Summary
Die Differenzierung von Stammzellen in Inselzellen bietet eine alternative Lösung zur herkömmlichen Diabetesbehandlung und Krankheitsmodellierung. Wir beschreiben ein detailliertes Stammzellkulturprotokoll, das ein kommerzielles Differenzierungskit mit einer zuvor validierten Methode kombiniert, um die Herstellung von Insulin sezernierenden, aus Stammzellen gewonnenen Inseln in einer Schale zu unterstützen.
Abstract
Die Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) in insulinsezernierende Betazellen liefert Material für die Untersuchung der Betazellfunktion und der Diabetesbehandlung. Es besteht jedoch nach wie vor eine Herausforderung bei der Gewinnung von aus Stammzellen gewonnenen Betazellen, die native menschliche Betazellen adäquat nachahmen. Aufbauend auf früheren Studien wurden hPSC-abgeleitete Inselzellen generiert, um ein Protokoll mit verbesserten Differenzierungsergebnissen und Konsistenz zu erstellen. Das hier beschriebene Protokoll verwendet ein Pankreas-Vorläufer-Kit in den Phasen 1-4, gefolgt von einem Protokoll, das aus einer zuvor 2014 veröffentlichten Arbeit (im Folgenden als "R-Protokoll" bezeichnet) während der Phasen 5-7 modifiziert wurde. Detaillierte Verfahren für die Verwendung des Pankreas-Vorläufer-Kits und der Mikrotiterplatten mit einem Durchmesser von 400 μm zur Erzeugung von Pankreas-Vorläuferclustern, das R-Protokoll für die endokrine Differenzierung in einem statischen 96-Well-Suspensionsformat sowie die In-vitro-Charakterisierung und funktionelle Bewertung von hPSC-abgeleiteten Inseln sind enthalten. Das vollständige Protokoll dauert 1 Woche für die anfängliche hPSC-Expansion, gefolgt von ~5 Wochen, um insulinproduzierende hPSC-Inseln zu erhalten. Personal mit grundlegenden Stammzellkulturtechniken und Ausbildung in biologischen Assays kann dieses Protokoll reproduzieren.
Introduction
Betazellen der Bauchspeicheldrüse schütten Insulin aus, das auf einen Anstieg des Blutzuckerspiegels reagiert. Patienten, die aufgrund der autoimmunen Zerstörung von Betazellen bei Typ-1-Diabetes (T1D)1 oder aufgrund einer Betazelldysfunktion bei Typ-2-Diabetes (T2D)2 keine ausreichende Insulinproduktion aufweisen, werden in der Regel mit der Gabe von exogenem Insulin behandelt. Trotz dieser lebensrettenden Therapie kann sie nicht genau mit der exquisiten Kontrolle des Blutzuckers mithalten, wie sie durch die dynamische Insulinsekretion aus echten Betazellen erreicht wird. Daher leiden die Patienten häufig unter den Folgen lebensbedrohlicher hypoglykämischer Episoden und anderer Komplikationen, die aus chronischen hyperglykämischen Exkursionen resultieren. Die Transplantation menschlicher Leicheninseln stellt bei T1D-Patienten erfolgreich eine strenge glykämische Kontrolle wieder her, ist jedoch durch die Verfügbarkeit von Inselspendern und Schwierigkeiten bei der Reinigung gesunder Inseln für die Transplantation eingeschränkt 3,4. Diese Herausforderung kann prinzipiell durch den Einsatz von hPS-Zellen als alternatives Ausgangsmaterial gelöst werden.
Derzeitige Strategien zur Generierung von Insulin-sezernierenden Inseln aus hPS-Zellen in vitro zielen häufig darauf ab, den Prozess der embryonalen Entwicklung der Bauchspeicheldrüse in vivo nachzuahmen 5,6. Dies erfordert die Kenntnis der verantwortlichen Signalwege und die zeitgesteuerte Zugabe entsprechender löslicher Faktoren, um kritische Stadien der sich entwickelnden embryonalen Bauchspeicheldrüse nachzuahmen. Das Pankreasprogramm beginnt mit der Bindung in das definitive Endoderm, das durch die Transkriptionsfaktoren Gabelkopfbox A2 (FOXA2) und geschlechtsbestimmende Region Y-Box 17 (SOX17)7 gekennzeichnet ist. Die sukzessive Differenzierung des definitiven Endoderms beinhaltet die Bildung eines primitiven Darmschlauchs, der in einen hinteren Vorderdarm übergeht, der die Pankreas- und Zwölffingerdarm-Homöobox 1 (PDX1)7,8,9 exprimiert, und die epitheliale Expansion in pankreatische Vorläuferzellen, die PDX1 und NK6-Homöobox 1 (NKX6.1)10,11 co-exprimieren.
Das weitere Engagement für endokrine Inselzellen geht einher mit der vorübergehenden Expression des pro-endokrinen Masterregulators Neurogenin-3 (NGN3)12 und der stabilen Induktion der wichtigsten Transkriptionsfaktoren neuronale Differenzierung 1 (NEUROD1) und NK2-Homöobox 2 (NKX2.2)13. Anschließend werden die wichtigsten hormonexprimierenden Zellen, wie insulinproduzierende Betazellen, Glucagon-produzierende Alphazellen, Somatostatin-produzierende Delta-Zellen und Pankreas-Polypeptid-produzierende PY-Zellen, programmiert. Mit diesem Wissen sowie Entdeckungen aus umfangreichen Hochdurchsatz-Wirkstoff-Screening-Studien haben jüngste Fortschritte die Erzeugung von hPSC-Inseln mit Zellen ermöglicht, die Betazellen ähneln, die zur Insulinsekretion fähig sind 14,15,16,17,18,19.
Es wurde über schrittweise Protokolle zur Generierung von Glukose-responsiven Betazellen berichtet 6,14,18,19. Aufbauend auf diesen Studien beinhaltet das vorliegende Protokoll die Verwendung eines Pankreas-Vorläuferkits zur Generierung von PDX1+/NKX6.1+ Pankreas-Vorläuferzellen in einer planaren Kultur, gefolgt von der Aggregation von Mikrotiterplatten zu Clustern einheitlicher Größe und der weiteren Differenzierung in Richtung Insulin-sezernierende hPSC-Inseln mit dem R-Protokoll in einer statischen 3D-Suspensionskultur. Qualitätskontrollanalysen, einschließlich Durchflusszytometrie, Immunfärbung und funktioneller Bewertung, werden zur rigorosen Charakterisierung der differenzierenden Zellen durchgeführt. Diese Arbeit bietet eine detaillierte Beschreibung der einzelnen Schritte der gerichteten Differenzierung und skizziert die in vitro Charakterisierungsansätze.
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Protocol
Dieses Protokoll basiert auf der Arbeit mit hPSC-Leitungen, einschließlich H1, HUES4 PDXeG und Mel1 INSGFP/W, unter speiserfreien Bedingungen. In diesem Abschnitt wird eine Schritt-für-Schritt-Anleitung beschrieben, wobei im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" unterstützende Daten aus der Differenzierung von Mel1 INSGFP/W aufgeführt sind. Wir empfehlen, dass weitere Optimierungen erforderlich sind, wenn Sie mit anderen hPSC-Linien arbeiten, die hier nicht aufgeführt sind. In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Reagenzien und Lösungen, die in diesem Protokoll verwendet werden.
1. Herstellung von Differenzierungsmedien und -lösungen
ANMERKUNG: Siehe Tabelle 1 für alle herzustellenden Lösungen und Tabelle 2 für die Differenzierungsmedien.
