Summary
La diferenciación de las células madre en células de los islotes proporciona una solución alternativa al tratamiento convencional de la diabetes y al modelado de la enfermedad. Describimos un protocolo detallado de cultivo de células madre que combina un kit de diferenciación comercial con un método previamente validado para ayudar a producir islotes derivados de células madre secretores de insulina en una placa.
Abstract
La diferenciación de las células madre pluripotentes humanas (hPSC) en células beta secretoras de insulina proporciona material para investigar la función de las células beta y el tratamiento de la diabetes. Sin embargo, sigue habiendo desafíos para obtener células beta derivadas de células madre que imiten adecuadamente a las células beta humanas nativas. Sobre la base de estudios previos, se han generado células de islotes derivadas de hPSC para crear un protocolo con mejores resultados de diferenciación y consistencia. El protocolo descrito aquí utiliza un kit de progenitores pancreáticos durante las etapas 1-4, seguido de un protocolo modificado de un artículo publicado previamente en 2014 (denominado "protocolo R" en adelante) durante las etapas 5-7. Se incluyen procedimientos detallados para el uso del kit de progenitores pancreáticos y placas de micropocillos de 400 μm de diámetro para generar grupos de progenitores pancreáticos, el protocolo R para la diferenciación endocrina en un formato de suspensión estática de 96 pocillos, y la caracterización in vitro y la evaluación funcional de los islotes derivados de hPSC. El protocolo completo tarda 1 semana para la expansión inicial de la hPSC, seguida de ~5 semanas para obtener islotes de hPSC productores de insulina. Este protocolo puede ser reproducido por personal con técnicas básicas de cultivo de células madre y formación en ensayos biológicos.
Introduction
Las células beta pancreáticas secretan insulina en respuesta a los aumentos en los niveles de glucosa en sangre. Los pacientes que carecen de suficiente producción de insulina debido a la destrucción autoinmune de las células beta en la diabetes tipo 1 (DT1)1, o debido a la disfunción de las células beta en la diabetes tipo 2 (DT2)2, suelen ser tratados con la administración de insulina exógena. A pesar de esta terapia que salva vidas, no puede igualar con precisión el exquisito control de la glucosa en sangre que se logra mediante la secreción dinámica de insulina de las células beta de buena fe. Como tal, los pacientes a menudo sufren las consecuencias de episodios de hipoglucemia potencialmente mortales y otras complicaciones resultantes de excursiones hiperglucémicas crónicas. El trasplante de islotes cadavéricos humanos restaura con éxito un estricto control glucémico en pacientes con diabetes Tipo 1, pero está limitado por la disponibilidad de donantes de islotes y las dificultades para purificar islotes sanos para trasplante 3,4. Este reto puede, en principio, resolverse mediante el uso de hPSC como material de partida alternativo.
Las estrategias actuales para generar islotes secretores de insulina a partir de hPSCs in vitro a menudo apuntan a imitar el proceso de desarrollo embrionario del páncreas in vivo 5,6. Esto requiere el conocimiento de las vías de señalización responsables y la adición programada de los factores solubles correspondientes para imitar las etapas críticas del páncreas embrionario en desarrollo. El programa pancreático se inicia con el compromiso con el endodermo definitivo, que está marcado por los factores de transcripción forkhead box A2 (FOXA2) y la región determinante del sexo Y-box 17 (SOX17)7. La diferenciación sucesiva del endodermo definitivo implica la formación de un tubo intestinal primitivo, que se modela en un intestino anterior posterior que expresa el homeobox 1 pancreático y duodenal (PDX1)7,8,9, y la expansión epitelial en progenitores pancreáticos que coexpresan PDX1 y homeobox 1 NK6 (NKX6.1)10,11.
Un mayor compromiso con las células endocrinas de los islotes se acompaña de la expresión transitoria del regulador maestro proendocrino neurogenina-3 (NGN3)12 y la inducción estable de los factores de transcripción clave diferenciación neuronal 1 (NEUROD1) y NK2 homeobox 2 (NKX2.2)13. Posteriormente, se programan las principales células que expresan hormonas, como las células beta productoras de insulina, las células alfa productoras de glucagón, las células delta productoras de somatostatina y las células PPY productoras de polipéptidos pancreáticos. Con este conocimiento, así como con los descubrimientos de extensos estudios de cribado de fármacos de alto rendimiento, los avances recientes han permitido la generación de islotes hPSC con células parecidas a las células beta capaces de secreción de insulina 14,15,16,17,18,19.
Se han reportado protocolos escalonados para generar células beta sensibles a la glucosa 6,14,18,19. Sobre la base de estos estudios, el presente protocolo implica el uso de un kit de progenitores pancreáticos para generar células progenitoras pancreáticas PDX1+/NKX6.1+ en un cultivo plano, seguido de la agregación de placas de micropocillos en grupos de tamaño uniforme y una mayor diferenciación hacia islotes de hPSC secretoras de insulina con el protocolo R en un cultivo estático en suspensión 3D. Se realizan análisis de control de calidad, incluida la citometría de flujo, la inmunotinción y la evaluación funcional, para una caracterización rigurosa de las células diferenciadoras. Este artículo proporciona una descripción detallada de cada paso de la diferenciación dirigida y describe los enfoques de caracterización in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Este protocolo se basa en el trabajo con líneas hPSC, incluyendo H1, HUES4 PDXeG y Mel1 INSGFP/W, en condiciones libres de alimentadores. En esta sección se detalla un procedimiento paso a paso, con datos de apoyo de la diferenciación de Mel1 INSGFP/W en la sección de resultados representativos. Recomendamos que se necesite una mayor optimización cuando se trabaje con otras líneas hPSC que no se indican aquí. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los reactivos y soluciones utilizados en este protocolo.
1. Preparación de medios y soluciones de diferenciación
NOTA: Consulte la Tabla 1 para ver todas las soluciones que se deben preparar y la Tabla 2 para los medios de diferenciación.
- Prepare todos los medios y reactivos para el cultivo celular en una cabina de bioseguridad estéril. Calentar brevemente las soluciones relacionadas con el cultivo celular y los medios basales a 37 °C en un baño antes de su uso.
NOTA: Como se describe a continuación, haga nuevos medios de diferenciación diariamente agregando suplementos y utilícelos el mismo día. Alternativamente, el kit de progenitores pancreáticos ofrece la opción de preparar un volumen mayor con anticipación que se puede usar durante varios días siguiendo el protocolo del fabricante. Ambos métodos para la preparación de los medios de comunicación han demostrado funcionar bien. Tenga en cuenta que no se recomienda dejar los medios durante un tiempo prolongado en el baño de agua. Al preparar medios frescos cada día, se recomienda alícuotas de suplementos para evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación.
