Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Différenciation de cellules souches pluripotentes humaines en amas d’îlots pancréatiques producteurs d’insuline

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/64840
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2, 3, 1,2,4
1Department of Cellular & Physiological Sciences, Life Science Institute, University of British Columbia, 2School of Biomedical Engineering, University of British Columbia, 3STEMCELL Technologies Inc, 4Department of Surgery, University of British Columbia
* These authors contributed equally

Summary

La différenciation des cellules souches en cellules d’îlots pancréatiques offre une solution alternative au traitement conventionnel du diabète et à la modélisation de la maladie. Nous décrivons un protocole détaillé de culture de cellules souches qui combine un kit de différenciation commercial avec une méthode préalablement validée pour aider à produire des îlots dérivés de cellules souches sécrétrices d’insuline dans une boîte.

Abstract

La différenciation des cellules souches pluripotentes humaines (CSPh) en cellules bêta sécrétrices d’insuline fournit du matériel pour étudier la fonction des cellules bêta et le traitement du diabète. Cependant, il reste des défis à relever pour obtenir des cellules bêta dérivées de cellules souches qui imitent adéquatement les cellules bêta humaines natives. S’appuyant sur des études antérieures, des cellules d’îlots pancréatiques dérivées de CSPh ont été générées pour créer un protocole avec des résultats de différenciation et une cohérence améliorés. Le protocole décrit ici utilise un kit de progéniteurs pancréatiques pendant les stades 1 à 4, suivi d’un protocole modifié à partir d’un article précédemment publié en 2014 (appelé « protocole R » ci-après) au cours des stades 5 à 7. Des procédures détaillées pour l’utilisation du kit de progéniteurs pancréatiques et de plaques de micropuits de 400 μm de diamètre pour générer des grappes de progéniteurs pancréatiques, le protocole R pour la différenciation endocrinienne dans un format de suspension statique à 96 puits, ainsi que la caractérisation in vitro et l’évaluation fonctionnelle des îlots dérivés des CSPh, sont inclus. Le protocole complet prend 1 semaine pour l’expansion initiale des CSPh, suivie de ~5 semaines pour obtenir des îlots de CSPh productrices d’insuline. Le personnel possédant des techniques de culture de cellules souches de base et une formation en essais biologiques peut reproduire ce protocole.

Introduction

Les cellules bêta pancréatiques sécrètent de l’insuline en réponse à l’augmentation de la glycémie. Les patients qui ne produisent pas suffisamment d’insuline en raison de la destruction auto-immune des cellules bêta dans le diabète de type 1 (DT1)1, ou en raison d’un dysfonctionnement des cellules bêta dans le diabète de type 2 (DT2)2, sont généralement traités par l’administration d’insuline exogène. Malgré cette thérapie qui sauve des vies, elle ne peut pas égaler avec précision le contrôle exquis de la glycémie obtenu par la sécrétion dynamique d’insuline à partir de cellules bêta authentiques. En tant que tels, les patients souffrent souvent des conséquences d’épisodes hypoglycémiques potentiellement mortels et d’autres complications résultant d’excursions hyperglycémiques chroniques. La transplantation d’îlots cadavériques humains rétablit avec succès un contrôle glycémique strict chez les patients atteints de DT1, mais elle est limitée par la disponibilité de donneurs d’îlots et les difficultés à purifier les îlots sains pour la transplantation 3,4. Ce défi peut, en principe, être résolu en utilisant les hPSC comme matériau de départ alternatif.

Les stratégies actuelles de génération d’îlots sécréteurs d’insuline à partir de CSPh in vitro visent souvent à imiter le processus de développement du pancréas embryonnaire in vivo 5,6. Cela nécessite de connaître les voies de signalisation responsables et d’ajouter au moment opportun les facteurs solubles correspondants pour imiter les étapes critiques du développement du pancréas embryonnaire. Le programme pancréatique commence par l’engagement dans l’endoderme définitif, qui est marqué par les facteurs de transcription forkhead box A2 (FOXA2) et la région déterminant le sexe Y-box 17 (SOX17)7. La différenciation successive de l’endoderme définitif implique la formation d’un tube intestinal primitif, formant un intestin antérieur postérieur qui exprime l’homéobox pancréatique et duodénal 1 (PDX1)7,8,9, et l’expansion épithéliale en progéniteurs pancréatiques qui co-expriment PDX1 et NK6 homéobox 1 (NKX6.1)10,11.

Un engagement supplémentaire dans les cellules des îlots endocriniens s’accompagne de l’expression transitoire de la neurogénine-3 (NGN3)12 et de l’induction stable des facteurs de transcription clés de la différenciation neuronale 1 (NEUROD1) et de l’homéobox 2 NK2 (NKX2.2)13. Les principales cellules exprimant des hormones, telles que les cellules bêta productrices d’insuline, les cellules alpha productrices de glucagon, les cellules delta productrices de somatostatine et les cellules PPY productrices de polypeptides pancréatiques, sont ensuite programmées. Grâce à ces connaissances, ainsi qu’aux découvertes issues d’études approfondies de criblage de médicaments à haut débit, les progrès récents ont permis de générer des îlots hPSC avec des cellules ressemblant à des cellules bêta capables de sécréter de l’insuline 14,15,16,17,18,19.

Des protocoles par étapes ont été rapportés pour générer des cellules bêta sensibles au glucose 6,14,18,19. Basé sur ces études, le présent protocole implique l’utilisation d’un kit de progéniteurs pancréatiques pour générer des cellules progénitrices pancréatiques PDX1+/NKX6.1+ dans une culture planaire, suivie d’une agrégation de plaques de micropuits en grappes de taille uniforme et d’une différenciation supplémentaire vers des îlots hPSC sécrétrices d’insuline avec le protocole R dans une culture statique en suspension 3D. Des analyses de contrôle de la qualité, y compris la cytométrie en flux, l’immunomarquage et l’évaluation fonctionnelle, sont effectuées pour une caractérisation rigoureuse des cellules en voie de différenciation. Cet article fournit une description détaillée de chaque étape de la différenciation dirigée et décrit les approches de caractérisation in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ce protocole est basé sur le travail avec des lignées hPSC, y compris H1, HUES4 PDXeG et Mel1 INSGFP/W, dans des conditions sans feeder. Une procédure étape par étape est détaillée dans cette section, avec des données à l’appui de la différenciation de Mel1 INSGFP/W dans la section des résultats représentatifs. Nous recommandons qu’une optimisation supplémentaire soit nécessaire lorsque vous travaillez avec d’autres lignes hPSC qui ne sont pas indiquées ici. Reportez-vous au tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les réactifs et solutions utilisés dans ce protocole.

1. Préparation des milieux et solutions de différenciation

REMARQUE : Voir le tableau 1 pour toutes les solutions à préparer et le tableau 2 pour les milieux de différenciation.