- Bereiten Sie alle Medien und Reagenzien für die Zellkultur in einer sterilen Biosicherheitswerkbank vor. Zellkulturbezogene Lösungen und Basalmedien vor Gebrauch in einem Bad kurz auf 37 °C erwärmen.
HINWEIS: Stellen Sie, wie unten beschrieben, täglich neue Differenzierungsmedien her, indem Sie Nahrungsergänzungsmittel hinzufügen und sie am selben Tag verwenden. Alternativ bietet das Pankreas-Vorläufer-Kit die Möglichkeit, ein größeres Volumen im Voraus vorzubereiten, das über mehrere Tage gemäß dem Protokoll des Herstellers verwendet werden kann. Beide Methoden zur Medienaufbereitung erweisen sich als bewährt. Beachten Sie, dass es nicht empfohlen wird, Medien über einen längeren Zeitraum im Wasserbad zu belassen. Bei der täglichen Zubereitung von Medien wird empfohlen, Nahrungsergänzungsmittel zu aliquotieren, um wiederholte Gefrier-Auftau-Zyklen zu vermeiden.
2. Differenzierung von hPSCs in Pankreas-Vorläuferzellen
- Halten Sie undifferenzierte hPS-Zellen auf Matrigel-beschichteten Gefäßen in mTeSR1-Komplettmedium aufrecht und führen Sie täglich einen Mediumwechsel durch. Während der Erhaltungskultur werden hPSCs alle 3-4 Tage mit dem Zelldissoziationsreagenz gemäß dem Protokoll des Herstellers verabreicht, wenn die Zellen eine Konfluenz von ~70 % erreicht haben. Um die Differenzierung zu initiieren, werden die Zellen in einzelne Zellen dissoziiert und auf mit 6-Well- oder 12-Well-Gewebekulturen behandelte Platten (mit Medienvolumina von 2 ml bzw. 1 ml pro Well) ausgesät.
HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für Anweisungen zur Lagerung von endoderm Basalmedium und seinen Aliquoten. - Anschwemmkulturvertiefungen mit hESC-qualifiziertem Matrigel (verdünnt in eiskaltem DMEM/F12, wie vom Herstellerprotokoll empfohlen) vorschwemmen und die Platte 30 Minuten lang in einen befeuchteten 37 °C und 5 % CO2 -Inkubator legen.
- Die Matrigel-beschichtete Platte auf Raumtemperatur stellen (innerhalb von 3 h verbrauchen).
- Das verbrauchte Medium aus der hPSC-Kultur absaugen und einmal mit DPBS spülen. Die hPSC-Kultur wird mit einem Zelldissoziationsenzym bei 37 °C für 3-5 min in einzelne Zellen dissoziiert. Spülen Sie die Zellen ab, indem Sie warmes DMEM/F12-Medium hinzufügen, in ein konisches 15-ml- oder 50-ml-Röhrchen überführen und 5 Minuten lang bei 300 × g schleudern.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet mit Stammzell-Komplettmedium plus 10 μM Y-27632 und führen Sie eine Lebendzellzählung (Trypanblau negativ) mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler durch. Verdünntes Matrigel absaugen und lebende Zellen mit einer Dichte von 1,60-1,80 × 10 5/cm2 sofort in Matrigel-beschichtete Vertiefungen aufnehmen und 24 h lang in einem befeuchteten 37 °C und5 % CO2 -% -Inkubator inkubieren. Fahren Sie mit Schritt 1 fort.
HINWEIS: Dies führt zu einer anfänglichen Konfluenz von ~95 % für die Initiierung der Differenzierung. Laut Herstellerprotokoll wird eine Aussaatdichte von 2,6 × 105/cm2 empfohlen. Es wird empfohlen, verschiedene Aussaatdichten zu testen, um den optimalen Wert für eine Zelllinie zu ermitteln und die Zellviabilität zu überprüfen. Wenn die Lebensfähigkeit unter 80 % liegt, fahren Sie nicht mit der Differenzierung fort. Eine geringe Zelllebensfähigkeit kann das Ergebnis einer Überverdauung oder Übertriturierung während der Ernte oder des Verbleibs der Zellen in DMEM/F12-Medium vor der Aussaat sein. - Auf Stufe 1 Tag 1 das Endoderm-Basalmedium kurz in einem Bad auf 37 °C erwärmen und die Nahrungsergänzungsmittel MR und CJ auftauen. Bereiten Sie das Medium der Stufe 1A vor, indem Sie dem Basalmedium des Endoderms Supplement MR und CJ hinzufügen. Gut mischen und sofort verwenden.
- Das verbrauchte Medium wird aus den Vertiefungen abgesaugt, Medium der Stufe 1A zugegeben und in einem befeuchteten 37 °C, 5 % CO2 -Inkubator für 24 h inkubiert.
HINWEIS: Waschschritte sind nicht erforderlich. Entfernen Sie alle nicht anhaftenden Zellen aus der Kultur, indem Sie die Kulturplatte vor dem Mediumwechsel vorsichtig schütteln. Vermeiden Sie eine Unterbrechung der Monoschicht, indem Sie die Pipettenspitze während der Entfernung des Mediums und durch die sanfte Zugabe des Mediums nicht mit dem Boden der Vertiefung berühren. - Auf Stufe 1 Tag 2 das Endoderm-Basalmedium in einem 37 °C warmen Bad kurz erwärmen und Supplement CJ auftauen. Bereiten Sie das Medium der Stufe 1B vor, indem Sie Supplement CJ zum Endoderm-Basalmedium hinzufügen. Gut mischen und sofort verwenden.
- Das verbrauchte Medium wird aus den Vertiefungen abgesaugt, Medium der Stufe 1B hinzugefügt und 24 h lang in einem befeuchteten 37 °CC und 5 % CO 2 -Inkubator inkubiert.
- Wiederholen Sie an Tag 3 der Stufe 1 die Schritte 2.8 bis 2.9. Fahren Sie mit Phase 2 fort.
- An Tag 1 der Stufe 2 das Basalmedium der Bauchspeicheldrüse der Stufe 2-4 in einem 37 °C heißen Bad erwärmen und die Ergänzungen 2A und 2B auftauen. Bereiten Sie das Medium der Stufe 2A vor, indem Sie die Ergänzungen 2A und 2B zum Basalmedium der Bauchspeicheldrüse der Stufe 2-4 hinzufügen. Gut mischen und sofort verwenden.
- Das verbrauchte Medium wird aus Vertiefungen abgesaugt, Medium der Stufe 2A zugegeben und 24 Stunden lang in einem befeuchteten 37 °C und 5 % CO2 -Inkubator inkubiert.
- An Tag 2 der Stufe 2 das Basalmedium der Bauchspeicheldrüse der Stufe 2-4 in einem 37 °C warmen Bad erwärmen und die Ergänzung 2B auftauen. Bereiten Sie das Medium der Stufe 2B vor, indem Sie das Medium der Bauchspeicheldrüse der Stufe 2-4 in das Basalmedium der Bauchspeicheldrüse der Stufe 2-4 geben. Gut mischen und sofort verwenden.
- Das verbrauchte Medium wird aus den Wells abgesaugt, Medium der Stufe 2B hinzugefügt und in einem befeuchteten Inkubator mit 37 °C und 5 % CO2 24 h inkubiert.
- Wiederholen Sie in Phase 2 Tag 3 die Schritte 2.13 bis 2.14. Fahren Sie mit Phase 3 fort.
