge til tillegg 2A og 2B til bukspyttkjertelen trinn 2-4 basalmedium. Bland godt og bruk umiddelbart.
  12. Aspirer det brukte mediet fra brønner, tilsett trinn 2A-medium og inkuber i en fuktet 37 °C, 5 % CO2 -inkubator i 24 timer.
  13. På trinn 2 dag 2, varm bukspyttkjertel trinn 2-4 basal medium i et 37 ° C bad og tine tillegg 2B. Forbered trinn 2B medium ved å legge tillegg 2B til bukspyttkjertelen trinn 2-4 basal medium. Bland godt og bruk umiddelbart.
  14. Aspirer det brukte mediet fra brønner, tilsett trinn 2B-medium og inkuber i en fuktet 37 °C, 5 %CO2-inkubator i 24 timer.
  15. På trinn 2 dag 3, gjenta trinn 2.13-2.14. Gå videre til trinn 3.
  16. På trinn 3 dag 1, varm bukspyttkjertel trinn 2-4 basal medium i et 37 ° C bad og tine tillegg 3. Forbered trinn 3 medium ved å legge til supplement 3 til bukspyttkjertelen trinn 2-4 basalmedium. Bland godt og bruk umiddelbart.
  17. Aspirer det brukte mediet fra brønner, tilsett trinn 3 medium og inkuber i en fuktet 37 °C, 5% CO2 inkubator i 24 timer.
  18. På trinn 3 dag 2 og dag 3, gjenta trinn 2.16-2.17. Gå videre til trinn 4.
  19. På trinn 4 dag 1, varm bukspyttkjertel trinn 2-4 basal medium i et 37 ° C bad og tine tillegg 4. Forbered trinn 4 medium ved å legge til tillegg 4 til bukspyttkjertelen trinn 2-4 basalmedium. Bland godt og bruk umiddelbart.
  20. Aspirer det brukte mediet fra brønner, tilsett trinn 4 medium og inkuber i en fuktet 37 ° C, 5% CO2 -inkubator i 24 timer.
  21. På trinn 4 dag 2 til dag 4, gjenta trinn 2.19-2.20. Gå videre til aggregeringstrinnene.

3. Aggregering i bukspyttkjertelen stamceller ved bruk av 400 μm diameter microwell plater

  1. På trinn 4 dag 5, forbehandle mikrobrønnene (f.eks. 24-brønns plateformat) med 500 μL anti-adherence skylleløsning per brønn.
  2. Forbered en balanseplate og sentrifuge mikrobrønnplaten ved 1,300 × g i 5 minutter.
    MERK: Kontroller platen under et mikroskop for å sikre at det ikke er bobler igjen i mikrobrønnene. Sentrifuge igjen i ytterligere 5 minutter hvis bobler forblir fanget i noen mikrobrønner.
  3. Aspirer Anti-Adherence Rinsing Solution fra brønnene og skyll én gang med 1 ml DPBS. Aspirer DPBS fra brønnene og tilsett 1 ml aggregeringsmedium til hver brønn.
  4. Fjern det brukte mediet fra bukspyttkjertelen stamfar kulturer og vask en gang med DPBS. Desosiere kulturene til enkeltceller med dissosiasjonsreagens ved 37 °C i 10-12 min. Skyll cellene av med varm DMEM/F12, overfør dem til et rør og spinn ved 300 × g i 5 minutter.
  5. Resuspender cellepelleten i aggregeringsmediet og utfør live celletelling. Frø 2,4-3,6 millioner celler totalt per brønn (dvs. 2000-3000 celler per mikrobrønn) og tilsett aggregeringsmedium til hver brønn for å oppnå et endelig volum på 2 ml per brønn.
  6. Pipetter cellene forsiktig opp og ned flere ganger med en P1000 pipettespiss for å sikre en jevn fordeling av celler gjennom brønnen. Ikke introduser bobler i mikrobrønner. Sentrifuger mikrobrønnplaten ved 300 × g i 5 minutter for å fange cellene i mikrobrønnene. Inkuber mikrobrønnplaten i en fuktet 37 ° C, 5% CO2 -inkubator i 24 timers aggregering og fortsett til trinn 5-7 differensiering.
    MERK: Vær forsiktig så du ikke forstyrrer platen i løpet av aggregeringstidspunktet. Opptil 48 timers inkubasjonstid kan være nødvendig for optimal aggregatdannelse.

