Summary
Differentieringen af stamceller i øceller giver en alternativ løsning til konventionel diabetesbehandling og sygdomsmodellering. Vi beskriver en detaljeret stamcellekulturprotokol, der kombinerer et kommercielt differentieringssæt med en tidligere valideret metode til at hjælpe med at producere insulinudskillende, stamcelleafledte øer i en skål.
Abstract
Differentiering af humane pluripotente stamceller (hPSC'er) i insulinudskillende betaceller giver materiale til undersøgelse af betacellefunktion og diabetesbehandling. Der er dog stadig udfordringer med at opnå stamcelleafledte betaceller, der i tilstrækkelig grad efterligner indfødte humane betaceller. På baggrund af tidligere undersøgelser er hPSC-afledte øceller blevet genereret for at skabe en protokol med forbedrede differentieringsresultater og konsistens. Protokollen beskrevet her bruger et pancreas stamfadersæt i trin 1-4, efterfulgt af en protokol ændret fra et papir, der tidligere blev offentliggjort i 2014 (kaldet "R-protokol" i det følgende) i trin 5-7. Detaljerede procedurer for anvendelse af pancreas stamfadersæt og mikrobrøndplader med en diameter på 400 μm til generering af pancreas stamfaderklynger, R-protokol for endokrin differentiering i et 96-brønds statisk suspensionsformat og in vitro-karakterisering og funktionel evaluering af hPSC-afledte øer er inkluderet. Den komplette protokol tager 1 uge for indledende hPSC-ekspansion efterfulgt af ~ 5 uger for at opnå insulinproducerende hPSC-øer. Personale med grundlæggende stamcellekulturteknikker og træning i biologiske assays kan reproducere denne protokol.
Introduction
Pancreas beta-celler udskiller insulin, der reagerer på stigninger i blodsukkerniveauet. Patienter, der mangler tilstrækkelig insulinproduktion på grund af autoimmun destruktion af betaceller i type 1-diabetes (T1D)1 eller på grund af betacelledysfunktion i type 2-diabetes (T2D)2, behandles typisk med administration af eksogent insulin. På trods af denne livreddende behandling kan den ikke nøjagtigt matche den udsøgte kontrol af blodsukkeret, som opnås ved dynamisk insulinsekretion fra bona fide betaceller. Som sådan lider patienter ofte konsekvenserne af livstruende hypoglykæmiske episoder og andre komplikationer som følge af kroniske hyperglykæmiske udflugter. Transplantation af humane kadaverøer genopretter med succes stram glykæmisk kontrol hos T1D-patienter, men er begrænset af tilgængeligheden af ødonorer og vanskeligheder med at rense sunde øer til transplantation 3,4. Denne udfordring kan i princippet løses ved at anvende hPSC'er som alternativt udgangsmateriale.
Nuværende strategier til generering af insulinudskillende øer fra hPSC'er in vitro sigter ofte mod at efterligne processen med embryonal udvikling af bugspytkirtlen in vivo 5,6. Dette kræver kendskab til de ansvarlige signalveje og tidsbestemt tilsætning af tilsvarende opløselige faktorer for at efterligne kritiske stadier af den udviklende embryonale bugspytkirtel. Bugspytkirtelprogrammet starter med forpligtelsen til endelig endoderm, som er præget af transkriptionsfaktorer gaffelhovedboks A2 (FOXA2) og kønsbestemmende region Y-boks 17 (SOX17)7. Successiv differentiering af endelig endoderm involverer dannelsen af et primitivt tarmrør, mønster i en bageste fortarm, der udtrykker bugspytkirtlen og duodenal homeobox 1 (PDX1)7,8,9 og epitelekspansion til bugspytkirtelforfædre, der co-udtrykker PDX1 og NK6 homeobox 1 (NKX6.1)10,11.
Yderligere forpligtelse til endokrine øceller ledsages af den forbigående ekspression af pro-endokrin masterregulator neurogenin-3 (NGN3)12 og stabil induktion af nøgletranskriptionsfaktorer neuronal differentiering 1 (NEUROD1) og NK2 homeobox 2 (NKX2.2)13. De vigtigste hormonekspressive celler, såsom insulinproducerende betaceller, glukagonproducerende alfaceller, somatostatinproducerende deltaceller og pancreas polypeptidproducerende PPY-celler, programmeres efterfølgende. Med denne viden samt opdagelser fra omfattende lægemiddelscreeningsundersøgelser med høj kapacitet har nylige fremskridt muliggjort generering af hPSC-øer med celler, der ligner betaceller, der er i stand til insulinsekretion 14,15,16,17,18,19.
Trinvise protokoller er blevet rapporteret til generering af glukose-responsive betaceller 6,14,18,19. Bygget på disse undersøgelser involverer denne protokol brugen af et pancreas stamfadersæt til generering af PDX1+/NKX6.1+ stamceller i bugspytkirtlen i en plan kultur, efterfulgt af mikrobrøndpladeaggregering i klynger af ensartet størrelse og yderligere differentiering mod insulinudskillende hPSC-øer med R-protokollen i en statisk 3D-suspensionskultur. Kvalitetskontrolanalyser, herunder flowcytometri, immunfarvning og funktionel vurdering, udføres til streng karakterisering af de differentierende celler. Dette papir giver en detaljeret beskrivelse af hvert trin i den rettede differentiering og skitserer in vitro-karakteriseringsmetoderne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol er baseret på arbejde med hPSC-linjer, herunder H1, HUES4 PDXeG og Mel1 INSGFP/W, under føderfrie forhold. En trinvis procedure er beskrevet i dette afsnit med understøttende data fra differentieringen af Mel1 INSGFP/W i afsnittet om repræsentative resultater. Vi anbefaler, at der er behov for yderligere optimering, når du arbejder med andre hPSC-linjer, der ikke er angivet her. Se materialetabellen for detaljer vedrørende alle reagenser og opløsninger, der anvendes i denne protokol.
1. Udarbejdelse af differentieringsmedier og opløsninger
BEMÆRK: Se tabel 1 for alle opløsninger, der skal fremstilles, og tabel 2 for differentieringsmedier.
- Forbered alle medier og reagenser til cellekultur i et sterilt biosikkerhedsskab. Cellekulturrelaterede opløsninger og basalmedier opvarmes kortvarigt til 37 °C i et bad før brug.
