Summary
La differenziazione delle cellule staminali in cellule insulari fornisce una soluzione alternativa al trattamento convenzionale del diabete e alla modellizzazione della malattia. Descriviamo un protocollo dettagliato di coltura di cellule staminali che combina un kit di differenziazione commerciale con un metodo precedentemente convalidato per aiutare a produrre isole derivate da cellule staminali secernenti insulina in un piatto.
Abstract
La differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) in cellule beta secernenti insulina fornisce materiale per studiare la funzione delle cellule beta e il trattamento del diabete. Tuttavia, permangono sfide nell'ottenere cellule beta derivate da cellule staminali che imitano adeguatamente le cellule beta umane native. Sulla base di studi precedenti, sono state generate cellule insulari derivate da hPSC per creare un protocollo con risultati di differenziazione e coerenza migliorati. Il protocollo qui descritto utilizza un kit di progenitori pancreatici durante le fasi 1-4, seguito da un protocollo modificato da un articolo precedentemente pubblicato nel 2014 (denominato "protocollo R" di seguito) durante le fasi 5-7. Sono incluse procedure dettagliate per l'utilizzo del kit di progenitori pancreatici e piastre a micropozzetti da 400 μm di diametro per generare cluster di progenitori pancreatici, protocollo R per il differenziamento endocrino in un formato di sospensione statica a 96 pozzetti e caratterizzazione in vitro e valutazione funzionale di isole derivate da hPSC. Il protocollo completo richiede 1 settimana per l'espansione iniziale delle hPSC, seguita da ~5 settimane per ottenere le isole hPSC produttrici di insulina. Il personale con tecniche di coltura di base di cellule staminali e formazione in saggi biologici può riprodurre questo protocollo.
Introduction
Le cellule beta pancreatiche secernono insulina rispondendo all'aumento dei livelli di glucosio nel sangue. I pazienti che non hanno una produzione sufficiente di insulina a causa della distruzione autoimmune delle cellule beta nel diabete di tipo 1 (T1D)1, o a causa della disfunzione delle cellule beta nel diabete di tipo 2 (T2D)2, sono in genere trattati con la somministrazione di insulina esogena. Nonostante questa terapia salvavita, non può eguagliare con precisione lo squisito controllo della glicemia ottenuto dalla secrezione dinamica di insulina dalle cellule beta in buona fede. Pertanto, i pazienti spesso subiscono le conseguenze di episodi ipoglicemici potenzialmente letali e altre complicanze derivanti da escursioni iperglicemice croniche. Il trapianto di isole da cadavere umano ripristina con successo uno stretto controllo glicemico nei pazienti con diabete di tipo 1, ma è limitato dalla disponibilità di donatori di isole e dalle difficoltà nel purificare le isole sane per il trapianto 3,4. Questa sfida può, in linea di principio, essere risolta utilizzando le hPSC come materiale di partenza alternativo.
Le attuali strategie per la generazione di isole che secernono insulina da hPSC in vitro spesso mirano a imitare il processo di sviluppo del pancreas embrionale in vivo 5,6. Ciò richiede la conoscenza delle vie di segnalazione responsabili e l'aggiunta temporizzata di fattori solubili corrispondenti per imitare le fasi critiche del pancreas embrionale in via di sviluppo. Il programma pancreatico inizia con l'impegno nell'endoderma definitivo, che è caratterizzato dai fattori di trascrizione forkhead box A2 (FOXA2) e dalla regione Y-box 17 che determina il sesso (SOX17)7. La differenziazione successiva dell'endoderma definitivo comporta la formazione di un tubo intestinale primitivo, che si sviluppa in un intestino anteriore posteriore che esprime l'omeobox pancreatico e duodenale 1 (PDX1)7,8,9 e l'espansione epiteliale nei progenitori pancreatici che co-esprimono PDX1 e NK6 homeobox 1 (NKX6.1)10,11.
Un ulteriore impegno per le cellule delle isole endocrine è accompagnato dall'espressione transitoria della neurogenina-3 (NGN3)12 e dall'induzione stabile dei fattori di trascrizione chiave della differenziazione neuronale 1 (NEUROD1) e dell'homeobox 2 NK2 (NKX2.2)13. Le principali cellule che esprimono ormoni, come le cellule beta produttrici di insulina, le cellule alfa produttrici di glucagone, le cellule delta produttrici di somatostatina e le cellule PPY produttrici di polipeptidi pancreatici, vengono successivamente programmate. Con questa conoscenza, così come le scoperte di studi di screening farmacologico estesi e ad alto rendimento, i recenti progressi hanno permesso la generazione di isole hPSC con cellule simili alle cellule beta in grado di secernere insulina 14,15,16,17,18,19.
Sono stati riportati protocolli graduali per la generazione di cellule betasensibili al glucosio 6,14,18,19. Sulla base di questi studi, il presente protocollo prevede l'uso di un kit di progenitori pancreatici per la generazione di cellule progenitrici pancreatiche PDX1+/NKX6.1+ in una coltura planare, seguita dall'aggregazione di piastre a micropozzetti in cluster di dimensioni uniformi e da un'ulteriore differenziazione verso le isole hPSC secernenti insulina con il protocollo R in una coltura statica in sospensione 3D. Vengono eseguite analisi di controllo della qualità, tra cui citometria a flusso, immunocolorazione e valutazione funzionale, per una rigorosa caratterizzazione delle cellule differenzianti. Questo articolo fornisce una descrizione dettagliata di ogni fase del differenziamento diretto e delinea gli approcci di caratterizzazione in vitro.
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Protocol
Questo protocollo si basa sul lavoro con linee hPSC, tra cui H1, HUES4 PDXeG e Mel1 INSGFP/W, in condizioni di alimentazione libera. Una procedura passo-passo è descritta in dettaglio in questa sezione, con i dati di supporto della differenziazione di Mel1 INSGFP/W nella sezione dei risultati rappresentativi. Si consiglia di eseguire un'ulteriore ottimizzazione quando si lavora con altre linee hPSC non indicate qui. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i reagenti e le soluzioni utilizzate in questo protocollo.
1. Preparazione dei mezzi e delle soluzioni di differenziazione
NOTA: Vedere la Tabella 1 per tutte le soluzioni da preparare e la Tabella 2 per i mezzi di differenziazione.
- Preparare tutti i terreni e i reagenti per la coltura cellulare in una cabina sterile per la biosicurezza. Riscaldare brevemente le soluzioni relative alle colture cellulari e i terreni basali a 37 °C in un bagno prima dell'uso.