- Auf Stufe 3 Tag 1 Bauchspeicheldrüsen-Basalmedium der Stufe 2-4 in einem 37 °C warmen Bad erwärmen und Ergänzung 3 auftauen. Bereiten Sie das Medium der Stufe 3 vor, indem Sie dem Basalmedium der Stufe 2-4 der Bauchspeicheldrüse Nahrungsergänzungsmittel 3 hinzufügen. Gut mischen und sofort verwenden.
- Das verbrauchte Medium wird aus Vertiefungen abgesaugt, Medium der Stufe 3 hinzugefügt und 24 Stunden lang in einem befeuchteten Inkubator mit 37 °C und 5 % CO2 -% inkubiert.
- Wiederholen Sie in Phase 3, Tag 2 und Tag 3 die Schritte 2.16-2.17. Fahren Sie mit Phase 4 fort.
- Auf Stufe 4 Tag 1 Bauchspeicheldrüsen-Basalmedium der Stufe 2-4 in einem 37 °C warmen Bad erwärmen und Ergänzung 4 auftauen. Bereiten Sie das Medium der Stufe 4 vor, indem Sie das Nahrungsergänzungsmittel 4 zum Basalmedium der Bauchspeicheldrüse der Stufe 2-4 hinzufügen. Gut mischen und sofort verwenden.
- Das verbrauchte Medium wird aus Vertiefungen abgesaugt, Medium der Stufe 4 hinzugefügt und 24 Stunden lang in einem befeuchteten Inkubator mit 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.
- Wiederholen Sie in Phase 4 Tag 2 bis Tag 4 die Schritte 2.19-2.20. Fahren Sie mit den Aggregationsschritten fort.
3. Aggregation zu Pankreas-Vorläuferclustern unter Verwendung von Mikrotiterplatten mit einem Durchmesser von 400 μm
- In Phase 4 Tag 5 behandeln Sie die Mikrowells (z. B. 24-Well-Plattenformat) mit 500 μl Anti-Adhärenz-Spüllösung pro Well.
- Bereiten Sie eine Waageplatte vor und zentrifugieren Sie die Mikrotiterplatte bei 1.300 × g 5 Minuten lang.
HINWEIS: Überprüfen Sie die Platte unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, dass keine Blasen in den Mikrowellen zurückbleiben. Zentrifugieren Sie erneut für weitere 5 Minuten, wenn Blasen in Mikrowellen eingeschlossen bleiben. - Saugen Sie die Anti-Adhärenz-Spüllösung aus den Vertiefungen an und spülen Sie sie einmal mit 1 ml DPBS ab. Saugen Sie das DPBS aus den Vertiefungen ab und geben Sie 1 ml Aggregationsmedium in jede Vertiefung.
- Entfernen Sie das verbrauchte Medium aus den Pankreas-Vorläuferkulturen und waschen Sie es einmal mit DPBS. Dissoziation der Kulturen in Einzelzellen mit Dissoziationsreagenz bei 37 °C für 10-12 min. Spülen Sie die Zellen mit warmem DMEM/F12 ab, geben Sie sie in ein Röhrchen und schleudern Sie sie bei 300 × g für 5 Minuten.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet im Aggregationsmedium und führen Sie eine Lebendzellzählung durch. Säen Sie 2,4-3,6 Millionen Gesamtzellen pro Well (d. h. 2.000-3.000 Zellen pro Mikrowelle) und fügen Sie Aggregationsmedium zu jeder Vertiefung hinzu, um ein Endvolumen von 2 ml pro Well zu erreichen.
- Pipettieren Sie die Zellen vorsichtig mehrmals mit einer P1000-Pipettenspitze auf und ab, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen in der Vertiefung zu gewährleisten. Führen Sie keine Blasen in Mikrowellen ein. Zentrifugieren Sie die Mikrotiterplatte bei 300 × g für 5 Minuten, um die Zellen in den Mikrowellen zu erfassen. Inkubieren Sie die Mikrotiterplatte in einem befeuchteten 37 °C heißen, 5 % CO2 - Inkubator für eine 24-stündige Aggregation und fahren Sie mit der Differenzierung der Stufen 5 bis 7 fort.
HINWEIS: Achten Sie darauf, die Platte während der Zeit der Aggregation nicht zu stören. Bis zu 48 Stunden Inkubationszeit können für eine optimale Aggregatbildung erforderlich sein.
4. Differenzierung von Kit-abgeleiteten Pankreas-Vorläuferclustern in hPSC-Inselzellen
- An Tag 1 der Stufe 5 das Basalmedium der Stufe 5-7 in einem 37 °C warmen Bad erwärmen und ergänzen (siehe Tabelle 1 und Tabelle 2). Bereiten Sie das Medium der Stufe 5 vor, indem Sie dem Basalmedium der Stufe 5-7 Zusätze (zu den endgültigen Arbeitskonzentrationen) hinzufügen. Gut mischen und sofort verwenden.
- Nach der Aggregatbildung pipettieren Sie die Aggregate vorsichtig mehrmals mit einer P1000-Pipettenspitze auf und ab, um alle nicht aggregierten Zellen schwimmen zu lassen. Lassen Sie die Aggregate durch die Schwerkraft absetzen (warten Sie ~1 Minute). Entfernen Sie vorsichtig das verbrauchte Medium (das die schwimmenden, nicht aggregierten Zellen enthält) so weit wie möglich aus der Vertiefung und vermeiden Sie dabei das Ansaugen von Aggregaten.
- Geben Sie frisches Medium der Stufe 5 kräftig auf die Oberfläche der Mikrotiterplatte, um Aggregate aus den Mikrowellen zu entfernen. Überführen Sie die Aggregate in 6-Wells (Ultralow Attachment, ULA). Einmal mit Medium der Stufe 5 spülen, um die Aggregate vollständig aus den Mikrowellen zu entfernen.
- Sammeln Sie alle Aggregate in den ULA 6-Wells, resuspendieren Sie die Aggregate im Medium der Stufe 5 und passen Sie die Dichte auf 20 Cluster pro 100 μl an (z. B. werden ~1.200 Cluster aus jeder Vertiefung erwartet. Resuspendierung von 1.200 Clustern in 6 ml Medium der Stufe 5). Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 50 μl Medium der Stufe 5 in jede Vertiefung einer ULA-Flachbodenplatte mit 96 Vertiefungen zu dosieren. Füllen Sie die Eck- und Randvertiefungen mit 200 μl DPBS.
HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Randschächte für die Kultivierung von Zuschlagstoffen zu verwenden, da sie zu mehr Verdunstung neigen. Andernfalls verwenden Sie eine 96-Well-Platte, die so konzipiert ist, dass die Verdunstung entlang der Ränder minimiert wird (z. B. 96-Well-Platten mit eingebauten Gräben), oder legen Sie die Kulturplatte in einen Mikroklima-Zellkultur-Inkubator mit hoher Luftfeuchtigkeit. - Geben Sie 100 μl der Cluster-Resuspension in jede Vertiefung der ULA-Flachbodenplatte mit 96 Wells, was zu insgesamt 150 μl Nährmedium führt, das durchschnittlich 20 Cluster pro Well enthält.
HINWEIS: Mischen Sie die Cluster-Resuspension jedes Mal vorsichtig, bevor Sie sie in 96-Wells dosieren. - Kulturplatten werden 24 h lang auf einer ebenen Fläche in einen befeuchteten Inkubator mit 37 °C und 5 % CO2 gelegt.