BEMÆRK: Som beskrevet nedenfor skal du lave friske differentieringsmedier dagligt ved at tilføje kosttilskud og bruge dem samme dag. Alternativt giver bugspytkirtelstamfadersættet mulighed for at forberede et større volumen på forhånd, der kan bruges over flere dage efter producentens protokol. Begge metoder til medieforberedelse viser sig at fungere godt. Bemærk, at det ikke anbefales at forlade medier i længere tid i vandbadet. Når du tilbereder medier friske hver dag, anbefales det at alikvote kosttilskud for at undgå gentagne fryse-optøningscyklusser.
2. Differentiering af hPSC'er i stamceller i bugspytkirtlen
- Oprethold udifferentierede hPSC'er på Matrigel-coatede beholdere i mTeSR1 komplet medium, og udfør medieskift dagligt. Under vedligeholdelseskultur, passage hPSC'er hver 3-4 dage, når celler når ~ 70% sammenløb ved hjælp af celledissociationsreagenset efter producentens protokol. For at starte differentiering skal du adskille cellerne i enkeltceller og frø dem på 6-brønds eller 12-brønds vævskulturbehandlede plader (med medievolumener på henholdsvis 2 ml eller 1 ml pr. Brønd).
BEMÆRK: Se tabel 1 for instruktioner vedrørende opbevaring af endoderm basalmedium og dets alikvoter. - Forlakningskulturbrønde med hESC-kvalificeret Matrigel (fortyndet i iskold DMEM/F12 som anbefalet i fabrikantens protokol) og anbring pladen i en befugtet 37 °C, 5% CO2 inkubator i 30 min.
- Flyt den Matrigel-belagte plade til stuetemperatur (brug inden for 3 timer).
- Det brugte medium suges ud af hPSC-kulturen, og skylles én gang med DPBS. HPSC-kulturen dissocieres i enkeltceller med celledissociationsenzym ved 37 °C i 3-5 minutter. Skyl cellerne af ved at tilsætte varmt DMEM/F12-medium, overfør til et 15 ml eller 50 ml konisk rør, og drej ved 300 × g i 5 minutter.
- Resuspender cellepillen med stamcelle komplet medium plus 10 μM Y-27632 og udfør levende celle (trypanblå negativ) tælling med et hæmocytometer eller automatiseret celletæller. Aspirat fortyndet Matrigel og straks frø levende celler med en densitet på 1,60-1,80 × 10 5/cm2 på Matrigel-coatede brønde og inkuberes i en befugtet 37 °C,5% CO2 inkubator i 24 timer. Fortsæt til trin 1.
BEMÆRK: Dette vil resultere i ~ 95% startsammenløb for at starte differentiering. Ifølge producentens protokol anbefales en såtæthed på 2,6 × 105 / cm2 . Det anbefales at teste forskellige såtætheder for at bestemme den optimale værdi for en cellelinje og for at kontrollere cellelevedygtigheden. Hvis levedygtigheden er under 80%, skal du ikke fortsætte med differentiering. Lav cellelevedygtighed kan være et resultat af overfordøjelse eller overtrituration under høst eller forlade celler i længere tid i DMEM / F12-medium før såning. - På trin 1 dag 1, kortvarigt varm endoderm basal medium til 37 ° C i et bad og optø Supplement MR og CJ. Forbered trin 1A-medium ved at tilføje Supplement MR og CJ til endoderm basalmediet. Bland godt og brug straks.
- Det brugte substrat suges ud af hullerne, trin 1A-substratet tilsættes og inkuberes i en befugtet 5 % CO2 -inkubator på 37 °C i 24 timer.
BEMÆRK: Vasketrin er unødvendige. Fjern eventuelle ikke-fastgjorte celler fra kulturen ved forsigtigt at ryste kulturpladen før medieudvekslingen. Undgå at forstyrre monolaget ved ikke at røre pipettespidsen til brøndbunden under fjernelse af mediet og ved forsigtig tilsætning af medium. - På trin 1 dag 2 opvarmes endoderm basalmediet kortvarigt i et 37 °C bad og optøes Supplement CJ. Forbered trin 1B-medium ved at tilføje Supplement CJ til endoderm basalmediet. Bland godt og brug straks.
- Det brugte medium suges ud af hullerne, trin 1B-substrat tilsættes og inkuberes i en befugtet 5 % CO2 -inkubator på 37 °C i 24 timer.
- På trin 1 dag 3 gentages trin 2.8-2.9. Fortsæt til trin 2.
- På trin 2 dag 1, varm bugspytkirteltrin 2-4 basalmedium i et 37 ° C bad og optø supplement 2A og 2B. Forbered trin 2A medium ved at tilføje supplement 2A og 2B til bugspytkirtlen trin 2-4 basal medium. Bland godt og brug straks.
- Det brugte medium suges ud af hullerne, trin 2A-substratet tilsættes, og det inkuberes i en befugtet 5 % CO2 -inkubator på 37 °C i 24 timer.
- På trin 2 dag 2, varm bugspytkirtlen trin 2-4 Basal medium i et 37 ° C bad og optø supplement 2B. Forbered trin 2B medium ved at tilføje supplement 2B til bugspytkirtlen trin 2-4 basal medium. Bland godt og brug straks.
- Det brugte substrat suges ud af hullerne, trin 2B-substratet tilsættes, og det inkuberes i en befugtet 5 % CO2 -inkubator på 37 °C i 24 timer.
- På trin 2 dag 3 gentages trin 2.13-2.14. Fortsæt til trin 3.
- På trin 3 dag 1, varm bugspytkirtel fase 2-4 Basal medium i et 37 ° C bad og optøning Supplement 3. Forbered trin 3-medium ved at tilføje supplement 3 til bugspytkirtelstadiet 2-4 basalmedium. Bland godt og brug straks.
- Det brugte medium suges ud af hullerne, tilsættes trin 3-medium, og det inkuberes i en befugtet 5 % CO2 -inkubator på 37 °C i 24 timer.
- På trin 3, dag 2 og dag 3, gentag trin 2.16-2.17. Fortsæt til trin 4.
- På trin 4 dag 1, varm bugspytkirtel fase 2-4 Basal medium i et 37 ° C bad og optøning Supplement 4. Forbered trin 4 medium ved at tilføje supplement 4 til bugspytkirtlen fase 2-4 basal medium. Bland godt og brug straks.
- Det brugte medium suges ud af hullerne, tilsættes trin 4-medium, og det inkuberes i en befugtet 5 % CO2 -inkubator på 37 °C i 24 timer.
- På trin 4 dag 2 til dag 4 gentages trin 2.19-2.20. Fortsæt til aggregeringstrin.