  1. Préparez tous les milieux et réactifs pour la culture cellulaire dans une enceinte de sécurité biologique stérile. Réchauffer brièvement les solutions liées à la culture cellulaire et les milieux basaux à 37 °C dans un bain avant utilisation.
    REMARQUE : Comme décrit ci-dessous, préparez quotidiennement de nouveaux supports de différenciation en ajoutant des suppléments et utilisez-les le même jour. Alternativement, le kit de progéniteur pancréatique offre la possibilité de préparer à l’avance un volume plus important qui peut être utilisé sur plusieurs jours en suivant le protocole du fabricant. Les deux méthodes de préparation des milieux s’avèrent bien fonctionner. Notez qu’il n’est pas recommandé de laisser le support pendant une période prolongée dans le bain-marie. Lors de la préparation quotidienne de substrats frais, il est recommandé d’aliquoter des suppléments afin d’éviter les cycles répétés de gel-dégel.

2. Différenciation des CSPh en cellules progénitrices pancréatiques

  1. Maintenir des CSPh indifférenciées sur les vaisseaux enrobés de Matrigel dans le milieu complet mTeSR1 et effectuer des changements de milieu quotidiennement. Pendant la culture d’entretien, les CSPh passent tous les 3 à 4 jours lorsque les cellules atteignent ~70 % de confluence en utilisant le réactif de dissociation cellulaire en suivant le protocole du fabricant. Pour amorcer la différenciation, dissociez les cellules en cellules individuelles et ensemencez-les sur des plaques traitées par culture tissulaire à 6 ou 12 puits (avec des volumes de milieu de 2 mL ou 1 mL par puits, respectivement).
    REMARQUE : Voir le tableau 1 pour les instructions relatives à l’entreposage du milieu basal de l’endoderme et de ses aliquotes.
  2. Pré-enrober les puits de culture avec du Matrigel qualifié hESC (dilué dans du DMEM/F12 glacé comme recommandé par le protocole du fabricant) et placer la plaque dans un incubateur humidifié à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 30 min.
  3. Déplacez la plaque enduite de Matrigel à température ambiante (à utiliser dans les 3 h).
  4. Aspirez le milieu usé de la culture hPSC et rincez une fois avec du DPBS. Dissocier la culture de hPSC en cellules individuelles avec une enzyme de dissociation cellulaire à 37 °C pendant 3 à 5 minutes. Rincez les cellules en ajoutant du milieu DMEM/F12 chaud, transférez-les dans un tube conique de 15 ml ou 50 ml et essorez-les à 300 × g pendant 5 minutes.
  5. Remettre en suspension la pastille cellulaire avec un milieu complet de cellules souches plus 10 μM Y-27632 et effectuer un comptage de cellules vivantes (bleu trypan négatif) à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé. Aspirer le Matrigel dilué et semer immédiatement les cellules vivantes à une densité de 1,60-1,80 × 105/cm 2 sur des puits recouverts de Matrigel et incuber dans un incubateur humidifié à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 24 h. Passez à l’étape 1.
    REMARQUE : Cela se traduira par une confluence de départ de ~95% pour initier la différenciation. Selon le protocole du fabricant, une densité de semis de 2,6 × 105/cm2 est recommandée. Il est recommandé de tester différentes densités de semis pour déterminer la valeur optimale d’une lignée cellulaire et pour vérifier la viabilité des cellules. Si la viabilité est inférieure à 80 %, ne procédez pas à la différenciation. Une faible viabilité cellulaire peut être le résultat d’une surdigestion ou d’une surtrituration pendant la récolte ou du fait de laisser les cellules pendant une période prolongée dans un milieu DMEM/F12 avant le semis.
  6. Au stade 1 jour 1, réchauffer brièvement le milieu basal de l’endoderme à 37 °C dans un bain et décongeler le supplément MR et CJ. Préparez le milieu de stade 1A en ajoutant le supplément MR et CJ au milieu basal de l’endoderme. Bien mélanger et utiliser immédiatement.
  7. Aspirer le milieu usé des puits, ajouter le milieu de l’étape 1A et incuber dans un incubateur humidifié à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 24 h.
    REMARQUE : Les étapes de lavage ne sont pas nécessaires. Retirez toutes les cellules non attachées de la culture en secouant doucement la plaque de culture avant l’échange du milieu. Évitez de perturber la monocouche en ne touchant pas l’embout de la pipette au fond du puits lors du retrait du fluide et en ajoutant doucement du milieu.
  8. À l’étape 1 jour 2, réchauffez brièvement le milieu basal de l’endoderme dans un bain à 37 °C et décongelez le supplément CJ. Préparez le milieu de stade 1B en ajoutant le supplément CJ au milieu basal de l’endoderme. Bien mélanger et utiliser immédiatement.
  9. Aspirer le milieu usé des puits, ajouter le milieu de l’étape 1B et incuber dans un incubateur humidifié à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 24 h.
  10. À l’étape 1 jour 3, répétez les étapes 2.8 à 2.9. Passez à l’étape 2.
  11. Au stade 2 jour 1, réchauffez le milieu basal pancréatique de stade 2 à 4 dans un bain à 37 °C et décongelez les suppléments 2A et 2B. Préparez le milieu de stade 2A en ajoutant les suppléments 2A et 2B au milieu basal pancréatique de stade 2 à 4. Bien mélanger et utiliser immédiatement.
  12. Aspirer le milieu usé des puits, ajouter le milieu de l’étape 2A et incuber dans un incubateur humidifié à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 24 h.
  13. Au stade 2 jour 2, réchauffer le milieu basal pancréatique de stade 2 à 4 dans un bain à 37 °C et décongeler le supplément 2B. Préparer le milieu de stade 2B en ajoutant le supplément 2B au milieu basal pancréatique de stade 2 à 4. Bien mélanger et utiliser immédiatement.
  14. Aspirer le milieu usé des puits, ajouter le milieu de l’étape 2B et incuber dans un incubateur humidifié à 37 °C et à 5 % de CO2 pendant 24 h.
  15. À l’étape 2 jour 3, répétez les étapes 2.13 à 2.14. Passez à l’étape 3.
  16. Au stade 3 jour 1, réchauffer le milieu basal pancréatique de stade 2-4 dans un bain à 37 °C et décongeler le supplément 3. Préparez le milieu de stade 3 en ajoutant le supplément 3 au milieu basal pancréatique de stade 2 à 4. Bien mélanger et utiliser immédiatement.
  17. Aspirer le milieu usé des puits, ajouter le milieu de l’étape 3 et incuber dans un incubateur humidifié à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 24 h.
  18. À l’étape 3 jour 2 et jour 3, répétez les étapes 2.16-2.17. Passez à l’étape 4.
  19. Au stade 4 jour 1, réchauffer le milieu basal pancréatique de stade 2-4 dans un bain à 37 °C et décongeler le supplément 4. Préparez le milieu de stade 4 en ajoutant le supplément 4 au milieu basal pancréatique de stade 2 à 4. Bien mélanger et utiliser immédiatement.
  20. Aspirer le milieu usé des puits, ajouter le milieu de l’étape 4 et incuber dans un incubateur humidifié à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 24 h.
  21. De l’étape 4 du jour 2 au jour 4, répétez les étapes 2.19-2.20. Passez aux étapes d’agrégation.