4. Differensiering av kit-deriverte pankreas-stamklynger i hPSC-øyer

  1. På dag 5 på dag 1 varmer du basalmedium i stadium 5-7 i et bad- og tinetilskudd på 37 °C (se tabell 1 og tabell 2). Forbered trinn 5 medium ved å legge til kosttilskudd (til endelige arbeidskonsentrasjoner) til fase 5-7 basalmedium. Bland godt og bruk umiddelbart.
  2. Etter aggregatdannelse pipetterer du forsiktig aggregatene opp og ned flere ganger med en P1000-pipettespiss for å flyte eventuelle ikke-aggregerte celler. La aggregatene slå seg ned ved tyngdekraften (vent til ~ 1 min). Fjern forsiktig det brukte mediet (som inneholder de flytende ikke-aggregerte cellene) fra brønnen så mye som mulig, samtidig som du unngår aspirasjonsaggregater.
  3. Dispenser fersk trinn 5 medium kraftig på overflaten av mikrobrønnplaten for å løsne aggregater fra mikrobrønnene. Overføre aggregater til ultralow attachment (ULA) 6-brønner. Skyll en gang med trinn 5 medium for å hente aggregater helt fra mikrobrønnene.
  4. Samle alle aggregater i ULA 6-brønnene, resuspendere aggregater i trinn 5 medium, og juster tettheten til 20 klynger per 100 μL (f.eks. forventes ~1.200 klynger å bli hentet fra hver brønn. Resuspender 1,200 klynger i 6 ml trinn 5 medium). Bruk en flerkanals pipette til å dispensere 50 μL trinn 5-medium i hver brønn i en ULA flat bunn 96-brønnplate. Fyll hjørne- og kantbrønnene med 200 μL DPBS.
    MERK: Unngå å bruke kantbrønnene til dyrking av aggregater, siden de er utsatt for mer fordampning. Ellers bruk en 96-brønns plate som er designet for å minimere fordampning langs kantene (f.eks. 96-brønnplater med innebygde vollgraver) eller plasser kulturplaten i en mikroklimacellekulturinkubator med høy luftfuktighet.
  5. Legg til 100 μL av klyngefjæringen i hver brønn i ULA flat bottom 96-brønnplate, noe som resulterer i totalt 150 μL kulturmedium som inneholder gjennomsnittlig 20 klynger per brønn.
    MERK: Bland klaseopphenget forsiktig hver gang før dispensering i 96-brønner.
  6. Plasser kulturplater på en jevn overflate i en fuktet 37 ° C, 5% CO2 -inkubator i 24 timer.
  7. På trinn 5 dag 2, forbered trinn 5 medium etter trinn 4.1.
  8. Bruk en flerkanalspipett til å fjerne ~90 μL av det brukte mediet fra hver brønn, og oppdater med 100 μL trinn 5-medium.
  9. På trinn 5 dag 3, gjenta trinn 4.7-4.8. Gå videre til trinn 6.
  10. På trinn 6 dag 1, varm stadium 5-7 basal medium i et bad og tinetilskudd på 37 °C (se tabell 1 og tabell 2). Forbered trinn 6 medium ved å legge til kosttilskudd (til endelige arbeidskonsentrasjoner) til fase 5-7 basalmedium. Bland godt og bruk umiddelbart.
  11. Bruk en flerkanalspipett til å fjerne ~90 μL av det brukte mediet og oppdater med 100 μL trinn 6-medium per brønn.
  12. På trinn 6 dag 2 til dag 8, gjenta trinn 4.10-4.11. Gå videre til trinn 7.
  13. På stadium 7 dag 1, varm stadium 5-7 basal medium i et bad og tinetilskudd på 37 °C (se tabell 1 og tabell 2). Forbered trinn 7 medium ved å legge til kosttilskudd (til endelige arbeidskonsentrasjoner) til fase 5-7 basalmedium. Bland godt og bruk umiddelbart.
  14. Bruk en flerkanalspipett til å fjerne ~90 μL av det brukte mediet og oppdater med 100 μL trinn 7-medium per brønn.
  15. På trinn 7 dag 2 til dag 12, gjenta trinn 4.13-4.14. Fortsett til in vitro karakterisering.

5. Flowcytometrisk analyse

  1. Fjern kulturmedier og vask en gang med DPBS. Dissosiere kulturene (plane stamceller eller differensierende klynger) til enkeltceller med dissosiasjonsreagens ved å inkubere ved 37 °C i 10-12 minutter. Skyll med FACS-buffer og sentrifugerer ved 300 × g i 5 min.
  2. Resuspender cellepelleten i FACS-buffer og utfør celletelling. Spinnceller ved 300 × g i 5 minutter. Resuspender enkeltceller i 500 μL Fix/Perm-buffer i 10 minutter ved romtemperatur.
    MERK: Ta Fix/Perm-bufferen til romtemperatur før bruk. Fix/Perm-bufferen inneholder paraformaldehyd (PFA). Håndter PFA forsiktig i en avtrekkshette og kast i henhold til institusjonelle retningslinjer.
  3. Sentrifugering ved 500 × g i 3 minutter, vask to ganger med 500 μL 1x Perm/Wash-buffer, og resuspender i 300 μL 1x Perm/Wash-buffer. Overfør 100 mikroliter enkeltcelleresuspensjon (hver inneholdende 2,5-3 × 105 celler) til tre mikrofugerør for ufarget kontroll, isotypekontroll og antistofffarging (se materialfortegnelse for informasjon om antistoffer og fortynning). Inkuber i 45 min ved romtemperatur og dekk med folie.
  4. Spinn ved 500 × g i 3 minutter. Vask to ganger med 500 μL 1x Perm/Wash buffer. Resuspender prøvene i 100 μL FACS-buffer og analyser de fargede cellene (se materialfortegnelse for intracellulær farging av markører på bestemte stadier) med et flowcytometer og programvare (f.eks. FlowJo).
    MERK: Hvis prøvene ikke analyseres umiddelbart, oppbevares de ved 4 °C beskyttet mot lys. For gatingstrategien styres strømningsdataene først av spredningsegenskaper (FSC-A og SSC-A) for å fjerne små cellulære rusk etterfulgt av FSC-A- og FSC-breddeegenskaper for å identifisere singleter. Positiv og negativ gating bestemmes av stamcellekontroller og / eller ufargede, isotype kontroller.