3. Aggregering i pancreas stamfaderklynger ved hjælp af mikrobrøndplader med en diameter på 400 μm
- På trin 4 dag 5 forbehandles mikrobrøndene (f.eks. 24-brønds pladeformat) med 500 μL Anti-Adherence Rinsing Solution pr. Brønd.
- Klargør en balanceplade, og centrifuger mikrobrøndpladen ved 1.300 × g i 5 minutter.
BEMÆRK: Kontroller pladen under et mikroskop for at sikre, at der ikke er bobler tilbage i mikrobrøndene. Centrifuger igen i yderligere 5 minutter, hvis bobler forbliver fanget i mikrobrønde. - Opsug Anti-Adherence Rinsing Solution fra hullerne og skyl en gang med 1 ml DPBS. Opsug DPBS fra brøndene, og tilsæt 1 ml aggregeringsmedium til hver brønd.
- Fjern det brugte medium fra bugspytkirtelstamfaderkulturerne og vask en gang med DPBS. Separatiser kulturerne i enkeltceller med dissociationsreagens ved 37 °C i 10-12 min. Skyl cellerne af med varm DMEM/F12, før dem til et rør, og drej dem ved 300 × g i 5 minutter.
- Resuspender cellepellet i aggregeringsmediet, og udfør levende celletælling. Frø 2,4-3,6 millioner celler i alt pr. brønd (dvs. 2.000-3.000 celler pr. mikrobrønd) og tilsæt aggregeringsmedium til hver brønd for at opnå et endeligt volumen på 2 ml pr. brønd.
- Pipetter forsigtigt cellerne op og ned flere gange med en P1000-pipettespids for at sikre en jævn fordeling af celler i hele brønden. Indfør ikke bobler i mikrobrønde. Mikrobrøndpladen centrifugeres ved 300 × g i 5 minutter for at fange cellerne i mikrobrøndene. Mikrobrøndpladen inkuberes i en befugtet 5 % CO2 -inkubator til 37 ° C i 24 timers aggregering og fortsæt til differentiering i trin 5-7.
BEMÆRK: Pas på ikke at forstyrre pladen under aggregeringstiden. Op til 48 timers inkubationstid kan være nødvendig for optimal aggregatdannelse.
4. Differentiering af kitafledte pancreas stamfaderklynger i hPSC-øer
- På trin 5 dag 1, varmt trin 5-7 basalmedium i et 37 °C bad og optøningstilskud (se tabel 1 og tabel 2). Forbered trin 5-medium ved at tilføje kosttilskud (til endelige arbejdskoncentrationer) til trin 5-7 basalmediet. Bland godt og brug straks.
- Efter aggregatdannelse pipetteres aggregaterne forsigtigt op og ned flere gange med en P1000-pipettespids for at flyde eventuelle ikke-aggregerede celler. Lad aggregaterne lægge sig ned af tyngdekraften (vent i ~ 1 min). Fjern forsigtigt det brugte medium (indeholdende de flydende ikke-aggregerede celler) fra brønden så meget som muligt, samtidig med at man undgår aspirerende aggregater.
- Frisk trin 5-substrat fordeles kraftigt på overfladen af mikrobrøndpladen for at løsne aggregater fra mikrobrøndene. Overfør aggregater til ultralow attachment (ULA) 6-brønde. Skyl én gang med trin 5-substrat for at hente aggregater helt fra mikrobrøndene.
- Saml alle aggregater i ULA 6-brøndene, resuspender aggregater i trin 5-medium, og juster densiteten til 20 klynger pr. 100 μL (f.eks. ~ 1.200 klynger forventes at blive hentet fra hver brønd. Resuspender 1.200 klynger i 6 ml trin 5-medium). Brug en multikanalpipette til at dispensere 50 μL trin 5-medium i hvert hul i en ULA fladbundet 96-brøndsplade. Fyld hjørne- og kanthullerne med 200 μL DPBS.
BEMÆRK: Undgå at bruge kantbrøndene til dyrkning af aggregater, da de er tilbøjelige til mere fordampning; Ellers skal du bruge en 96-brøndplade, der er designet til at minimere fordampning langs kanterne (f.eks. 96-brøndplader med indbyggede voldgrave) eller placere kulturpladen i en mikroklimacellekulturinkubator med høj luftfugtighed. - Der tilsættes 100 μL af klyngeopslæmningen i hvert hul i ULA fladbundet 96-brøndplade, hvilket resulterer i i alt 150 μL kulturmedium, der i gennemsnit indeholder 20 klynger pr. hul.
BEMÆRK: Bland forsigtigt klyngeophængningen hver gang, før den dispenseres i 96-huller. - Kulturpladerne anbringes på en plan overflade i en befugtet 5 % CO2 -inkubator på 37 °C i 24 timer.
- På trin 5 dag 2 skal du forberede trin 5 medium efter trin 4.1.
- Brug en multikanalpipette til at fjerne ~90 μL af det brugte medium fra hvert hul, og opdater med 100 μL trin 5-medium.
- På trin 5 dag 3 gentages trin 4.7-4.8. Fortsæt til trin 6.
- På trin 6 dag 1, varm fase 5-7 basalmedium i et 37 °C bad og optøning kosttilskud (se tabel 1 og tabel 2). Forbered trin 6-medium ved at tilføje kosttilskud (til endelige arbejdskoncentrationer) til trin 5-7 basalmediet. Bland godt og brug straks.
- Brug en multikanalpipette til at fjerne ~90 μL af det brugte medie, og opdater med 100 μL trin 6-substrat pr. hul.
- På trin 6 dag 2 til dag 8 gentages trin 4.10-4.11. Fortsæt til trin 7.
- På trin 7 dag 1, varmt trin 5-7 basalmedium i et 37 ° C bad og optøningstilskud (se tabel 1 og tabel 2). Forbered trin 7-medium ved at tilføje kosttilskud (til endelige arbejdskoncentrationer) til trin 5-7 basalmediet. Bland godt og brug straks.
- Brug en multikanalpipette til at fjerne ~90 μL af det brugte medium, og opdater med 100 μL trin 7-medium pr. hul.
- På trin 7 dag 2 til dag 12 gentages trin 4.13-4.14. Fortsæt til in vitro karakterisering.
5. Flow cytometrisk analyse
- Fjern kulturmediet, og vask én gang med DPBS. Desocier kulturerne (plane stamceller eller differentierende klynger) i enkeltceller med dissociationsreagens ved inkubation ved 37 °C i 10-12 min. Skyl med FACS-buffer og drej ved 300 × g i 5 min.