3. Agrégation en grappes de progéniteurs pancréatiques à l’aide de plaques de micropuits de 400 μm de diamètre

  1. À l’étape 4 jour 5, prétraiter les micropuits (p. ex., format plaque à 24 puits) avec 500 μL de solution de rinçage anti-adhérence par puits.
  2. Préparez une plaque d’équilibre et centrifugez la plaque de micropuits à 1 300 × g pendant 5 min.
    REMARQUE : Vérifiez la plaque au microscope pour vous assurer qu’il ne reste pas de bulles dans les micropuits. Centrifugez à nouveau pendant 5 minutes supplémentaires si des bulles restent piégées dans des micropuits.
  3. Aspirer la solution de rinçage anti-adhérence des puits et rincer une fois avec 1 mL de DPBS. Aspirer le DPBS des puits et ajouter 1 mL de milieu d’agrégation dans chaque puits.
  4. Retirez le milieu épuisé des cultures de progéniteurs pancréatiques et lavez-les une fois avec du DPBS. Dissocier les cultures en cellules individuelles avec un réactif de dissociation à 37 °C pendant 10 à 12 min. Rincez les cellules avec du DMEM/F12 chaud, transférez-les dans un tube et essorez-les à 300 × g pendant 5 min.
  5. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans le milieu d’agrégation et effectuer le comptage des cellules vivantes. Ensemencer un total de 2,4 à 3,6 millions de cellules par puits (c.-à-d. 2 000 à 3 000 cellules par micropuits) et ajouter un milieu d’agrégation à chaque puits pour obtenir un volume final de 2 ml par puits.
  6. Pipetez doucement les cellules de haut en bas plusieurs fois avec une pointe de pipette P1000 pour assurer une répartition uniforme des cellules dans tout le puits. N’introduisez pas de bulles dans les micropuits. Centrifuger la plaque de micropuits à 300 × g pendant 5 min pour capturer les cellules dans les micropuits. Incuber la plaque de micropuits dans un incubateur humidifié à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 24 h d’agrégation et procéder à la différenciation des étapes 5 à 7.
    REMARQUE : Veillez à ne pas déranger la plaque pendant le temps d’agrégation. Jusqu’à 48 h de temps d’incubation peuvent être nécessaires pour une formation optimale des agrégats.

4. Différenciation des groupes de progéniteurs pancréatiques dérivés de kits en îlots hPSC

  1. Au stade 5 jour 1, réchauffer le milieu de base des stades 5 à 7 dans un bain à 37 °C et décongeler les suppléments (voir les tableaux 1 et 2). Préparer le milieu de l’étape 5 en ajoutant des suppléments (aux concentrations finales de travail) au milieu basal de l’étape 5-7. Bien mélanger et utiliser immédiatement.
  2. Après la formation des agrégats, pipetez doucement les agrégats de haut en bas plusieurs fois avec une pointe de pipette P1000 pour faire flotter les cellules non agrégées. Laisser les agrégats se déposer par gravité (attendre ~1 min). Retirer délicatement le milieu usé (contenant les cellules flottantes non agrégées) du puits autant que possible tout en évitant d’aspirer des agrégats.
  3. Distribuer vigoureusement le milieu frais de l’étape 5 sur la surface de la plaque de micropuits pour déloger les agrégats des micropuits. Transvaser les agrégats dans des puits à 6 puits. Rincez une fois avec le milieu de l’étape 5 pour récupérer complètement les agrégats des micropuits.
  4. Recueillir tous les agrégats dans les 6 puits ULA, remettre en suspension les agrégats dans le milieu de l’étape 5 et ajuster la densité à 20 grappes par 100 μL (p. ex., ~1 200 grappes devraient être extraites de chaque puits. Remettre en suspension 1 200 grappes dans 6 mL de milieu de stade 5). À l’aide d’une pipette multicanaux, distribuer 50 μL de milieu de l’étape 5 dans chaque puits d’une plaque ULA à fond plat de 96 puits. Remplissez les puits d’angle et de bord avec 200 μL de DPBS.
    REMARQUE : Évitez d’utiliser les puits de bord pour la culture des agrégats, car ils sont sujets à une plus grande évaporation ; Sinon, utilisez une plaque à 96 puits conçue pour minimiser l’évaporation le long des bords (par exemple, des plaques à 96 puits avec des douves intégrées) ou placez la plaque de culture dans un incubateur de culture cellulaire à microclimat très humide.
  5. Ajouter 100 μL de la resuspension en grappes dans chaque puits de la plaque ULA à fond plat de 96 puits, ce qui donne un milieu de culture total de 150 μL contenant en moyenne 20 grappes par puits.
    REMARQUE : Mélangez doucement la remise en suspension de la grappe à chaque fois avant de la distribuer dans 96 puits.
  6. Placer les plaques de culture sur une surface plane dans un incubateur humidifié à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 24 h.
  7. À l’étape 5 jour 2, préparez l’étape 5 moyenne en suivant l’étape 4.1.
  8. Utilisez une pipette multicanal pour éliminer ~90 μL du milieu usé de chaque puits, puis rafraîchissez avec 100 μL de milieu de l’étape 5.
  9. À l’étape 5 jour 3, répétez les étapes 4.7 à 4.8. Passez à l’étape 6.
  10. Au stade 6 jour 1, réchauffer le milieu basal des stades 5 à 7 dans un bain à 37 °C et décongeler les suppléments (voir les tableaux 1 et 2). Préparer le milieu de l’étape 6 en ajoutant des suppléments (aux concentrations finales de travail) au milieu de base de l’étape 5-7. Bien mélanger et utiliser immédiatement.
  11. Utilisez une pipette multicanal pour éliminer ~90 μL du milieu usé et rafraîchir avec 100 μL de milieu de l’étape 6 par puits.
  12. De l’étape 6 du jour 2 au jour 8, répétez les étapes 4.10 à 4.11. Passez à l’étape 7.
  13. Au stade 7 jour 1, réchauffer le milieu basal des stades 5 à 7 dans un bain à 37 °C et décongeler les suppléments (voir les tableaux 1 et 2). Préparer le milieu de l’étape 7 en ajoutant des suppléments (aux concentrations finales de travail) au milieu de base de l’étape 5-7. Bien mélanger et utiliser immédiatement.
  14. Utilisez une pipette multicanal pour éliminer ~90 μL du milieu usé et rafraîchir avec 100 μL de milieu de l’étape 7 par puits.
  15. De l’étape 7 du jour 2 au jour 12, répétez les étapes 4.13 à 4.14. Procéder à la caractérisation in vitro .