6. Hele mount immunostaining

  1. Samle klynger i et mikrofugerør. Sett klynger etter tyngdekraften. Aspirer det brukte mediet og skyll en gang med 1 ml PBS (med kalsium og magnesium). Fest klyngene med 1 ml 4 % PFA ved 4 °C over natten.
  2. Skyll en gang med PBST og permeabiliser 20-30 klynger med 500 μL 0,3% TritonX-100 i et mikrofugerør ved omgivelsestemperatur i minst 6 timer på en tilt shaker.
    MERK: En lengre permeabiliseringstid (opptil 24 timer) er nødvendig for store klynger.
  3. Inkuber klyngene i 100 μL blokkeringsbuffer ved omgivelsestemperatur i 1 time på en tilt shaker. Fjern blokkeringsbufferen og inkuber klyngene med 100 mikrol primære antistoffer fortynnet i antistofffortynningsbuffer ved omgivelsestemperatur over natten på en tiltshaker.
    MERK: Hvis bakgrunnen er sterk under avbildning, inkuber med primære antistoffer ved 4 °C.
  4. Vask 3 x 30 min med 500 μL PBST grundig på en tilt shaker (hellingsvinkel satt til 8, hastighet satt til 20).
  5. Inkuber klyngene med 100 μL sekundære antistoffer i antistofffortynningsbuffer ved omgivelsestemperatur over natten på en tiltshaker. Dekk rørene med folie.
    MERK: Hvis bakgrunnen er sterk under avbildning, inkuber med sekundære antistoffer ved 4 °C.
  6. Skyll én gang med 500 μL PBST. Tilsett 100 μL 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) oppløsning (10 μg/ml i PBST) og beis ved omgivelsestemperatur i 10-15 min. Dekk til med folie og beskytt mot lys.
  7. Vask 3 x 30 min med 500 μL PBST grundig på en vipperister. Dekk rørene med folie under vasketrinnet.
  8. Fest klyngene på lysbildene i bildekammeret (se materialfortegnelsen) forhåndsbelagt med vevlim i henhold til produsentens protokoll og publiserte protokoller20,21.
  9. Monteres med vevsryddemedium (80% glyserol i PBS-oppløsning) og deksel med glassdeksler. Beskytt mot lys til konfokal bildebehandling.
    MERK: Hvis prøvene ikke avbildes umiddelbart, må du oppbevare dem ved 4 °C beskyttet mot lys.

7. Statisk GSIS-analyse

  1. Varm lavglukose Krebs Ringer bikarbonat (3.3G KRB) buffer, høy glukose (16.7G) KRB-buffer og 30 mM KCl KRB-buffer i et 37 ° C bad.
  2. Håndplukk størrelsesmatchede klynger og skyll med 2 ml varm 3,3 G KRB-buffer. Overfør klyngene til ikke-vevskulturbehandlet 6-brønnsplate og likevekt i 2 ml o varm 3.3G KRB-buffer i 1 time i en fuktet 37 °C, 5% CO2 -inkubator.
  3. Etter likevekt, fyll analysekammeret (se materialtabellen) med 100 μL varm 3,3 G KRB-buffer. Håndplukk fem klynger og overfør dem til midten av analysekammeret. Inkuber i 30 minutter i en fuktet 37 ° C, 5% CO2 -inkubator.
    MERK: Bruk 10 μL pipettespisser for overføring av klynger med minimalt middels volum.
  4. Oppfang forsiktig ~100 mikrol av supernatanten og oppbevar den ved -30 °C inntil måling av basal insulinsekresjon (se trinn 7.9). Ikke tørk eller mist klynger i dette trinnet. Tilsett umiddelbart 100 μL varm 16,7 G KRB-buffer i analysekammeret og inkuber de samme klyngene i 30 minutter i en fuktet 37 °C, 5% CO2 -inkubator.
  5. Oppfang forsiktig ~100 μL av supernatanten og oppbevar den ved -30 °C inntil glukosestimulert insulinsekresjon måles (se trinn 7.9). Tilsett umiddelbart 100 μL varm 30 mM KCl KRB-buffer i analysekammeret og inkuber de samme klyngene i 30 minutter i en fuktet 37 °C, 5% CO2 -inkubator.
  6. Oppfang ~100 μL av supernatanten forsiktig og oppbevar ved -30 °C inntil måling av KCl-stimulert insulinsekresjon (se trinn 7.9). Tilsett umiddelbart 100 μL RIPA lysisbuffer i analysekammeret og overfør lysisbufferen som inneholder alle fem klyngene til et mikrofugerør.
  7. Valgfritt) Bryt klyngene manuelt ved kraftig triturering med en P200-pipettespiss. Vortex i 30 s og ruge på is i 30 min etterfulgt av ytterligere 30 s av vortexing.
    MERK: Sikre fullstendig lysis ved vortexing og tilstrekkelig tid for inkubasjon på is.
  8. Spinn på 8000 × g i 1 min. Supernatanten skal samles opp og oppbevares ved -30 °C inntil total insulinmengde måles opp (se trinn 7.9).
  9. Mål humant insulin i supernatantprøvene ved hjelp av et humant insulin ELISA-sett i henhold til produsentens protokoll og publiserte protokoller20,22.
    MERK: Unngå gjentatt frysing og tining av supernatantprøver. Prøver med mer enn tre fryse-og-tine sykluser bør ikke analyseres.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi utviklet en hybridstrategi for å differensiere stamceller til insulinutskillende hPSC-øyer i syv trinn, som benytter et pankreasprogenitorsett for de fire første stadiene i plan kultur, etterfulgt av en modifisert protokoll bygget på en tidligere rapportert metode6 i en statisk suspensjonskultur for de tre siste stadiene (figur 1). Med denne protokollen er det avgjørende å sikre en nærkonfluens (90%-100%) kultur ved 24 timer etter cellesåing (trinn 0) for å starte en effektiv differensiering for de fleste hPSC-linjer (figur 2A). Testing av forskjellige såtettheter anbefales sterkt for å bestemme den optimale tilstanden for en bestemt cellelinje. Under fase 1-kulturen vil media sannsynligvis virke overskyet på grunn av flytende døde celler, som ofte observeres på dette stadiet. Dette kompromitterer ikke differensieringseffektiviteten til settet så lenge de vedlagte cellene dekker fartøyets overflate helt. Under trinn 2-4, når celler sprer seg og celledød avtar, blir monolagene mer komprimerte og de brukte mediene er ikke så overskyet som under trinn 1 (figur 2A). Som demonstrert med insulinreporteren Mel1 INSGFP/W hESCs, kan minst 95 % FOXA2+/SOX17+ definitive endodermceller på slutten av trinn 1 og 80 % PDX1+/NKX6.1+ pankreasstamceller på slutten av trinn 4 oppnås rutinemessig (figur 2B-E). Overgangen av pankreasprogenitorceller fra plan kultur til suspensjonskultur har vist seg å fremme påfølgende endokrin celleinduksjon23,24. I denne oppdaterte protokollen bruker vi mikrobrønnplater og tillater 24 timers celleaggregering. Dette genererer tusenvis av bukspyttkjertelsstamklynger med ensartet størrelse og morfologi om gangen (figur 3A, B), og gjennomsnittlig aggregeringseffektivitet (ved å beregne prosentandelen celler som er innlemmet i aggregater) er 74,1% ± 4,4% (figur 3C). Det er viktig at ekspresjon av PDX1 og NKX6.1 opprettholdes på høye nivåer i disse klyngene etter aggregering (figur 3D, E), noe som tyder på en effektiv produksjon av bukspyttkjertelprogenitorer in vitro med differensieringssettet og mikrobrønnplaten.