- Bereiten Sie an Tag 2 der Stufe 5 die mittlere Stufe nach Schritt 4.1 vor.
- Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um ~90 μl des verbrauchten Mediums aus jeder Vertiefung zu entfernen, und frischen Sie es mit 100 μl Medium der Stufe 5 auf.
- Wiederholen Sie an Tag 3 der Stufe 5 die Schritte 4.7 bis 4.8. Fahren Sie mit Phase 6 fort.
- An Tag 1 der Stufe 6 das Basalmedium der Stufe 5-7 in einem Bad bei 37 °C erwärmen und auftauen (siehe Tabelle 1 und Tabelle 2). Bereiten Sie das Medium der Stufe 6 vor, indem Sie dem Basalmedium der Stufe 5-7 Zusätze (zu den endgültigen Arbeitskonzentrationen) hinzufügen. Gut mischen und sofort verwenden.
- Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um ~90 μl des verbrauchten Mediums zu entfernen, und frischen Sie es mit 100 μl Medium der Stufe 6 pro Well auf.
- Wiederholen Sie in Phase 6, Tag 2 bis Tag 8 die Schritte 4.10-4.11. Fahren Sie mit Phase 7 fort.
- An Tag 1 der Stufe 7 das Basalmedium der Stufe 5-7 in einem 37 °C warmen Bad erwärmen und die Nahrungsergänzungsmittel auftauen (siehe Tabelle 1 und Tabelle 2). Bereiten Sie das Medium der Stufe 7 vor, indem Sie dem Basalmedium der Stufe 5-7 Zusätze (zu den endgültigen Arbeitskonzentrationen) hinzufügen. Gut mischen und sofort verwenden.
- Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um ~90 μl des verbrauchten Mediums zu entfernen und mit 100 μl Medium der Stufe 7 pro Well aufzufrischen.
- Wiederholen Sie auf Etappe 7 Tag 2 bis Tag 12 die Schritte 4.13-4.14. Fahren Sie mit der In-vitro-Charakterisierung fort.
5. Durchflusszytometrische Analyse
- Nährmedien entfernen und einmal mit DPBS waschen. Dissoziation der Kulturen (planare Vorläuferzellen oder differenzierende Cluster) in Einzelzellen mit Dissoziationsreagenz durch Inkubation bei 37 °C für 10-12 min. Mit FACS-Puffer abspülen und bei 300 × g 5 Minuten schleudern.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet im FACS-Puffer und führen Sie die Zellzählung durch. Schleudern Sie die Zellen bei 300 × g für 5 Minuten. Resuspendieren Sie einzelne Zellen in 500 μl Fix/Perm-Puffer für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Bringen Sie den Fix/Perm-Puffer vor Gebrauch auf Raumtemperatur. Der Fix/Perm-Puffer enthält Paraformaldehyd (PFA). PFA vorsichtig in einem Abzug behandeln und gemäß den institutionellen Richtlinien entsorgen. - 3 Minuten lang bei 500 × g schleudern, zweimal mit 500 μl 1x Perm/Wash-Puffer waschen und in 300 μl 1x Perm/Wash-Puffer resuspendieren. 100 μl Einzelzell-Resuspension (jeweils mit 2,5-3 × 105 Zellen) werden zur ungefärbten Kontrolle, Isotypkontrolle und Antikörperfärbung in drei Mikrofugenröhrchen überführt (siehe Materialtabelle für Informationen zu Probenantikörpern und Verdünnungen). 45 min bei Raumtemperatur inkubieren und mit Folie abdecken.
- Bei 500 × g 3 Min. schleudern. Zweimal mit 500 μl 1x Dauerwellen-/Waschpuffer waschen. Resuspendieren Sie die Proben in 100 μl FACS-Puffer und analysieren Sie die gefärbten Zellen (siehe Materialtabelle für die intrazelluläre Färbung von Markern in bestimmten Stadien) mit einem Durchflusszytometer und einer Software (z. B. FlowJo).
HINWEIS: Wenn die Proben nicht sofort untersucht werden, lagern Sie sie bei 4 °C und vor Licht geschützt. Bei der Anschnittstrategie werden die Strömungsdaten zunächst durch Streueigenschaften (FSC-A und SSC-A) gesteuert, um kleine Zelltrümmer zu entfernen, gefolgt von FSC-A- und FSC-Breiteneigenschaften, um Singuletts zu identifizieren. Positives und negatives Gating wird durch Stammzellkontrollen und/oder ungefärbte Isotypkontrollen bestimmt.
6. Immunfärbung des gesamten Mounts
- Sammle Cluster in einem Mikrofugenröhrchen. Besiedeln Sie Cluster durch die Schwerkraft. Saugen Sie das verbrauchte Medium ab und spülen Sie es einmal mit 1 ml PBS (mit Kalzium und Magnesium) ab. Fixieren Sie die Cluster mit 1 ml 4% PFA bei 4 °C über Nacht.
- Einmal mit PBST spülen und 20-30 Cluster mit 500 μl 0,3% TritonX-100 in einem Mikrofugenröhrchen bei Raumtemperatur für mindestens 6 h auf einem Kippschüttler permeabilisieren.
HINWEIS: Für große Cluster ist eine längere Permeabilisierungszeit (bis zu 24 Stunden) erforderlich. - Inkubieren Sie die Cluster in 100 μl Sperrpuffer bei Raumtemperatur für 1 h auf einem Kippschüttler. Entfernen Sie den Blockierungspuffer und inkubieren Sie die Cluster mit 100 μl Primärantikörpern, die in Antikörperverdünnungspuffer bei Raumtemperatur über Nacht auf einem Kippschüttler verdünnt wurden.
HINWEIS: Wenn der Hintergrund während der Bildgebung stark ist, mit Primärantikörpern bei 4 °C inkubieren. - 3 x 30 min mit 500 μl PBST gründlich auf einem Kippschüttler waschen (Neigungswinkel auf 8 eingestellt, Geschwindigkeit auf 20 eingestellt).
- Inkubieren Sie die Cluster mit 100 μl Sekundärantikörpern in Antikörperverdünnungspuffer bei Raumtemperatur über Nacht auf einem Kippschüttler. Decken Sie die Röhrchen mit Folie ab.
HINWEIS: Wenn der Hintergrund während der Bildgebung stark ist, mit Sekundärantikörpern bei 4 °C inkubieren. - Einmal mit 500 μl PBST ausspülen. Fügen Sie 100 μl 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-Lösung (10 μg/ml in PBST) hinzu und färben Sie sie bei Raumtemperatur für 10-15 Minuten. Mit Folie abdecken und vor Licht schützen.
- 3 x 30 min mit 500 μl PBST gründlich auf einem Kippschüttler waschen. Decken Sie die Röhrchen während des Waschvorgangs mit Folie ab.
- Befestigen Sie die Cluster auf Objektträgern der Bildgebungskammer (siehe Materialtabelle), die gemäß dem Protokoll des Herstellers und den veröffentlichten Protokollen20,21 mit Gewebeklebstoff vorbeschichtet sind.
- Mit gewebereinigendem Medium (80 % Glycerin in PBS-Lösung) bestücken und mit Deckgläsern abdecken. Bis zur konfokalen Bildgebung vor Licht schützen.
HINWEIS: Wenn Proben nicht sofort abgebildet werden, lagern Sie sie bei 4 °C lichtgeschützt.