5. Analyse par cytométrie en flux

  1. Retirez le milieu de culture et lavez-le une fois avec du DPBS. Dissocier les cultures (cellules progénitrices planes ou amas de différenciation) en cellules individuelles avec réactif de dissociation en incubant à 37 °C pendant 10 à 12 min. Rincer avec le tampon FACS et essorer à 300 × g pendant 5 min.
  2. Remettez en suspension la pastille de cellule dans le tampon FACS et effectuez le comptage des cellules. Faire tourner les cellules à 300 × g pendant 5 min. Remettre en suspension des cellules individuelles dans 500 μL de tampon Fix/Perm pendant 10 min à température ambiante.
    REMARQUE : Amenez le tampon Fix/Perm à température ambiante avant utilisation. Le tampon Fix/Perm contient du paraformaldéhyde (PFA). Manipulez soigneusement les PFA dans une hotte et éliminez-les conformément aux directives de l’établissement.
  3. Essorer à 500 × g pendant 3 min, laver deux fois avec 500 μL de 1x tampon Perm/Wash et remettre en suspension dans 300 μL de 1x tampon Perm/Wash. Transférez 100 μL de resuspension unicellulaire (contenant chacun 2,5-3 × 105 cellules) dans trois tubes de micro-fuges pour le contrôle non coloré, le contrôle des isotypes et la coloration des anticorps (voir le tableau des matériaux pour obtenir des informations sur les échantillons d’anticorps et la dilution). Incuber pendant 45 min à température ambiante et couvrir de papier d’aluminium.
  4. Essorer à 500 × g pendant 3 min. Laver deux fois avec 500 μL de tampon 1x Perm/Wash. Remettre les échantillons en suspension dans 100 μL de tampon FACS et analyser les cellules colorées (voir le tableau des matériaux pour la coloration intracellulaire des marqueurs à des stades spécifiques) à l’aide d’un cytomètre en flux et d’un logiciel (p. ex., FlowJo).
    REMARQUE : Si les échantillons ne sont pas analysés immédiatement, conservez-les à 4°C à l’abri de la lumière. Pour la stratégie de déclenchement, les données d’écoulement sont d’abord contrôlées par des propriétés de diffusion (FSC-A et SSC-A) pour éliminer les petits débris cellulaires, puis par des propriétés FSC-A et FSC-width pour identifier les singulets. Les contrôles positifs et négatifs sont déterminés par des témoins à base de cellules souches et/ou des témoins isotypes non colorés.

6. Immunomarquage de l’ensemble du montage

  1. Recueillir les grappes dans un tube de microfuge. Colonisez les grappes par gravité. Aspirer le milieu épuisé et rincer une fois avec 1 mL de PBS (avec calcium et magnésium). Fixez les grappes avec 1 mL de PFA à 4 % à 4 °C pendant la nuit.
  2. Rincer une fois avec du PBST et perméabiliser 20 à 30 grappes avec 500 μL de TritonX-100 à 0,3 % dans un tube de microfuge à température ambiante pendant au moins 6 h sur un agitateur inclinable.
    REMARQUE : Un temps de perméabilisation plus long (jusqu’à 24 h) est nécessaire pour les grandes grappes.
  3. Incuber les grappes dans 100 μL de tampon bloquant à température ambiante pendant 1 h sur un agitateur inclinable. Retirez le tampon bloquant et incubez les grappes avec 100 μL d’anticorps primaires dilués dans un tampon de dilution d’anticorps à température ambiante pendant la nuit sur un agitateur inclinable.
    REMARQUE : Si le bruit de fond est fort pendant l’imagerie, incuber avec des anticorps primaires à 4 °C.
  4. Laver soigneusement 3 x 30 min avec 500 μL de PBST sur un agitateur inclinable (angle d’inclinaison réglé à 8, vitesse réglée à 20).
  5. Incuber les grappes avec 100 μL d’anticorps secondaires dans un tampon de dilution d’anticorps à température ambiante pendant la nuit sur un agitateur inclinable. Recouvrez les tubes de papier d’aluminium.
    REMARQUE : Si le bruit de fond est fort pendant l’imagerie, incuber avec des anticorps secondaires à 4 °C.
  6. Rincer une fois avec 500 μL de PBST. Ajouter 100 μL de solution de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (10 μg/mL dans le PBST) et colorer à température ambiante pendant 10 à 15 minutes. Couvrir d’une feuille d’aluminium et protéger de la lumière.
  7. Laver soigneusement 3 x 30 min avec 500 μL de PBST sur un agitateur inclinable. Couvrez les tubes avec du papier d’aluminium pendant l’étape de lavage.
  8. Fixer les grappes sur des lames de chambre d’imagerie (voir le tableau des matériaux) préenduites d’adhésif tissulaire conformément au protocole du fabricant et aux protocoles publiés20,21.
  9. Monter avec un milieu de nettoyage des tissus (80% de glycérol dans une solution de PBS) et couvrir avec des lamelles en verre. Protéger de la lumière jusqu’à l’imagerie confocale.
    REMARQUE : Si les échantillons ne sont pas photographiés immédiatement, conservez-les à 4 °C à l’abri de la lumière.

7. Essai statique GSIS

  1. Réchauffez le tampon de bicarbonate Kreb’s Ringer à faible teneur en glucose (3,3 G KRB), le tampon KRB à haute teneur en glucose (16,7 G) et le tampon KCl KRB de 30 mM dans un bain à 37 °C.
  2. Cueillez à la main des grappes de taille assortie et rincez-les avec 2 ml de tampon KRB chaud de 3,3 G. Transférer les grappes dans une plaque à 6 puits non traitée pour culture tissulaire et les équilibrer dans un tampon KRB de 3,3 G chaud de 2 ml ou chaud pendant 1 h dans un incubateur humidifié à 37 °C et à 5 % de CO2 .
  3. Après équilibration, remplir la chambre d’essai (voir le tableau des matériaux) avec 100 μL de tampon KRB chaud de 3,3 G. Cueillez à la main cinq grappes et transférez-les au centre de la chambre d’essai. Incuber pendant 30 min dans un incubateur humidifié à 37 °C, 5% CO2 .
    REMARQUE : Utilisez des pointes de pipette de 10 μL pour transférer des grappes avec un volume moyen minimal.
  4. Prélever soigneusement ~100 μL de surnageant et le conserver à -30 °C jusqu’à mesure de la sécrétion basale d’insuline (voir étape 7.9). Ne séchez pas et ne perdez pas de grappes à cette étape. Ajouter immédiatement 100 μL de tampon KRB chaud de 16,7 G dans la chambre d’essai et incuber les mêmes grappes pendant 30 min dans un incubateur humidifié à 37 °C, 5 % de CO2 .
  5. Recueillir soigneusement ~100 μL de surnageant et le conserver à -30 °C jusqu’à mesure de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose (voir étape 7.9). Ajouter immédiatement 100 μL de tampon KCl KRB chaud de 30 mM dans la chambre d’essai et incuber les mêmes grappes pendant 30 min dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO2 .
  6. Prélever soigneusement ~100 μL de surnageant et conserver à -30 °C jusqu’à mesure de la sécrétion d’insuline stimulée par le KCl (voir étape 7.9). Ajouter immédiatement 100 μL de tampon de lyse RIPA dans la chambre d’essai et transférer le tampon de lyse contenant les cinq grappes dans un tube de microfuge.
  7. Facultatif) Cassez les grappes manuellement par trituration vigoureuse avec une pointe de pipette P200. Tourbillonner pendant 30 s et incuber sur de la glace pendant 30 minutes, suivi de 30 autres secondes de vortex.
    REMARQUE : Assurer une lyse complète par vortex et un temps d’incubation suffisant sur la glace.
  8. Essorer à 8 000 × g pendant 1 min. Prélever le surnageant et le conserver à -30 °C jusqu’à mesure de la teneur totale en insuline (voir étape 7.9).
  9. Mesurer l’insuline humaine dans les échantillons surnageants à l’aide d’une trousse ELISA pour l’insuline humaine conformément au protocole du fabricant et aux protocoles publiés20,22.
    REMARQUE : Éviter la congélation et la décongélation répétées d’échantillons surnageants. Les échantillons comportant plus de trois cycles de congélation et de décongélation ne doivent pas être analysés.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nous avons développé une stratégie hybride pour différencier les cellules souches en îlots hPSC sécréteurs d’insuline en sept étapes, qui utilise un kit de progéniteurs pancréatiques pour les quatre premières étapes de la culture planaire, suivi d’un protocole modifié basé sur une méthode6 précédemment rapportée dans une culture en suspension statique pour les trois dernières étapes (Figure 1). Avec ce protocole, il est essentiel d’assurer une culture proche de la confluence (90 %-100 %) 24 h après l’ensemencement cellulaire (stade 0) pour initier une différenciation efficace pour la plupart des lignées de CSPh (Figure 2A). Il est fortement recommandé de tester différentes densités d’ensemencement pour déterminer les conditions optimales pour une lignée cellulaire particulière. Au cours de la culture de l’étape 1, le milieu apparaîtra probablement trouble en raison des cellules mortes flottantes, qui sont couramment observées à ce stade. Cela ne compromet pas l’efficacité de différenciation du kit tant que les cellules attachées recouvrent entièrement la surface du vaisseau. Au cours des stades 2 à 4, à mesure que les cellules prolifèrent et que la mort cellulaire diminue, les monocouches deviennent plus compactes et les milieux usés ne sont pas aussi troubles qu’au stade 1 (figure 2A). Comme l’a démontré l’insuline rapporteur Mel1 INSGFP/W hESCs, au moins 95 % des cellules endodermiques définitives FOXA2+/SOX17+ à la fin du stade 1 et 80 % des cellules progénitrices pancréatiques PDX1+/NKX6.1+ à la fin du stade 4 peuvent être obtenues systématiquement (Figure 2B-E). Il a été démontré que la transition des cellules progénitrices pancréatiques de la culture plane à la culture en suspension favorise l’induction subséquente des cellules endocrines23,24. Dans ce protocole mis à jour, nous utilisons des plaques de micropuits et permettons 24 h d’agrégation cellulaire. Cela génère des milliers d’amas de progéniteurs pancréatiques de taille et de morphologie uniformes à la fois (Figure 3A, B), et l’efficacité moyenne d’agrégation (en calculant le pourcentage de cellules incorporées dans les agrégats) est de 74,1 % ± 4,4 % (Figure 3C). Il est important de noter que l’expression de PDX1 et NKX6.1 est maintenue à des niveaux élevés dans ces clusters après l’agrégation (Figure 3D, E), ce qui suggère une production efficace de progéniteurs pancréatiques in vitro avec le kit de différenciation et la plaque de micropuits.