Vi bruker deretter R-protokoll (en metode modifisert fra Rezania et al.6) for den siste 3-trinns differensieringen i et statisk suspensjonskultursystem ved bruk av ULA flat bunn 96-brønnsplater for ytterligere å differensiere disse kit-avledede pankreasprogenitorene mot hPSC-holmer (figur 1). Insulinuttrykkende celler induseres gradvis i endokrine klynger, noe som indikeres av de økte INS-GFP-signalene i levende kulturer over tid (figur 4A, B). Kvantifisering av klyngestørrelse viser at gjennomsnittlig diameter på trinn 5-klynger er 150 μm, og ved trinn 7 øker gjennomsnittlig diameter til 220 μm (figur 4C). Klyngene opprettholder hovedsakelig sitt glatte, sfæriske utseende når de vokser mellom trinn 5 og trinn 7, noe som tyder på at den statiske kulturmetoden begrenser klyngeklumping sammenlignet med orbitale shakerbaserte suspensjonskulturer (som vanligvis genererer noen overdimensjonerte klynger)25. Vedlikehold av komprimerte klynger med glatt sfærisk morfologi er en indikator på god levedyktighet av differensieringscellene, noe som er viktig for en vellykket differensiering mot funksjonelle hPSC-øyer til slutt.

Karakterisering av cellesammensetning viser at trinn 7 hPSC-øyer generert av hybridprotokollen primært er endokrine og består av fire hovedtyper av øyceller, inkludert insulinpositive betaceller, glukagonpositive alfaceller, somatostatin-positive deltaceller og bukspyttkjertelpolypeptid-positive PPY-celler, mens enterokromaffinceller (avledet fra en off-target lineage26) også er tilstede (figur 5A-C). Spesielt genererer denne hybridprotokollen i stor grad monohormonelle øyceller (~ 50% CPEP + / GCG-/SST- celler, ~ 17% GCG + / CPEP- celler og ~ 12% SST + / CPEP-celler) og bare et mindretall av bihormonelle celler (CPEP + / GCG + eller CPEP + / SST +) i stadium 7-kulturer (figur 5B-D). Undersøkelse av flere viktige transkripsjonsfaktorer og modne betacellemarkører i stadium 7 hPSC-øyer viser at differensierende betaceller uttrykker PDX1, NKX6.1, NEUROD1, MAFA og glukosetransportør GLUT1 (figur 6A). Videre induseres ~60 % INS+/PDX1+-celler (figur 6B) og 50 % CPEP+/NKX6.1+-celler (figur 6C) i trinn 7-kulturer, noe som tyder på en effektiv generering av funksjonelle betaceller ved hjelp av hybridstrategien som presentert her. Faktisk viser in vitro statiske glukosestimulerte insulinsekresjonsanalyser (GSIS) at trinn 7 hPSC-øyer kan utskille høye nivåer av insulin som reagerer på både høy glukose og direkte depolarisering (figur 6D). Selv om denne funksjonen er oppmuntrende, er in vitro glukoseresponsen fra hPSC-øyer fortsatt ikke ekvivalent med den for kadaveriske øyer når det gjelder størrelsen på insulinsekresjon (figur 6D), og det totale insulininnholdet i hPSC-øyer er omtrent halvparten av mengden av det i kadaveriske øyer (figur 6E). Fortsatt optimalisering er nødvendig for å oppnå hPSC-øyer med mer modne betacellefenotyper.