NOTA: Come descritto di seguito, prepara ogni giorno nuovi mezzi di differenziazione aggiungendo integratori e usali lo stesso giorno. In alternativa, il kit di progenitori pancreatici offre la possibilità di preparare in anticipo un volume maggiore che può essere utilizzato per diversi giorni seguendo il protocollo del produttore. Entrambi i metodi per la preparazione dei supporti si rivelano efficaci. Si noti che non è consigliabile lasciare i supporti per un tempo prolungato a bagnomaria. Quando si preparano terreni freschi ogni giorno, si consiglia di aliquotare gli integratori per evitare ripetuti cicli di gelo-disgelo.
2. Differenziazione delle hPSCs in cellule progenitrici pancreatiche
- Mantenere le hPSC indifferenziate sui vasi rivestiti di Matrigel nel terreno completo mTeSR1 ed eseguire cambi di terreno ogni giorno. Durante la coltura di mantenimento, le hPSC passano ogni 3-4 giorni quando le cellule raggiungono ~70% di confluenza utilizzando il reagente di dissociazione cellulare seguendo il protocollo del produttore. Per avviare la differenziazione, dissociare le cellule in singole cellule e seminarle su piastre trattate con coltura tissutale a 6 o 12 pozzetti (con volumi di terreno rispettivamente di 2 mL o 1 mL per pozzetto).
NOTA: Vedere la Tabella 1 per le istruzioni relative alla conservazione del terreno basale dell'endoderma e delle sue aliquote. - Prerivestire i pozzetti di coltura con Matrigel qualificato hESC (diluito in DMEM/F12 ghiacciato come raccomandato dal protocollo del produttore) e porre la piastra in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% CO2 per 30 min.
- Portare la piastra rivestita in Matrigel a temperatura ambiente (utilizzare entro 3 ore).
- Aspirare il terreno esausto dalla coltura hPSC e risciacquare una volta con DPBS. Dissociare la coltura di hPSC in singole cellule con enzima di dissociazione cellulare a 37 °C per 3-5 minuti. Risciacquare le cellule aggiungendo un terreno caldo DMEM/F12, trasferire in una provetta conica da 15 mL o 50 mL e centrifugare a 300 × g per 5 min.
- Risospendere il pellet cellulare con terreno completo di cellule staminali più 10 μM Y-27632 ed eseguire il conteggio delle cellule vive (tripano blu negativo) con un emocitometro o un contatore automatico di cellule. Aspirare Matrigel diluito e seminare immediatamente cellule vive ad una densità di 1,60-1,80 × 105/cm2 su pozzetti rivestiti di Matrigel e incubare in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% CO2 per 24 ore. Procedere alla fase 1.
NOTA: Ciò si tradurrà in una confluenza iniziale del ~95% per avviare la differenziazione. Secondo il protocollo del produttore, si consiglia una densità di semina di 2,6 × 105/cm2 . Si consiglia di testare varie densità di semina per determinare il valore ottimale per una linea cellulare e per verificare la vitalità cellulare. Se la redditività è inferiore all'80%, non procedere con la differenziazione. La bassa vitalità cellulare può essere il risultato di un'eccessiva digestione o di un'eccessiva triturazione durante la raccolta o di lasciare le cellule per un tempo prolungato nel terreno DMEM/F12 prima della semina. - Nella fase 1 giorno 1, riscaldare brevemente il mezzo basale dell'endoderma a 37 °C in un bagno e scongelare il supplemento MR e CJ. Preparare il terreno di fase 1A aggiungendo il supplemento MR e CJ al terreno basale dell'endoderma. Mescolare bene e utilizzare immediatamente.
- Aspirare il terreno esausto dai pozzetti, aggiungere il terreno di fase 1A e incubare in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% CO2 per 24 ore.
NOTA: Le fasi di lavaggio non sono necessarie. Rimuovere tutte le cellule non attaccate dalla coltura agitando delicatamente la piastra di coltura prima dello scambio di terreno. Evitare di rompere il monostrato non toccando il puntale della pipetta con il fondo del pozzetto durante la rimozione del fluido e aggiungendo delicatamente il fluido. - Nella fase 1 giorno 2, riscaldare brevemente il terreno basale endodermico in un bagno a 37 °C e scongelare il supplemento CJ. Preparare il terreno di Fase 1B aggiungendo il Supplemento CJ al terreno basale dell'endoderma. Mescolare bene e utilizzare immediatamente.
- Aspirare il terreno esausto dai pozzetti, aggiungere il terreno Stage 1B e incubare in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% CO2 per 24 ore.
- Nella fase 1 giorno 3, ripetere i passaggi 2.8-2.9. Procedere alla fase 2.
- Nella fase 2 giorno 1, riscaldare il terreno basale pancreatico Stadio 2-4 in un bagno a 37 °C e scongelare i supplementi 2A e 2B. Preparare il terreno di fase 2A aggiungendo il supplemento 2A e 2B al terreno basale pancreatico stadio 2-4. Mescolare bene e utilizzare immediatamente.
- Aspirare il terreno esausto dai pozzetti, aggiungere il terreno di fase 2A e incubare in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% di CO2 per 24 ore.
- Nella fase 2 giorno 2, riscaldare il terreno basale pancreatico Stage 2-4 in un bagno a 37 °C e scongelare il supplemento 2B. Preparare il terreno di fase 2B aggiungendo il supplemento 2B al terreno basale pancreatico Stage 2-4. Mescolare bene e utilizzare immediatamente.
- Aspirare il terreno esausto dai pozzetti, aggiungere il terreno Stage 2B e incubare in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% CO2 per 24 ore.
- Nella fase 2 giorno 3, ripetere i passaggi 2.13-2.14. Procedere alla fase 3.
- Nella fase 3 giorno 1, riscaldare il terreno basale pancreatico stadio 2-4 in un bagno a 37 °C e scongelare il supplemento 3. Preparare il terreno di Stadio 3 aggiungendo l'Integratore 3 al terreno basale di Stadio pancreatico 2-4. Mescolare bene e utilizzare immediatamente.
- Aspirare il terreno esausto dai pozzetti, aggiungere il terreno di fase 3 e incubare in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% di CO2 per 24 ore.
- Nella fase 3, giorno 2 e giorno 3, ripetere i passaggi 2.16-2.17. Procedi alla fase 4.