2. Diferenciación de hPSCs en células progenitoras pancreáticas
- Mantener hPSC indiferenciadas en vasos recubiertos de Matrigel, en medio completo mTeSR1 y realizar cambios de medio diariamente. Durante el cultivo de mantenimiento, pase las hPSC cada 3-4 días cuando las células alcancen ~70% de confluencia utilizando el reactivo de disociación celular siguiendo el protocolo del fabricante. Para iniciar la diferenciación, disocie las células en células individuales y siembrójelas en placas tratadas con cultivo de tejidos de 6 o 12 pocillos (con volúmenes de medios de 2 ml o 1 ml por pocillo, respectivamente).
NOTA: Consulte la Tabla 1 para obtener instrucciones relacionadas con el almacenamiento del medio basal del endodermo y sus alícuotas. - Precubra los pocillos de cultivo con Matrigel calificado hESC (diluido en DMEM/F12 helado según lo recomendado por el protocolo del fabricante) y coloque la placa en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2 durante 30 min.
- Mueva la placa recubierta de Matrigel a temperatura ambiente (úsela dentro de las 3 h).
- Aspire el medio gastado del cultivo de hPSC y enjuague una vez con DPBS. Disociar el cultivo de hPSC en células individuales con la enzima de disociación celular a 37 °C durante 3-5 min. Enjuague las células agregando medio DMEM/F12 tibio, transfiéralas a un tubo cónico de 15 ml o 50 ml y centrifugue a 300 × g durante 5 minutos.
- Vuelva a suspender el gránulo celular con medio completo de células madre más 10 μM Y-27632 y realice el recuento de células vivas (azul de tripano negativo) con un hemocitómetro o contador de células automatizado. Aspirar Matrigel diluido e inmediatamente sembrar células vivas a una densidad de 1,60-1,80 × 105/cm2 en pocillos recubiertos de Matrigel e incubar en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2 durante 24 h. Continúe con la Etapa 1.
NOTA: Esto dará como resultado una confluencia inicial de ~95% para iniciar la diferenciación. De acuerdo con el protocolo del fabricante, se recomienda una densidad de siembra de 2,6 × 105/cm2 . Se recomienda probar varias densidades de siembra para determinar el valor óptimo de una línea celular y comprobar la viabilidad celular. Si la viabilidad es inferior al 80%, no proceda con la diferenciación. La baja viabilidad celular puede ser el resultado de una digestión excesiva o una trituración excesiva durante la cosecha o de dejar las células durante un tiempo prolongado en medio DMEM/F12 antes de la siembra. - En la etapa 1 día 1, calentar brevemente el medio basal del endodermo a 37 °C en un baño y descongelar el suplemento MR y CJ. Prepare el medio de la etapa 1A agregando Supplement MR y CJ al medio basal del endodermo. Mezclar bien y usar inmediatamente.
- Aspirar el medio gastado de los pocillos, añadir el medio Stage 1A e incubar en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2 durante 24 h.
NOTA: Los pasos de lavado son innecesarios. Retire las células no adheridas del cultivo agitando suavemente la placa de cultivo antes del intercambio de medios. Evite alterar la monocapa al no tocar la punta de la pipeta con el fondo del pocillo durante la extracción del medio y mediante la adición suave del medio. - En la etapa 1 día 2, calentar brevemente el medio basal del endodermo en un baño a 37 °C y descongelar Suplemento CJ. Prepare el medio de la etapa 1B agregando el suplemento CJ al medio basal del endodermo. Mezclar bien y usar inmediatamente.
- Aspirar el medio gastado de los pocillos, añadir el medio Stage 1B e incubar en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2 durante 24 h.
- En la Etapa 1 día 3, repita los pasos 2.8-2.9. Continúe con la Etapa 2.
- En el día 1 de la Etapa 2, calentar el medio basal pancreático Etapa 2-4 en un baño a 37 °C y descongelar el Suplemento 2A y 2B. Prepare el medio de la Etapa 2A agregando el Suplemento 2A y 2B al medio basal pancreático Etapa 2-4. Mezclar bien y usar inmediatamente.
- Aspirar el medio gastado de los pocillos, añadir el medio Stage 2A e incubar en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2 durante 24 h.
- En el día 2 de la Etapa 2, calentar el medio basal pancreático Etapa 2-4 en un baño a 37 °C y descongelar el Suplemento 2B. Prepare el medio de la Etapa 2B agregando el Suplemento 2B al medio basal pancreático Etapa 2-4. Mezclar bien y usar inmediatamente.
- Aspirar el medio gastado de los pocillos, añadir el medio Stage 2B e incubar en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2 durante 24 h.
- En la Etapa 2 día 3, repita los pasos 2.13-2.14. Continúe con la Etapa 3.
- En la Etapa 3 día 1, calentar el medio basal pancreático Etapa 2-4 en un baño a 37 °C y descongelar el Suplemento 3. Prepare el medio de la Etapa 3 agregando el Suplemento 3 al medio basal de la Etapa 2-4 del páncreas. Mezclar bien y usar inmediatamente.
- Aspirar el medio gastado de los pocillos, añadir el medio Stage 3 e incubar en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2 durante 24 h.
- En la etapa 3, día 2 y día 3, repita los pasos 2.16-2.17. Continúe con la etapa 4.
- En la Etapa 4 día 1, calentar el medio basal pancreático Etapa 2-4 en un baño a 37 °C y descongelar el Suplemento 4. Prepare el medio de la Etapa 4 agregando el Suplemento 4 al medio basal de la Etapa 2-4 del páncreas. Mezclar bien y usar inmediatamente.
- Aspirar el medio gastado de los pocillos, añadir el medio Stage 4 e incubar en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2 durante 24 h.
- En la etapa 4 del día 2 al día 4, repita los pasos 2.19-2.20. Continúe con los pasos de agregación.
3. Agregación en grupos de progenitores pancreáticos utilizando placas de micropocillos de 400 μm de diámetro
- En la etapa 4 del día 5, pretrate los micropocillos (p. ej., formato de placa de 24 pocillos) con 500 μL de solución de enjuague antiadherente por pocillo.
- Prepare una placa de equilibrio y centrifugue la placa de micropocillos a 1.300 × g durante 5 min.