Figure 1
Figur 1: Oversikt over differensieringsskjema for generering av funksjonelle hPSC-holmer in vitro. Arbeidsflytdiagrammet gir en oversikt over den syv-trinns prosedyren som er involvert i differensiering av hPSCs til bukspyttkjertelprogenitorceller i en plan kultur ved bruk av bukspyttkjertelens stamcellesett, aggregering i bukspyttkjertelprogenitorklynger ved bruk av mikrobrønnplater og overgang mot hPSC-øyer i en statisk suspensjonskultur. En insulinreporter hESC-linje, Mel1 INSGFP / W, brukes gjennom hele denne studien som et eksempel for å demonstrere effekten av denne hybridmetoden. Forkortelser: hPSCs = humane pluripotente stamceller; GSIS = glukosestimulert insulinsekresjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Rettet differensiering av hPSCs til pankreasprogenitorceller ved bruk av pankreasprogenitorsettet. (A) Representative fasekontrastbilder som viser cellemorfologi på de angitte stadiene. Skalastenger = 750 μm. (B, C) Representative flowcytometriplott for nøkkelmarkører for (B) stadium 1 definitive endodermceller (FOXA2+/SOX17+) og (C) stadium 4 pankreasstamceller (PDX1+/NKX6.1+). (D) Representative immunfargingsbilder av pankreasprogenitorceller for PDX1 (rød) og NKX6.1 (grønn). Kjerner ble farget med DAPI (blå). Skala bar = 200 μm. (E) Flowcytometrisk kvantifisering av PDX1+/NKX6.1+ celler i fase 4 Dag 4 monolagsceller i pankreasprogenitorer (n = 5 biologiske replikater). Forkortelser: hPSCs = humane pluripotente stamceller; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Aggregering i ensartede pankreasstamklynger med 400 μm diameter mikrobrønnplater. (A) Representative fasekontrastbilder på slutten av trinn 4 som viser klasemorfologi i mikrobrønnen og etter uthenting fra mikrobrønnen. Skalastenger = 300 μm. (B) Kvantifisering av klyngediameter ved slutten av trinn 4 (n = 60 klynger fra 3 biologiske replikater). (C) Kvantifisering av aggregeringseffektivitet ved slutten av trinn 4 (n = 5 biologiske replikater). (D) Representative immunfargingsbilder av pankreasprogenitorklynger for PDX1 (rød) og NKX6.1 (grønn). Kjerner ble farget med DAPI (blå). Skala bar = 100 μm. (E) Flowcytometrisk kvantifisering av PDX1+/NKX6.1+ celler i stadium 4 dag 5 pankreasprogenitoraggregater (n = 4 biologiske replikater). Forkortelse: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Differensiering av pankreasprogenitorer til hPSC-holmer i statisk suspensjonsdyrkningssystem . (A) Representative fasekontrastbilder (øverste panel) og fluorescerende bilder (nederste panel) som viser klasemorfologi og insulinuttrykksmønster i angitte stadier. Skalastenger = 300 μm. (B) Kvantifisering av gjennomsnittlig INS-GFP fluorescerende intensitet per klynge på angitte stadier (n = 30 klynger fra to biologiske replikater). (C) Kvantifisering av klyngediameter på angitte stadier (n = 60 klynger fra tre biologiske replikater). Forkortelser: hPSC = human pluripotent stamcelle; INS = insulin; GFP = grønt fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Karakterisering av cellesammensetning i stadium 7 hPSC-øyer. (A) Representative immunfargingsbilder av stadium 7 hPSC-øyer som viser forskjellige celletyper (SYN, panendokrin markør; CK19, duktal markør; INS-GFP, insulin indikeres av reporter GFP-signaler; GCG; SST; PPY; ENC ble farget av SLC18A1 antistoff). Kjerner ble farget med DAPI (blå). Skalastenger = 100 μm. (B,C) Representative flowcytometriplott av (B) prosentandelen av CPEP+ og GCG+ celler i stadium 7 hPSC-øyer og (C) prosentandelen av CPEP+ og SST + celler i trinn 7 hPSC-øyer. (D) Flowcytometrikvantifisering av indikerte cellemarkører i stadium 7 hPSC-øyer (n = 4 biologiske replikater). Forkortelser: hPSC = human pluripotent stamcelle; INS = insulin; GFP = grønt fluorescerende protein; SYN = synaptofysin; GCG = glukagon; SST = somatostatin; PPY = bukspyttkjertelpolypeptid; ENC = enterokromaffin; CPEP = C-peptid; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: In vitro karakterisering og funksjonsvurdering av stadium 7 hPSC-øyer. (A) Representative immunfargingsbilder av stadium 7 hPSC-øyer som viser samtidig ekspresjon av insulin (indikert av reporter INS-GFP-signaler) med flere viktige betacellemarkører, som NKX6.1, MAFA, NEUROD1, PDX1 og glukosetransportør GLUT1. Kjerner ble farget med DAPI (blå). Skalastenger = 100 μm. (B,C) Representative flowcytometriplott av (B) prosentandelen av INS+/PDX1+ celler og (C) prosentandelen av CPEP+/NKX6.1+ celler. (D) Statiske GSIS-analyser som viser insulinfrigjøring fra stadium 7 hPSC-øyer (n = 6 inkludert 3 biologiske og 2 tekniske replikater) og humane øyer (n = 6 inkludert 3 biologiske og 2 tekniske replikater) som respons på høy glukose (16,7 G, 16,7 mM glukose) og 30 mM KCl depolarisering. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. En uparet tosidig t-test (**p < 0,01) ble brukt for å sammenligne mellom to angitte grupper. (E) Totalt insulininnhold i trinn 7 hPSC-øyer (n = 6 inkludert 3 biologiske og 2 tekniske replikater) og humane øyer (n = 6 inkludert 3 biologiske og 2 tekniske replikater). En uparet tosidig t-test (*p < 0,05) ble brukt for å sammenligne de to gruppene. Forkortelser: hPSC = human pluripotent stamcelle; INS = insulin; GFP = grønt fluorescerende protein; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Formulering av alle løsninger og medier som brukes i denne protokollen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Formulering av trinn 1-7 differensieringsmedier. Tabellen inneholder oppskriften for å klargjøre differensieringsmediet trinn 1-7. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne artikkelen beskriver en syvtrinns hybridprotokoll som gjør det mulig å generere hPSC-øyer som er i stand til å utskille insulin ved glukoseeksponering innen 40 dager etter dyrkning in vitro. Blant disse flere trinnene antas effektiv induksjon av definitiv endoderm å sette et viktig utgangspunkt for de endelige differensieringsresultatene18,27,28. I produsentens protokoll anbefales en såtetthet ved 2,6 × 105 / cm 2 for å starte differensiering, og celler blir utsatt for trinn 1-medier i2 dager. For å sikre at cellene når nær samløp på dag 1 (90%-100%), anbefaler vi sterkt å teste såtettheter når du arbeider på en ny hPSC-linje, da den optimale såtettheten kan variere. For eksempel, med alle tre hPSC-linjene testet i våre hender, ble 1,6-1,80 × 10 5/cm 2, i stedet for 2,60 × 105/cm2, funnet å være en optimal såtetthet. Utvidelse av kulturvarigheten til trinn 1 fra 2 dager til 3 dager med en ekstra dag i trinn 1B-medium øker renheten til FOXA2 + / SOX17+ celler fra 80% til > 93% (data ikke vist). Hvis andelen FOXA2+/SOX17+-celler er lavere enn 70 % ved slutten av trinn 1, vil induksjon av PDX1+-celler og PDX1+/NKX6.1+-celler sannsynligvis bli kompromittert.