- Nella fase 4 giorno 1, riscaldare il terreno basale pancreatico stadio 2-4 in un bagno a 37 °C e scongelare il supplemento 4. Preparare il terreno di Stadio 4 aggiungendo il Supplemento 4 al terreno basale di Stadio pancreatico 2-4. Mescolare bene e utilizzare immediatamente.
- Aspirare il terreno esausto dai pozzetti, aggiungere il terreno Stage 4 e incubare in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% CO2 per 24 ore.
- Nella fase 4 dal giorno 2 al giorno 4, ripetere i passaggi 2.19-2.20. Procedere con i passaggi di aggregazione.
3. Aggregazione in cluster di progenitori pancreatici utilizzando piastre a micropozzetti da 400 μm di diametro
- Nella fase 4 giorno 5, pretrattare i micropozzetti (ad es. formato piastra a 24 pozzetti) con 500 μL di soluzione di risciacquo antiaderenza per pozzetto.
- Preparare una piastra di bilanciamento e centrifugare la piastra per micropozzetti a 1.300 × g per 5 minuti.
NOTA: Controllare la piastra al microscopio per assicurarsi che non rimangano bolle nei micropozzetti. Centrifugare di nuovo per altri 5 minuti se le bolle rimangono intrappolate nei micropozzetti. - Aspirare la soluzione di risciacquo antiaderente dai pozzetti e risciacquare una volta con 1 mL di DPBS. Aspirare il DPBS dai pozzetti e aggiungere 1 mL di terreno di aggregazione a ciascun pozzetto.
- Rimuovere il terreno esausto dalle colture dei progenitori pancreatici e lavare una volta con DPBS. Dissociare le colture in singole cellule con reagente di dissociazione a 37 °C per 10-12 min. Risciacquare le cellule con DMEM/F12 caldo, trasferirle in un tubo e centrifugare a 300 × g per 5 min.
- Risospendere il pellet cellulare nel mezzo di aggregazione ed eseguire il conteggio delle cellule vive. Inizializzare 2,4-3,6 milioni di cellule totali per pozzetto (cioè 2.000-3.000 cellule per micropozzetto) e aggiungere il terreno di aggregazione a ciascun pozzetto per ottenere un volume finale di 2 mL per pozzetto.
- Pipettare delicatamente le cellule su e giù più volte con un puntale per pipette P1000 per garantire una distribuzione uniforme delle cellule in tutto il pozzetto. Non introdurre bolle nei micropozzetti. Centrifugare la piastra per micropozzetti a 300 × g per 5 minuti per catturare le cellule nei micropozzetti. Incubare la piastra a micropozzetti in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% di CO2 per 24 ore di aggregazione e procedere alla differenziazione delle fasi 5-7.
NOTA: Fare attenzione a non disturbare la piastra durante il tempo di aggregazione. Possono essere necessarie fino a 48 ore di incubazione per una formazione ottimale dell'aggregato.
4. Differenziamento di cluster di progenitori pancreatici derivati da kit in isole hPSC
- Nella fase 5 giorno 1, riscaldare il terreno basale della fase 5-7 in un bagno a 37 °C e scongelare gli integratori (vedere Tabella 1 e Tabella 2). Preparare il terreno di Stage 5 aggiungendo supplementi (alle concentrazioni di lavoro finali) al terreno basale di Stage 5-7. Mescolare bene e utilizzare immediatamente.
- Dopo la formazione dell'aggregato, pipettare delicatamente gli aggregati su e giù più volte con un puntale per pipette P1000 per far galleggiare le cellule non aggregate. Lasciare che gli aggregati si depositino per gravità (attendere ~1 min). Rimuovere delicatamente il più possibile il terreno esausto (contenente le cellule galleggianti non aggregate) dal pozzetto, evitando di aspirare gli aggregati.
- Erogare energicamente il terreno fresco Stage 5 sulla superficie della piastra per micropozzetti per rimuovere gli aggregati dai micropozzetti. Trasferimento degli aggregati in 6 pozzetti a attacco ultrabasso (ULA). Risciacquare una volta con il terreno Stage 5 per recuperare completamente gli aggregati dai micropozzetti.
- Raccogliere tutti gli aggregati nei 6 pozzetti dell'ULA, risospendere gli aggregati nel terreno di fase 5 e regolare la densità a 20 cluster per 100 μL (ad esempio, si prevede di recuperare ~1.200 cluster da ciascun pozzetto. Risospendere 1.200 cluster in 6 mL di terreno di fase 5). Utilizzare una pipetta multicanale per erogare 50 μL di terreno Stage 5 in ciascun pozzetto di una piastra ULA a fondo piatto da 96 pozzetti. Riempire i pozzetti angolari e perimetrali con 200 μL di DPBS.
NOTA: Evitare di utilizzare i pozzetti perimetrali per la coltura di aggregati poiché sono soggetti a una maggiore evaporazione; In caso contrario, utilizzare una piastra a 96 pozzetti progettata per ridurre al minimo l'evaporazione lungo i bordi (ad es. piastre a 96 pozzetti con fossati incorporati) o posizionare la piastra di coltura in un incubatore per colture cellulari ad alta umidità microclimatica. - Aggiungere 100 μL di risospensione del cluster in ciascun pozzetto della piastra a fondo piatto a 96 pozzetti ULA, ottenendo un totale di 150 μL di terreno di coltura contenente una media di 20 cluster per pozzetto.
NOTA: Miscelare delicatamente la risospensione del cluster ogni volta prima di erogare in 96 pozzetti. - Posizionare le piastre di coltura su una superficie piana in un'incubatrice umidificata a 37 °C, 5% CO2 per 24 ore.
- Nella fase 5 giorno 2, preparare la fase 5 media seguendo la fase 4.1.
- Utilizzare una pipetta multicanale per rimuovere ~90 μL di terreno esausto da ciascun pozzetto e aggiornare con 100 μL di terreno di fase 5.
- Nella fase 5 giorno 3, ripetere i passaggi 4.7-4.8. Procedi alla fase 6.
- Nella fase 6 giorno 1, riscaldare il terreno basale della fase 5-7 in un bagno a 37 °C e scongelare gli integratori (vedere Tabella 1 e Tabella 2). Preparare il terreno di Stage 6 aggiungendo supplementi (alle concentrazioni di lavoro finali) al terreno basale di Stage 5-7. Mescolare bene e utilizzare immediatamente.
- Utilizzare una pipetta multicanale per rimuovere ~90 μL del terreno esausto e aggiornare con 100 μL di terreno Stage 6 per pozzetto.
- Nella fase 6 dal giorno 2 al giorno 8, ripetere i passaggi 4.10-4.11. Procedi alla fase 7.