- Resuspender cellepelleten i FACS-buffer og udfør celletælling. Spin celler ved 300 × g i 5 min. Resuspender enkeltceller i 500 μL Fix/Perm-buffer i 10 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Bring Fix/Perm-bufferen til stuetemperatur før brug. Fix/Perm-bufferen indeholder paraformaldehyd (PFA). PFA skal forsigtigt håndteres i en røghætte og bortskaffes i henhold til institutionelle retningslinjer. - Centrifuger ved 500 × g i 3 minutter, vask to gange med 500 μL 1x Perm/Wash-buffer, og ophæng igen i 300 μL 1x Perm/Wash-buffer. Overfør 100 μL enkeltcelleopslæmning (hver indeholdende 2,5-3 × 105 celler) til tre mikrofugerør til ufarvet kontrol, isotypekontrol og antistoffarvning (se materialetabel for prøveantistof og fortyndingsoplysninger). Inkuber i 45 min ved stuetemperatur og dæk med folie.
- Spin ved 500 × g i 3 min. Vask to gange med 500 μL 1x Perm/Wash buffer. Resuspender prøverne i 100 μL FACS-buffer og analyser de farvede celler (se Tabel over materialer til intracellulær farvning af markører på specifikke stadier) med et flowcytometer og software (f.eks. FlowJo).
BEMÆRK: Hvis prøverne ikke analyseres med det samme, opbevares de ved 4 °C beskyttet mod lys. For gating-strategien lukkes flowdataene først af spredningsegenskaber (FSC-A og SSC-A) for at fjerne små cellulære affald efterfulgt af FSC-A- og FSC-breddeegenskaber for at identificere singlets. Positiv og negativ gating bestemmes af stamcellekontroller og / eller ufarvede, isotype kontroller.
6. Helmonteret immunfarvning
- Saml klynger i et mikrofugerør. Afvikl klynger efter tyngdekraften. Opsug det brugte medium og skyl en gang med 1 ml PBS (med calcium og magnesium). Fastgør klyngerne med 1 ml 4% PFA ved 4 °C natten over.
- Skyl en gang med PBST og permeabiliser 20-30 klynger med 500 μL 0,3% TritonX-100 i et mikrofugerør ved omgivelsestemperatur i mindst 6 timer på en vipperyster.
BEMÆRK: En længere permeabiliseringstid (op til 24 timer) er nødvendig for store klynger. - Klyngerne inkuberes i 100 μL blokerende buffer ved omgivelsestemperatur i 1 time på en vipperyster. Den blokerende buffer fjernes, og klyngerne inkuberes med 100 μL primære antistoffer fortyndet i antistoffortyndingsbuffer ved omgivelsestemperatur natten over på en vipperyster.
BEMÆRK: Hvis baggrunden er stærk under billeddannelsen, inkuberes med primære antistoffer ved 4 °C. - 3 x 30 min vaskes grundigt med 500 μL PBST på en vipperyster (vippevinkel indstillet til 8, hastighed indstillet til 20).
- Klyngerne inkuberes med 100 μL sekundære antistoffer i antistoffortyndingsbuffer ved omgivelsestemperatur natten over på en vipperyster. Dæk rørene med folie.
BEMÆRK: Hvis baggrunden er stærk under billeddannelsen, inkuberes med sekundære antistoffer ved 4 °C. - Skyl én gang med 500 μL PBST. Der tilsættes 100 μL 4',6-diamidino-2-phenylindolopløsning (DAPI) (10 μg/ml i PBST) og pletter ved omgivelsestemperatur i 10-15 minutter. Dæk med folie og beskyt mod lys.
- Vask 3 x 30 min med 500 μL PBST grundigt på en vipperyster. Dæk rør med folie under vasketrinnet.
- Fastgør klyngerne på billedkammerglas (se materialetabellen), der er præbelagt med vævslim i henhold til producentens protokol og offentliggjorte protokoller20,21.
- Monter med vævsrensningsmedium (80% glycerol i PBS-opløsning) og dæk med glasdæksel. Beskyt mod lys indtil konfokal billeddannelse.
BEMÆRK: Hvis prøverne ikke afbildes med det samme, opbevares de ved 4 °C beskyttet mod lys.
7. Statisk GSIS-analyse
- Varm Kreb's Ringer-bicarbonatbuffer med lavt glukoseindhold (3,3 G KRB), KRB-buffer med højt glukoseindhold (16,7 G) og 30 mM KCl KRB-buffer i et 37 °C-bad.
- Håndpluk størrelsesmatchede klynger og skyl med 2 ml varm 3,3 G KRB-buffer. Klyngerne overføres til ikke-vævskulturbehandlet 6-brøndplade og ekvilibreres i 2 ml varm 3,3 G KRB-buffer i 1 time i en befugtet 37 °C, 5 % CO2 -inkubator.
- Efter ligevægt fyldes analysekammeret (se materialetabellen) med 100 μL varm 3,3 G KRB-buffer. Håndpluk fem klynger og overfør dem til midten af analysekammeret. Inkuberes i 30 min i en befugtet 37 °C, 5% CO2 inkubator.
BEMÆRK: Brug 10 μL pipettespidser til overførsel af klynger med minimal medium volumen. - Der opsamles forsigtigt ~100 μl supernatant, som opbevares ved -30 °C, indtil basalinsulinsekretionen måles (se trin 7.9). Du må ikke tørre eller miste klynger i dette trin. Tilsæt straks 100 μL varm 16,7 G KRB-buffer i analysekammeret og inkuber de samme klynger i 30 minutter i en befugtet 37 °C, 5% CO2 -inkubator.
- Der opsamles forsigtigt ~100 μL supernatant, og den opbevares ved -30 °C, indtil den glucosestimulerede insulinsekretion måles (se trin 7.9). Tilsæt straks 100 μL varm 30 mM KCl KRB-buffer i analysekammeret og inkuber de samme klynger i 30 minutter i en befugtet 37 °C, 5% CO2 -inkubator.
- Der opsamles forsigtigt ~100 μl supernatant, og ved -30 °C opbevares indtil måling af den KCl-stimulerede insulinsekretion (se trin 7.9). Der tilsættes straks 100 μL RIPA-lysisbuffer i analysekammeret, og lysisbufferen, der indeholder alle fem klynger, overføres til et mikrofugerør.
- Valgfrit) Bryd klyngerne manuelt ved kraftig trituration med en P200-pipettespids. Vortex i 30 s og inkuberes på is i 30 minutter efterfulgt af yderligere 30 s hvirvelstrøm.