Nous utilisons ensuite le protocole R (une méthode modifiée par Rezania et al.6) pour la dernière différenciation en 3 étapes dans un système de culture en suspension statique utilisant des plaques ULA à fond plat à 96 puits afin de différencier davantage ces progéniteurs pancréatiques dérivés du kit vers les îlots hPSC (Figure 1). Les cellules exprimant l’insuline sont progressivement induites au sein des amas endocriniens, comme l’indique l’augmentation des signaux INS-GFP dans les cultures vivantes au fil du temps (Figure 4A, B). La quantification de la taille des amas révèle que le diamètre moyen des amas de l’étape 5 est de 150 μm et qu’à l’étape 7, le diamètre moyen augmente à 220 μm (Figure 4C). Les grappes conservent principalement leur aspect lisse et sphérique au fur et à mesure qu’elles se développent entre le stade 5 et le stade 7, ce qui suggère que la méthode de culture statique limite l’agglutination des grappes par rapport aux cultures en suspension à base d’agitateurs orbitaux (qui génèrent généralement des grappes surdimensionnées)25. Le maintien d’amas compactés avec une morphologie sphérique lisse est un indicateur de bonne viabilité des cellules de différenciation, ce qui est important pour une différenciation réussie vers des îlots hPSC fonctionnels à la fin.

La caractérisation de la composition cellulaire montre que les îlots hPSC de stade 7 générés par le protocole hybride sont principalement endocriniens et comprennent quatre principaux types de cellules d’îlots pancréatiques, y compris les cellules bêta insulino-positives, les cellules alpha glucagon-positives, les cellules delta positives à la somatostatine et les cellules PPY polypeptidiques pancréatiques positives, tandis que les cellules entérochromaffines (dérivées d’une lignée hors cible26) sont également présentes (Figure 5A-C). Notamment, ce protocole hybride génère en grande partie des cellules d’îlots pancréatiques monohormonales (~ 50 % de cellules CPEP+/GCG-/SST-, ~17 % de cellules GCG+/CPEP- et ~12 % de cellules SST+/CPEP-) et seulement une minorité de cellules bi-hormonales (CPEP+/GCG+ ou CPEP+/SST+) dans les cultures de stade 7 (Figure 5B-D). L’examen de plusieurs facteurs de transcription clés et de marqueurs cellulaires bêta matures dans les îlots hPSC de stade 7 révèle que les cellules bêta en différenciation expriment PDX1, NKX6.1, NEUROD1, MAFA et le transporteur de glucose GLUT1 (Figure 6A). De plus, ~60 % de cellules INS+/PDX1+ (Figure 6B) et 50 % de cellules CPEP+/NKX6.1+ (Figure 6C) sont induites dans les cultures de stade 7, ce qui suggère une génération efficace de cellules bêta fonctionnelles en utilisant la stratégie hybride présentée ici. En effet, des tests in vitro de sécrétion d’insuline statique stimulée par le glucose (GSIS) démontrent que les îlots hPSC de stade 7 peuvent sécréter des niveaux élevés d’insuline répondant à la fois à un taux élevé de glucose et à une dépolarisation directe (Figure 6D). Bien que cette fonction soit encourageante, la réactivité au glucose in vitro des îlots hPSC n’est toujours pas équivalente à celle des îlots cadavériques en termes d’ampleur de la sécrétion d’insuline (Figure 6D) et la teneur totale en insuline des îlots hPSC est environ la moitié de celle des îlots cadavériques (Figure 6E). Une optimisation continue est nécessaire pour obtenir des îlots hPSC avec des phénotypes de cellules bêta plus matures.