7. Statischer GSIS-Assay
- Erwärmen Sie den Ringer-Bicarbonat-Puffer (3,3 G KRB) von Kreb mit niedrigem Glukosegehalt, den KRB-Puffer mit hohem Glukosegehalt (16,7 G) und den 30 mM KCl KRB-Puffer in einem 37 °C-Bad.
- Wählen Sie von Hand auf die Größe abgestimmte Cluster aus und spülen Sie sie mit 2 ml warmem 3,3 G KRB-Puffer ab. Die Cluster werden in eine nicht mit Gewebekulturen behandelte 6-Well-Platte überführt und in 2 ml oder warmem 3,3 G KRB-Puffer für 1 h in einem befeuchteten 37 °C und 5 % CO2 -Inkubator äquilibriert.
- Nach der Äquilibrierung wird die Assay-Kammer (siehe Materialtabelle) mit 100 μl warmem 3,3 G KRB-Puffer gefüllt. Wählen Sie fünf Cluster von Hand aus und übertragen Sie sie in die Mitte der Analysekammer. 30 min in einem befeuchteten 37 °C, 5% CO2 -Inkubator inkubieren.
HINWEIS: Verwenden Sie 10-μl-Pipettenspitzen zum Übertragen von Clustern mit minimalem mittlerem Volumen. - ~100 μl des Überstandes vorsichtig auffangen und bei -30 °C bis zur Messung der Basalinsulinsekretion lagern (siehe Schritt 7.9). Trocknen Sie in diesem Schritt keine Trauben und verlieren Sie sie nicht. Sofort 100 μl warmer 16,7 G KRB-Puffer in die Assay-Kammer geben und dieselben Cluster 30 Minuten lang in einem befeuchteten 37 °C und 5 % CO2 -Inkubator inkubieren.
- ~100 μl des Überstandes vorsichtig auffangen und bei -30 °C lagern, bis die Glukose-stimulierte Insulinsekretion gemessen wird (siehe Schritt 7.9). Sofort 100 μl warmer 30 mM KCl KRB-Puffer in die Assay-Kammer geben und dieselben Cluster 30 Minuten lang in einem befeuchteten 37 °C und 5 % CO2 -Inkubator inkubieren.
- ~100 μl des Überstandes vorsichtig auffangen und bei -30 °C lagern, bis die KCl-stimulierte Insulinsekretion gemessen wurde (siehe Schritt 7.9). Geben Sie sofort 100 μl RIPA-Lysepuffer in die Assay-Kammer und überführen Sie den Lysepuffer, der alle fünf Cluster enthält, in ein Mikrofugenröhrchen.
- Optional) Brechen Sie die Cluster manuell durch kräftiges Reiben mit einer P200-Pipettenspitze. 30 s Vortex und 30 min auf Eis inkubieren, gefolgt von weiteren 30 s Vortexing.
HINWEIS: Stellen Sie eine vollständige Lyse durch Vortexing und eine ausreichende Inkubationszeit auf Eis sicher. - Bei 8.000 × g 1 Min. schleudern. Der Überstand wird aufgefangen und bei -30 °C gelagert, bis der Gesamtinsulingehalt gemessen wurde (siehe Schritt 7.9).
- Messung des Humaninsulins in den überstehenden Proben mit einem Humaninsulin-ELISA-Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers und den veröffentlichten Protokollen20,22.
HINWEIS: Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen von überstehenden Proben. Proben mit mehr als drei Gefrier- und Auftauzyklen sollten nicht untersucht werden.
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Representative Results
Wir haben eine Hybridstrategie entwickelt, um Stammzellen in sieben Schritten in insulinsezernierende hPSC-Inseln zu differenzieren, die ein Pankreas-Vorläuferkit für die ersten vier Stadien in planarer Kultur verwendet, gefolgt von einem modifizierten Protokoll, das auf einer zuvor beschriebenen Methode6 in einer statischen Suspensionskultur für die letzten drei Stadien aufbaut (Abbildung 1). Bei diesem Protokoll ist die Sicherstellung einer nahezu konfluenten (90%-100%) Kultur 24 Stunden nach der Zellaussaat (Stufe 0) entscheidend, um eine effiziente Differenzierung für die meisten hPSC-Linien zu initiieren (Abbildung 2A). Es wird dringend empfohlen, verschiedene Aussaatdichten zu testen, um die optimalen Bedingungen für eine bestimmte Zelllinie zu bestimmen. Während der Kultur im Stadium 1 erscheinen die Medien wahrscheinlich trüb aufgrund von schwimmenden toten Zellen, die in diesem Stadium häufig beobachtet werden. Dies beeinträchtigt nicht die Differenzierungseffizienz des Kits, solange die angehängten Zellen die Gefäßoberfläche vollständig bedecken. Während der Stadien 2-4, wenn sich die Zellen vermehren und der Zelltod abnimmt, verdichten sich die Monoschichten und die verbrauchten Medien sind nicht mehr so trüb wie in Phase 1 (Abbildung 2A). Wie mit dem Insulinreporter Mel1 INSGFP/W hES-Zellen gezeigt wurde, können routinemäßig mindestens 95 % FOXA2+/SOX17+ definitive Endodermzellen am Ende von Stadium 1 und 80 % PDX1+/NKX6.1+ Pankreas-Vorläuferzellen am Ende von Stadium 4 erreicht werden (Abbildung 2B-E). Es wurde gezeigt, dass der Übergang von Pankreas-Vorläuferzellen von der planaren Kultur zur Suspensionskultur die anschließende endokrine Zellinduktion fördert23,24. In diesem aktualisierten Protokoll verwenden wir Mikrotiterplatten und ermöglichen eine Zellaggregation von 24 Stunden. Dadurch entstehen Tausende von Pankreas-Vorläuferclustern mit einheitlicher Größe und Morphologie gleichzeitig (Abbildung 3A, B), und die durchschnittliche Aggregationseffizienz (durch Berechnung des Prozentsatzes der Zellen, die in Aggregate eingebaut werden) beträgt 74,1 % ± 4,4 % (Abbildung 3C). Wichtig ist, dass die Expression von PDX1 und NKX6.1 in diesen Clustern nach der Aggregation auf einem hohen Niveau gehalten wird (Abbildung 3D, E), was auf eine effiziente Produktion von Pankreas-Vorläuferzellen in vitro mit dem Differenzierungskit und der Mikrotiterplatte hindeutet.
Als nächstes verwenden wir das R-Protokoll (eine von Rezania et al.6 modifizierte Methode) für die letzte 3-stufige Differenzierung in einem statischen Suspensionskultursystem unter Verwendung von ULA-96-Well-Platten mit flachem Boden, um diese aus dem Kit abgeleiteten Pankreas-Vorläuferzellen weiter in Richtung hPSC-Inseln zu differenzieren (Abbildung 1). Insulinexprimierende Zellen werden allmählich innerhalb endokriner Cluster induziert, was durch die im Laufe der Zeit erhöhten INS-GFP-Signale in lebenden Kulturen angezeigt wird (Abbildung 4A, B). Die Quantifizierung der Clustergröße zeigt, dass der durchschnittliche Durchmesser von Clustern im Stadium 5 150 μm beträgt und im Stadium 7 der durchschnittliche Durchmesser auf 220 μm ansteigt (Abbildung 4C). Die Cluster behalten überwiegend ihr glattes, kugelförmiges Erscheinungsbild bei, wenn sie zwischen Stadium 5 und Stadium 7 wachsen, was darauf hindeutet, dass die statische Kulturmethode die Verklumpung von Clustern im Vergleich zu Suspensionskulturen auf Basis von Orbitalschüttlern (die typischerweise einige übergroße Cluster erzeugen) begrenzt25. Die Aufrechterhaltung von verdichteten Clustern mit glatter sphärischer Morphologie ist ein Indikator für eine gute Lebensfähigkeit der differenzierenden Zellen, was für eine erfolgreiche Differenzierung in Richtung funktioneller hPSC-Inseln wichtig ist.