- Nella fase 7 giorno 1, riscaldare il terreno basale della fase 5-7 in un bagno a 37 °C e scongelare gli integratori (vedere Tabella 1 e Tabella 2). Preparare il terreno di Stage 7 aggiungendo supplementi (alle concentrazioni di lavoro finali) al terreno basale di Stage 5-7. Mescolare bene e utilizzare immediatamente.
- Utilizzare una pipetta multicanale per rimuovere ~90 μL di terreno esausto e aggiornare con 100 μL di terreno Stage 7 per pozzetto.
- Nella fase 7 dal giorno 2 al giorno 12, ripetere i passaggi 4.13-4.14. Procedere alla caratterizzazione in vitro .
5. Analisi citofluorimetrica
- Rimuovere i terreni di coltura e lavarli una volta con DPBS. Dissociare le colture (cellule progenitrici planari o cluster differenzianti) in singole cellule con reagente di dissociazione incubando a 37 °C per 10-12 min. Risciacquare con tampone FACS e centrifugare a 300 × g per 5 min.
- Risospendere il pellet cellulare nel tampone FACS ed eseguire il conteggio delle cellule. Centrifugare le pile a 300 × g per 5 min. Risospendere le singole cellule in 500 μL di tampone Fix/Perm per 10 minuti a temperatura ambiente.
NOTA: Portare il tampone Fix/Perm a temperatura ambiente prima dell'uso. Il tampone Fix/Perm contiene paraformaldeide (PFA). Maneggiare con cura il PFA in una cappa aspirante e smaltirlo secondo le linee guida istituzionali. - Centrifugare a 500 × g per 3 min, lavare due volte con 500 μL di 1x tampone Perm/Wash e risospendere in 300 μL di 1x tampone Perm/Wash. Trasferire 100 μL di risospensione a singola cellula (ciascuna contenente 2,5-3 × 105 cellule) in tre provette microfuge per il controllo non colorato, il controllo dell'isotipo e la colorazione degli anticorpi (vedere la tabella dei materiali per informazioni sugli anticorpi e sulla diluizione del campione). Incubare per 45 minuti a temperatura ambiente e coprire con un foglio.
- Centrifugare a 500 × g per 3 min. Lavare due volte con 500 μL di 1x tampone Perm/Wash. Risospendere i campioni in 100 μL di tampone FACS e analizzare le cellule colorate (vedere la tabella dei materiali per la colorazione intracellulare dei marcatori in fasi specifiche) con un citometro a flusso e un software (ad es. FlowJo).
NOTA: Se i campioni non vengono analizzati immediatamente, conservarli a 4°C al riparo dalla luce. Per la strategia di gating, i dati di flusso vengono prima controllati dalle proprietà di dispersione (FSC-A e SSC-A) per rimuovere i piccoli detriti cellulari, seguite dalle proprietà FSC-A e FSC-width per identificare i singoletti. Il gating positivo e negativo è determinato dai controlli con cellule staminali e/o dai controlli isotipici non colorati.
6. Immunocolorazione a montaggio intero
- Raccogli i grappoli in un tubo di microfuga. Sedimentare gli ammassi per gravità. Aspirare il terreno esausto e risciacquare una volta con 1 mL di PBS (con calcio e magnesio). Fissare i cluster con 1 mL di PFA al 4% a 4°C per una notte.
- Risciacquare una volta con PBST e permeabilizzare 20-30 cluster con 500 μL di TritonX-100 allo 0,3% in una provetta microfuge a temperatura ambiente per almeno 6 ore su uno scuotitore inclinabile.
NOTA: Per i cluster di grandi dimensioni è necessario un tempo di permeabilizzazione più lungo (fino a 24 ore). - Incubare i cluster in 100 μL di tampone bloccante a temperatura ambiente per 1 ora su un tilt shaker. Rimuovere il tampone bloccante e incubare i cluster con 100 μL di anticorpi primari diluiti in tampone di diluizione anticorpale a temperatura ambiente per una notte su un tilt shaker.
NOTA: Se il fondo è forte durante l'imaging, incubare con anticorpi primari a 4 °C. - Lavare accuratamente 3 x 30 min con 500 μL di PBST su uno scuotitore inclinabile (angolo di inclinazione impostato su 8, velocità impostata su 20).
- Incubare i cluster con 100 μL di anticorpi secondari in tampone di diluizione anticorpale a temperatura ambiente per una notte su un tilt shaker. Coprire i tubi con un foglio.
NOTA: Se il fondo è forte durante l'imaging, incubare con anticorpi secondari a 4 °C. - Risciacquare una volta con 500 μL di PBST. Aggiungere 100 μL di soluzione di 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (10 μg/mL in PBST) e colorare a temperatura ambiente per 10-15 minuti. Coprire con un foglio di alluminio e proteggere dalla luce.
- Lavare accuratamente 3 x 30 min con 500 μL di PBST su uno scuotitore inclinabile. Coprire i tubi con un foglio durante la fase di lavaggio.
- Fissare i cluster sui vetrini della camera di imaging (vedere la tabella dei materiali) prerivestiti con adesivo per tessuti secondo il protocollo del produttore e i protocolli pubblicati20,21.
- Montare con un terreno di purificazione dei tessuti (glicerolo all'80% in soluzione PBS) e coprire con vetrini coprioggetti. Proteggere dalla luce fino all'imaging confocale.
NOTA: Se i campioni non vengono acquisiti immediatamente, conservarli a 4 °C al riparo dalla luce.
7. Saggio statico GSIS
- Tampone caldo di bicarbonato di Kreb a basso contenuto di glucosio (3,3 G KRB), tampone KRB ad alto contenuto di glucosio (16,7 G) e tampone KRB KCl da 30 mM in un bagno a 37 °C.
- Prelevare a mano i cluster di dimensioni corrispondenti e risciacquare con 2 mL di tampone KRB caldo da 3,3 G. Trasferire i cluster in una piastra a 6 pozzetti non trattata con coltura tissutale ed equilibrarli in un tampone KRB da 2 mL o caldo da 3,3 G per 1 ora in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% CO2 .
- Dopo l'equilibrazione, riempire la camera del saggio (vedere la tabella dei materiali) con 100 μL di tampone caldo KRB da 3,3 G. Prelevare a mano cinque grappoli e trasferirli al centro della camera del saggio. Incubare per 30 minuti in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% CO2 .