Figure 1
Figure 1 : Vue d’ensemble du schéma de différenciation pour la génération d’îlots hPSC fonctionnels in vitro. Le diagramme de flux de travail donne un aperçu de la procédure en sept étapes impliquée dans la différenciation des CSPh en cellules progénitrices pancréatiques dans une culture plane à l’aide du kit de progéniteurs pancréatiques, l’agrégation en groupes de progéniteurs pancréatiques à l’aide de plaques de micropuits et la transition vers les îlots hPSC dans une culture en suspension statique. Une lignée d’insuline rapporteur hESC, Mel1 INSGFP/W, est utilisée tout au long de cette étude à titre d’exemple pour démontrer l’efficacité de cette méthode hybride. Abréviations : CSPh = cellules souches pluripotentes humaines ; GSIS = sécrétion d’insuline stimulée par le glucose. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Différenciation dirigée des CSPh en cellules progénitrices pancréatiques à l’aide du kit progéniteur pancréatique. (A) Images représentatives du contraste de phase montrant la morphologie des cellules aux stades indiqués. Barres d’échelle = 750 μm. (B, C) Diagrammes représentatifs de cytométrie en flux pour les marqueurs clés des cellules de l’endoderme définitif de stade 1 (FOXA2+/SOX17+) et (C) des cellules progénitrices pancréatiques de stade 4 (PDX1+/NKX6.1+). (D) Images d’immunomarquage représentatives des cellules progénitrices pancréatiques pour PDX1 (rouge) et NKX6.1 (vert). Les noyaux ont été colorés avec du DAPI (bleu). Barre d’échelle = 200 μm. (E) Quantification par cytométrie en flux des cellules PDX1+/NKX6.1+ dans les cellules monocouches progénitrices pancréatiques du stade 4 du jour 4 (n = 5 répétitions biologiques). Abréviations : CSPh = cellules souches pluripotentes humaines ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Agrégation en grappes de progéniteurs pancréatiques de taille uniforme à l’aide de plaques de micropuits de 400 μm de diamètre. (A) Images représentatives du contraste de phase à la fin de l’étape 4 montrant la morphologie de l’amas dans le micropuits et après récupération du micropuits. Barres d’échelle = 300 μm. (B) Quantification du diamètre des grappes à la fin de l’étape 4 (n = 60 grappes de 3 répétitions biologiques). (C) Quantification de l’efficacité de l’agrégation à la fin de l’étape 4 (n = 5 répétitions biologiques). (D) Images d’immunomarquage représentatives des groupes de progéniteurs pancréatiques pour PDX1 (rouge) et NKX6.1 (vert). Les noyaux ont été colorés avec du DAPI (bleu). Barre d’échelle = 100 μm. (E) Quantification par cytométrie en flux des cellules PDX1+/NKX6.1+ dans des agrégats progéniteurs pancréatiques de stade 4 Jour 5 (n = 4 répétitions biologiques). Abréviation : DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Différenciation des progéniteurs pancréatiques en îlots hPSC dans un système de culture en suspension statique. (A) Images représentatives du contraste de phase (panneau supérieur) et images fluorescentes (panneau inférieur) montrant la morphologie des grappes et le profil d’expression de l’insuline aux stades indiqués. Barres d’échelle = 300 μm. (B) Quantification des intensités fluorescentes moyennes de l’INS-GFP par grappe à des stades indiqués (n = 30 grappes de deux répétitions biologiques). (C) Quantification du diamètre des grappes à des stades indiqués (n = 60 grappes provenant de trois répétitions biologiques). Abréviations : hPSC = cellule souche pluripotente humaine ; INS = insuline ; GFP = protéine fluorescente verte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Caractérisation de la composition cellulaire des îlots hPSC de stade 7. (A) Images d’immunomarquage représentatives des îlots hPSC de stade 7 montrant différents types de cellules (SYN, marqueur pan-endocrinien ; CK19, marqueur canalaire ; INS-GFP, l’insuline est indiquée par des signaux GFP rapporteurs ; GCG ; SST; PPY ; L’ENC a été colorée par SLC18A1 anticorps). Les noyaux ont été colorés avec du DAPI (bleu). Barres d’échelle = 100 μm. (B,C) Diagrammes représentatifs de cytométrie en flux du pourcentage (B) de cellules CPEP+ et GCG+ dans les îlots hPSC de stade 7 et (C) du pourcentage de cellules CPEP+ et SST+ dans les îlots hPSC de stade 7. (D) Quantification par cytométrie en flux des marqueurs cellulaires indiqués dans les îlots hPSC de stade 7 (n = 4 répétitions biologiques). Abréviations : hPSC = cellule souche pluripotente humaine ; INS = insuline ; GFP = protéine fluorescente verte ; SYN = synaptophysine ; GCG = glucagon ; SST = somatostatine ; PPY = polypeptide pancréatique ; ENC = entérochromaffine ; CPEP = peptide C ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Caractérisation in vitro et évaluation fonctionnelle des îlots hPSC de stade 7. (A) Images d’immunomarquage représentatives des îlots hPSC de stade 7 montrant la co-expression de l’insuline (indiquée par les signaux INS-GFP rapporteurs) avec plusieurs marqueurs clés des cellules bêta, tels que NKX6.1, MAFA, NEUROD1, PDX1 et le transporteur de glucose GLUT1. Les noyaux ont été colorés avec du DAPI (bleu). Barres d’échelle = 100 μm. (B,C) Graphiques représentatifs de cytométrie en flux du pourcentage (B) de cellules INS+/PDX1+ et du pourcentage (C) de cellules CPEP+/NKX6.1+. (D) Tests GSIS statiques montrant la libération d’insuline par les îlots hPSC de stade 7 (n = 6 comprenant 3 répétitions biologiques et 2 répétitions techniques) et les îlots humains (n = 6 comprenant 3 répétitions biologiques et 2 répétitions techniques) en réponse à une dépolarisation élevée en glucose (16,7 G, 16,7 mM de glucose) et 30 mM de KCl. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± MEB. Un test t bilatéral non apparié (**p < 0,01) a été utilisé pour comparer deux groupes indiqués. (E) Teneur totale en insuline des îlots hPSC de stade 7 (n = 6 dont 3 répétitions biologiques et 2 répétitions techniques) et des îlots humains (n = 6 dont 3 répétitions biologiques et 2 répétitions techniques). Un test t bilatéral non apparié (*p < 0,05) a été utilisé pour comparer les deux groupes. Abréviations : hPSC = cellule souche pluripotente humaine ; INS = insuline ; GFP = protéine fluorescente verte ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Formulation de toutes les solutions et de tous les milieux utilisés dans ce protocole. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Formulation des milieux de différenciation des stades 1 à 7. Le tableau ci-dessous fournit la recette pour préparer les milieux de différenciation des étapes 1 à 7. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cet article décrit un protocole hybride en sept étapes qui permet de générer des îlots hPSC capables de sécréter de l’insuline lors d’une provocation au glucose dans les 40 jours suivant la culture in vitro. Parmi ces multiples étapes, l’induction efficace de l’endoderme définitif est considérée comme un point de départ important pour les résultats finaux de différenciation18,27,28. Selon le protocole du fabricant, une densité de semis de 2,6 × 105/cm 2 est recommandée pour amorcer la différenciation, et les cellules sont exposées au milieu de stade 1 pendant2 jours. Pour s’assurer que les cellules atteignent une quasi-confluence le jour 1 (90 %-100 %), nous recommandons fortement de tester les densités de semis lorsque vous travaillez sur une nouvelle lignée hPSC, car la densité de semis optimale peut varier. Par exemple, avec les trois lignées hPSC testées entre nos mains, 1,6-1,80 × 10 5/cm 2, plutôt que 2,60 × 105/cm2, se sont avérées être une densité de semis optimale. L’extension de la durée de culture de l’étape 1 de 2 jours à 3 jours avec un jour supplémentaire dans le milieu de l’étape 1B augmente la pureté des cellules FOXA2+/SOX17+ de 80 % à > 93 % (données non présentées). Si la proportion de cellules FOXA2+/SOX17+ est inférieure à 70 % à la fin de l’étape 1, l’induction des cellules PDX1+ et des cellules PDX1+/NKX6.1+ sera probablement compromise.