Die Charakterisierung der Zellzusammensetzung zeigt, dass die durch das Hybridprotokoll erzeugten hPSC-Inseln im Stadium 7 in erster Linie endokrin sind und aus vier Hauptzelltypen bestehen, darunter insulinpositive Betazellen, Glucagon-positive Alphazellen, Somatostatin-positive Delta-Zellen und Pankreas-Polypeptid-positive PY-Zellen, während enterochromaffine Zellen (abgeleitet von einer Off-Target-Linie26) ebenfalls vorhanden sind (Abbildung 5A-C). Bemerkenswert ist, dass dieses Hybridprotokoll weitgehend monohormonelle Inselzellen (~50% CPEP+/GCG-/SST-Zellen, ~17% GCG+/CPEP-Zellen und ~12% SST+/CPEP-Zellen) und nur eine Minderheit von bihormonellen Zellen (CPEP+/GCG+ oder CPEP+/SST+) in Kulturen des Stadiums 7 erzeugt (Abbildung 5B-D). Die Untersuchung mehrerer wichtiger Transkriptionsfaktoren und reifer Betazellmarker in hPSC-Inseln im Stadium 7 zeigt, dass differenzierende Betazellen PDX1, NKX6.1, NEUROD1, MAFA und den Glukosetransporter GLUT1 exprimieren (Abbildung 6A). Darüber hinaus werden ~60% INS+/PDX1+ Zellen (Abbildung 6B) und 50% CPEP+/NKX6.1+ Zellen (Abbildung 6C) in den Stufe-7-Kulturen induziert, was auf eine effiziente Generierung von funktionellen Betazellen mit der hier vorgestellten Hybridstrategie hindeutet. In der Tat zeigen In-vitro-Assays zur statischen Glukose-stimulierten Insulinsekretion (GSIS), dass hPSC-Inseln im Stadium 7 hohe Insulinspiegel sezernieren können, die sowohl auf hohe Glukose als auch auf direkte Depolarisation reagieren (Abbildung 6D). Obwohl diese Funktion ermutigend ist, ist die In-vitro-Glukosereaktionsfähigkeit von hPSC-Inseln in Bezug auf das Ausmaß der Insulinsekretion immer noch nicht äquivalent zu der von Leicheninseln (Abbildung 6D) und der Gesamtinsulingehalt von hPSC-Inseln ist etwa halb so hoch wie in Leicheninseln (Abbildung 6E). Weitere Optimierungen sind erforderlich, um hPSC-Inseln mit reiferen Betazell-Phänotypen zu erreichen.
Abbildung 1: Überblick über das Differenzierungsschema zur Generierung funktioneller hPSC-Inseln in vitro. Das Workflow-Diagramm gibt einen Überblick über das siebenstufige Verfahren bei der Differenzierung von hPSCs in pankreatische Vorläuferzellen in einer planaren Kultur mit dem Pankreas-Vorläuferkit, der Aggregation zu pankreatischen Vorläuferclustern unter Verwendung von Mikrotiterplatten und dem Übergang zu hPSC-Inseln in einer statischen Suspensionskultur. Eine Insulin-Reporter-hESC-Linie, Mel1 INSGFP/W, wird in dieser Studie als Beispiel verwendet, um die Wirksamkeit dieser Hybridmethode zu demonstrieren. Abkürzungen: hPSCs = humane pluripotente Stammzellen; GSIS = Glukose-stimulierte Insulinsekretion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Gezielte Differenzierung von hPSCs in Pankreas-Vorläuferzellen mit Hilfe des Pankreas-Vorläuferkits. (A) Repräsentative Phasenkontrastbilder, die die Zellmorphologie in den angegebenen Stadien zeigen. Maßstabsbalken = 750 μm. (B, C) Repräsentative Durchflusszytometrie-Diagramme für Schlüsselmarker von (B) definitiven Endodermzellen im Stadium 1 (FOXA2+/SOX17+) und (C) Pankreas-Vorläuferzellen im Stadium 4 (PDX1+/NKX6.1+). (D) Repräsentative Immunfärbungsbilder von Pankreas-Vorläuferzellen für PDX1 (rot) und NKX6.1 (grün). Die Zellkerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt. Maßstabsbalken = 200 μm. (E) Durchflusszytometrische Quantifizierung von PDX1+/NKX6.1+-Zellen in Pankreas-Vorläuferzellen im Stadium 4 Tag 4 (n = 5 biologische Replikate). Abkürzungen: hPSCs = humane pluripotente Stammzellen; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Aggregation zu Pankreas-Vorläuferclustern einheitlicher Größe unter Verwendung von Mikrotiterplatten mit einem Durchmesser von 400 μm. (A) Repräsentative Phasenkontrastbilder am Ende von Stufe 4, die die Clustermorphologie im Mikrowell und nach der Entnahme aus dem Mikrotopf zeigen. Maßstabsbalken = 300 μm. (B) Quantifizierung des Clusterdurchmessers am Ende von Stufe 4 (n = 60 Cluster aus 3 biologischen Replikaten). (C) Quantifizierung der Aggregationseffizienz am Ende der Stufe 4 (n = 5 biologische Replikate). (D) Repräsentative Immunfärbungsbilder von Pankreas-Vorläuferclustern für PDX1 (rot) und NKX6.1 (grün). Die Zellkerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt. Maßstabsbalken = 100 μm. (E) Durchflusszytometrische Quantifizierung von PDX1+/NKX6.1+-Zellen in Pankreas-Vorläuferaggregaten der Stufe 4 Tag 5 (n = 4 biologische Replikate). Abkürzung: DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Differenzierung von Pankreas-Vorläuferzellen zu hPSC-Inseln in einem statischen Suspensionskultursystem . (A) Repräsentative Phasenkontrastbilder (oben) und Fluoreszenzbilder (unten), die die Clustermorphologie und das Insulinexpressionsmuster in den angegebenen Stadien zeigen. Maßstabsbalken = 300 μm. (B) Quantifizierung der mittleren INS-GFP-Fluoreszenzintensitäten pro Cluster in den angegebenen Stadien (n = 30 Cluster aus zwei biologischen Replikaten). (C) Quantifizierung des Clusterdurchmessers in den angegebenen Stadien (n = 60 Cluster aus drei biologischen Replikaten). Abkürzungen: hPSC = humane pluripotente Stammzelle; INS = Insulin; GFP = grün fluoreszierendes Protein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Charakterisierung der Zellzusammensetzung in hPSC-Inseln im Stadium 7. (A) Repräsentative Immunfärbungsbilder von hPSC-Inseln im Stadium 7 mit unterschiedlichen Zelltypen (SYN, pan-endokriner Marker; CK19, duktaler Marker; INS-GFP, Insulin wird durch Reporter-GFP-Signale angezeigt; GCG; SST; PPY; ENC wurde durch SLC18A1 Antikörper gefärbt). Die Zellkerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt. Maßstabsbalken = 100 μm. (B,C) Repräsentative Durchflusszytometrie-Diagramme des (B) Prozentsatzes von CPEP+- und GCG+-Zellen in hPSC-Inseln im Stadium 7 und (C) des Prozentsatzes von CPEP+- und SST+-Zellen in hPSC-Inseln im Stadium 7. (D) Durchflusszytometrische Quantifizierung von indizierten Zellmarkern in hPSC-Inseln im Stadium 7 (n = 4 biologische Replikate). Abkürzungen: hPSC = humane pluripotente Stammzelle; INS= Insulin; GFP = grün fluoreszierendes Protein; SYN = Synaptophysin; GCG = Glukagon; SST = Somatostatin; PPY = Polypeptid