Det er viktig å merke seg at noe celledød kan observeres under hele trinn 1-kulturen, mens de vedlagte cellene kreves for å dekke 100% av overflaten. Under trinn 2-4 resulterer reduksjonen i celledød samtidig med celleproliferasjon i komprimerte og flerlagsceller, noe som har blitt rapportert å være kritisk for effektiv induksjon av bukspyttkjertelprogenitormarkørene PDX1 og NKX6.1 og deres nukleære lokalisering29,30. På den siste dagen i trinn 4 dissosieres cellene og aggregeres i klynger ved hjelp av AggreWells mikrobrønnplater med diameter 400 μm. Sammenlignet med andre tilnærminger som suspendert aggregering, manuell aggregering eller bruk av U-bunnplater med 96 brønner, genererer Aggregering tusenvis av sfæriske klynger av ensartet størrelse, noe som illustrerer robustheten til denne metoden.

For endokrin induksjon under trinn 5-7 i en statisk 3D-kultur, overfører vi et gjennomsnittlig antall ~ 20 kit-avledede pankreasprogenitorklynger i hver brønn av ULA flat bunn 96-brønnplater. Denne metoden reduserer dannelsen av store klynger og forbedrer cellenes levedyktighet, muligens ved å begrense klyngefusjon og/eller senke skjærspenningsmediert celletap under orbital shakerkultur. For å fjerne flytende døde celler i brukte medier og samtidig redusere risikoen for å miste klynger under medieendring, anbefaler vi å oppdatere omtrent to tredjedeler av det totale mediumvolumet. Vi bemerker at denne partielle mediumendringen ikke hemmer endokrin differensiering og i stedet kan gi en skånsom overgang når du bytter mellom forskjellige stadier. Likevel kan noe celledød fortsatt observeres under stadium 5 og tidlig stadium 6 med denne hybridprotokollen ved overgang fra plan kultur til statisk suspensjonskultur. Reporter hPSC-linjer (for eksempel Mel1 INSGFP / W hESCs) er nyttige for å overvåke senfasedifferensiering i levende kulturer. Løpende flowcytometri vil bidra til å undersøke NKX6.1+/NEUROD1+ på slutten av trinn 5, INS+/NKX6.1+ på slutten av trinn 6 og CPEP+/NKX6.1+ på slutten av trinn 7. Effektiv induksjon av CPEP+-populasjoner uttrykt samtidig med NKX6.1 er kritisk for å oppnå glukoserespons i betaceller31,32. I denne forbindelse genererer denne protokollen konsekvent >50% CPEP+/NKX6.1+ celler i de resulterende trinn 7 hPSC-øyene som kan utskille insulin som svar på en høy glukoseutfordring in vitro.