Il est important de noter qu’une certaine mort cellulaire peut être observée pendant toute la culture de l’étape 1 alors que les cellules attachées doivent couvrir 100 % de la surface. Au cours des stades 2 à 4, la diminution de la mort cellulaire concomitante à la prolifération cellulaire se traduit par des cellules compactées et multicouches, ce qui a été rapporté comme étant essentiel pour l’induction efficace des marqueurs progénitrices pancréatiques PDX1 et NKX6.1 et leur localisation nucléaire29,30. Le dernier jour de l’étape 4, les cellules sont dissociées et agrégées en grappes à l’aide des plaques de micropuits AggreWell de 400 μm de diamètre. Par rapport à d’autres approches telles que l’agrégation suspendue, l’agrégation manuelle ou l’utilisation de plaques à 96 puits à fond en U, l’agrégation AggreWell génère des milliers de clusters sphériques de taille uniforme, illustrant la robustesse de cette méthode.

Pour l’induction endocrinienne au cours des stades 5 à 7 dans une culture 3D statique, nous transférons un nombre moyen de ~20 grappes de progéniteurs pancréatiques dérivés du kit dans chaque puits de plaques ULA à fond plat de 96 puits. Cette méthode réduit considérablement la formation d’amas surdimensionnés et améliore la viabilité cellulaire, peut-être en limitant la fusion des amas et/ou en diminuant la perte cellulaire médiée par la contrainte de cisaillement pendant la culture par agitateur orbital. Pour éliminer les cellules mortes flottantes dans les milieux usés tout en réduisant le risque de perte de grappes lors du changement de milieu, nous recommandons de rafraîchir environ les deux tiers du volume total du milieu. Nous remarquons que ce changement partiel du milieu n’entrave pas la différenciation endocrinienne et peut plutôt offrir une transition douce lors du passage d’un stade à l’autre. Néanmoins, une certaine mort cellulaire peut encore être observée au cours du stade 5 et du début du stade 6 avec ce protocole hybride lors de la transition de la culture planaire à la culture statique en suspension. Les lignées rapporteures de CSPh (par exemple, les CSEh Mel1 INSGFP/W) sont utiles pour surveiller la différenciation à un stade avancé dans les cultures vivantes. La cytométrie en flux en cours d’exécution permettra d’examiner NKX6.1+/NEUROD1+ à la fin de l’étape 5, INS+/NKX6.1+ à la fin de l’étape 6 et CPEP+/NKX6.1+ à la fin de l’étape 7. L’induction efficace de populations CPEP+ co-exprimées avec NKX6.1 est essentielle pour obtenir une réactivité au glucose dans les cellules bêta31,32. À cet égard, ce protocole génère systématiquement >50 % de cellules CPEP+/NKX6.1+ dans les îlots hPSC de stade 7 qui peuvent sécréter de l’insuline en réponse à un défi glycémique élevé in vitro.

Bien que le présent protocole ait démontré l’efficacité de la génération d’îlots de CSPh productrices d’insuline, cette méthode présente des limites. À la fin de l’étape 4, l’efficacité de la différenciation à partir de diverses lignées de CSPh, en particulier les CSPi, avec cette trousse de progéniteurs pancréatiques pourrait encore être variable (données non présentées). L’optimisation doit être effectuée au cas par cas. Cette méthode pour les trois dernières étapes de différenciation repose sur l’utilisation de la culture en suspension statique dans des plaques à 96 puits, ce qui est à forte intensité de main-d’œuvre et non évolutif, limitant ainsi son utilisation à la recherche uniquement. Bien qu’il soit encourageant d’obtenir une capacité de sécrétion d’insuline, la réactivité au glucose in vitro et la teneur en insuline des îlots hPSC sont significativement inférieures à celles des îlots cadavériques. Des efforts futurs sont encore nécessaires pour poursuivre l’optimisation du protocole. Malgré ces limitations, nous pensons que le protocole présenté ici fournit des matériaux dérivés de CSPh adaptés au criblage des facteurs induisant la différenciation et des régulateurs de la sécrétion d’hormones des îlots pancréatiques, ainsi qu’à la modélisation du dysfonctionnement des cellules des îlots pancréatiques.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Timothy J. Kieffer était un employé de ViaCyte lors de la préparation de ce manuscrit. Les autres auteurs ne déclarent pas d’intérêts concurrents.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier STEMCELL Technologies, Michael Smith Health Research BC, Stem Cell Network, FRDJ et les Instituts de recherche en santé du Canada pour leur soutien. Jia Zhao et Shenghui Liang sont les récipiendaires de la bourse Michael Smith Health Research BC Trainee Award. Mitchell J.S. Braam est récipiendaire de la bourse Mitacs Accélération. Diepiriye G. Iworima est récipiendaire de la bourse d’études supérieures du Canada Alexander-Graham-Bell et du Prix commémoratif de l’École Polytechnique 1989 de la FCFDU. Nous remercions sincèrement le Dr Edouard G. Stanley de l’IRMC et de l’Université Monash d’avoir partagé la ligne Mel1 INS GFP/W et l’Alberta Diabetes Institute Islet Core pour l’isolement et la distribution des îlots humains. Nous tenons également à souligner le soutien des installations d’imagerie et de cytométrie en flux de l’Institut des sciences de la vie de l’Université de la Colombie-Britannique. La figure 1 a été créée avec BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) Sigma T6397 Thyroid hormone
4% PFA solution Santa Cruz Biotechnology sc-281692 Should be handled in fume hood
96-Well, Ultralow Attachment, flat bottom Corning Costar (VWR) CLS3474 Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages
Accutase STEMCELL Technologies 07920 Dissociation reagent for Stage 4 cells
Aggrewell400 plates STEMCELL Technologies 34415 400 µm diameter microwell plates
Aggrewell800 plates STEMCELL Technologies 34815 800 µm diameter microwell plates
Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG) R&D Systems IC2400G 1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells
Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control R&D Systems IC108G 1:100 in flow cytometry
Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B) BD Sciences 566032 1:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype Control R&D Systems IC0041G 1:500 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ) BD Pharmingen 565831 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ) BD Sciences 565689 1:2,000 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ) BD Sciences 563338 1:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ) BD Sciences 562594 1:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells
Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype Control BD Sciences 557714 1:50 in flow cytometry
ALK5i II Cayman Chemicals 14794 TGF-beta signaling inhibitor
Anti-Adherence Rinsing Solution  STEMCELL Technologies 7010 Microwell Rinsing Solution
Assay chamber Cellvis D35-10-1-N For static GSIS and confocal imaging purposes
Bovine serum albumin (BSA) Thermo Fisher Scientific BP1600-100 For immunostaining procedure
CK19 antibody DAKO M0888 1:50 in whole mount immunofluorescence
D-glucose Sigma G8769 Medium supplement
DAPI Sigma D9542 For nuclear counterstaining
DMEM/F12, HEPES Thermo Fisher Scientific 11330032 Matrix diluting solution
Donkey anti-goat Alexa Fluor 555 Life technologies A21432 1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-goat Alexa Fluor 647 Life technologies A21447 1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555 Life technologies A31570 1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 Life technologies A31571 1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555 Life technologies A31572 1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647 Life technologies A31573 1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647 Life technologies A21448 1:500 in whole mount immunofluorescence
DPBS Sigma D8537 Without Ca2+ and Mg2+
ELISA, insulin, human Alpco 80-INSHU-E01.1 For human insulin measurement
Fatty acid-free BSA Proliant 68700 Medium supplement
Fixation and Permeabilization Solution Kit BD Sciences 554714 Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included
Gentle Cell Dissociation Reagent STEMCELL Technologies 7174 For clump passaging hPSCs during maintenance culture
Glucagon antibody Sigma G2654 1:400 in whole mount immunofluorescence
GLUT1 antibody Thermo Fisher Scientific PA1-37782 1:200 in whole mount immunofluorescence
GlutaMAX-I (100x) Gibco 35050061 L-glutamine supplement
Glycerol Thermo Fisher Scientific G33-4 For tissue clearing and mounting
GSi XX Sigma Millipore 565789 Notch inhibitor
Heparin Sigma H3149 Medium supplement
ITS-X (100x) Thermo Fisher Scientific 51500056 Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement
LDN193189  STEMCELL Technologies 72147 BMP antagonist
MAFA antibody Abcam ab26405 1:200 in whole mount immunofluorescence
Matrigel, hESC-qualified Thermo Fisher Scientific 08-774-552 Extracellular matrix for vessel surface coating
MCDB131 medium Life technologies 10372019 Base medium
mTeSR1 Complete Kit STEMCELL Technologies 85850 stem cell medium and 5x supplement included
N-Cys (N-acetyl cysteine) Sigma A9165 Antioxidant
NaHCO3 Sigma S6297 Medium supplement
NEUROD1 antibody R&D Systems AF2746 1:20 in whole mount immunofluorescence
NKX6.1 antibody DSHB F55A12-c 1:50 in whole mount immunofluorescence
Pancreatic polypeptide antibody R&D Systems AF6297 1:200 in whole mount immunofluorescence
PBS Sigma D8662 With Ca2+ and Mg2+
PDX1 antibody Abcam ab47267 1:200 in whole mount immunofluorescence
PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ) BD Sciences 565860 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k) BD Sciences 563023 1:250 in flow cytometry
PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k) BD Sciences 562161 1:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells
PE Mouse IgG1κ Isotype Control BD Sciences 554680 1:2,000 in flow cytometry
PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k) BD Sciences 564563 1:200 in flow cytometry
R428  Cayman Chemicals 21523 AXL tyrosine kinase inhibitor
Retinoid acid, all-trans Sigma R2625 Light-sensitive
RIPA lysis buffer, 10x Sigma 20-188 For hormone extraction
SANT-1 Sigma S4572 SHH inhibitor
SLC18A1 antibody Sigma HPA063797 1:200 in whole mount immunofluorescence
Somatostatin antibody Sigma HPA019472 1:100 in whole mount immunofluorescence
STEMdiff Pancreatic Progenitor Kit STEMCELL Technologies 05120 Basal media and supplements included
Synaptophysin antibody Novus NB120-16659 1:25 in whole mount immunofluorescence
Triton X-100 Sigma X100 For permeabilization
Trolox  Sigma Millipore 648471 Vitamin E analog
TrypLE Enzyme Express Life technologies 12604-021 cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs
Trypsin1/2/3 antibody R&D Systems AF3586 1:25 in whole mount immunofluorescence
Y-27632 STEMCELL Technologies 72304 ROCK inhibitor
Zinc sulfate Sigma Z0251 Medium supplement