der Bauchspeicheldrüse; ENC = enterochromaffin; CPEP = C-Peptid; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: In-vitro-Charakterisierung und funktionelle Bewertung von hPSC-Inseln im Stadium 7. (A) Repräsentative Immunfärbungsbilder von hPSC-Inseln im Stadium 7, die eine Koexpression von Insulin (angezeigt durch Reporter-INS-GFP-Signale) mit mehreren wichtigen Betazellmarkern wie NKX6.1, MAFA, NEUROD1, PDX1 und dem Glukosetransporter GLUT1 zeigen. Die Zellkerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt. Maßstabsbalken = 100 μm. (B,C) Repräsentative Durchflusszytometrie-Diagramme des (B)-Prozentsatzes der INS+/PDX1+-Zellen und des (C)-Prozentsatzes der CPEP+/NKX6.1+-Zellen. (D) Statische GSIS-Assays, die eine Insulinfreisetzung von hPSC-Inseln im Stadium 7 (n = 6 einschließlich 3 biologischer und 2 technischer Replikate) und humanen Inseln (n = 6 einschließlich 3 biologischer und 2 technischer Replikate) als Reaktion auf eine hohe Glukose- (16,7 G, 16,7 mM Glukose) und 30 mM KCl-Depolarisation zeigen. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Ein ungepaarter zweiseitiger t-Test (**p < 0,01) wurde verwendet, um zwischen zwei indizierten Gruppen zu vergleichen. (E) Gesamtinsulingehalt von hPSC-Inseln im Stadium 7 (n = 6 einschließlich 3 biologischer und 2 technischer Replikate) und humanen Inseln (n = 6 einschließlich 3 biologischer und 2 technischer Replikate). Ein ungepaarter zweiseitiger t-Test (*p < 0,05) wurde verwendet, um die beiden Gruppen zu vergleichen. Abkürzungen: hPSC = humane pluripotente Stammzelle; INS = Insulin; GFP = grün fluoreszierendes Protein; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Tabelle 1: Formulierung aller in diesem Protokoll verwendeten Lösungen und Medien. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 2: Formulierung der Differenzierungsmedien der Stufen 1-7. Die Tabelle enthält das Rezept für die Zubereitung der Differenzierungsmedien der Stufen 1 bis 7. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
In dieser Arbeit wird ein siebenstufiges Hybridprotokoll beschrieben, das die Erzeugung von hPSC-Inseln ermöglicht, die in der Lage sind, Insulin bei Glukoseprovokation innerhalb von 40 Tagen nach der Kultur in vitro zu sezernieren. Es wird angenommen, dass die effiziente Induktion des definitiven Endoderms unter diesen mehreren Schritten einen wichtigen Ausgangspunkt für die endgültigen Differenzierungsergebnisse darstellt18,27,28. Im Protokoll des Herstellers wird eine Aussaatdichte von 2,6 × 105/cm2 empfohlen, um die Differenzierung einzuleiten, und die Zellen werden 2 Tage lang Medien der Stufe 1 ausgesetzt. Um sicherzustellen, dass die Zellen an Tag 1 nahezu konfluent sind (90%-100%), empfehlen wir dringend, die Aussaatdichten zu testen, wenn Sie an einer neuen hPSC-Linie arbeiten, da die optimale Aussaatdichte variieren kann. Als wir zum Beispiel alle drei getesteten hPSC-Linien in unseren Händen hielten, erwies sich 1,6-1,80 × 10 5/cm 2 anstelle von 2,60 × 105/cm2 als optimale Aussaatdichte. Die Verlängerung der Kulturdauer von Stufe 1 von 2 Tagen auf 3 Tage mit einem zusätzlichen Tag im Medium der Stufe 1B erhöht die Reinheit der FOXA2+/SOX17+-Zellen von 80 % auf > 93 % (Daten nicht gezeigt). Wenn der Anteil der FOXA2+/SOX17+-Zellen am Ende von Stufe 1 unter 70 % liegt, ist die Induktion von PDX1+-Zellen und PDX1+/NKX6.1+-Zellen wahrscheinlich beeinträchtigt.
Es ist wichtig zu beachten, dass ein gewisser Zelltod während der gesamten Kultur im Stadium 1 beobachtet werden kann, während die anhaftenden Zellen 100% der Oberfläche bedecken müssen. In den Stadien 2-4 führt die Abnahme des Zelltods gleichzeitig mit der Zellproliferation zu verdichteten und mehrschichtigen Zellen, was sich als entscheidend für die effiziente Induktion der Pankreas-Vorläufermarker PDX1 und NKX6.1 und deren Kernlokalisation erwiesenhat 29,30. Am letzten Tag der Stufe 4 werden die Zellen dissoziiert und mit Hilfe der AggreWell-Mikrotiterplatten mit einem Durchmesser von 400 μm zu Clustern aggregiert. Im Vergleich zu anderen Ansätzen wie der suspendierten Aggregation, der manuellen Aggregation oder der Verwendung von 96-Well-Platten mit U-Boden erzeugt die AggreWell-Aggregation Tausende von kugelförmigen Clustern einheitlicher Größe, was die Robustheit dieser Methode verdeutlicht.
Für die endokrine Induktion während der Stadien 5-7 in einer statischen 3D-Kultur übertragen wir eine durchschnittliche Anzahl von ~20 aus dem Kit abgeleiteten Pankreas-Vorläuferclustern in jede Vertiefung von ULA-Flachbodenplatten mit 96 Wells. Diese Methode reduziert die Bildung von übergroßen Clustern erheblich und verbessert die Zelllebensfähigkeit, möglicherweise durch die Begrenzung der Clusterfusion und/oder die Verringerung des durch Scherstress vermittelten Zellverlusts während der Orbitalschüttlerkultur. Um schwebende tote Zellen in verbrauchten Medien zu entfernen und gleichzeitig das Risiko des Verlusts von Clustern während des Medienwechsels zu verringern, empfehlen wir, etwa zwei Drittel des gesamten Mediumvolumens aufzufrischen. Wir stellen fest, dass dieser partielle Mediumwechsel die endokrine Differenzierung nicht behindert und stattdessen einen sanften Übergang beim Wechsel zwischen verschiedenen Stadien bieten kann. Nichtsdestotrotz kann mit diesem Hybridprotokoll beim Übergang von planarer Kultur zu statischer Suspensionskultur immer noch ein gewisser Zelltod während des Stadiums 5 und frühen Stadiums 6 beobachtet werden. Reporter-hPSC-Linien (z. B. MEL1 INSGFP/W hESCs) sind nützlich für die Überwachung der späten Differenzierung in lebenden Kulturen. Die Durchflusszytometrie hilft bei der Untersuchung von NKX6.1+/NEUROD1+ am Ende von Phase 5, INS+/NKX6.1+ am Ende von Phase 6 und CPEP+/NKX6.1+ am Ende von Phase 7. Die effiziente Induktion von CPEP+-Populationen, die zusammen mit NKX6.1 exprimiert werden, ist entscheidend für das Erreichen der Glukosereaktionsfähigkeit in Betazellen31,32. In diesem Zusammenhang erzeugt dieses Protokoll konsistent >50% CPEP+/NKX6.1+ Zellen in den resultierenden hPSC-Inseln des Stadiums 7, die Insulin als Reaktion auf eine hohe Glukosebelastung in vitro sezernieren können.