NOTA: Revise la placa bajo un microscopio para asegurarse de que no queden burbujas en los micropocillos. Vuelva a centrifugar durante otros 5 minutos si quedan burbujas atrapadas en algún micropocillo. - Aspire la solución de enjuague antiadherente de los pocillos y enjuague una vez con 1 ml de DPBS. Aspire el DPBS de los pocillos y agregue 1 ml de medio de agregación a cada pocillo.
- Retire el medio gastado de los cultivos de progenitores pancreáticos y lávese una vez con DPBS. Disociar los cultivos en células individuales con reactivo de disociación a 37 °C durante 10-12 min. Enjuague las células con DMEM/F12 tibio, transfiéralas a un tubo y centrifugue a 300 × g durante 5 minutos.
- Vuelva a suspender el gránulo de células en el medio de agregación y realice el recuento de células vivas. Siembre 2,4-3,6 millones de células totales por pocillo (es decir, 2.000-3.000 células por micropocillo) y agregue medio de agregación a cada pocillo para lograr un volumen final de 2 ml por pocillo.
- Pipetee suavemente las células hacia arriba y hacia abajo varias veces con una punta de pipeta P1000 para garantizar una distribución uniforme de las células por todo el pocillo. No introduzca burbujas en los micropocillos. Centrifugar la placa de micropocillos a 300 × g durante 5 min para capturar las células en los micropocillos. Incubar la placa de micropocillos en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2 durante 24 h de agregación y proceder a la diferenciación de las etapas 5-7.
NOTA: Tenga cuidado de no alterar la placa durante el tiempo de agregación. Pueden ser necesarias hasta 48 h de tiempo de incubación para una formación óptima de agregados.
4. Diferenciación de grupos de progenitores pancreáticos derivados del kit en islotes hPSC
- En la Etapa 5 día 1, calentar el medio basal de la Etapa 5-7 en un baño a 37 °C y descongelar suplementos (ver Tabla 1 y Tabla 2). Prepare el medio de la Etapa 5 agregando suplementos (a las concentraciones finales de trabajo) al medio basal de la Etapa 5-7. Mezclar bien y usar inmediatamente.
- Después de la formación de agregados, pipetee suavemente los agregados hacia arriba y hacia abajo varias veces con una punta de pipeta P1000 para hacer flotar cualquier celda no agregada. Deje que los agregados se asienten por gravedad (espere ~ 1 min). Retire suavemente el medio gastado (que contiene las células flotantes no agregadas) del pocillo tanto como sea posible mientras evita aspirar agregados.
- Dispense el medio fresco de la Etapa 5 vigorosamente sobre la superficie de la placa de micropocillos para desalojar los agregados de los micropocillos. Transfiera los agregados a 6 pocillos de fijación ultrabajo (ULA). Enjuague una vez con el medio Stage 5 para recuperar completamente los agregados de los micropocillos.
- Recoja todos los agregados en los 6 pocillos de ULA, vuelva a suspender los agregados en el medio de la etapa 5 y ajuste la densidad a 20 grupos por 100 μL (por ejemplo, se espera que se recuperen ~ 1,200 grupos de cada pozo. Resuspender 1.200 racimos en 6 mL de medio Stage 5). Utilice una pipeta multicanal para dispensar 50 μL de medio de la etapa 5 en cada pocillo de una placa ULA de fondo plano de 96 pocillos. Llene los pocillos de las esquinas y los bordes con 200 μL de DPBS.
NOTA: Evite usar los pozos de borde para cultivar agregados, ya que son propensos a una mayor evaporación; De lo contrario, use una placa de 96 pocillos que esté diseñada para minimizar la evaporación a lo largo de los bordes (por ejemplo, placas de 96 pocillos con fosos incorporados) o coloque la placa de cultivo en una incubadora de cultivo celular de microclima de alta humedad. - Agregue 100 μL de la resuspensión del racimo en cada pocillo de la placa de 96 pocillos de fondo plano de ULA, lo que da como resultado un total de 150 μL de medio de cultivo que contiene un promedio de 20 racimos por pocillo.
NOTA: Mezcle suavemente la resuspensión del racimo cada vez antes de dispensar en 96 pocillos. - Coloque las placas de cultivo sobre una superficie nivelada en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2 durante 24 h.
- En el día 2 de la Etapa 5, prepare el medio de la Etapa 5 siguiendo el paso 4.1.
- Utilice una pipeta multicanal para eliminar ~90 μL del medio gastado de cada pocillo y refresque con 100 μL de medio de la Etapa 5.
- En la etapa 5 del día 3, repita los pasos 4.7-4.8. Continúe con la etapa 6.
- En la etapa 6 del día 1, calentar el medio basal de la etapa 5-7 en un baño a 37 °C y descongelar suplementos (ver Tabla 1 y Tabla 2). Prepare el medio de la Etapa 6 agregando suplementos (a las concentraciones finales de trabajo) al medio basal de la Etapa 5-7. Mezclar bien y usar inmediatamente.
- Utilice una pipeta multicanal para eliminar ~90 μL del medio gastado y refresque con 100 μL de medio de la Etapa 6 por pocillo.
- En la etapa 6, del día 2 al día 8, repita los pasos 4.10-4.11. Continúe con la etapa 7.
- En la etapa 7 del día 1, calentar el medio basal de la etapa 5-7 en un baño a 37 °C y descongelar suplementos (ver Tabla 1 y Tabla 2). Prepare el medio de la Etapa 7 agregando suplementos (a las concentraciones finales de trabajo) al medio basal de la Etapa 5-7. Mezclar bien y usar inmediatamente.
- Utilice una pipeta multicanal para eliminar ~90 μL del medio gastado y refresque con 100 μL de medio de la Etapa 7 por pocillo.
- En la etapa 7 del día 2 al día 12, repita los pasos 4.13-4.14. Proceder a la caracterización in vitro .
5. Análisis citométrico de flujo
- Retire el medio de cultivo y lávelo una vez con DPBS. Disociar los cultivos (células progenitoras planas o grupos diferenciadores) en células individuales con reactivo de disociación incubando a 37 °C durante 10-12 min. Enjuagar con tampón FACS y centrifugar a 300 × g durante 5 min.
- Vuelva a suspender el gránulo de células en el tampón FACS y realice el recuento de células. Centrifugar las células a 300 × g durante 5 min. Vuelva a suspender las células individuales en 500 μL de tampón Fix/Perm durante 10 minutos a temperatura ambiente.
NOTA: Lleve el tampón Fix/Perm a temperatura ambiente antes de usarlo. El tampón Fix/Perm contiene paraformaldehído (PFA). Manipule con cuidado el PFA en una campana extractora y deséchelo de acuerdo con las pautas institucionales. - Centrifugar a 500 × g durante 3 min, lavar dos veces con 500 μL de 1x tampón Perm/Wash y volver a suspender en 300 μL de 1x tampón Perm/Wash. Transfiera 100 μL de resuspensión de una sola célula (cada una de las cuales contiene 2,5-3 × 105 células) a tres tubos de microfuga para el control sin tinción, el control del isotipo y la tinción de anticuerpos (consulte la Tabla de materiales para obtener información sobre la muestra de anticuerpos y dilución). Incubar durante 45 minutos a temperatura ambiente y cubrir con papel de aluminio.
- Centrifugar a 500 × g durante 3 min. Lavar dos veces con 500 μL de 1x tampón Perm/Wash. Vuelva a suspender las muestras en 100 μL de tampón FACS y analice las células teñidas (consulte la Tabla de materiales para la tinción intracelular de marcadores en etapas específicas) con un citómetro de flujo y un software (p. ej., FlowJo).
NOTA: Si las muestras no se analizan inmediatamente, guárdelas a 4 °C protegidas de la luz. Para la estrategia de compuertas, los datos de flujo se controlan primero mediante propiedades de dispersión (FSC-A y SSC-A) para eliminar pequeños desechos celulares, seguidas de propiedades de ancho FSC-A y FSC para identificar singletes. La activación positiva y negativa se determina mediante controles de células madre y/o controles de isotipo sin teñir.
6. Inmunotinción de montaje completo
- Recoja los racimos en un tubo de microfuga. Asentamiento de cúmulos por gravedad. Aspirar el medio gastado y enjuagar una vez con 1 mL de PBS (con calcio y magnesio). Fije los racimos con 1 ml de PFA al 4% a 4 °C durante la noche.
- Enjuagar una vez con PBST y permeabilizar 20-30 racimos con 500 μL de TritonX-100 al 0,3% en un tubo de microfuga a temperatura ambiente durante al menos 6 h en un agitador basculante.
NOTA: Se necesita un tiempo de permeabilización más largo (hasta 24 h) para racimos grandes. - Incubar los racimos en 100 μL de tampón de bloqueo a temperatura ambiente durante 1 h en un agitador basculante. Retire el tampón de bloqueo e incube los grupos con 100 μl de anticuerpos primarios diluidos en tampón de dilución de anticuerpos a temperatura ambiente durante la noche en un agitador basculante.
NOTA: Si el fondo es fuerte durante la toma de imágenes, incubar con anticuerpos primarios a 4 °C. - Lavar 3 x 30 min con 500 μL de PBST a fondo en un agitador basculante (ángulo de inclinación ajustado a 8, velocidad ajustada a 20).
- Incubar los grupos con 100 μL de anticuerpos secundarios en tampón de dilución de anticuerpos a temperatura ambiente durante la noche en un agitador basculante. Cubre los tubos con papel de aluminio.
NOTA: Si el fondo es fuerte durante la toma de imágenes, incubar con anticuerpos secundarios a 4 °C. - Enjuague una vez con 500 μL de PBST. Añadir 100 μL de solución de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (10 μg/mL en PBST) y teñir a temperatura ambiente durante 10-15 min. Cubra con papel de aluminio y proteja de la luz.
- Lavar 3 x 30 min con 500 μL de PBST a fondo en un agitador basculante. Cubra los tubos con papel de aluminio durante el paso de lavado.
- Coloque los grupos en portaobjetos de la cámara de imágenes (consulte la Tabla de materiales) prerecubiertos con adhesivo tisular de acuerdo con el protocolo del fabricante y los protocolos publicados20,21.
- Montar con medio de limpieza de tejidos (80% de glicerol en solución de PBS) y cubrir con cubreobjetos de vidrio. Proteger de la luz hasta la obtención de imágenes confocal.
NOTA: Si las muestras no se toman imágenes inmediatamente, guárdelas a 4 °C protegidas de la luz.
7. Ensayo GSIS estático
- Calentar el tampón de bicarbonato Ringer de Kreb (3,3 g de KRB) bajo en glucosa, el tampón de KRB con alto contenido de glucosa (16,7 g) y el tampón KCl KRB de 30 mM en un baño a 37 °C.
- Elija a mano los racimos del mismo tamaño y enjuague con 2 ml de tampón tibio de 3,3 g de KRB. Transfiera los racimos a una placa de 6 pocillos no tratada con cultivo de tejidos y equilibre en tampón KRB de 2 ml o 3,3 g tibio durante 1 h en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2 .
- Después del equilibrio, llene la cámara de ensayo (consulte la Tabla de materiales) con 100 μL de tampón KRB tibio de 3,3 G. Elija a mano cinco grupos y transfiéralos al centro de la cámara de ensayo. Incubar durante 30 min en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2 .
NOTA: Utilice puntas de pipeta de 10 μL para transferir grupos con un volumen medio mínimo. - Recoja cuidadosamente ~100 μL del sobrenadante y guárdelo a -30 °C hasta la medición de la secreción basal de insulina (ver paso 7.9). No seque ni pierda ningún racimo en este paso. Añadir inmediatamente 100 μL de tampón KRB tibio de 16,7 g en la cámara de ensayo e incubar los mismos racimos durante 30 min en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2 .
- Recoja cuidadosamente ~100 μL del sobrenadante y guárdelo a -30 °C hasta la medición de la secreción de insulina estimulada por la glucosa (ver paso 7.9). Añadir inmediatamente 100 μL de tampón KCl KRB tibio de 30 mM en la cámara de ensayo e incubar los mismos racimos durante 30 min en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2 .
- Recoja cuidadosamente ~100 μL del sobrenadante y guárdelo a -30 °C hasta la medición de la secreción de insulina estimulada por KCl (ver paso 7.9). Agregue inmediatamente 100 μL de tampón de lisis RIPA a la cámara de ensayo y transfiera el tampón de lisis que contiene los cinco grupos a un tubo de microfuga.
- Opcional) Rompa los racimos manualmente mediante una trituración vigorosa con una punta de pipeta P200. Vórtice durante 30 s e incube en hielo durante 30 minutos, seguido de otros 30 s de vórtice.
NOTA: Asegure la lisis completa por vórtice y un tiempo suficiente de incubación en hielo. - Girar a 8.000 × g durante 1 min. Recoger el sobrenadante y almacenar a -30 °C hasta la medición del contenido total de insulina (ver paso 7.9).
- Medir la insulina humana en las muestras sobrenadantes utilizando un kit ELISA de insulina humana de acuerdo con el protocolo del fabricante y los protocolos publicados20,22.
NOTA: Evite la congelación y descongelación repetida de las muestras sobrenadantes. No se deben analizar muestras con más de tres ciclos de congelación y descongelación.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Desarrollamos una estrategia híbrida para diferenciar las células madre en islotes hPSC secretores de insulina en siete pasos, que utiliza un kit progenitor pancreático para las primeras cuatro etapas en cultivo plano, seguido de un protocolo modificado basado en un método 6 previamente informado en un cultivoestático en suspensión para las últimas tres etapas (Figura 1). Con este protocolo, asegurar un cultivo cercano a la confluencia (90%-100%) a las 24 h después de la siembra celular (Etapa 0) es fundamental para iniciar una diferenciación eficiente para la mayoría de las líneas de hPSC (Figura 2A). Se recomienda encarecidamente probar diferentes densidades de siembra para determinar la condición óptima para una línea celular en particular. Durante el cultivo de la etapa 1, es probable que el medio aparezca turbio debido a las células muertas flotantes, que se observan comúnmente en esta etapa. Esto no compromete la eficiencia de diferenciación del kit siempre que las celdas adjuntas cubran completamente la superficie del recipiente. Durante las etapas 2-4, a medida que las células proliferan y la muerte celular disminuye, las monocapas se compactan más y los medios gastados no son tan turbios como durante la etapa 1 (Figura 2A). Como se demostró con las hESCGFP/W del indicador de insulina Mel1 INS, se puede lograr de forma rutinaria al menos el 95 % de las células endodérmicas definitivas FOXA2+/SOX17+ al final de la etapa 1 y el 80 % de las células progenitoras pancreáticas PDX1+/NKX6.1+ al final de la etapa 4 (Figura 2B-E). Se ha demostrado que la transición de las células progenitoras pancreáticas del cultivo plano al cultivo en suspensión promueve la posterior inducción de células endocrinas23,24. En este protocolo actualizado, utilizamos placas de micropocillos y permitimos 24 h de agregación celular. Esto genera miles de grupos de progenitores pancreáticos con tamaño y morfología uniformes a la vez (Figura 3A, B), y la eficiencia media de agregación (calculando el porcentaje de células que se incorporan a los agregados) es del 74,1% ± del 4,4% (Figura 3C). Es importante destacar que la expresión de PDX1 y NKX6.1 se mantiene en niveles altos en estos grupos después de la agregación (Figura 3D, E), lo que sugiere una producción eficiente de progenitores pancreáticos in vitro con el kit de diferenciación y la placa de micropocillos.
A continuación, utilizamos el protocolo R (un método modificado de Rezania et al.6) para la última diferenciación de 3 etapas en un sistema de cultivo en suspensión estática utilizando placas de 96 pocillos de fondo plano ULA para diferenciar aún más estos progenitores pancreáticos derivados del kit hacia islotes hPSC (Figura 1). Las células que expresan insulina se inducen gradualmente dentro de grupos endocrinos, como lo indica el aumento de las señales de INS-GFP en cultivos vivos a lo largo del tiempo (Figura 4A, B). La cuantificación del tamaño del racimo revela que el diámetro promedio de los racimos de la Etapa 5 es de 150 μm y para la Etapa 7, el diámetro promedio aumenta a 220 μm (Figura 4C). Los racimos mantienen predominantemente su apariencia lisa y esférica a medida que crecen entre la Etapa 5 y la Etapa 7, lo que sugiere que el método de cultivo estático limita la aglomeración de racimos en comparación con los cultivos en suspensión basados en agitadores orbitales (que generalmente generan algunos grupos de gran tamaño)25. El mantenimiento de racimos compactados con morfología esférica suave es un indicador de la buena viabilidad de las células en diferenciación, lo cual es importante para una diferenciación exitosa hacia islotes funcionales de hPSC al final.
La caracterización de la composición celular muestra que los islotes hPSC en estadio 7 generados por el protocolo híbrido son principalmente endocrinos y están compuestos por cuatro tipos principales de células de islotes, incluidas las células beta positivas para insulina, las células alfa positivas para glucagón, las células delta positivas para somatostatina y las células PPY positivas para polipéptidos pancreáticos, mientras que las células enterocromafines (derivadas de un linaje fuera del objetivo26) también están presentes (Figura 5A-C). En particular, este protocolo híbrido genera en gran medida células de islotes monohormonales (~50% de células CPEP+/GCG-/SST-, ~17% de células GCG+/CPEP- y ~12% de células SST+/CPEP-) y solo una minoría de células bihormonales (CPEP+/GCG+ o CPEP+/SST+) en cultivos en estadio 7 (Figura 5B-D). El examen de varios factores de transcripción clave y marcadores de células beta maduras en islotes hPSC en estadio 7 revela que las células beta diferenciadas expresan PDX1, NKX6.1, NEUROD1, MAFA y el transportador de glucosa GLUT1 (Figura 6A). Además, se induce un ~60% de células INS+/PDX1+ (Figura 6B) y un 50% de células CPEP+/NKX6.1+ (Figura 6C) en los cultivos de estadio 7, lo que sugiere una generación eficiente de células beta funcionales utilizando la estrategia híbrida que se presenta aquí. De hecho, los ensayos in vitro de secreción de insulina estimulada por glucosa estática (GSIS) demuestran que los islotes hPSC en estadio 7 pueden secretar altos niveles de insulina que responden tanto a la glucosa alta como a la despolarización directa (Figura 6D). Si bien esta función es alentadora, la respuesta a la glucosa in vitro de los islotes hPSC aún no es equivalente a la de los islotes cadavéricos en términos de la magnitud de la secreción de insulina (Figura 6D) y el contenido total de insulina de los islotes hPSC es aproximadamente la mitad de la cantidad de los islotes cadavéricos (Figura 6E). Se requiere una optimización continua para lograr islotes hPSC con fenotipos de células beta más maduros.
Figura 1: Resumen del esquema de diferenciación para generar islotes funcionales de hPSC in vitro. El diagrama de flujo de trabajo proporciona una descripción general del procedimiento de siete pasos involucrado en la diferenciación de hPSC en células progenitoras pancreáticas en un cultivo planar utilizando el kit de progenitores pancreáticos, la agregación en grupos de progenitores pancreáticos utilizando placas de micropocillos y la transición hacia islotes de hPSC en un cultivo estático en suspensión. A lo largo de este estudio se utiliza una línea de hESC reportera de insulina, Mel1 INSGFP/W, como ejemplo para demostrar la eficacia de este método híbrido. Abreviaturas: hPSCs = células madre pluripotentes humanas; GSIS = secreción de insulina estimulada por glucosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diferenciación dirigida de hPSCs en células progenitoras pancreáticas utilizando el kit de progenitores pancreáticos. (A) Imágenes representativas de contraste de fase que muestren la morfología celular en las etapas indicadas. Barras de escala = 750 μm. (B, C) Gráficos representativos de citometría de flujo para marcadores clave de (B) células endodérmicas definitivas en estadio 1 (FOXA2+/SOX17+) y (C) células progenitoras pancreáticas en estadio 4 (PDX1+/NKX6.1+). (D) Imágenes representativas de inmunotinción de células progenitoras pancreáticas para PDX1 (rojo) y NKX6.1 (verde). Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). Barra de escala = 200 μm. (E) Cuantificación citométrica de flujo de células PDX1+/NKX6.1+ en células monocapa progenitoras pancreáticas en estadio 4 día 4 (n = 5 réplicas biológicas). Abreviaturas: hPSCs = células madre pluripotentes humanas; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Agregación en grupos de progenitores pancreáticos de tamaño uniforme utilizando placas de micropocillos de 400 μm de diámetro. (A) Imágenes representativas de contraste de fase al final de la etapa 4 que muestran la morfología del grupo en el micropocillo y después de la recuperación del micropocillo. Barras de escala = 300 μm. (B) Cuantificación del diámetro del racimo al final de la Etapa 4 (n = 60 racimos de 3 réplicas biológicas). (C) Cuantificación de la eficiencia de agregación al final de la Etapa 4 (n = 5 réplicas biológicas). (D) Imágenes representativas de inmunotinción de grupos de progenitores pancreáticos para PDX1 (rojo) y NKX6.1 (verde). Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). Barra de escala = 100 μm. (E) Cuantificación citométrica de flujo de células PDX1+/NKX6.1+ en agregados progenitores pancreáticos del día 5 en estadio 4 (n = 4 réplicas biológicas). Abreviatura: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Diferenciación de progenitores pancreáticos en islotes hPSC en un sistema de cultivo estático en suspensión . (A) Imágenes representativas de contraste de fase (panel superior) e imágenes fluorescentes (panel inferior) que muestran la morfología del grupo y el patrón de expresión de insulina en las etapas indicadas. Barras de escala = 300 μm. (B) Cuantificación de las intensidades fluorescentes medias de INS-GFP por conglomerado en estadios indicados (n = 30 conglomerados a partir de dos réplicas biológicas). (C) Cuantificación del diámetro del racimo en las etapas indicadas (n = 60 racimos de tres réplicas biológicas). Abreviaturas: hPSC = célula madre pluripotente humana; INS = insulina; GFP = proteína verde fluorescente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Caracterización de la composición celular en islotes hPSC en estadio 7. (A) Imágenes representativas de inmunotinción de islotes hPSC en estadio 7 que muestran diferentes tipos de células (SYN, marcador panendocrino; CK19: marcador ductal; INS-GFP, la insulina se indica mediante señales de GFP reporteras; GCG; SST; PPY; El ENC fue teñido por SLC18A1 anticuerpo). Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). Barras de escala = 100 μm. (B,C) Gráficos representativos de citometría de flujo de (B) porcentaje de células CPEP+ y GCG+ en islotes hPSC en estadio 7 y (C) porcentaje de células CPEP+ y SST+ en islotes hPSC estadio 7. (D) Cuantificación por citometría de flujo de marcadores celulares indicados en islotes hPSC en estadio 7 (n = 4 réplicas biológicas). Abreviaturas: hPSC = célula madre pluripotente humana; INS= insulina; GFP = proteína verde fluorescente; SYN = sinaptofisina; GCG = glucagón; SST = somatostatina; PPY = polipéptido pancreático; ENC = enterocromafina; CPEP = péptido C; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Caracterización in vitro y evaluación funcional de islotes hPSC en estadio 7. (A) Imágenes representativas de inmunotinción de islotes hPSC en estadio 7 que muestran la coexpresión de insulina (indicada por señales reporteras de INS-GFP) con varios marcadores clave de células beta, como NKX6.1, MAFA, NEUROD1, PDX1 y el transportador de glucosa GLUT1. Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). Barras de escala = 100 μm. (B,C) Gráficos representativos de citometría de flujo del porcentaje (B) de células INS+/PDX1+ y el porcentaje (C) de células CPEP+/NKX6.1+. (D) Ensayos estáticos de GSIS que muestran la liberación de insulina de islotes hPSC en estadio 7 (n = 6, incluidas 3 réplicas biológicas y 2 técnicas) e islotes humanos (n = 6, incluidas 3 réplicas biológicas y 2 técnicas) en respuesta a una glucosa alta (16,7 G, 16,7 mM de glucosa) y una despolarización de KCl de 30 mM. Los datos se presentan como media ± SEM. Se utilizó una prueba t de dos colas no apareadas (**p < 0,01) para comparar entre dos grupos indicados. (E) Contenido total de insulina de los islotes hPSC en estadio 7 (n = 6, incluidas 3 réplicas biológicas y 2 técnicas) y de los islotes humanos (n = 6, incluidas 3 réplicas biológicas y 2 técnicas). Se utilizó una prueba t de dos colas no apareadas (*p < 0,05) para comparar los dos grupos. Abreviaturas: hPSC = célula madre pluripotente humana; INS = insulina; GFP = proteína verde fluorescente; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Formulación de todas las soluciones y medios utilizados en este protocolo. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: Formulación de medios de diferenciación de las etapas 1-7. La tabla proporciona la receta para preparar los medios de diferenciación de las etapas 1-7. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En este trabajo se describe un protocolo híbrido de siete etapas que permite la generación de islotes hPSC capaces de secretar insulina tras la exposición a la glucosa dentro de los 40 días posteriores al cultivo in vitro. Entre estos múltiples pasos, se cree que la inducción eficiente del endodermo definitivo establece un punto de partida importante para los resultados finales de diferenciación18,27,28. En el protocolo del fabricante, se recomienda una densidad de siembra de 2,6 × 105/cm2 para iniciar la diferenciación, y las células se exponen a los medios de la etapa 1 durante 2 días. Para garantizar que las células alcancen casi la confluencia en el día 1 (90%-100%), recomendamos encarecidamente probar las densidades de siembra cuando se trabaja en una nueva línea de hPSC, ya que la densidad de siembra óptima puede variar. Por ejemplo, con las tres líneas de hPSC probadas en nuestras manos, se encontró que 1,6-1,80 × 10 5/cm2, en lugar de 2,60 × 105/cm2, era una densidad de siembra óptima. La extensión de la duración del cultivo de la etapa 1 de 2 días a 3 días con un día adicional en el medio de la etapa 1B aumenta la pureza de las células FOXA2+/SOX17+ del 80 % al > 93 % (datos no mostrados). Si la proporción de células FOXA2+/SOX17+ es inferior al 70% al final de la etapa 1, es probable que la inducción de las células PDX1+ y las células PDX1+/NKX6.1+ se vea comprometida.
Es importante tener en cuenta que se puede observar cierta muerte celular durante todo el cultivo de la Etapa 1, mientras que se requiere que las células adheridas cubran el 100% del área de superficie. Durante las etapas 2-4, la disminución de la muerte celular concurrente con la proliferación celular da como resultado células compactadas y multicapas, lo que se ha reportado como crítico para la inducción eficiente de los marcadores progenitores pancreáticos PDX1 y NKX6.1 y su localización nuclear 29,30. En el último día de la Etapa 4, las células se disocian y se agregan en grupos utilizando las placas de micropocillos AggreWell de 400 μm de diámetro. En comparación con otros enfoques, como la agregación suspendida, la agregación manual o el uso de placas de 96 pocillos con fondo en U, la agregación AggreWell genera miles de grupos esféricos de tamaño uniforme, lo que ilustra la solidez de este método.
Para la inducción endocrina durante las etapas 5-7 en un cultivo estático en 3D, transferimos un número promedio de ~ 20 grupos de progenitores pancreáticos derivados del kit a cada pocillo de placas de 96 pocillos de fondo plano ULA. Este método reduce en gran medida la formación de grupos de gran tamaño y mejora la viabilidad celular, posiblemente limitando la fusión de clústeres y/o disminuyendo la pérdida celular mediada por estrés de cizallamiento durante el cultivo con agitador orbital. Para eliminar las células muertas flotantes en los medios gastados y, al mismo tiempo, reducir el riesgo de perder clústeres durante el cambio de medio, se recomienda actualizar aproximadamente dos tercios del volumen total del medio. Observamos que este cambio parcial del medio no dificulta la diferenciación endocrina y, en cambio, puede ofrecer una transición suave al cambiar entre diferentes etapas. Sin embargo, todavía se puede observar cierta muerte celular durante la etapa 5 y principios de la etapa 6 con este protocolo híbrido cuando se pasa del cultivo plano al cultivo en suspensión estática. Las líneas de hPSC reporteras (por ejemplo, las hESC Mel1 INSGFP/W) son útiles para monitorear la diferenciación en estadios tardíos en cultivos vivos. La citometría de flujo en ejecución ayudará a examinar NKX6.1+/NEUROD1+ al final de la etapa 5, INS+/NKX6.1+ al final de la etapa 6 y CPEP+/NKX6.1+ al final de la etapa 7. La inducción eficiente de las poblaciones de CPEP+ coexpresadas con NKX6.1 es fundamental para lograr la respuesta a la glucosa en las células beta31,32. En este sentido, este protocolo genera consistentemente >50% de células CPEP+/NKX6.1+ en los islotes hPSC de etapa 7 resultantes que pueden secretar insulina en respuesta a un desafío de glucosa alta in vitro.
Aunque el presente protocolo ha demostrado una generación eficiente de islotes de hPSC productores de insulina, este método tiene limitaciones. Las eficiencias de diferenciación al final de la etapa 4 de varias líneas de hPSC, en particular iPSC, con este kit de progenitores pancreáticos aún podrían ser variables (datos no mostrados). La optimización debe realizarse caso por caso. Este método para las últimas tres etapas de diferenciación se basa en el uso de cultivo en suspensión estática en placas de 96 pocillos, que requiere mucha mano de obra y no es escalable, lo que limita su uso solo a la investigación. Si bien es alentador obtener la capacidad de secreción de insulina, la capacidad de respuesta a la glucosa in vitro y el contenido de insulina de los islotes hPSC son significativamente más bajos que los de los islotes cadavéricos. Todavía se requieren esfuerzos futuros para la optimización continua del protocolo. A pesar de estas limitaciones, creemos que el protocolo presentado aquí proporciona materiales derivados de hPSC adecuados para el cribado de factores inductores de diferenciación y reguladores de la secreción de hormonas de los islotes, así como para modelar la disfunción de las células de los islotes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Timothy J. Kieffer fue empleado de ViaCyte durante la preparación de este manuscrito. Los demás autores declaran no tener intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Agradecemos el apoyo de STEMCELL Technologies, Michael Smith Health Research BC, Stem Cell Network, JDRF y los Institutos Canadienses de Investigación en Salud. Jia Zhao y Shenghui Liang han recibido el premio Michael Smith Health Research BC Trainee Award. Mitchell J.S. Braam es beneficiario de la beca Mitacs Accelerate. Diepiriye G. Iworima recibió la Beca de Posgrado Alexander Graham Bell Canadá y el Premio Conmemorativo de la Escuela Politécnica 1989 de la CFUW. Agradecemos sinceramente al Dr. Edouard G. Stanley de MCRI y la Universidad de Monash por compartir la línea Mel1 INS GFP/W y al Núcleo de Islotes del Instituto de Diabetes de Alberta por aislar y distribuir islotes humanos. También agradecemos el apoyo de las instalaciones de Imágenes y Citometría de Flujo del Instituto de Ciencias de la Vida de la Universidad de Columbia Británica. La figura 1 se creó con BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma | T6397 | Thyroid hormone |
| 4% PFA solution | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Should be handled in fume hood |
| 96-Well, Ultralow Attachment, flat bottom | Corning Costar (VWR) | CLS3474 | Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 07920 | Dissociation reagent for Stage 4 cells |
| Aggrewell400 plates | STEMCELL Technologies | 34415 | 400 µm diameter microwell plates |
| Aggrewell800 plates | STEMCELL Technologies | 34815 | 800 µm diameter microwell plates |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG) | R&D Systems | IC2400G | 1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control | R&D Systems | IC108G | 1:100 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B) | BD Sciences | 566032 | 1:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype Control | R&D Systems | IC0041G | 1:500 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ) | BD Pharmingen | 565831 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565689 | 1:2,000 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 563338 | 1:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 562594 | 1:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 557714 | 1:50 in flow cytometry |
| ALK5i II | Cayman Chemicals | 14794 | TGF-beta signaling inhibitor |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies | 7010 | Microwell Rinsing Solution |
| Assay chamber | Cellvis | D35-10-1-N | For static GSIS and confocal imaging purposes |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | BP1600-100 | For immunostaining procedure |
| CK19 antibody | DAKO | M0888 | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| D-glucose | Sigma | G8769 | Medium supplement |
| DAPI | Sigma | D9542 | For nuclear counterstaining |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Matrix diluting solution |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 555 | Life technologies | A21432 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21447 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31570 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31571 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31572 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31573 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21448 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| DPBS | Sigma | D8537 | Without Ca2+ and Mg2+ |
| ELISA, insulin, human | Alpco | 80-INSHU-E01.1 | For human insulin measurement |
| Fatty acid-free BSA | Proliant | 68700 | Medium supplement |
| Fixation and Permeabilization Solution Kit | BD Sciences | 554714 | Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | For clump passaging hPSCs during maintenance culture |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | 1:400 in whole mount immunofluorescence |
| GLUT1 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA1-37782 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| GlutaMAX-I (100x) | Gibco | 35050061 | L-glutamine supplement |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G33-4 | For tissue clearing and mounting |
| GSi XX | Sigma Millipore | 565789 | Notch inhibitor |
| Heparin | Sigma | H3149 | Medium supplement |
| ITS-X (100x) | Thermo Fisher Scientific | 51500056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement |
| LDN193189 | STEMCELL Technologies | 72147 | BMP antagonist |
| MAFA antibody | Abcam | ab26405 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Matrigel, hESC-qualified | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | Extracellular matrix for vessel surface coating |
| MCDB131 medium | Life technologies | 10372019 | Base medium |
| mTeSR1 Complete Kit | STEMCELL Technologies | 85850 | stem cell medium and 5x supplement included |
| N-Cys (N-acetyl cysteine) | Sigma | A9165 | Antioxidant |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | Medium supplement |
| NEUROD1 antibody | R&D Systems | AF2746 | 1:20 in whole mount immunofluorescence |
| NKX6.1 antibody | DSHB | F55A12-c | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| Pancreatic polypeptide antibody | R&D Systems | AF6297 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PBS | Sigma | D8662 | With Ca2+ and Mg2+ |
| PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565860 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 563023 | 1:250 in flow cytometry |
| PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 562161 | 1:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| PE Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 554680 | 1:2,000 in flow cytometry |
| PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k) | BD Sciences | 564563 | 1:200 in flow cytometry |
| R428 | Cayman Chemicals | 21523 | AXL tyrosine kinase inhibitor |
| Retinoid acid, all-trans | Sigma | R2625 | Light-sensitive |
| RIPA lysis buffer, 10x | Sigma | 20-188 | For hormone extraction |
| SANT-1 | Sigma | S4572 | SHH inhibitor |
| SLC18A1 antibody | Sigma | HPA063797 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Somatostatin antibody | Sigma | HPA019472 | 1:100 in whole mount immunofluorescence |
| STEMdiff Pancreatic Progenitor Kit | STEMCELL Technologies | 05120 | Basal media and supplements included |
| Synaptophysin antibody | Novus | NB120-16659 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | For permeabilization |
| Trolox | Sigma Millipore | 648471 | Vitamin E analog |
| TrypLE Enzyme Express | Life technologies | 12604-021 | cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs |
| Trypsin1/2/3 antibody | R&D Systems | AF3586 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | ROCK inhibitor |
| Zinc sulfate | Sigma | Z0251 | Medium supplement |
References
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W.
- Petersen, M. C., Shulman, G. I.
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
- Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. The journey of islet cell transplantation and future development. Islets. 10 (2), 80-94 (2018).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
- Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
- Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
- Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
- Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
- Rukstalis, J. M., Habener, J. F. Neurogenin3: a master regulator of pancreatic islet differentiation and regeneration. Islets. 1 (3), 177-184 (2009).
- Mastracci, T. L., Anderson, K. R., Papizan, J. B., Sussel, L. Regulation of Neurod1 contributes to the lineage potential of Neurogenin3+ endocrine precursor cells in the pancreas. PLoS Genetics. 9 (2), e1003278 (2013).
- Balboa, D., et al. Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells. Nature Biotechnology. 40 (7), 1042-1055 (2022).
- Du, Y., et al. Human pluripotent stem-cell-derived islets ameliorate diabetes in non-human primates. Nature Medicine. 28 (2), 272-282 (2022).
- Hogrebe, N. J., Augsornworawat, P., Maxwell, K. G., Velazco-Cruz, L., Millman, J. R. Targeting the cytoskeleton to direct pancreatic differentiation of human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 38 (4), 460-470 (2020).
- Yoshihara, E., et al. Immune-evasive human islet-like organoids ameliorate diabetes. Nature. 586 (7830), 606-611 (2020).
- Mahaddalkar, P. U., et al. Generation of pancreatic beta cells from CD177(+) anterior definitive endoderm. Nature Biotechnology. 38 (9), 1061-1072 (2020).
- Liang, S., et al. Differentiation of stem cell-derived pancreatic progenitors into insulin-secreting islet clusters in a multiwell-based static 3D culture system. Cell Reports Methods. 3, 10046 (2023).
- Zhao, J., et al. In vivo imaging of beta-cell function reveals glucose-mediated heterogeneity of beta-cell functional development. Elife. 8, e41540 (2019).
- Zhao, J., et al. In vivo imaging of calcium activities from pancreatic beta-cells in zebrafish embryos using spinning-disc confocal and two-photon light-sheet microscopy. Bio-protocol. 11 (23), e4245 (2021).
- Liang, S., et al. Carbon monoxide enhances calcium transients and glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta-cells by activating phospholipase C signal pathway in diabetic mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 582, 1-7 (2021).
- Bruin, J. E., et al. Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice. Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).
- Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
- Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
- Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro beta-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
- D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Jiang, Y., et al. Generation of pancreatic progenitors from human pluripotent stem cells by small molecules. Stem Cell Reports. 16 (9), 2395-2409 (2021).
- Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190 (2020).
- Mamidi, A., et al. Mechanosignalling via integrins directs fate decisions of pancreatic progenitors. Nature. 564 (7734), 114-118 (2018).
- Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells. 31 (11), 2432-2442 (2013).
- Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).