BEMÆRK: Sørg for fuldstændig lysis ved hvirvelstrøm og tilstrækkelig tid til inkubation på is. - Spin ved 8.000 × g i 1 min. Supernatanten opsamles og opbevares ved -30 °C, indtil det samlede insulinindhold er målt (se trin 7.9).
- Der måles humant insulin i supernatantprøverne ved hjælp af et humant insulin-ELISA-sæt i overensstemmelse med fabrikantens protokol og offentliggjorte protokoller20,22.
BEMÆRK: Undgå gentagen frysning og optøning af supernatantprøver. Prøver med mere end tre fryse- og optøningscyklusser bør ikke analyseres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi udviklede en hybridstrategi til at differentiere stamceller til insulinudskillende hPSC-øer i syv trin, som anvender et pancreasstamfadersæt til de første fire faser i plan kultur efterfulgt af en modificeret protokol bygget på en tidligere rapporteret metode6 i en statisk suspensionskultur i de sidste tre faser (figur 1). Med denne protokol er det afgørende at sikre en næsten sammenflydende (90% -100%) kultur 24 timer efter cellesåning (trin 0) for at starte en effektiv differentiering for de fleste hPSC-linjer (figur 2A). Test af forskellige såtætheder anbefales kraftigt for at bestemme den optimale tilstand for en bestemt cellelinje. Under fase 1-kulturen vil medierne sandsynligvis virke uklare på grund af flydende døde celler, som almindeligvis observeres på dette stadium. Dette kompromitterer ikke sættets differentieringseffektivitet, så længe de vedhæftede celler fuldt ud dækker beholderoverfladen. I trin 2-4, når celler formerer sig og celledød falder, bliver monolagene mere komprimerede, og de brugte medier er ikke så uklare som i fase 1 (figur 2A). Som påvist med insulinreporteren Mel1 INSGFP/W hESC'er kan mindst 95 % FOXA2+/SOX17+ endelige endodermceller ved afslutningen af trin 1 og 80 % PDX1+/NKX6.1+ stamceller i bugspytkirtlen ved afslutningen af trin 4 opnås rutinemæssigt (figur 2B-E). Overgangen af stamceller i bugspytkirtlen fra plan kultur til suspensionskultur har vist sig at fremme efterfølgende endokrin celleinduktion23,24. I denne opdaterede protokol bruger vi mikrobrøndplader og giver mulighed for 24 timers celleaggregering. Dette genererer tusindvis af bugspytkirtelstamfaderklynger med ensartet størrelse og morfologi ad gangen (figur 3A, B), og den gennemsnitlige aggregeringseffektivitet (ved at beregne procentdelen af celler, der er inkorporeret i aggregater) er 74,1% ± 4,4% (figur 3C). Det er vigtigt, at ekspression af PDX1 og NKX6.1 opretholdes på høje niveauer i disse klynger efter aggregering (figur 3D, E), hvilket tyder på en effektiv produktion af stamfædre i bugspytkirtlen in vitro med differentieringssættet og mikrobrøndpladen.
Vi bruger derefter R-protokol (en metode modificeret fra Rezania et al.6) til den sidste 3-trins differentiering i et statisk suspensionskultursystem ved hjælp af ULA fladbundede 96-brøndplader for yderligere at differentiere disse kitafledte bugspytkirtelforfædre mod hPSC-øer (figur 1). Insulinekspressive celler induceres gradvist i endokrine klynger, som det fremgår af de øgede INS-GFP-signaler i levende kulturer over tid (figur 4A, B). Kvantificering af klyngestørrelse afslører, at den gennemsnitlige diameter af trin 5-klynger er 150 μm, og ved trin 7 øges den gennemsnitlige diameter til 220 μm (figur 4C). Klyngerne bevarer overvejende deres glatte, sfæriske udseende, når de vokser mellem trin 5 og trin 7, hvilket tyder på, at den statiske kulturmetode begrænser klyngeklumpning sammenlignet med orbitale rystebaserede suspensionskulturer (som typisk genererer nogle overdimensionerede klynger)25. Vedligeholdelse af komprimerede klynger med glat sfærisk morfologi er en indikator for de differentierende cellers gode levedygtighed, hvilket er vigtigt for en vellykket differentiering mod funktionelle hPSC-øer i sidste ende.
Karakterisering af cellesammensætning viser, at fase 7 hPSC-øer genereret af hybridprotokollen primært er endokrine og består af fire hovedøcelletyper, herunder insulinpositive betaceller, glukagonpositive alfaceller, somatostatin-positive deltaceller og pancreas polypeptid-positive PPY-celler, mens enterochromaffinceller (afledt af en off-target afstamning26) også er til stede (figur 5A-C). Især genererer denne hybridprotokol stort set monohormonelle øceller (~ 50% CPEP + / GCG - / SST- celler, ~ 17% GCG + / CPEP- celler og ~ 12% SST + / CPEP - celler) og kun et mindretal af bihormonelle celler (CPEP + / GCG + eller CPEP + / SST +) i fase 7 kulturer (figur 5B-D). Undersøgelse af flere vigtige transkriptionsfaktorer og modne betacellemarkører i fase 7 hPSC-øer afslører, at differentierende betaceller udtrykker PDX1, NKX6.1, NEUROD1, MAFA og glukosetransportør GLUT1 (figur 6A). Desuden induceres ~ 60% INS + / PDX1 + celler (figur 6B) og 50% CPEP + / NKX6.1 + celler (figur 6C) i fase 7-kulturerne, hvilket tyder på en effektiv generering af funktionelle betaceller ved hjælp af hybridstrategien som præsenteret her. Faktisk viser in vitro statiske glucosestimulerede insulinsekretionsassays (GSIS), at fase 7 hPSC-øer kan udskille høje niveauer af insulin, der reagerer på både høj glukose og direkte depolarisering (figur 6D). Selvom denne funktion er opmuntrende, svarer in vitro-glukoseresponsen fra hPSC-øer stadig ikke til den for kadaverøer med hensyn til størrelsen af insulinsekretion (figur 6D), og det samlede insulinindhold i hPSC-øer er ca. halvdelen af mængden i kadaverøer (figur 6E). Fortsat optimering er nødvendig for at opnå hPSC-øer med mere modne beta-cellefænotyper.