Selv om den nåværende protokollen har vist en effektiv generering av insulinproduserende hPSC-øyer, er det begrensninger for denne metoden. Differensieringseffektiviteten på slutten av trinn 4 fra forskjellige hPSC-linjer, spesielt iPSCs, med dette pankreasprogenitorsettet kan fortsatt være variabel (data ikke vist). Optimalisering bør utføres fra sak til sak. Denne metoden for de tre siste stadiene av differensiering er avhengig av bruk av statisk suspensjonskultur i 96-brønnsplater, som er arbeidskrevende og ikke skalerbar, og dermed begrenser bruken til kun forskning. Selv om det er oppmuntrende å oppnå insulinutskillende evne, er in vitro glukoseresponsen og insulininnholdet i hPSC-øyer betydelig lavere enn for kadaveriske øyer. Fremtidig innsats er fortsatt nødvendig for fortsatt protokolloptimalisering. Til tross for disse begrensningene, tror vi at protokollen som presenteres her gir hPSC-avledede materialer egnet for screening differensieringsfremkallende faktorer og regulatorer av øyhormonsekresjon, samt for modellering av holmcelledysfunksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Timothy J. Kieffer var ansatt i ViaCyte under utarbeidelsen av dette manuskriptet. De øvrige forfatterne oppgir ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi takker støtten fra STEMCELL Technologies, Michael Smith Health Research BC, Stem Cell Network, JDRF og Canadian Institutes of Health Research. Jia Zhao og Shenghui Liang er mottakere av Michael Smith Health Research BC Trainee Award. Mitchell JS Braam er mottaker av Mitacs Accelerate Fellowship. Diepiriye G. Iworima er mottaker av Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship og CFUW 1989 Ecole Polytechnique Commemorative Award. Vi takker Dr. Edouard G. Stanley fra MCRI og Monash University for å dele Mel1 INS GFP / W-linjen og Alberta Diabetes Institute Islet Core for å isolere og distribuere menneskelige øyer. Vi anerkjenner også støtten fra Life Sciences Institute Imaging and Flow Cytometry-fasilitetene ved University of British Columbia. Figur 1 ble laget med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) Sigma T6397 Thyroid hormone
4% PFA solution Santa Cruz Biotechnology sc-281692 Should be handled in fume hood
96-Well, Ultralow Attachment, flat bottom Corning Costar (VWR) CLS3474 Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages
Accutase STEMCELL Technologies 07920 Dissociation reagent for Stage 4 cells
Aggrewell400 plates STEMCELL Technologies 34415 400 µm diameter microwell plates
Aggrewell800 plates STEMCELL Technologies 34815 800 µm diameter microwell plates
Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG) R&D Systems IC2400G 1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells
Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control R&D Systems IC108G 1:100 in flow cytometry
Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B) BD Sciences 566032 1:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype Control R&D Systems IC0041G 1:500 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ) BD Pharmingen 565831 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ) BD Sciences 565689 1:2,000 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ) BD Sciences 563338 1:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ) BD Sciences 562594 1:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells
Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype Control BD Sciences 557714 1:50 in flow cytometry
ALK5i II Cayman Chemicals 14794 TGF-beta signaling inhibitor
Anti-Adherence Rinsing Solution  STEMCELL Technologies 7010 Microwell Rinsing Solution
Assay chamber Cellvis D35-10-1-N For static GSIS and confocal imaging purposes
Bovine serum albumin (BSA) Thermo Fisher Scientific BP1600-100 For immunostaining procedure
CK19 antibody DAKO M0888 1:50 in whole mount immunofluorescence
D-glucose Sigma G8769 Medium supplement
DAPI Sigma D9542 For nuclear counterstaining
DMEM/F12, HEPES Thermo Fisher Scientific 11330032 Matrix diluting solution
Donkey anti-goat Alexa Fluor 555 Life technologies A21432 1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-goat Alexa Fluor 647 Life technologies A21447 1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555 Life technologies A31570 1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 Life technologies A31571 1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555 Life technologies A31572 1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647 Life technologies A31573 1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647 Life technologies A21448 1:500 in whole mount immunofluorescence
DPBS Sigma D8537 Without Ca2+ and Mg2+
ELISA, insulin, human Alpco 80-INSHU-E01.1 For human insulin measurement
Fatty acid-free BSA Proliant 68700 Medium supplement
Fixation and Permeabilization Solution Kit BD Sciences 554714 Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included
Gentle Cell Dissociation Reagent STEMCELL Technologies 7174 For clump passaging hPSCs during maintenance culture
Glucagon antibody Sigma G2654 1:400 in whole mount immunofluorescence
GLUT1 antibody Thermo Fisher Scientific PA1-37782 1:200 in whole mount immunofluorescence
GlutaMAX-I (100x) Gibco 35050061 L-glutamine supplement
Glycerol Thermo Fisher Scientific G33-4 For tissue clearing and mounting
GSi XX Sigma Millipore 565789 Notch inhibitor
Heparin Sigma H3149 Medium supplement
ITS-X (100x) Thermo Fisher Scientific 51500056 Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement
LDN193189  STEMCELL Technologies 72147 BMP antagonist
MAFA antibody Abcam ab26405 1:200 in whole mount immunofluorescence
Matrigel, hESC-qualified Thermo Fisher Scientific 08-774-552 Extracellular matrix for vessel surface coating
MCDB131 medium Life technologies 10372019 Base medium
mTeSR1 Complete Kit STEMCELL Technologies 85850 stem cell medium and 5x supplement included
N-Cys (N-acetyl cysteine) Sigma A9165 Antioxidant
NaHCO3 Sigma S6297 Medium supplement
NEUROD1 antibody R&D Systems AF2746 1:20 in whole mount immunofluorescence
NKX6.1 antibody DSHB F55A12-c 1:50 in whole mount immunofluorescence
Pancreatic polypeptide antibody R&D Systems AF6297 1:200 in whole mount immunofluorescence
PBS Sigma D8662 With Ca2+ and Mg2+
PDX1 antibody Abcam ab47267 1:200 in whole mount immunofluorescence
PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ) BD Sciences 565860 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k) BD Sciences 563023 1:250 in flow cytometry
PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k) BD Sciences 562161 1:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells
PE Mouse IgG1κ Isotype Control BD Sciences 554680 1:2,000 in flow cytometry
PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k) BD Sciences 564563 1:200 in flow cytometry
R428  Cayman Chemicals 21523 AXL tyrosine kinase inhibitor
Retinoid acid, all-trans Sigma R2625 Light-sensitive
RIPA lysis buffer, 10x Sigma 20-188 For hormone extraction
SANT-1 Sigma S4572 SHH inhibitor
SLC18A1 antibody Sigma HPA063797 1:200 in whole mount immunofluorescence
Somatostatin antibody Sigma HPA019472 1:100 in whole mount immunofluorescence
STEMdiff Pancreatic Progenitor Kit STEMCELL Technologies 05120 Basal media and supplements included
Synaptophysin antibody Novus NB120-16659 1:25 in whole mount immunofluorescence
Triton X-100 Sigma X100 For permeabilization
Trolox  Sigma Millipore 648471 Vitamin E analog
TrypLE Enzyme Express Life technologies 12604-021 cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs
Trypsin1/2/3 antibody R&D Systems AF3586 1:25 in whole mount immunofluorescence
Y-27632 STEMCELL Technologies 72304 ROCK inhibitor
Zinc sulfate Sigma Z0251 Medium supplement