Obwohl das vorliegende Protokoll eine effiziente Generierung von insulinproduzierenden hPSC-Inseln gezeigt hat, gibt es Einschränkungen für diese Methode. Die Differenzierungseffizienzen am Ende von Stadium 4 aus verschiedenen hPSC-Linien, insbesondere iPS-Zellen, mit diesem Pankreas-Vorläuferkit könnten noch variabel sein (Daten nicht gezeigt). Die Optimierung sollte von Fall zu Fall erfolgen. Diese Methode für die letzten drei Stufen der Differenzierung beruht auf der Verwendung einer statischen Suspensionskultur in 96-Well-Platten, die arbeitsintensiv und nicht skalierbar ist, so dass sie nur auf die Forschung beschränkt ist. Obwohl es ermutigend ist, die Fähigkeit zur Insulinsekretion zu erhalten, sind die In-vitro-Glukosereaktionsfähigkeit und der Insulingehalt von hPSC-Inseln signifikant niedriger als die von Leicheninseln. Für die weitere Optimierung des Protokolls sind noch weitere Anstrengungen erforderlich. Trotz dieser Einschränkungen glauben wir, dass das hier vorgestellte Protokoll hPSC-abgeleitete Materialien liefert, die für das Screening differenzierungsinduzierender Faktoren und Regulatoren der Inselhormonsekretion sowie für die Modellierung der Dysfunktion von Inselzellen geeignet sind.
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Disclosures
Timothy J. Kieffer war während der Erstellung dieses Manuskripts Mitarbeiter von ViaCyte. Die anderen Autoren erklären, dass es keine konkurrierenden Interessen gibt.
Acknowledgments
Wir bedanken uns für die Unterstützung von STEMCELL Technologies, Michael Smith Health Research BC, Stem Cell Network, JDRF und den Canadian Institutes of Health Research. Jia Zhao und Shenghui Liang wurden mit dem Michael Smith Health Research BC Trainee Award ausgezeichnet. Mitchell J.S. Braam ist Stipendiat des Mitacs Accelerate Fellowship. Diepiriye G. Iworima ist Stipendiatin des Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship und des CFUW 1989 Ecole Polytechnique Commemorative Award. Wir danken Dr. Edouard G. Stanley vom MCRI und der Monash University für die gemeinsame Nutzung der Mel1 INS GFP/W-Linie und dem Inselkern des Alberta Diabetes Institute für die Isolierung und Verteilung menschlicher Inseln. Wir bedanken uns auch für die Unterstützung durch die Einrichtungen des Life Sciences Institute für Bildgebung und Durchflusszytometrie an der University of British Columbia. Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma | T6397 | Thyroid hormone |
| 4% PFA solution | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Should be handled in fume hood |
| 96-Well, Ultralow Attachment, flat bottom | Corning Costar (VWR) | CLS3474 | Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 07920 | Dissociation reagent for Stage 4 cells |
| Aggrewell400 plates | STEMCELL Technologies | 34415 | 400 µm diameter microwell plates |
| Aggrewell800 plates | STEMCELL Technologies | 34815 | 800 µm diameter microwell plates |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG) | R&D Systems | IC2400G | 1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control | R&D Systems | IC108G | 1:100 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B) | BD Sciences | 566032 | 1:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype Control | R&D Systems | IC0041G | 1:500 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ) | BD Pharmingen | 565831 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565689 | 1:2,000 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 563338 | 1:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 562594 | 1:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 557714 | 1:50 in flow cytometry |
| ALK5i II | Cayman Chemicals | 14794 | TGF-beta signaling inhibitor |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies | 7010 | Microwell Rinsing Solution |
| Assay chamber | Cellvis | D35-10-1-N | For static GSIS and confocal imaging purposes |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | BP1600-100 | For immunostaining procedure |
| CK19 antibody | DAKO | M0888 | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| D-glucose | Sigma | G8769 | Medium supplement |
| DAPI | Sigma | D9542 | For nuclear counterstaining |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Matrix diluting solution |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 555 | Life technologies | A21432 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21447 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31570 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31571 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31572 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31573 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21448 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| DPBS | Sigma | D8537 | Without Ca2+ and Mg2+ |
| ELISA, insulin, human | Alpco | 80-INSHU-E01.1 | For human insulin measurement |
| Fatty acid-free BSA | Proliant | 68700 | Medium supplement |
| Fixation and Permeabilization Solution Kit | BD Sciences | 554714 | Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | For clump passaging hPSCs during maintenance culture |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | 1:400 in whole mount immunofluorescence |
| GLUT1 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA1-37782 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| GlutaMAX-I (100x) | Gibco | 35050061 | L-glutamine supplement |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G33-4 | For tissue clearing and mounting |
| GSi XX | Sigma Millipore | 565789 | Notch inhibitor |
| Heparin | Sigma | H3149 | Medium supplement |
| ITS-X (100x) | Thermo Fisher Scientific | 51500056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement |
| LDN193189 | STEMCELL Technologies | 72147 | BMP antagonist |
| MAFA antibody | Abcam | ab26405 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Matrigel, hESC-qualified | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | Extracellular matrix for vessel surface coating |
| MCDB131 medium | Life technologies | 10372019 | Base medium |
| mTeSR1 Complete Kit | STEMCELL Technologies | 85850 | stem cell medium and 5x supplement included |
| N-Cys (N-acetyl cysteine) | Sigma | A9165 | Antioxidant |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | Medium supplement |
| NEUROD1 antibody | R&D Systems | AF2746 | 1:20 in whole mount immunofluorescence |
| NKX6.1 antibody | DSHB | F55A12-c | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| Pancreatic polypeptide antibody | R&D Systems | AF6297 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PBS | Sigma | D8662 | With Ca2+ and Mg2+ |
| PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565860 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 563023 | 1:250 in flow cytometry |
| PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 562161 | 1:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| PE Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 554680 | 1:2,000 in flow cytometry |
| PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k) | BD Sciences | 564563 | 1:200 in flow cytometry |
| R428 | Cayman Chemicals | 21523 | AXL tyrosine kinase inhibitor |
| Retinoid acid, all-trans | Sigma | R2625 | Light-sensitive |
| RIPA lysis buffer, 10x | Sigma | 20-188 | For hormone extraction |
| SANT-1 | Sigma | S4572 | SHH inhibitor |
| SLC18A1 antibody | Sigma | HPA063797 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Somatostatin antibody | Sigma | HPA019472 | 1:100 in whole mount immunofluorescence |
| STEMdiff Pancreatic Progenitor Kit | STEMCELL Technologies | 05120 | Basal media and supplements included |
| Synaptophysin antibody | Novus | NB120-16659 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | For permeabilization |
| Trolox | Sigma Millipore | 648471 | Vitamin E analog |
| TrypLE Enzyme Express | Life technologies | 12604-021 | cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs |
| Trypsin1/2/3 antibody | R&D Systems | AF3586 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | ROCK inhibitor |
| Zinc sulfate | Sigma | Z0251 | Medium supplement |
References
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