NOTA: Utilizzare puntali per pipette da 10 μL per il trasferimento di cluster con volume di terreno minimo. - Prelevare con cura ~100 μL del surnatante e conservarlo a -30 °C fino alla misurazione della secrezione basale di insulina (vedere punto 7.9). Non asciugare o perdere i grappoli in questa fase. Aggiungere immediatamente 100 μL di tampone KRB caldo da 16,7 G nella camera del saggio e incubare gli stessi cluster per 30 minuti in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% di CO2 .
- Prelevare con cura ~100 μL del surnatante e conservarlo a -30 °C fino alla misurazione della secrezione di insulina stimolata dal glucosio (vedere punto 7.9). Aggiungere immediatamente 100 μL di tampone caldo 30 mM KCl KRB nella camera del saggio e incubare gli stessi cluster per 30 minuti in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% CO2 .
- Prelevare con cura ~100 μL del surnatante e conservare a -30 °C fino alla misurazione della secrezione di insulina stimolata da KCl (vedere punto 7.9). Aggiungere immediatamente 100 μL di tampone di lisi RIPA nella camera del saggio e trasferire il tampone di lisi contenente tutti e cinque i cluster in una provetta per microfuge.
- Facoltativo) Rompere manualmente i cluster mediante una vigorosa triturazione con un puntale per pipette P200. Vortice per 30 secondi e incubazione su ghiaccio per 30 minuti seguiti da altri 30 secondi di vortice.
NOTA: Garantire una lisi completa mediante vortex e un tempo sufficiente di incubazione sul ghiaccio. - Centrifugare a 8.000 × g per 1 min. Raccogliere il surnatante e conservare a -30 °C fino alla misurazione del contenuto totale di insulina (vedere punto 7.9).
- Misurare l'insulina umana nei campioni surnatanti utilizzando un kit ELISA per insulina umana secondo il protocollo del produttore e i protocolli pubblicati20,22.
NOTA: Evitare il congelamento e lo scongelamento ripetuti dei campioni surnatanti. I campioni con più di tre cicli di congelamento e disgelo non devono essere analizzati.
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Representative Results
Abbiamo sviluppato una strategia ibrida per differenziare le cellule staminali in isole hPSC secernenti insulina in sette fasi, che utilizza un kit di progenitori pancreatici per i primi quattro stadi in coltura planare, seguito da un protocollo modificato basato su un metodo6 precedentemente riportato in una coltura in sospensione statica per gli ultimi tre stadi (Figura 1). Con questo protocollo, garantire una coltura vicina alla confluenza (90%-100%) a 24 ore dalla semina cellulare (Fase 0) è fondamentale per avviare una differenziazione efficiente per la maggior parte delle linee di hPSC (Figura 2A). Si consiglia vivamente di testare diverse densità di semina per determinare le condizioni ottimali per una particolare linea cellulare. Durante la coltura di fase 1, il terreno apparirà probabilmente torbido a causa delle cellule morte fluttuanti, che si osservano comunemente in questa fase. Ciò non compromette l'efficienza di differenziazione del kit fintanto che le celle attaccate coprono completamente la superficie del vaso. Durante le fasi 2-4, man mano che le cellule proliferano e la morte cellulare diminuisce, i monostrati diventano più compatti e i terreni esauriti non sono così torbidi come durante la fase 1 (Figura 2A). Come dimostrato con le hESC dell'insulina reporter Mel1 INSGFP/W, è possibile ottenere di routine almeno il 95% di cellule endodermiche definitive FOXA2+/SOX17+ alla fine dello stadio 1 e l'80% di cellule progenitrici pancreatiche PDX1+/NKX6.1+ alla fine dello stadio 4 (Figura 2B-E). È stato dimostrato che la transizione delle cellule progenitrici pancreatiche dalla coltura planare alla coltura in sospensione promuove la successiva induzione delle cellule endocrine23,24. In questo protocollo aggiornato, utilizziamo piastre a micropozzetti e consentiamo 24 ore di aggregazione cellulare. Questo genera migliaia di cluster di progenitori pancreatici con dimensioni e morfologia uniformi alla volta (Figura 3A, B) e l'efficienza media di aggregazione (calcolando la percentuale di cellule che sono incorporate negli aggregati) è del 74,1% ± del 4,4% (Figura 3C). È importante sottolineare che l'espressione di PDX1 e NKX6.1 è mantenuta a livelli elevati in questi cluster dopo l'aggregazione (Figura 3D, E), suggerendo un'efficiente produzione di progenitori pancreatici in vitro con il kit di differenziazione e la piastra a micropozzetti.
Successivamente utilizziamo il protocollo R (un metodo modificato da Rezania et al.6) per l'ultima differenziazione a 3 stadi in un sistema di coltura in sospensione statica utilizzando piastre ULA a fondo piatto a 96 pozzetti per differenziare ulteriormente questi progenitori pancreatici derivati dal kit verso le isole hPSC (Figura 1). Le cellule che esprimono insulina sono gradualmente indotte all'interno dei cluster endocrini, come indicato dall'aumento dei segnali INS-GFP nelle colture viventi nel tempo (Figura 4A, B). La quantificazione della dimensione del cluster rivela che il diametro medio dei cluster di stadio 5 è di 150 μm e allo stadio 7 il diametro medio aumenta a 220 μm (Figura 4C). Gli ammassi mantengono prevalentemente il loro aspetto liscio e sferico mentre crescono tra lo stadio 5 e lo stadio 7, suggerendo che il metodo di coltura statica limita l'aggregazione dei grappoli rispetto alle colture in sospensione basate su agitatori orbitali (che in genere generano alcuni ammassi sovradimensionati)25. Il mantenimento di cluster compattati con morfologia sferica liscia è un indicatore di buona vitalità delle cellule differenzianti, che è importante per un differenziamento di successo verso le isole hPSC funzionali.