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).
  2. Petersen, M. C., Shulman, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
  3. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
  4. Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. The journey of islet cell transplantation and future development. Islets. 10 (2), 80-94 (2018).
  5. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  6. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  7. Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
  8. Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
  9. Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
  10. Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
  11. Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
  12. Rukstalis, J. M., Habener, J. F. Neurogenin3: a master regulator of pancreatic islet differentiation and regeneration. Islets. 1 (3), 177-184 (2009).
  13. Mastracci, T. L., Anderson, K. R., Papizan, J. B., Sussel, L. Regulation of Neurod1 contributes to the lineage potential of Neurogenin3+ endocrine precursor cells in the pancreas. PLoS Genetics. 9 (2), e1003278 (2013).
  14. Balboa, D., et al. Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells. Nature Biotechnology. 40 (7), 1042-1055 (2022).
  15. Du, Y., et al. Human pluripotent stem-cell-derived islets ameliorate diabetes in non-human primates. Nature Medicine. 28 (2), 272-282 (2022).
  16. Hogrebe, N. J., Augsornworawat, P., Maxwell, K. G., Velazco-Cruz, L., Millman, J. R. Targeting the cytoskeleton to direct pancreatic differentiation of human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 38 (4), 460-470 (2020).
  17. Yoshihara, E., et al. Immune-evasive human islet-like organoids ameliorate diabetes. Nature. 586 (7830), 606-611 (2020).
  18. Mahaddalkar, P. U., et al. Generation of pancreatic beta cells from CD177(+) anterior definitive endoderm. Nature Biotechnology. 38 (9), 1061-1072 (2020).
  19. Liang, S., et al. Differentiation of stem cell-derived pancreatic progenitors into insulin-secreting islet clusters in a multiwell-based static 3D culture system. Cell Reports Methods. 3, 10046 (2023).
  20. Zhao, J., et al. In vivo imaging of beta-cell function reveals glucose-mediated heterogeneity of beta-cell functional development. Elife. 8, e41540 (2019).
  21. Zhao, J., et al. In vivo imaging of calcium activities from pancreatic beta-cells in zebrafish embryos using spinning-disc confocal and two-photon light-sheet microscopy. Bio-protocol. 11 (23), e4245 (2021).
  22. Liang, S., et al. Carbon monoxide enhances calcium transients and glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta-cells by activating phospholipase C signal pathway in diabetic mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 582, 1-7 (2021).
  23. Bruin, J. E., et al. Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice. Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).
  24. Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
  25. Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
  26. Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro beta-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
  27. D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
  28. Jiang, Y., et al. Generation of pancreatic progenitors from human pluripotent stem cells by small molecules. Stem Cell Reports. 16 (9), 2395-2409 (2021).
  29. Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190 (2020).
  30. Mamidi, A., et al. Mechanosignalling via integrins directs fate decisions of pancreatic progenitors. Nature. 564 (7734), 114-118 (2018).
  31. Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells. 31 (11), 2432-2442 (2013).
  32. Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).

Tags

Utviklingsbiologi utgave 196 insulinproduserende øyklynger betaceller diabetesbehandling protokoll bukspyttkjertelsstamcellesett R-protokoll mikrobrønnplater endokrin differensiering 96-brønns statisk suspensjonsformat in vitro-karakterisering funksjonell evaluering HPSC-avledede øyer stamcellekulturteknikker biologiske analyser
Differensiering av humane pluripotente stamceller i insulinproduserende øyklynger
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, J., Liang, S., Braam, M. J.… More

Zhao, J., Liang, S., Braam, M. J. S., Baker, R. K., Iworima, D. G., Quiskamp, N., Kieffer, T. J. Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-Producing Islet Clusters. J. Vis. Exp. (196), e64840, doi:10.3791/64840 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter