Summary
A diferenciação de células-tronco em ilhotas fornece uma solução alternativa ao tratamento convencional do diabetes e à modelagem da doença. Descrevemos um protocolo detalhado de cultura de células-tronco que combina um kit de diferenciação comercial com um método previamente validado para auxiliar na produção de ilhotas derivadas de células-tronco secretoras de insulina em um prato.
Abstract
A diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) em células beta secretoras de insulina fornece material para investigar a função das células beta e o tratamento do diabetes. No entanto, permanecem desafios na obtenção de células beta derivadas de células-tronco que mimetizem adequadamente as células beta humanas nativas. Com base em estudos anteriores, células de ilhotas derivadas de hPSC foram geradas para criar um protocolo com melhores resultados de diferenciação e consistência. O protocolo aqui descrito utiliza um kit progenitor pancreático durante os estágios 1-4, seguido por um protocolo modificado de um artigo publicado anteriormente em 2014 (doravante denominado "protocolo R") durante os estágios 5-7. Procedimentos detalhados para o uso do kit de progenitores pancreáticos e placas de micropoços de 400 μm de diâmetro para gerar clusters de progenitores pancreáticos, protocolo R para diferenciação endócrina em um formato de suspensão estática de 96 poços e caracterização in vitro e avaliação funcional de ilhotas derivadas de hPSC são incluídos. O protocolo completo leva 1 semana para a expansão inicial da hPSC seguida por ~5 semanas para obter ilhotas hPSC produtoras de insulina. Pessoal com técnicas básicas de cultura de células-tronco e treinamento em ensaios biológicos pode reproduzir esse protocolo.
Introduction
As células beta pancreáticas secretam insulina respondendo a aumentos nos níveis de glicose no sangue. Pacientes sem produção suficiente de insulina devido à destruição autoimune das células beta no diabetes tipo 1 (DM1)1, ou devido à disfunção das células beta no diabetes tipo 2 (DM2)2, são tipicamente tratados com a administração de insulina exógena. Apesar dessa terapia que salva vidas, ela não pode corresponder precisamente ao controle requintado da glicose no sangue, como alcançado pela secreção dinâmica de insulina das células beta de boa-fé. Como tal, os pacientes frequentemente sofrem as consequências de episódios hipoglicêmicos com risco de vida e outras complicações resultantes de excursões hiperglicêmicas crônicas. O transplante de ilhotas de cadáveres humanos restaura com sucesso o controle glicêmico rigoroso em pacientes com DM1, mas é limitado pela disponibilidade de ilhotas doadoras e dificuldades na purificação de ilhotas saudáveis para transplante 3,4. Este desafio pode, em princípio, ser resolvido com o uso de hPSCs como material de partida alternativo.
As estratégias atuais de geração de ilhotas secretoras de insulina a partir de hPSCs in vitro frequentemente visam mimetizar o processo de desenvolvimento do pâncreas embrionário in vivo 5,6. Isso requer conhecimento das vias de sinalização responsáveis e adição cronometrada de fatores solúveis correspondentes para mimetizar estágios críticos do pâncreas embrionário em desenvolvimento. O programa pancreático inicia-se com o comprometimento na endoderme definitiva, que é marcada pelos fatores de transcrição forkhead box A2 (FOXA2) e região determinante do sexo Y-box 17 (SOX17)7. A diferenciação sucessiva da endoderme definitiva envolve a formação de um tubo intestinal primitivo, padronizado em um intestino anterior posterior que expressa a homeocaixa 1 pancreática e duodenal (PDX1)7,8,9, e expansão epitelial em progenitores pancreáticos que co-expressam PDX1 e NK6 homeobox 1 (NKX6.1)10,11.
Um maior comprometimento com as células das ilhotas endócrinas é acompanhado pela expressão transitória do regulador mestre pró-endócrino neurogenina-3 (NGN3)12 e indução estável dos principais fatores de transcrição diferenciação neuronal 1 (NEUROD1) e NK2 homeobox 2 (NKX2.2)13. As principais células que expressam hormônios, como células beta produtoras de insulina, células alfa produtoras de glucagon, células delta produtoras de somatostatina e células PPY produtoras de polipeptídeos pancreáticos, são subsequentemente programadas. Com esse conhecimento, bem como descobertas de extensos estudos de triagem de drogas em alto rendimento, avanços recentes têm possibilitado a geração de ilhotas hPSC com células semelhantes às células beta capazes de secreção de insulina 14,15,16,17,18,19.
Protocolos step-wise têm sido relatados para gerar células beta responsivas à glicose 6,14,18,19. Com base nesses estudos, o presente protocolo envolve o uso de um kit de progenitores pancreáticos para gerar células progenitoras pancreáticas PDX1+/NKX6.1+ em uma cultura plana, seguido pela agregação da placa de micropoços em agrupamentos de tamanho uniforme e diferenciação adicional para ilhotas hPSC secretoras de insulina com o protocolo R em uma cultura de suspensão 3D estática. Análises de controle de qualidade, incluindo citometria de fluxo, imunomarcação e avaliação funcional, são realizadas para caracterização rigorosa das células diferenciadoras. Este trabalho fornece uma descrição detalhada de cada etapa da diferenciação dirigida e delineia as abordagens de caracterização in vitro.
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Protocol
Este protocolo é baseado no trabalho com linhagens hPSC, incluindo H1, HUES4 PDXeG e Mel1 INSGFP/W, em condições livres de alimentadores. Um procedimento passo a passo é detalhado nesta seção, com dados de apoio da diferenciação de Mel1 INSGFP/W na seção de resultados representativos. Recomendamos que seja necessária uma otimização adicional ao trabalhar com outras linhas hPSC que não são indicadas aqui. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os reagentes e soluções usados neste protocolo.
1. Preparação de meios e soluções de diferenciação
NOTA: Consulte a Tabela 1 para todas as soluções a serem preparadas e a Tabela 2 para os meios de diferenciação.
- Preparar todos os meios e reagentes para cultura celular em gabinete estéril de biossegurança. Aquecer brevemente as soluções relacionadas com cultura celular e o meio basal a 37 °C num banho antes da utilização.
NOTA: Conforme descrito abaixo, faça novos meios de diferenciação diariamente, adicionando suplementos e use-os no mesmo dia. Alternativamente, o kit progenitor pancreático oferece a opção de preparar um volume maior com antecedência que pode ser usado durante vários dias seguindo o protocolo do fabricante. Ambos os métodos de preparação de mídia provam funcionar bem. Note que não é recomendado deixar a mídia por um tempo prolongado no banho-maria. Ao preparar meios frescos todos os dias, recomenda-se aliquotar suplementos para evitar ciclos repetidos de congelamento-descongelamento.
2. Diferenciação de hPSCs em células progenitoras pancreáticas
- Manter hPSCs indiferenciadas em vasos revestidos com Matrigel em meio completo mTeSR1 e realizar trocas de meio diariamente. Durante a cultura de manutenção, as hPSCs de passagem a cada 3-4 dias quando as células atingem ~70% de confluência usando o reagente de dissociação celular seguindo o protocolo do fabricante. Para iniciar a diferenciação, dissociar as células em células únicas e semeá-las em placas tratadas com cultura de tecidos de 6 ou 12 poços (com volumes médios de 2 mL ou 1 mL por poço, respectivamente).
NOTA: Consulte a Tabela 1 para instruções relacionadas ao armazenamento do meio basal da endoderme e suas alíquotas. - Poços de cultura pré-revestidos com Matrigel qualificado para hESC (diluído em DMEM/F12 gelado conforme recomendado pelo protocolo do fabricante) e colocar a placa em uma incubadora umidificada a 37 °C, 5% CO2 por 30 min.
- Mova a placa revestida com Matrigel para a temperatura ambiente (utilizar no prazo de 3 h).
- Aspirar o meio gasto da cultura hPSC e enxaguar uma vez com DPBS. Dissociar a cultura de hPSC em células únicas com enzima de dissociação celular a 37 °C por 3-5 min. Enxaguar as células adicionando meio DMEM/F12 quente, transferir para um tubo cônico de 15 mL ou 50 mL e girar a 300 × g por 5 min.
- Ressuspender o pellet celular com meio completo de células-tronco mais 10 μM Y-27632 e realizar contagem de células vivas (azul de tripano negativo) com hemocitômetro ou contador automático de células. Aspirar Matrigel diluído e semear imediatamente células vivas a uma densidade de 1,60-1,80 × 105/cm2 em poços revestidos com Matrigel e incubar em uma incubadora umidificada a 37 °C, 5% CO2 por 24 h. Prossiga para o Estágio 1.
NOTA: Isso resultará em ~95% de confluência inicial para iniciar a diferenciação. De acordo com o protocolo do fabricante, recomenda-se uma densidade de semeadura de 2,6 × 105/cm2 . Recomenda-se testar várias densidades de semeadura para determinar o valor ideal para uma linhagem celular e verificar a viabilidade celular. Se a viabilidade for inferior a 80%, não proceda à diferenciação. A baixa viabilidade celular pode ser resultado de superdigestão ou supertrituração durante a colheita ou deixar as células por um tempo prolongado em meio DMEM/F12 antes da semeadura. - Na Fase 1 dia 1, aquecer brevemente a endoderme basal a 37 °C em banho e descongelar o Suplemento MR e CJ. Preparar o meio Estágio 1A adicionando Suplemento MR e CJ ao meio basal endodérmico. Misture bem e use imediatamente.
- Aspirar o meio irradiado dos poços, adicionar o meio Estágio 1A e incubar em estufa umidificada a 37 °C, 5% CO2 por 24 h.
NOTA: As etapas de lavagem são desnecessárias. Remova as células soltas da cultura agitando suavemente a placa de cultura antes da troca do meio. Evite interromper a monocamada não tocando a ponta da pipeta no fundo do poço durante a remoção do meio e através da adição suave do meio. - Na Fase 1 dia 2, aquecer brevemente o meio basal endodérmico em banho a 37 °C e descongelar o Suplemento CJ. Prepare o meio Estágio 1B adicionando Suplemento CJ ao meio basal endodérmico. Misture bem e use imediatamente.
- Aspirar o meio gasto dos poços, adicionar o meio Estágio 1B e incubar em estufa umidificada a 37 °C, 5% CO2 por 24 h.
- No Estágio 1 dia 3, repita as etapas 2.8-2.9. Prossiga para o Estágio 2.
- No Estágio 2 dia 1, quente pancreático Estágio 2-4 Meio Basal em um banho de 37 °C e descongelar Suplemento 2A e 2B. Preparar o meio Estágio 2A adicionando Suplemento 2A e 2B ao Estágio pancreático 2-4 Meio Basal. Misture bem e use imediatamente.
- Aspirar o meio gasto dos poços, adicionar o meio Estágio 2A e incubar em uma incubadora umidificada a 37 °C, 5% CO2 por 24 h.
- No Estágio 2 dia 2, quente pancreático Estágio 2-4 Meio Basal em um banho de 37 °C e descongelar Suplemento 2B. Preparar o meio Estágio 2B adicionando Suplemento 2B ao Estágio pancreático 2-4 Meio Basal. Misture bem e use imediatamente.
- Aspirar o meio gasto dos poços, adicionar o meio Estágio 2B e incubar em uma incubadora umidificada a 37 °C, 5% CO2 por 24 h.
- No Estágio 2 dia 3, repita as etapas 2.13-2.14. Prossiga para o Estágio 3.
- No Estágio 3 dia 1, pancreático quente Estágio 2-4 Meio Basal em um banho de 37 °C e descongelar Suplemento 3. Prepare o meio do estágio 3 adicionando o suplemento 3 ao meio basal do estágio pancreático 2-4. Misture bem e use imediatamente.
- Aspirar o meio gasto dos poços, adicionar o meio Estágio 3 e incubar em uma incubadora umidificada a 37 °C, 5% CO2 por 24 h.
- Na fase 3 dia 2 e dia 3, repita os passos 2.16-2.17. Prossiga para o Estágio 4.
- No Estágio 4 dia 1, pancreático quente Estágio 2-4 Meio Basal em um banho de 37 °C e descongelar Suplemento 4. Prepare o meio do estágio 4 adicionando o suplemento 4 ao meio basal do estágio pancreático 2-4. Misture bem e use imediatamente.
- Aspirar o meio gasto dos poços, adicionar o meio Estágio 4 e incubar em uma incubadora umidificada a 37 °C, 5% CO2 por 24 h.
- No Estágio 4 do dia 2 ao dia 4, repita as etapas 2.19-2.20. Prossiga para as etapas de agregação.
3. Agregação em grupos de progenitores pancreáticos utilizando placas de micropoços de 400 μm de diâmetro
- No Estágio 4 dia 5, pré-trate os micropoços (por exemplo, formato de placa de 24 poços) com 500 μL de Solução de Enxágue Antiaderente por poço.
- Prepare uma placa de equilíbrio e centrifugar a placa de micropoço a 1.300 × g por 5 min.
NOTA: Verifique a placa sob um microscópio para garantir que não restem bolhas nos micropoços. Centrifugar novamente por mais 5 minutos se as bolhas permanecerem presas em qualquer micropoço. - Aspirar a Solução de Enxágue Antiaderente dos poços e enxaguar uma vez com 1 mL de DPBS. Aspirar a DPBS dos poços e adicionar 1 mL de meio de agregação a cada poço.
- Retire o meio gasto das culturas progenitoras pancreáticas e lave uma vez com DPBS. Dissociar as culturas em células únicas com reagente de dissociação a 37 °C por 10-12 min. Enxaguar as células com DMEM/F12 quente, transferi-las para um tubo e girar a 300 × g por 5 min.
- Ressuspenda a pastilha de células no meio de agregação e execute a contagem de células vivas. Semeando 2,4-3,6 milhões de células totais por poço (ou seja, 2.000-3.000 células por micropoço) e adicionando meio de agregação a cada poço para atingir um volume final de 2 mL por poço.
- Pipetar suavemente as células para cima e para baixo várias vezes com uma ponta de pipeta P1000 para garantir uma distribuição uniforme das células por todo o poço. Não introduza bolhas em micropoços. Centrifugar a placa do micropoço a 300 × g por 5 min para capturar as células nos micropoços. Incubar a placa de micropoço em uma incubadora umidificada a 37 °C, 5% CO2 para agregação de 24 h e prosseguir para os estágios 5-7 de diferenciação.
OBS: Cuidado para não atrapalhar a placa durante o tempo de agregação. Até 48 h de tempo de incubação podem ser necessários para a formação ideal de agregados.
4. Diferenciação de grupos de progenitores pancreáticos derivados de kits em ilhotas hPSC
- No Estágio 5 dia 1, aquecer o meio basal do Estágio 5-7 em um banho de 37 °C e descongelar suplementos (ver Tabela 1 e Tabela 2). Prepare o meio do Estágio 5 adicionando suplementos (às concentrações finais de trabalho) ao meio basal do Estágio 5-7. Misture bem e use imediatamente.
- Após a formação do agregado, pipetar suavemente os agregados para cima e para baixo várias vezes com uma ponta de pipeta P1000 para flutuar quaisquer células não agregadas. Deixe os agregados se acomodarem por gravidade (aguarde ~1 min). Remova suavemente o meio gasto (contendo as células flutuantes não agregadas) do poço tanto quanto possível, evitando aspirar agregados.
- Dispense o meio fresco do Estágio 5 vigorosamente na superfície da placa do micropoço para desalojar os agregados dos micropoços. Transfira agregados para 6 poços de fixação ultrabaixa (ULA). Enxaguar uma vez com meio Estágio 5 para recuperar completamente os agregados dos micropoços.
- Coletar todos os agregados nos poços ULA 6, ressuspender agregados em meio de Estágio 5 e ajustar a densidade para 20 clusters por 100 μL (por exemplo, espera-se que ~1.200 clusters sejam recuperados de cada poço. Ressuspender 1.200 cachos em 6 mL do meio Estágio 5). Use uma pipeta multicanal para distribuir 50 μL de meio Estágio 5 em cada poço de uma placa ULA de fundo plano de 96 poços. Preencha os poços de canto e borda com 200 μL de DPBS.
OBS: Evite utilizar os poços de borda para cultivo de agregados, pois eles são propensos a maior evaporação; caso contrário, use uma placa de 96 poços projetada para minimizar a evaporação ao longo das bordas (por exemplo, placas de 96 poços com fossos embutidos) ou coloque a placa de cultura em uma incubadora de cultura de células de microclima de alta umidade. - Adicionar 100 μL da ressuspensão de cluster em cada poço da placa de fundo plano de 96 poços da ULA, resultando em um total de 150 μL de meio de cultura contendo uma média de 20 cachos por poço.
NOTA: Misture suavemente a ressuspensão do cluster todas as vezes antes de distribuir em 96 poços. - Colocar as placas de cultura numa superfície plana numa incubadora humidificada a 37 °C, 5% CO2 durante 24 horas.
- No Estágio 5 dia 2, prepare o Estágio 5 médio seguindo o passo 4.1.
- Use uma pipeta multicanal para remover ~90 μL do meio gasto de cada poço e atualize com 100 μL do meio Estágio 5.
- No Estágio 5 dia 3, repita as etapas 4.7-4.8. Prossiga para o Estágio 6.
- No Estágio 6 dia 1, aquecer o meio basal do Estágio 5-7 em um banho de 37 °C e descongelar suplementos (ver Tabela 1 e Tabela 2). Prepare o meio do Estágio 6 adicionando suplementos (às concentrações finais de trabalho) ao meio basal do Estágio 5-7. Misture bem e use imediatamente.
- Use uma pipeta multicanal para remover ~90 μL do meio gasto e atualizar com 100 μL de meio Estágio 6 por poço.
- No Estágio 6 do dia 2 ao dia 8, repita as etapas 4.10-4.11. Prossiga para o Estágio 7.
- No Estágio 7 dia 1, aquecer o meio basal do Estágio 5-7 em um banho de 37 °C e descongelar suplementos (ver Tabela 1 e Tabela 2). Prepare o meio do Estágio 7 adicionando suplementos (às concentrações finais de trabalho) ao meio basal do Estágio 5-7. Misture bem e use imediatamente.
- Use uma pipeta multicanal para remover ~90 μL do meio gasto e atualizar com 100 μL de meio Estágio 7 por poço.
- No Estágio 7 do dia 2 ao dia 12, repita os passos 4.13-4.14. Proceder à caracterização in vitro .
5. Análise por citometria de fluxo
- Retire os meios de cultura e lave uma vez com DPBS. Dissociar as culturas (células progenitoras planas ou clusters diferenciadores) em células únicas com reagente de dissociação, incubando a 37 °C por 10-12 min. Enxaguar com tampão FACS e girar a 300 × g por 5 min.
- Ressuspenda a pastilha de célula no buffer FACS e execute a contagem de células. Spin cells a 300 × g por 5 min. Ressuspender células individuais em 500 μL de tampão Fix/Perm por 10 min à temperatura ambiente.
NOTA: Leve o buffer Fix/Perm à temperatura ambiente antes de usar. O buffer Fix/Perm contém paraformaldeído (PFA). Manusear cuidadosamente o PFA em uma capela de fumaça e descartar de acordo com as diretrizes institucionais. - Gire a 500 × g por 3 min, lave duas vezes com 500 μL de 1x Perm/Wash buffer e ressuspenda em 300 μL de 1x Perm/Wash buffer. Transferir 100 μL de ressuspensão de célula única (cada uma contendo 2,5-3 × 105 células) para três tubos de microfuga para controle não corado, controle de isotipos e coloração de anticorpos (consulte Tabela de materiais para obter informações sobre anticorpos e diluição de amostras). Incubar durante 45 min à temperatura ambiente e cobrir com papel alumínio.
- Gire a 500 × g por 3 min. Lavar duas vezes com 500 μL de 1x Perm/Wash buffer. Ressuspender as amostras em 100 μL de tampão FACS e analisar as células coradas (ver Tabela de Materiais para coloração intracelular de marcadores em estágios específicos) com um citômetro de fluxo e software (por exemplo, FlowJo).
NOTA: Se as amostras não forem imediatamente ensaiadas, armazená-las a 4°C protegidas da luz. Para a estratégia de limitação, os dados de fluxo são primeiramente limitados por propriedades de dispersão (FSC-A e SSC-A) para remover pequenos detritos celulares, seguidas pelas propriedades FSC-A e FSC-width para identificar singlets. O confinamento positivo e negativo é determinado por controles de células-tronco e/ou controles isotípicos não corados.
6. Imunomarcação de montagem inteira
- Colete cachos em um tubo de microfuga. Estabeleça aglomerados por gravidade. Aspirar o meio gasto e enxaguar uma vez com 1 mL de PBS (com cálcio e magnésio). Fixar os cachos com 1 mL de PFA a 4% a 4°C durante a noite.
- Enxaguar uma vez com PBST e permeabilizar 20-30 cachos com 500 μL de TritonX-100 a 0,3% em um tubo de microfuga à temperatura ambiente por pelo menos 6 h em um agitador de inclinação.
NOTA: Um tempo de permeabilização mais longo (até 24 h) é necessário para grandes clusters. - Incubar os cachos em 100 μL de tampão de bloqueio à temperatura ambiente durante 1 h num agitador de inclinação. Remova o tampão de bloqueio e incube os aglomerados com 100 μL de anticorpos primários diluídos em tampão de diluição de anticorpos à temperatura ambiente durante a noite em um agitador de inclinação.
NOTA: Se o fundo for forte durante a aquisição de imagens, incubar com anticorpos primários a 4 °C. - Lave 3 x 30 min com 500 μL de PBST completamente em um agitador de inclinação (ângulo de inclinação definido em 8, velocidade definida em 20).
- Incubar os clusters com 100 μL de anticorpos secundários em tampão de diluição de anticorpos à temperatura ambiente durante a noite em um agitador de inclinação. Cubra os tubos com papel alumínio.
NOTA: Se o fundo for forte durante a aquisição de imagens, incubar com anticorpos secundários a 4 °C. - Enxaguar uma vez com 500 μL de PBST. Adicionar 100 μL da solução de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (10 μg/mL em PBST) e corar à temperatura ambiente por 10-15 min. Cubra com papel alumínio e proteja da luz.
- Lave 3 x 30 min com 500 μL de PBST completamente em um agitador basculante. Cubra os tubos com papel alumínio durante a etapa de lavagem.
- Fixar os agrupamentos em lâminas de câmara de imagem (ver Tabela de Materiais) pré-revestidas com adesivo tecidual de acordo com o protocolo do fabricante e protocolos publicados20,21.
- Monte com meio de limpeza de tecido (glicerol 80% em solução de PBS) e cubra com lamínulas de vidro. Proteger da luz até imagens confocais.
NOTA: Se as amostras não forem fotografadas imediatamente, armazene-as a 4 °C protegidas da luz.
7. Ensaio GSIS estático
- Tampão de bicarbonato de Ringer (3,3G KRB) de baixa glicose quente de Kreb, tampão de alta glicose (16,7G) de KRB e tampão de KCl KRB de 30 mM em banho de 37 °C.
- Escolha manualmente os cachos de tamanho compatível e enxágue com 2 mL de tampão KRB 3,3G quente. Transfira os aglomerados para uma placa de 6 poços não tratada com cultura de tecidos e equilibre em 2 mL de tampão 3,3G KRB aquecido por 1 h em uma incubadora umidificada a 37 °C, 5% CO2 .
- Após o equilíbrio, encha a câmara de ensaio (ver Tabela de Materiais) com 100 μL de tampão 3,3G KRB quente. Escolha manualmente cinco clusters e transfira-os para o centro da câmara de ensaio. Incubar por 30 min em uma incubadora umidificada a 37 °C, 5% CO2 .
NOTA: Use pontas de pipeta de 10 μL para transferir clusters com volume médio mínimo. - Recolher cuidadosamente ~100 μL do sobrenadante e armazená-lo a -30 °C até à medição da secreção basal de insulina (ver passo 7.9). Não seque nem perca cachos nesta etapa. Adicionar imediatamente 100 μL de tampão 16,7G KRB quente na câmara de ensaio e incubar os mesmos cachos por 30 min em uma incubadora umidificada a 37 °C, 5% CO2 .
- Recolher cuidadosamente ~100 μL do sobrenadante e armazená-lo a -30 °C até à medição da secreção de insulina estimulada por glicose (ver passo 7.9). Adicionar imediatamente 100 μL de tampão KCl KRB 30 mM quente na câmara de ensaio e incubar os mesmos cachos durante 30 min numa incubadora humidificada a 37 °C, 5% CO2 .
- Recolher cuidadosamente ~100 μL do sobrenadante e armazenar a -30 °C até à medição da secreção de insulina estimulada por KCl (ver passo 7.9). Adicionar imediatamente 100 μL de tampão de lise RIPA na câmara de ensaio e transferir o tampão de lise contendo todos os cinco clusters para um tubo de microfuga.
- Opcional) Quebre os cachos manualmente por trituração vigorosa com uma ponteira de pipeta P200. Vórtice por 30 s e incube no gelo por 30 min seguido por mais 30 s de vórtice.
NOTA: Garantir a lise completa por vórtice e tempo suficiente de incubação no gelo. - Gire a 8.000 × g por 1 min. Recolher o sobrenadante e conservar a -30 °C até à medição do teor total de insulina (ver passo 7.9).
- Dosagem de insulina humana nas amostras sobrenadantes utilizando um Kit ELISA de Insulina Humana de acordo com o protocolo do fabricante e protocolos publicados20,22.
NOTA: Evitar o congelamento e descongelamento repetidos de amostras sobrenadantes. Amostras com mais de três ciclos de congelamento e descongelamento não devem ser ensaiadas.
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Representative Results
Desenvolvemos uma estratégia híbrida para diferenciar células-tronco em ilhotas hPSC secretoras de insulina em sete etapas, que utiliza um kit de progenitores pancreáticos para os quatro primeiros estágios em cultura plana, seguido por um protocolo modificado baseado em um método previamente relatado6 em uma cultura de suspensão estática para os últimos três estágios (Figura 1). Com esse protocolo, garantir uma cultura de quase confluência (90%-100%) em 24 h após a semeadura celular (Estágio 0) é fundamental para iniciar uma diferenciação eficiente para a maioria das linhagens de hPSC (Figura 2A). Testar diferentes densidades de semeadura é altamente recomendado para determinar a condição ideal para uma determinada linhagem celular. Durante a cultura de Estágio 1, o meio provavelmente aparecerá turvo devido a células mortas flutuantes, que são comumente observadas nesta fase. Isso não compromete a eficiência de diferenciação do kit, desde que as células anexadas cubram totalmente a superfície do vaso. Durante os estágios 2-4, à medida que as células proliferam e a morte celular diminui, as monocamadas tornam-se mais compactadas e os meios gastos não são tão turvos como durante o estágio 1 (Figura 2A). Como demonstrado com o repórter de insulina Mel1 INSGFP/W hESCs, pelo menos 95% de células endodérmicas definitivas FOXA2+/SOX17+ no final do estágio 1 e 80% de células progenitoras pancreáticas PDX1+/NKX6.1+ no final do estágio 4 podem ser alcançadas rotineiramente (Figura 2B-E). Demonstrou-se que a transição de células progenitoras pancreáticas de cultura plana para cultura de suspensão promove subsequente indução de células endócrinas23,24. Neste protocolo atualizado, utilizamos placas de micropoços e permitimos 24 h de agregação celular. Isso gera milhares de aglomerados de progenitores pancreáticos com tamanho e morfologia uniformes ao mesmo tempo (Figura 3A, B), e a eficiência média de agregação (calculando-se a porcentagem de células que são incorporadas aos agregados) é de 74,1% ± 4,4% (Figura 3C). É importante ressaltar que a expressão de PDX1 e NKX6.1 é mantida em níveis elevados nesses agrupamentos após a agregação (Figura 3D, E), sugerindo uma produção eficiente de progenitores pancreáticos in vitro com o kit de diferenciação e placa de micropoço.
Em seguida, usamos o protocolo R (um método modificado de Rezania et al.6) para a diferenciação dos últimos 3 estágios em um sistema de cultura de suspensão estática usando placas ULA de fundo plano de 96 poços para diferenciar ainda mais esses progenitores pancreáticos derivados do kit em ilhotas hPSC (Figura 1). As células que expressam insulina são gradualmente induzidas dentro de grupos endócrinos, como indicado pelo aumento dos sinais de INS-GFP em culturas vivas ao longo do tempo (Figura 4A, B). A quantificação do tamanho dos agrupamentos revela que o diâmetro médio dos agrupamentos do Estágio 5 é de 150 μm e, no Estágio 7, o diâmetro médio aumenta para 220 μm (Figura 4C). Os aglomerados mantêm predominantemente sua aparência lisa e esférica à medida que crescem entre o Estágio 5 e o Estágio 7, sugerindo que o método de cultura estática limita a aglomeração de agrupamentos em comparação com culturas de suspensão baseadas em agitadores orbitais (que tipicamente geram alguns aglomerados superdimensionados)25. A manutenção de aglomerados compactados com morfologia esférica lisa é um indicador de boa viabilidade das células diferenciadoras, o que é importante para uma diferenciação bem-sucedida em direção a ilhotas hPSC funcionais no final.
A caracterização da composição celular mostra que as ilhotas hPSC de estágio 7 geradas pelo protocolo híbrido são primariamente endócrinas e compostas por quatro tipos principais de ilhotas, incluindo células beta insulino-positivas, células alfa positivas para glucagon, células delta positivas para somatostatina e células PPY positivas para polipeptídeos pancreáticos, enquanto células enterocromafins (derivadas de uma linhagem off-target26) também estão presentes (Figura 5A-C). Notavelmente, este protocolo híbrido gera em grande parte células monohormonais das ilhotas (~50% células CPEP+/GCG-/SST-, ~17% células GCG+/CPEP- e ~12% células SST+/CPEP--) e apenas uma minoria de células bi-hormonais (CPEP+/GCG+ ou CPEP+/SST+) em culturas de estágio 7 (Figura 5B-D). O exame de vários fatores-chave de transcrição e marcadores de células beta maduras em ilhotas hPSC de estágio 7 revela que as células beta diferenciadoras expressam PDX1, NKX6.1, NEUROD1, MAFA e o transportador de glicose GLUT1 (Figura 6A). Além disso, ~60% de células INS+/PDX1+ (Figura 6B) e 50% de células CPEP+/NKX6.1+ (Figura 6C) são induzidas nas culturas de Estágio 7, sugerindo uma geração eficiente de células beta funcionais usando a estratégia híbrida aqui apresentada. De fato, ensaios in vitro de secreção de insulina estimulada por glicose estática (GSIS) demonstram que as ilhotas hPSC estágio 7 podem secretar altos níveis de insulina respondendo tanto à glicose alta quanto à despolarização direta (Figura 6D). Embora essa função seja encorajadora, a responsividade in vitro à glicose das ilhotas hPSC ainda não é equivalente à das ilhotas de cadáveres em termos da magnitude da secreção de insulina (Figura 6D) e o conteúdo total de insulina das ilhotas de hPSC é aproximadamente metade da quantidade das ilhotas de cadáveres (Figura 6E). A otimização contínua é necessária para alcançar ilhotas hPSC com fenótipos de células beta mais maduros.
Figura 1: Visão geral do esquema de diferenciação para geração de ilhotas hPSC funcionais in vitro. O diagrama de fluxo de trabalho fornece uma visão geral do procedimento de sete etapas envolvido na diferenciação de hPSCs em células progenitoras pancreáticas em uma cultura planar usando o kit de progenitores pancreáticos, agregação em grupos de progenitores pancreáticos usando placas de micropoços e transição para ilhotas de hPSC em uma cultura de suspensão estática. Uma linhagem hESC de repórteres de insulina, Mel1 INSGFP/W, é usada ao longo deste estudo como exemplo para demonstrar a eficácia desse método híbrido. Abreviações: hPSCs = células-tronco pluripotentes humanas; GSIS = secreção de insulina estimulada por glicose. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Diferenciação direcionada de hPSCs em células progenitoras pancreáticas utilizando o kit progenitor pancreático. (A) Imagens representativas de contraste de fase mostrando a morfologia celular nos estágios indicados. Barras de escala = 750 μm. (B, C) Gráficos representativos de citometria de fluxo para os principais marcadores de (B) células endodérmicas definitivas estágio 1 (FOXA2+/SOX17+) e (C) células progenitoras pancreáticas estágio 4 (PDX1+/NKX6.1+). (D) Imagens representativas de imunomarcação de células progenitoras pancreáticas para PDX1 (vermelho) e NKX6.1 (verde). Os núcleos foram corados com DAPI (azul). Barra de escala = 200 μm. (E) Quantificação por citometria de fluxo de células PDX1+/NKX6.1+ em células monocamadas progenitoras pancreáticas estágio 4 Dia 4 (n = 5 réplicas biológicas). Abreviações: hPSCs = células-tronco pluripotentes humanas; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Agregação em grupos de progenitores pancreáticos de tamanho uniforme utilizando placas de micropoços de 400 μm de diâmetro. (A) Imagens representativas de contraste de fase no final do estágio 4 mostrando a morfologia do cluster no micropoço e após a recuperação do micropoço. Barras de escala = 300 μm. (B) Quantificação do diâmetro dos cachos no final do Estágio 4 (n = 60 clusters de 3 réplicas biológicas). (C) Quantificação da eficiência de agregação ao final da Etapa 4 (n = 5 repetições biológicas). (D) Imagens representativas de imunomarcação de clusters progenitores pancreáticos para PDX1 (vermelho) e NKX6.1 (verde). Os núcleos foram corados com DAPI (azul). Barra de escala = 100 μm. (E) Quantificação por citometria de fluxo de células PDX1+/NKX6.1+ em agregados progenitores pancreáticos Estágio 4 Dia 5 (n = 4 réplicas biológicas). Abreviação: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Diferenciação dos progenitores pancreáticos em ilhotas hPSC em sistema de cultura de suspensão estática . (A) Imagens representativas de contraste de fase (painel superior) e imagens fluorescentes (painel inferior) mostrando morfologia do cluster e padrão de expressão de insulina nos estágios indicados. Barras de escala = 300 μm. (B) Quantificação das intensidades fluorescentes médias de INS-GFP por cluster nos estágios indicados (n = 30 clusters de duas réplicas biológicas). (C) Quantificação do diâmetro dos cachos nos estágios indicados (n = 60 cachos de três réplicas biológicas). Abreviações: hPSC = célula-tronco pluripotente humana; INS = insulina; GFP = proteína fluorescente verde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Caracterização da composição celular nas ilhotas hPSC Estágio 7. (A) Imagens representativas de imunomarcação das ilhotas hPSC estágio 7 mostrando diferentes tipos celulares (SYN, marcador pan-endócrino; CK19, marcador ductal; INS-GFP, a insulina é indicada pelos sinais da GFP do repórter; GCG; TSM; PPY; O ENC foi corado por SLC18A1 anticorpo). Os núcleos foram corados com DAPI (azul). Barras de escala = 100 μm. (B,C) Gráficos representativos de citometria de fluxo da (B) porcentagem de células CPEP+ e GCG+ em ilhotas hPSC Estágio 7 e (C) porcentagem de células CPEP+ e SST+ em ilhotas hPSC Estágio 7. (D) Quantificação por citometria de fluxo dos marcadores celulares indicados nas ilhotas hPSC estágio 7 (n = 4 réplicas biológicas). Abreviações: hPSC = célula-tronco pluripotente humana; INS= insulina; GFP = proteína fluorescente verde; SYN = sinaptofisina; GCG = glucagon; TSM = somatostatina; PPY = polipeptídeo pancreático; ENC = enterocromafina; PECP = peptídeo C; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Caracterização in vitro e avaliação funcional das ilhotas hPSC estágio 7. (A) Imagens representativas de imunomarcação das ilhotas hPSC estágio 7 mostrando a co-expressão de insulina (indicada pelos sinais INS-GFP do repórter) com vários marcadores chave de células beta, como NKX6.1, MAFA, NEUROD1, PDX1 e transportador de glicose GLUT1. Os núcleos foram corados com DAPI (azul). Barras de escala = 100 μm. (B,C) Gráficos representativos de citometria de fluxo da (B) porcentagem de células INS+/PDX1+ e da (C) porcentagem de células CPEP+/NKX6.1+. (D) Ensaios estáticos de GSIS mostrando liberação de insulina de ilhotas hPSC estágio 7 (n = 6 incluindo 3 réplicas biológicas e 2 técnicas) e ilhotas humanas (n = 6 incluindo 3 réplicas biológicas e 2 técnicas) em resposta à glicose elevada (16,7G, glicose 16,7 mM) e despolarização de KCl 30 mM. Os dados são apresentados como média ± MEV. Um teste t bicaudal não pareado (**p < 0,01) foi utilizado para comparar entre os dois grupos indicados. (E) Teor total de insulina das ilhotas hPSC de estágio 7 (n = 6 incluindo 3 réplicas biológicas e 2 técnicas) e das ilhotas humanas (n = 6 incluindo 3 réplicas biológicas e 2 técnicas). Um teste t bicaudal não pareado (*p < 0,05) foi usado para comparar os dois grupos. Abreviações: hPSC = célula-tronco pluripotente humana; INS = insulina; GFP = proteína fluorescente verde; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Formulação de todas as soluções e meios utilizados neste protocolo. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 2: Formulação dos meios de diferenciação dos estágios 1-7. A tabela fornece a receita para preparar os meios de diferenciação dos Estágios 1 a 7. Clique aqui para baixar esta tabela.
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Discussion
Este trabalho descreve um protocolo híbrido de sete estágios que permite a geração de ilhotas hPSC capazes de secretar insulina após desafio glicêmico dentro de 40 dias de cultura in vitro. Dentre essas múltiplas etapas, acredita-se que a indução eficiente da endoderme definitiva seja um importante ponto de partida para os resultados finais dediferenciação18,27,28. No protocolo do fabricante, uma densidade de semeadura de 2,6 × 105/cm 2 é recomendada para iniciar a diferenciação, e as células são expostas ao meio de estágio 1 por2 dias. Para garantir que as células atinjam perto da confluência no Dia 1 (90%-100%), é altamente recomendável testar as densidades de semeadura ao trabalhar em uma nova linha hPSC, pois a densidade de semeadura ideal pode variar. Por exemplo, com todas as três linhas de hPSC testadas em nossas mãos, 1,6-1,80 × 10 5/cm 2, em vez de 2,60 × 105/cm2, foi encontrada para ser uma densidade de semeadura ideal. Estender a duração da cultura do Estágio 1 de 2 dias para 3 dias com um dia adicional em meio do Estágio 1B aumenta a pureza das células FOXA2+/SOX17+ de 80% para > 93% (dados não mostrados). Se a proporção de células FOXA2+/SOX17+ for inferior a 70% no final do Estágio 1, a indução de células PDX1+ e PDX1+/NKX6.1+ provavelmente estará comprometida.
É importante notar que alguma morte celular pode ser observada durante toda a cultura de Estágio 1, enquanto as células anexadas são necessárias para cobrir 100% da área de superfície. Durante os estágios 2-4, a diminuição da morte celular concomitante à proliferação celular resulta em células compactadas e multicamadas, o que tem sido relatado como crítico para a indução eficiente dos marcadores progenitores pancreáticos PDX1 e NKX6.1 e sua localização nuclear29,30. No último dia do Estágio 4, as células são dissociadas e agregadas em agrupamentos utilizando as placas de micropoço AggreWell de 400 μm de diâmetro. Em comparação com outras abordagens, como agregação suspensa, agregação manual ou usando placas de 96 poços com fundo em U, a agregação AggreWell gera milhares de clusters esféricos de tamanho uniforme, ilustrando a robustez desse método.
Para indução endócrina durante os estágios 5-7 em uma cultura 3D estática, transferimos um número médio de ~20 grupos de progenitores pancreáticos derivados de kits para cada poço de placas de fundo plano de 96 poços de ULA. Este método reduz consideravelmente a formação de aglomerados superdimensionados e melhora a viabilidade celular, possivelmente limitando a fusão de clusters e/ou diminuindo a perda celular mediada por tensão de cisalhamento durante a cultura de agitador orbital. Para remover células mortas flutuantes em mídia gasta e, ao mesmo tempo, reduzir o risco de perda de clusters durante a mudança de mídia, recomendamos atualizar cerca de dois terços do volume total do meio. Observamos que essa alteração parcial do meio não prejudica a diferenciação endócrina, podendo oferecer uma transição suave ao alternar entre diferentes estágios. No entanto, alguma morte celular ainda pode ser observada durante o estágio 5 e o estágio inicial 6 com este protocolo híbrido na transição da cultura planar para a cultura estática em suspensão. As linhas hPSC do repórter (por exemplo, Mel1 INSGFP/W hESCs) são úteis para monitorar a diferenciação em estágio avançado em culturas vivas. A citometria de fluxo em execução ajudará a examinar NKX6.1+/NEUROD1+ no final do Estágio 5, INS+/NKX6.1+ no final do Estágio 6 e CPEP+/NKX6.1+ no final do Estágio 7. A indução eficiente de populações CPEP+ co-expressas com NKX6.1 é crítica para alcançar responsividade à glicose em células beta31,32. Nesse sentido, esse protocolo gera consistentemente células CPEP+/NKX6.1+ de >50% nas ilhotas hPSC do estágio 7 resultantes, que podem secretar insulina em resposta a um desafio com glicose elevada in vitro.
Embora o presente protocolo tenha demonstrado uma geração eficiente de ilhotas hPSC produtoras de insulina, existem limitações para este método. As eficiências de diferenciação no final do Estágio 4 de várias linhagens de hPSC, particularmente iPSCs, com este kit de progenitores pancreáticos ainda podem ser variáveis (dados não mostrados). A otimização deve ser realizada caso a caso. Esse método para as três últimas etapas de diferenciação baseia-se no uso de cultura estática de suspensão em placas de 96 poços, que é trabalhosa e não escalável, limitando seu uso apenas à pesquisa. Embora seja encorajador obter capacidade de secretor de insulina, a responsividade in vitro à glicose e o conteúdo de insulina das ilhotas hPSC são significativamente menores do que as das ilhotas cadavéricas. Esforços futuros ainda são necessários para a otimização contínua do protocolo. Apesar dessas limitações, acreditamos que o protocolo aqui apresentado fornece materiais derivados da hPSC adequados para a triagem de fatores indutores de diferenciação e reguladores da secreção do hormônio das ilhotas, bem como para a modelagem da disfunção das ilhotas.
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Disclosures
Timothy J. Kieffer foi um funcionário da ViaCyte durante a preparação deste manuscrito. Os demais autores declaram não haver interesses conflitantes.
Acknowledgments
Agradecemos o apoio da STEMCELL Technologies, Michael Smith Health Research BC, Stem Cell Network, JDRF e dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde. Jia Zhao e Shenghui Liang recebem o Michael Smith Health Research BC Trainee Award. Mitchell J.S. Braam recebeu a Mitacs Accelerate Fellowship. Diepiriye G. Iworima recebeu a Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship e o CFUW 1989 Ecole Polytechnique Commemorative Award. Agradecemos sinceramente ao Dr. Edouard G. Stanley da MCRI e da Monash University por compartilhar a linha Mel1 INS GFP/W e o Alberta Diabetes Institute Islet Core por isolar e distribuir ilhotas humanas. Também agradecemos o apoio das instalações de Imagem e Citometria de Fluxo do Instituto de Ciências da Vida da Universidade da Colúmbia Britânica. A Figura 1 foi criada com BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma | T6397 | Thyroid hormone |
| 4% PFA solution | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Should be handled in fume hood |
| 96-Well, Ultralow Attachment, flat bottom | Corning Costar (VWR) | CLS3474 | Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 07920 | Dissociation reagent for Stage 4 cells |
| Aggrewell400 plates | STEMCELL Technologies | 34415 | 400 µm diameter microwell plates |
| Aggrewell800 plates | STEMCELL Technologies | 34815 | 800 µm diameter microwell plates |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG) | R&D Systems | IC2400G | 1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control | R&D Systems | IC108G | 1:100 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B) | BD Sciences | 566032 | 1:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype Control | R&D Systems | IC0041G | 1:500 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ) | BD Pharmingen | 565831 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565689 | 1:2,000 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 563338 | 1:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 562594 | 1:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 557714 | 1:50 in flow cytometry |
| ALK5i II | Cayman Chemicals | 14794 | TGF-beta signaling inhibitor |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies | 7010 | Microwell Rinsing Solution |
| Assay chamber | Cellvis | D35-10-1-N | For static GSIS and confocal imaging purposes |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | BP1600-100 | For immunostaining procedure |
| CK19 antibody | DAKO | M0888 | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| D-glucose | Sigma | G8769 | Medium supplement |
| DAPI | Sigma | D9542 | For nuclear counterstaining |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Matrix diluting solution |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 555 | Life technologies | A21432 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21447 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31570 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31571 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31572 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31573 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21448 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| DPBS | Sigma | D8537 | Without Ca2+ and Mg2+ |
| ELISA, insulin, human | Alpco | 80-INSHU-E01.1 | For human insulin measurement |
| Fatty acid-free BSA | Proliant | 68700 | Medium supplement |
| Fixation and Permeabilization Solution Kit | BD Sciences | 554714 | Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | For clump passaging hPSCs during maintenance culture |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | 1:400 in whole mount immunofluorescence |
| GLUT1 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA1-37782 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| GlutaMAX-I (100x) | Gibco | 35050061 | L-glutamine supplement |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G33-4 | For tissue clearing and mounting |
| GSi XX | Sigma Millipore | 565789 | Notch inhibitor |
| Heparin | Sigma | H3149 | Medium supplement |
| ITS-X (100x) | Thermo Fisher Scientific | 51500056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement |
| LDN193189 | STEMCELL Technologies | 72147 | BMP antagonist |
| MAFA antibody | Abcam | ab26405 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Matrigel, hESC-qualified | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | Extracellular matrix for vessel surface coating |
| MCDB131 medium | Life technologies | 10372019 | Base medium |
| mTeSR1 Complete Kit | STEMCELL Technologies | 85850 | stem cell medium and 5x supplement included |
| N-Cys (N-acetyl cysteine) | Sigma | A9165 | Antioxidant |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | Medium supplement |
| NEUROD1 antibody | R&D Systems | AF2746 | 1:20 in whole mount immunofluorescence |
| NKX6.1 antibody | DSHB | F55A12-c | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| Pancreatic polypeptide antibody | R&D Systems | AF6297 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PBS | Sigma | D8662 | With Ca2+ and Mg2+ |
| PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565860 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 563023 | 1:250 in flow cytometry |
| PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 562161 | 1:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| PE Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 554680 | 1:2,000 in flow cytometry |
| PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k) | BD Sciences | 564563 | 1:200 in flow cytometry |
| R428 | Cayman Chemicals | 21523 | AXL tyrosine kinase inhibitor |
| Retinoid acid, all-trans | Sigma | R2625 | Light-sensitive |
| RIPA lysis buffer, 10x | Sigma | 20-188 | For hormone extraction |
| SANT-1 | Sigma | S4572 | SHH inhibitor |
| SLC18A1 antibody | Sigma | HPA063797 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Somatostatin antibody | Sigma | HPA019472 | 1:100 in whole mount immunofluorescence |
| STEMdiff Pancreatic Progenitor Kit | STEMCELL Technologies | 05120 | Basal media and supplements included |
| Synaptophysin antibody | Novus | NB120-16659 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | For permeabilization |
| Trolox | Sigma Millipore | 648471 | Vitamin E analog |
| TrypLE Enzyme Express | Life technologies | 12604-021 | cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs |
| Trypsin1/2/3 antibody | R&D Systems | AF3586 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | ROCK inhibitor |
| Zinc sulfate | Sigma | Z0251 | Medium supplement |
References
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