La caratterizzazione della composizione cellulare mostra che le isole hPSC di stadio 7 generate dal protocollo ibrido sono principalmente endocrine e comprendono quattro principali tipi di cellule insulari, tra cui le cellule beta insulino-positive, le cellule alfa glucagone-positive, le cellule delta positive alla somatostatina e le cellule PPY positive ai polipeptidi pancreatici, mentre sono presenti anche cellule enterocromaffini (derivate da un lignaggio26 off-target) (Figura 5A-C). In particolare, questo protocollo ibrido genera in gran parte cellule insulari monoormonali (~50% di cellule CPEP+/GCG-/SST-, ~17% di cellule GCG+/CPEP- e ~12% di cellule SST+/CPEP-) e solo una minoranza di cellule bi-ormonali (CPEP+/GCG+ o CPEP+/SST+) nelle colture di stadio 7 (Figura 5B-D). L'esame di diversi fattori di trascrizione chiave e marcatori di cellule beta mature nelle isole hPSC di stadio 7 rivela che le cellule beta differenzianti esprimono PDX1, NKX6.1, NEUROD1, MAFA e il trasportatore del glucosio GLUT1 (Figura 6A). Inoltre, ~60% di cellule INS+/PDX1+ (Figura 6B) e 50% di cellule CPEP+/NKX6.1+ (Figura 6C) sono indotte nelle colture di stadio 7, suggerendo una generazione efficiente di cellule beta funzionali utilizzando la strategia ibrida come presentata qui. Infatti, i saggi in vitro di secrezione statica di insulina stimolata dal glucosio (GSIS) dimostrano che le isole hPSC in stadio 7 possono secernere alti livelli di insulina rispondendo sia al glucosio elevato che alla depolarizzazione diretta (Figura 6D). Sebbene questa funzione sia incoraggiante, la risposta al glucosio in vitro delle isole hPSC non è ancora equivalente a quella delle isole cadaveriche in termini di entità della secrezione di insulina (Figura 6D) e il contenuto totale di insulina delle isole hPSC è circa la metà di quello delle isole cadaveriche (Figura 6E). È necessaria un'ottimizzazione continua per ottenere isole hPSC con fenotipi di cellule beta più maturi.
Figura 1: Panoramica dello schema di differenziamento per la generazione di isole hPSC funzionali in vitro. Il diagramma del flusso di lavoro fornisce una panoramica della procedura in sette fasi coinvolta nella differenziazione delle hPSC in cellule progenitrici pancreatiche in una coltura planare utilizzando il kit di progenitori pancreatici, l'aggregazione in cluster di progenitori pancreatici utilizzando piastre a micropozzetti e la transizione verso le isole hPSC in una coltura in sospensione statica. Una linea di insulina reporter hESC, Mel1 INSGFP/W, viene utilizzata in questo studio come esempio per dimostrare l'efficacia di questo metodo ibrido. Abbreviazioni: hPSCs = cellule staminali pluripotenti umane; GSIS = secrezione di insulina stimolata dal glucosio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Differenziazione diretta delle hPSC in cellule progenitrici pancreatiche utilizzando il kit di progenitori pancreatici. (A) Immagini rappresentative a contrasto di fase che mostrano la morfologia cellulare negli stadi indicati. Barre di scala = 750 μm. (B, C) Grafici rappresentativi della citometria a flusso per i marcatori chiave di (B) cellule endodermiche definitive in stadio 1 (FOXA2+/SOX17+) e (C) cellule progenitrici pancreatiche in stadio 4 (PDX1+/NKX6.1+). (D) Immagini rappresentative di immunocolorazione delle cellule progenitrici pancreatiche per PDX1 (rosso) e NKX6.1 (verde). I nuclei sono stati colorati con DAPI (blu). Barra della scala = 200 μm. (E) Quantificazione citofluorimetrica di cellule PDX1+/NKX6.1+ in cellule monostrato progenitrici pancreatiche Stadio 4 Giorno 4 (n = 5 repliche biologiche). Abbreviazioni: hPSCs = cellule staminali pluripotenti umane; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Aggregazione in cluster di progenitori pancreatici di dimensioni uniformi utilizzando piastre a micropozzetti da 400 μm di diametro. (A) Immagini rappresentative a contrasto di fase alla fine dello stadio 4 che mostrano la morfologia del cluster nel micropozzetto e dopo il recupero dal micropozzetto. Barre di scala = 300 μm. (B) Quantificazione del diametro del cluster alla fine dello stadio 4 (n = 60 cluster da 3 repliche biologiche). (C) Quantificazione dell'efficienza di aggregazione alla fine dello Stadio 4 (n = 5 repliche biologiche). (D) Immagini immunocoloranti rappresentative dei cluster di progenitori pancreatici per PDX1 (rosso) e NKX6.1 (verde). I nuclei sono stati colorati con DAPI (blu). Barra della scala = 100 μm. (E) Quantificazione citofluorimetrica di cellule PDX1+/NKX6.1+ in aggregati progenitori pancreatici Stadio 4 Giorno 5 (n = 4 repliche biologiche). Abbreviazione: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Differenziazione dei progenitori pancreatici in isole hPSC in un sistema di coltura in sospensione statica . (A) Immagini rappresentative a contrasto di fase (pannello superiore) e immagini fluorescenti (pannello inferiore) che mostrano la morfologia del cluster e il modello di espressione dell'insulina negli stadi indicati. Barre della scala = 300 μm. (B) Quantificazione delle intensità medie di fluorescenza INS-GFP per cluster negli stadi indicati (n = 30 cluster da due repliche biologiche). (C) Quantificazione del diametro del cluster negli stadi indicati (n = 60 cluster da tre repliche biologiche). Abbreviazioni: hPSC = cellula staminale pluripotente umana; INS = insulina; GFP = proteina fluorescente verde. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Caratterizzazione della composizione cellulare nelle isole hPSC in stadio 7. (A) Immagini rappresentative di immunocolorazione di isole hPSC in stadio 7 che mostrano diversi tipi di cellule (SYN, marcatore pan-endocrino; CK19, marcatore duttale; INS-GFP, l'insulina è indicata dai segnali reporter GFP; GCG; SST; PPY; L'ENC è stato colorato con SLC18A1 anticorpo). I nuclei sono stati colorati con DAPI (blu). Barre di scala = 100 μm. (B,C) Grafici rappresentativi della citometria a flusso della percentuale (B) di cellule CPEP+ e GCG+ nelle isole hPSC in stadio 7 e (C) della percentuale di cellule CPEP+ e SST+ nelle isole hPSC in stadio 7. (D) Quantificazione con citometria a flusso di marcatori cellulari indicati in isole hPSC di stadio 7 (n = 4 repliche biologiche). Abbreviazioni: hPSC = cellula staminale pluripotente umana; INS= insulina; GFP = proteina fluorescente verde; SYN = sinaptofisina; GCG = glucagone; SST = somatostatina; PPY = polipeptide pancreatico; ENC = enterocromaffini; CPEP = peptide C; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Caratterizzazione in vitro e valutazione funzionale delle isole hPSC in stadio 7. (A) Immagini rappresentative di immunocolorazione delle isole hPSC in stadio 7 che mostrano la co-espressione dell'insulina (indicata dai segnali INS-GFP reporter) con diversi marcatori chiave delle cellule beta, come NKX6.1, MAFA, NEUROD1, PDX1 e il trasportatore del glucosio GLUT1. I nuclei sono stati colorati con DAPI (blu). Barre di scala = 100 μm. (B,C) Grafici rappresentativi della citometria a flusso della percentuale (B) di cellule INS+/PDX1+ e della percentuale (C) di cellule CPEP+/NKX6.1+. (D) Saggi GSIS statici che mostrano il rilascio di insulina da isole hPSC di stadio 7 (n = 6 di cui 3 repliche biologiche e 2 repliche tecniche) e isole umane (n = 6 di cui 3 repliche biologiche e 2 repliche tecniche) in risposta a depolarizzazione di glucosio elevato (16,7 G, 16,7 mM di glucosio) e 30 mM KCl. I dati sono presentati come media ± SEM. Un test t a due code non accoppiato (**p < 0,01) è stato utilizzato per confrontare i due gruppi indicati. (E) Contenuto totale di insulina delle isole hPSC di stadio 7 (n = 6, di cui 3 repliche biologiche e 2 repliche tecniche) e delle isole umane (n = 6, di cui 3 repliche biologiche e 2 repliche tecniche). Per confrontare i due gruppi è stato utilizzato un test t a due code spaiato (*p < 0,05). Abbreviazioni: hPSC = cellula staminale pluripotente umana; INS = insulina; GFP = proteina fluorescente verde; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Formulazione di tutte le soluzioni e i terreni utilizzati in questo protocollo. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Formulazione dei mezzi di differenziazione degli stadi 1-7. La tabella fornisce la ricetta per preparare i mezzi di differenziazione delle fasi 1-7. Clicca qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Questo documento descrive un protocollo ibrido a sette stadi che consente la generazione di isole hPSC in grado di secernere insulina in seguito a provocazione del glucosio entro 40 giorni dalla coltura in vitro. Tra queste molteplici fasi, si ritiene che l'induzione efficiente dell'endoderma definitivo costituisca un importante punto di partenza per gli esiti finali della differenziazione18,27,28. Nel protocollo del produttore, si raccomanda una densità di semina di 2,6 × 105/cm2 per avviare la differenziazione e le cellule sono esposte a terreni di fase 1 per 2 giorni. Per garantire che le cellule raggiungano quasi la confluenza il giorno 1 (90%-100%), si consiglia vivamente di testare le densità di semina quando si lavora su una nuova linea di hPSC, poiché la densità di semina ottimale può variare. Ad esempio, con tutte e tre le linee di hPSC testate nelle nostre mani, 1,6-1,80 × 10 5/cm 2, piuttosto che 2,60 × 105/cm2, è risultata essere una densità di semina ottimale. L'estensione della durata della coltura dello stadio 1 da 2 a 3 giorni con un giorno in più nel terreno di coltura dello stadio 1B aumenta la purezza delle cellule FOXA2+/SOX17+ dall'80% al > 93% (dati non mostrati). Se la proporzione di cellule FOXA2+/SOX17+ è inferiore al 70% alla fine dello stadio 1, l'induzione delle cellule PDX1+ e delle cellule PDX1+/NKX6.1+ sarà probabilmente compromessa.
È importante notare che una certa morte cellulare può essere osservata durante l'intera coltura di Stadio 1, mentre le cellule attaccate devono coprire il 100% della superficie. Durante gli stadi 2-4, la diminuzione della morte cellulare in concomitanza con la proliferazione cellulare si traduce in cellule compattate e multistrato, che è stata segnalata come critica per l'induzione efficiente dei marcatori progenitori pancreatici PDX1 e NKX6.1 e la loro localizzazione nucleare29,30. L'ultimo giorno della fase 4, le cellule vengono dissociate e aggregate in cluster utilizzando le piastre per micropozzetti AggreWell da 400 μm di diametro. Rispetto ad altri approcci come l'aggregazione sospesa, l'aggregazione manuale o l'utilizzo di piastre a 96 pozzetti con fondo a U, l'aggregazione AggreWell genera migliaia di cluster sferici di dimensioni uniformi, illustrando la robustezza di questo metodo.
Per l'induzione endocrina durante gli stadi 5-7 in una coltura 3D statica, trasferiamo un numero medio di ~20 cluster di progenitori pancreatici derivati da kit in ciascun pozzetto di piastre ULA a fondo piatto a 96 pozzetti. Questo metodo riduce notevolmente la formazione di cluster sovradimensionati e migliora la vitalità cellulare, probabilmente limitando la fusione dei cluster e/o riducendo la perdita cellulare mediata dallo stress di taglio durante la coltura dell'agitatore orbitale. Per rimuovere le cellule morte fluttuanti nei terreni esauriti, riducendo al contempo il rischio di perdita di cluster durante il cambio dei terreni, si consiglia di aggiornare circa due terzi del volume totale del fluido. Notiamo che questo cambiamento parziale del mezzo non ostacola la differenziazione endocrina e può invece offrire una transizione delicata quando si passa da uno stadio all'altro. Tuttavia, una certa morte cellulare può ancora essere osservata durante lo stadio 5 e lo stadio 6 iniziale con questo protocollo ibrido durante la transizione dalla coltura planare alla coltura in sospensione statica. Le linee di hPSC reporter (ad esempio, Mel1 INSGFP/W hESCs) sono utili per monitorare la differenziazione in fase avanzata nelle colture viventi. L'esecuzione della citometria a flusso aiuterà a esaminare NKX6.1+/NEUROD1+ alla fine della fase 5, INS+/NKX6.1+ alla fine della fase 6 e CPEP+/NKX6.1+ alla fine della fase 7. L'induzione efficiente delle popolazioni di CPEP+ co-espresse con NKX6.1 è fondamentale per ottenere la risposta al glucosio nelle cellule beta31,32. A questo proposito, questo protocollo genera costantemente il >50% di cellule CPEP+/NKX6.1+ nelle isole hPSC di stadio 7 risultanti che possono secernere insulina in risposta a un'elevata sfida glicemica in vitro.