Figur 1: Oversigt over differentieringsskema til generering af funktionelle hPSC-øer in vitro. Arbejdsgangsdiagrammet giver et overblik over den syvtrinsprocedure, der er involveret i differentieringen af hPSC'er i bugspytkirtelstamceller i en plan kultur ved hjælp af pancreasstamfadersættet, aggregering i bugspytkirtelstamfaderklynger ved hjælp af mikrobrøndplader og overgang til hPSC-øer i en statisk suspensionskultur. En insulinreporter hESC-linje, Mel1 INSGFP / W, bruges i hele denne undersøgelse som et eksempel til at demonstrere effektiviteten af denne hybridmetode. Forkortelser: hPSC'er = humane pluripotente stamceller; GSIS = glucose-stimuleret insulinsekretion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Rettet differentiering af hPSC'er i pancreas stamceller ved hjælp af pancreas stamfadersæt. (A) Repræsentative fasekontrastbilleder, der viser cellemorfologi på de angivne stadier. Skalastænger = 750 μm. (B, C) Repræsentative flowcytometriplots for nøglemarkører for (B) fase 1 endelige endodermceller (FOXA2+/SOX17+) og (C) trin 4 stamceller i bugspytkirtlen (PDX1+/NKX6.1+). (D) Repræsentative immunfarvningsbilleder af stamceller i bugspytkirtlen for PDX1 (rød) og NKX6.1 (grøn). Kerner blev farvet med DAPI (blå). Skalabjælke = 200 μm. (E) Flowcytometrisk kvantificering af PDX1+/NKX6.1+ celler i trin 4 dag 4 stamceller i bugspytkirtlen (n = 5 biologiske replikater). Forkortelser: hPSC'er = humane pluripotente stamceller; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Aggregering i mikrobrøndsplader med ensartet størrelse i bugspytkirtlen ved hjælp af mikrobrøndplader med en diameter på 400 μm. A) Repræsentative fasekontrastbilleder ved slutningen af trin 4, der viser klyngemorfologi i mikrobrønden og efter udtagning fra mikrobrønden. Skalastænger = 300 μm. (B) Kvantificering af klyngediameter ved slutningen af trin 4 (n = 60 klynger fra 3 biologiske replikater). C) Kvantificering af aggregeringseffektiviteten ved afslutningen af trin 4 (n = 5 biologiske replikater). (D) Repræsentative immunfarvningsbilleder af pancreas stamceller for PDX1 (rød) og NKX6.1 (grøn). Kerner blev farvet med DAPI (blå). Skalabjælke = 100 μm. (E) Flowcytometrisk kvantificering af PDX1+/NKX6.1+ celler i trin 4 dag 5 pancreas stamfaderaggregater (n = 4 biologiske replikater). Forkortelse: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Differentiering af stamceller i bugspytkirtlen i hPSC-øer i et statisk suspensionskultursystem . (A) Repræsentative fasekontrastbilleder (øverste panel) og fluorescerende billeder (nederste panel), der viser klyngemorfologi og insulinekspressionsmønster på angivne stadier. Skalastænger = 300 μm. (B) Kvantificering af gennemsnitlige INS-GFP-fluorescerende intensiteter pr. klynge på angivne stadier (n = 30 klynger fra to biologiske replikater). C) Kvantificering af klyngediameter på angivne stadier (n = 60 klynger fra tre biologiske replikater). Forkortelser: hPSC = human pluripotent stamcelle; INS = insulin; GFP = grønt fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Karakterisering af cellesammensætning i trin 7 hPSC-øer. (A) Repræsentative immunfarvningsbilleder af fase 7 hPSC-øer, der viser forskellige celletyper (SYN, panendokrin markør; CK19, kanalmarkør; INS-GFP, insulin er indikeret af reporter GFP-signaler; GCG; SST; PPY; ENC blev farvet af SLC18A1 antistof). Kerner blev farvet med DAPI (blå). Skalasøjler = 100 μm. (B,C) Repræsentative flowcytometriplots af (B) procentdelen af CPEP+- og GCG+-celler i trin 7 hPSC-øer og (C) procentdelen af CPEP+- og SST+-celler i trin 7 hPSC-øer. (D) Flowcytometrikvantificering af angivne cellemarkører i trin 7 hPSC-øer (n = 4 biologiske replikater). Forkortelser: hPSC = human pluripotent stamcelle; INS = insulin; GFP = grønt fluorescerende protein; SYN = synaptofysin; GCG = glukagon; SST = somatostatin; PPY = polypeptid i bugspytkirtlen; ENC = enterochromaffin; CPEP = C-peptid; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: In vitro karakterisering og funktionel vurdering af fase 7 hPSC-øer. (A) Repræsentative immunfarvningsbilleder af fase 7 hPSC-øer, der viser co-ekspression af insulin (angivet af indberetterens INS-GFP-signaler) med flere vigtige betacellemarkører, såsom NKX6.1, MAFA, NEUROD1, PDX1 og glucosetransportør GLUT1. Kerner blev farvet med DAPI (blå). Skalastænger = 100 μm. (B,C) Repræsentative flowcytometriplots af (B) procentdelen af INS + / PDX1 + celler og (C) procentdelen af CPEP + / NKX6.1 + celler. (D) Statiske GSIS-assays, der viser insulinfrigivelse fra trin 7 hPSC-øer (n = 6 inklusive 3 biologiske og 2 tekniske replikater) og humane øer (n = 6 inklusive 3 biologiske og 2 tekniske replikater) som reaktion på høj glucose (16,7 G, 16,7 mM glucose) og 30 mM KCl depolarisering. Data præsenteres som middelværdi ± SEM. En uparret tosidet t-test (**p < 0,01) blev brugt til at sammenligne mellem to angivne grupper. E) Samlet insulinindhold i trin 7 hPSC-øer (n = 6, herunder 3 biologiske og 2 tekniske replikater) og humane øer (n = 6, herunder 3 biologiske og 2 tekniske replikater). En uparret tosidet t-test (*p < 0,05) blev brugt til at sammenligne de to grupper. Forkortelser: hPSC = human pluripotent stamcelle; INS = insulin; GFP = grønt fluorescerende protein; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Formulering af alle opløsninger og medier, der anvendes i denne protokol. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Formulering af trin 1-7 differentieringsmedier. Tabellen indeholder opskriften til at forberede trin 1-7 differentieringsmedier. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papir beskriver en syv-trins hybridprotokol, der muliggør generering af hPSC-øer, der er i stand til at udskille insulin ved glukoseudfordring inden for 40 dage efter dyrkning in vitro. Blandt disse mange trin menes effektiv induktion af endelig endoderm at sætte et vigtigt udgangspunkt for de endelige differentieringsresultater18,27,28. I producentens protokol anbefales en såtæthed på 2,6 × 105 / cm 2 for at initiere differentiering, og celler udsættes for trin 1-medier i2 dage. For at sikre, at cellerne når tæt på sammenløbet på dag 1 (90% -100%), anbefaler vi stærkt at teste såtætheder, når du arbejder på en ny hPSC-linje, da den optimale såtæthed kan variere. For eksempel, med alle tre hPSC-linjer testet i vores hænder, viste 1,6-1,80 × 10 5 / cm 2 snarere end 2,60 × 105 / cm2 sig at være en optimal såtæthed. Forlængelse af dyrkningsvarigheden af trin 1 fra 2 dage til 3 dage med en ekstra dag i trin 1B-medium øger renheden af FOXA2+/SOX17+ celler fra 80% til > 93% (data ikke vist). Hvis andelen af FOXA2+/SOX17+ celler er lavere end 70% i slutningen af trin 1, vil induktion af PDX1+ celler og PDX1+/NKX6.1+ celler sandsynligvis blive kompromitteret.
Det er vigtigt at bemærke, at nogle celledød kan observeres under hele fase 1-kulturen, mens de vedhæftede celler skal dække 100% af overfladearealet. I trin 2-4 resulterer faldet i celledød samtidig med celleproliferation i komprimerede og flerlagede celler, hvilket er rapporteret at være kritisk for effektiv induktion af pancreas stamfadermarkører PDX1 og NKX6.1 og deres nukleare lokalisering29,30. På den sidste dag i trin 4 dissocieres cellerne og aggregeres i klynger ved hjælp af AggreWell mikrobrøndplader med en diameter på 400 μm. Sammenlignet med andre tilgange såsom suspenderet aggregering, manuel aggregering eller brug af U-bundplader med 96 brønde genererer AggreWell-aggregering tusindvis af sfæriske klynger af ensartet størrelse, hvilket illustrerer robustheden af denne metode.
For endokrin induktion i trin 5-7 i en statisk 3D-kultur overfører vi et gennemsnitligt antal ~ 20 kitafledte pancreasstamfaderklynger til hver brønd i ULA fladbundede 96-brøndplader. Denne metode reducerer i høj grad dannelsen af overdimensionerede klynger og forbedrer cellelevedygtigheden, muligvis ved at begrænse klyngefusion og / eller sænke forskydningsspændingsmedieret celletab under orbital shakerkultur. For at fjerne flydende døde celler i brugte medier og samtidig reducere risikoen for at miste klynger under medieskift anbefaler vi, at ca. to tredjedele af den samlede medievolumen opdateres. Vi bemærker, at denne delvise medieændring ikke hæmmer endokrin differentiering og i stedet kan tilbyde en blid overgang, når der skiftes mellem forskellige stadier. Ikke desto mindre kan der stadig observeres en vis celledød under trin 5 og tidligt trin 6 med denne hybridprotokol, når der overgår fra plan kultur til statisk suspensionskultur. Reporter hPSC-linjer (for eksempel Mel1 INSGFP / W hESC'er) er nyttige til overvågning af differentiering i sene stadier i levende kulturer. Løbende flowcytometri hjælper med at undersøge NKX6.1+/NEUROD1+ i slutningen af trin 5, INS+/NKX6.1+ i slutningen af trin 6 og CPEP+/NKX6.1+ i slutningen af trin 7. Effektiv induktion af CPEP+ populationer co-udtrykt med NKX6.1 er afgørende for at opnå glukoserespons i betaceller31,32. I denne henseende genererer denne protokol konsekvent >50% CPEP+/NKX6.1+ celler i de resulterende trin 7 hPSC-øer, der kan udskille insulin som reaktion på en høj glukoseprovokation in vitro.
Selvom den nuværende protokol har vist en effektiv generation af insulinproducerende hPSC-øer, er der begrænsninger for denne metode. Differentieringseffektiviteten i slutningen af trin 4 fra forskellige hPSC-linjer, især iPSC'er, med dette pancreasstamfadersæt kan stadig variere (data ikke vist). Optimering bør udføres fra sag til sag. Denne metode til de sidste tre trin af differentiering er afhængig af brugen af statisk suspensionskultur i 96-brøndplader, som er arbejdskrævende og ikke skalerbar, hvilket begrænser dens anvendelse til kun forskning. Mens det er opmuntrende at opnå insulinudskillende kapacitet, er in vitro-glukoseresponsen og insulinindholdet i hPSC-øer signifikant lavere end hos kadaverøer. Der kræves stadig en fremtidig indsats for fortsat protokoloptimering. På trods af disse begrænsninger mener vi, at protokollen, der præsenteres her, giver hPSC-afledte materialer, der er egnede til screening af differentieringsinducerende faktorer og regulatorer af øhormonsekretion samt til modellering af øcelledysfunktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Timothy J. Kieffer var ansat hos ViaCyte under udarbejdelsen af dette manuskript. De øvrige forfattere erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi anerkender taknemmeligt støtten fra STEMCELL Technologies, Michael Smith Health Research BC, Stem Cell Network, JDRF og Canadian Institutes of Health Research. Jia Zhao og Shenghui Liang er modtagere af Michael Smith Health Research BC Trainee Award. Mitchell J.S. Braam er modtager af Mitacs Accelerate Fellowship. Diepiriye G. Iworima er modtager af Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship og CFUW 1989 Ecole Polytechnique Commemorative Award. Vi takker oprigtigt Dr. Edouard G. Stanley fra MCRI og Monash University for at dele Mel1 INS GFP / W-linjen og Alberta Diabetes Institute Islet Core for at isolere og distribuere menneskelige øer. Vi anerkender også støtten fra Life Sciences Institute Imaging and Flow Cytometry faciliteter ved University of British Columbia. Figur 1 blev oprettet med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma | T6397 | Thyroid hormone |
| 4% PFA solution | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Should be handled in fume hood |
| 96-Well, Ultralow Attachment, flat bottom | Corning Costar (VWR) | CLS3474 | Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 07920 | Dissociation reagent for Stage 4 cells |
| Aggrewell400 plates | STEMCELL Technologies | 34415 | 400 µm diameter microwell plates |
| Aggrewell800 plates | STEMCELL Technologies | 34815 | 800 µm diameter microwell plates |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG) | R&D Systems | IC2400G | 1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control | R&D Systems | IC108G | 1:100 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B) | BD Sciences | 566032 | 1:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype Control | R&D Systems | IC0041G | 1:500 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ) | BD Pharmingen | 565831 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565689 | 1:2,000 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 563338 | 1:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 562594 | 1:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 557714 | 1:50 in flow cytometry |
| ALK5i II | Cayman Chemicals | 14794 | TGF-beta signaling inhibitor |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies | 7010 | Microwell Rinsing Solution |
| Assay chamber | Cellvis | D35-10-1-N | For static GSIS and confocal imaging purposes |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | BP1600-100 | For immunostaining procedure |
| CK19 antibody | DAKO | M0888 | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| D-glucose | Sigma | G8769 | Medium supplement |
| DAPI | Sigma | D9542 | For nuclear counterstaining |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Matrix diluting solution |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 555 | Life technologies | A21432 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21447 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31570 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31571 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31572 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31573 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21448 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| DPBS | Sigma | D8537 | Without Ca2+ and Mg2+ |