Sebbene il presente protocollo abbia dimostrato una generazione efficiente di isole hPSC produttrici di insulina, ci sono limitazioni a questo metodo. Le efficienze di differenziazione alla fine dello stadio 4 da varie linee di hPSC, in particolare iPSC, con questo kit di progenitori pancreatici potrebbero essere ancora variabili (dati non mostrati). L'ottimizzazione deve essere eseguita caso per caso. Questo metodo per le ultime tre fasi di differenziazione si basa sull'uso della coltura in sospensione statica in piastre a 96 pozzetti, che è ad alta intensità di manodopera e non scalabile, limitandone così l'uso alla sola ricerca. Sebbene sia incoraggiante ottenere la capacità di secernere insulina, la risposta al glucosio in vitro e il contenuto di insulina delle isole hPSC sono significativamente inferiori a quelli delle isole cadaveriche. Sono ancora necessari sforzi futuri per continuare a ottimizzare il protocollo. Nonostante queste limitazioni, riteniamo che il protocollo qui presentato fornisca materiali derivati da hPSC adatti per lo screening di fattori che inducono la differenziazione e regolatori della secrezione dell'ormone insulare, nonché per modellare la disfunzione delle cellule insulari.
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Disclosures
Timothy J. Kieffer era un dipendente di ViaCyte durante la preparazione di questo manoscritto. Gli altri autori dichiarano di non avere interessi contrastanti.
Acknowledgments
Riconosciamo con gratitudine il supporto di STEMCELL Technologies, Michael Smith Health Research BC, Stem Cell Network, JDRF e Canadian Institutes of Health Research. Jia Zhao e Shenghui Liang hanno ricevuto il Michael Smith Health Research BC Trainee Award. Mitchell J.S. Braam ha ricevuto la borsa di studio Mitacs Accelerate. Diepiriye G. Iworima ha ricevuto la borsa di studio Alexander Graham Bell Canada Graduate e il CFUW 1989 Ecole Polytechnique Commemorative Award. Ringraziamo sinceramente il Dr. Edouard G. Stanley dell'MCRI e della Monash University per aver condiviso la linea Mel1 INS GFP/W e l'Alberta Diabetes Institute Islet Core per l'isolamento e la distribuzione delle isole umane. Riconosciamo anche il supporto delle strutture di imaging e citometria a flusso dell'Istituto di Scienze della Vita presso l'Università della British Columbia. La Figura 1 è stata creata con BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma | T6397 | Thyroid hormone |
| 4% PFA solution | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Should be handled in fume hood |
| 96-Well, Ultralow Attachment, flat bottom | Corning Costar (VWR) | CLS3474 | Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 07920 | Dissociation reagent for Stage 4 cells |
| Aggrewell400 plates | STEMCELL Technologies | 34415 | 400 µm diameter microwell plates |
| Aggrewell800 plates | STEMCELL Technologies | 34815 | 800 µm diameter microwell plates |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG) | R&D Systems | IC2400G | 1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control | R&D Systems | IC108G | 1:100 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B) | BD Sciences | 566032 | 1:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype Control | R&D Systems | IC0041G | 1:500 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ) | BD Pharmingen | 565831 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565689 | 1:2,000 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 563338 | 1:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 562594 | 1:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 557714 | 1:50 in flow cytometry |
| ALK5i II | Cayman Chemicals | 14794 | TGF-beta signaling inhibitor |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies | 7010 | Microwell Rinsing Solution |
| Assay chamber | Cellvis | D35-10-1-N | For static GSIS and confocal imaging purposes |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | BP1600-100 | For immunostaining procedure |
| CK19 antibody | DAKO | M0888 | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| D-glucose | Sigma | G8769 | Medium supplement |
| DAPI | Sigma | D9542 | For nuclear counterstaining |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Matrix diluting solution |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 555 | Life technologies | A21432 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21447 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31570 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31571 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31572 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31573 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21448 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| DPBS | Sigma | D8537 | Without Ca2+ and Mg2+ |
| ELISA, insulin, human | Alpco | 80-INSHU-E01.1 | For human insulin measurement |
| Fatty acid-free BSA | Proliant | 68700 | Medium supplement |
| Fixation and Permeabilization Solution Kit | BD Sciences | 554714 | Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | For clump passaging hPSCs during maintenance culture |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | 1:400 in whole mount immunofluorescence |
| GLUT1 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA1-37782 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| GlutaMAX-I (100x) | Gibco | 35050061 | L-glutamine supplement |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G33-4 | For tissue clearing and mounting |
| GSi XX | Sigma Millipore | 565789 | Notch inhibitor |
| Heparin | Sigma | H3149 | Medium supplement |
| ITS-X (100x) | Thermo Fisher Scientific | 51500056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement |
| LDN193189 | STEMCELL Technologies | 72147 | BMP antagonist |
| MAFA antibody | Abcam | ab26405 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Matrigel, hESC-qualified | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | Extracellular matrix for vessel surface coating |
| MCDB131 medium | Life technologies | 10372019 | Base medium |
| mTeSR1 Complete Kit | STEMCELL Technologies | 85850 | stem cell medium and 5x supplement included |
| N-Cys (N-acetyl cysteine) | Sigma | A9165 | Antioxidant |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | Medium supplement |
| NEUROD1 antibody | R&D Systems | AF2746 | 1:20 in whole mount immunofluorescence |
| NKX6.1 antibody | DSHB | F55A12-c | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| Pancreatic polypeptide antibody | R&D Systems | AF6297 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PBS | Sigma | D8662 | With Ca2+ and Mg2+ |
| PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565860 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 563023 | 1:250 in flow cytometry |
| PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 562161 | 1:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| PE Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 554680 | 1:2,000 in flow cytometry |
| PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k) | BD Sciences | 564563 | 1:200 in flow cytometry |
| R428 | Cayman Chemicals | 21523 | AXL tyrosine kinase inhibitor |
| Retinoid acid, all-trans | Sigma | R2625 | Light-sensitive |
| RIPA lysis buffer, 10x | Sigma | 20-188 | For hormone extraction |
| SANT-1 | Sigma | S4572 | SHH inhibitor |
| SLC18A1 antibody | Sigma | HPA063797 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Somatostatin antibody | Sigma | HPA019472 | 1:100 in whole mount immunofluorescence |
| STEMdiff Pancreatic Progenitor Kit | STEMCELL Technologies | 05120 | Basal media and supplements included |
| Synaptophysin antibody | Novus | NB120-16659 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | For permeabilization |
| Trolox | Sigma Millipore | 648471 | Vitamin E analog |
| TrypLE Enzyme Express | Life technologies | 12604-021 | cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs |
| Trypsin1/2/3 antibody | R&D Systems | AF3586 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | ROCK inhibitor |
| Zinc sulfate | Sigma | Z0251 | Medium supplement |
References
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