| ELISA, insulin, human | Alpco | 80-INSHU-E01.1 | For human insulin measurement |
| Fatty acid-free BSA | Proliant | 68700 | Medium supplement |
| Fixation and Permeabilization Solution Kit | BD Sciences | 554714 | Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | For clump passaging hPSCs during maintenance culture |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | 1:400 in whole mount immunofluorescence |
| GLUT1 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA1-37782 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| GlutaMAX-I (100x) | Gibco | 35050061 | L-glutamine supplement |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G33-4 | For tissue clearing and mounting |
| GSi XX | Sigma Millipore | 565789 | Notch inhibitor |
| Heparin | Sigma | H3149 | Medium supplement |
| ITS-X (100x) | Thermo Fisher Scientific | 51500056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement |
| LDN193189 | STEMCELL Technologies | 72147 | BMP antagonist |
| MAFA antibody | Abcam | ab26405 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Matrigel, hESC-qualified | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | Extracellular matrix for vessel surface coating |
| MCDB131 medium | Life technologies | 10372019 | Base medium |
| mTeSR1 Complete Kit | STEMCELL Technologies | 85850 | stem cell medium and 5x supplement included |
| N-Cys (N-acetyl cysteine) | Sigma | A9165 | Antioxidant |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | Medium supplement |
| NEUROD1 antibody | R&D Systems | AF2746 | 1:20 in whole mount immunofluorescence |
| NKX6.1 antibody | DSHB | F55A12-c | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| Pancreatic polypeptide antibody | R&D Systems | AF6297 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PBS | Sigma | D8662 | With Ca2+ and Mg2+ |
| PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565860 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 563023 | 1:250 in flow cytometry |
| PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 562161 | 1:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| PE Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 554680 | 1:2,000 in flow cytometry |
| PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k) | BD Sciences | 564563 | 1:200 in flow cytometry |
| R428 | Cayman Chemicals | 21523 | AXL tyrosine kinase inhibitor |
| Retinoid acid, all-trans | Sigma | R2625 | Light-sensitive |
| RIPA lysis buffer, 10x | Sigma | 20-188 | For hormone extraction |
| SANT-1 | Sigma | S4572 | SHH inhibitor |
| SLC18A1 antibody | Sigma | HPA063797 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Somatostatin antibody | Sigma | HPA019472 | 1:100 in whole mount immunofluorescence |
| STEMdiff Pancreatic Progenitor Kit | STEMCELL Technologies | 05120 | Basal media and supplements included |
| Synaptophysin antibody | Novus | NB120-16659 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | For permeabilization |
| Trolox | Sigma Millipore | 648471 | Vitamin E analog |
| TrypLE Enzyme Express | Life technologies | 12604-021 | cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs |
| Trypsin1/2/3 antibody | R&D Systems | AF3586 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | ROCK inhibitor |
| Zinc sulfate | Sigma | Z0251 | Medium supplement |
References
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W.
- Petersen, M. C., Shulman, G. I.
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
- Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. The journey of islet cell transplantation and future development. Islets. 10 (2), 80-94 (2018).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
- Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
- Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
- Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
- Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
- Rukstalis, J. M., Habener, J. F. Neurogenin3: a master regulator of pancreatic islet differentiation and regeneration. Islets. 1 (3), 177-184 (2009).
- Mastracci, T. L., Anderson, K. R., Papizan, J. B., Sussel, L. Regulation of Neurod1 contributes to the lineage potential of Neurogenin3+ endocrine precursor cells in the pancreas. PLoS Genetics. 9 (2), e1003278 (2013).
- Balboa, D., et al. Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells. Nature Biotechnology. 40 (7), 1042-1055 (2022).
- Du, Y., et al. Human pluripotent stem-cell-derived islets ameliorate diabetes in non-human primates. Nature Medicine. 28 (2), 272-282 (2022).
- Hogrebe, N. J., Augsornworawat, P., Maxwell, K. G., Velazco-Cruz, L., Millman, J. R. Targeting the cytoskeleton to direct pancreatic differentiation of human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 38 (4), 460-470 (2020).
- Yoshihara, E., et al. Immune-evasive human islet-like organoids ameliorate diabetes. Nature. 586 (7830), 606-611 (2020).
- Mahaddalkar, P. U., et al. Generation of pancreatic beta cells from CD177(+) anterior definitive endoderm. Nature Biotechnology. 38 (9), 1061-1072 (2020).
- Liang, S., et al. Differentiation of stem cell-derived pancreatic progenitors into insulin-secreting islet clusters in a multiwell-based static 3D culture system. Cell Reports Methods. 3, 10046 (2023).
- Zhao, J., et al. In vivo imaging of beta-cell function reveals glucose-mediated heterogeneity of beta-cell functional development. Elife. 8, e41540 (2019).
- Zhao, J., et al. In vivo imaging of calcium activities from pancreatic beta-cells in zebrafish embryos using spinning-disc confocal and two-photon light-sheet microscopy. Bio-protocol. 11 (23), e4245 (2021).
- Liang, S., et al. Carbon monoxide enhances calcium transients and glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta-cells by activating phospholipase C signal pathway in diabetic mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 582, 1-7 (2021).
- Bruin, J. E., et al. Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice. Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).
- Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
- Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
- Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro beta-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
- D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Jiang, Y., et al. Generation of pancreatic progenitors from human pluripotent stem cells by small molecules. Stem Cell Reports. 16 (9), 2395-2409 (2021).
- Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190 (2020).
- Mamidi, A., et al. Mechanosignalling via integrins directs fate decisions of pancreatic progenitors. Nature. 564 (7734), 114-118 (2018).
- Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells. 31 (11), 2432-2442 (2013).
- Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).