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).
  2. Petersen, M. C., Shulman, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
  3. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
  4. Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. The journey of islet cell transplantation and future development. Islets. 10 (2), 80-94 (2018).
  5. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  6. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  7. Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
  8. Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
  9. Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
  10. Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
  11. Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
  12. Rukstalis, J. M., Habener, J. F. Neurogenin3: a master regulator of pancreatic islet differentiation and regeneration. Islets. 1 (3), 177-184 (2009).
  13. Mastracci, T. L., Anderson, K. R., Papizan, J. B., Sussel, L. Regulation of Neurod1 contributes to the lineage potential of Neurogenin3+ endocrine precursor cells in the pancreas. PLoS Genetics. 9 (2), e1003278 (2013).
  14. Balboa, D., et al. Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells. Nature Biotechnology. 40 (7), 1042-1055 (2022).
  15. Du, Y., et al. Human pluripotent stem-cell-derived islets ameliorate diabetes in non-human primates. Nature Medicine. 28 (2), 272-282 (2022).
  16. Hogrebe, N. J., Augsornworawat, P., Maxwell, K. G., Velazco-Cruz, L., Millman, J. R. Targeting the cytoskeleton to direct pancreatic differentiation of human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 38 (4), 460-470 (2020).
  17. Yoshihara, E., et al. Immune-evasive human islet-like organoids ameliorate diabetes. Nature. 586 (7830), 606-611 (2020).
  18. Mahaddalkar, P. U., et al. Generation of pancreatic beta cells from CD177(+) anterior definitive endoderm. Nature Biotechnology. 38 (9), 1061-1072 (2020).
  19. Liang, S., et al. Differentiation of stem cell-derived pancreatic progenitors into insulin-secreting islet clusters in a multiwell-based static 3D culture system. Cell Reports Methods. 3, 10046 (2023).
  20. Zhao, J., et al. In vivo imaging of beta-cell function reveals glucose-mediated heterogeneity of beta-cell functional development. Elife. 8, e41540 (2019).
  21. Zhao, J., et al. In vivo imaging of calcium activities from pancreatic beta-cells in zebrafish embryos using spinning-disc confocal and two-photon light-sheet microscopy. Bio-protocol. 11 (23), e4245 (2021).
  22. Liang, S., et al. Carbon monoxide enhances calcium transients and glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta-cells by activating phospholipase C signal pathway in diabetic mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 582, 1-7 (2021).
  23. Bruin, J. E., et al. Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice. Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).
  24. Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
  25. Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
  26. Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro beta-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
  27. D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
  28. Jiang, Y., et al. Generation of pancreatic progenitors from human pluripotent stem cells by small molecules. Stem Cell Reports. 16 (9), 2395-2409 (2021).
  29. Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190 (2020).
  30. Mamidi, A., et al. Mechanosignalling via integrins directs fate decisions of pancreatic progenitors. Nature. 564 (7734), 114-118 (2018).
  31. Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells. 31 (11), 2432-2442 (2013).
  32. Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).

Tags

Biologie du développement Numéro 196 Production d’insuline Amas d’îlots Cellules bêta Traitement du diabète Protocole Kit de progéniteurs pancréatiques Protocole R Plaques de micropuits Différenciation endocrinienne Format de suspension statique à 96 puits Caractérisation in vitro Évaluation fonctionnelle Îlots dérivés du HPSC Techniques de culture de cellules souches Essais biologiques
Différenciation de cellules souches pluripotentes humaines en amas d’îlots pancréatiques producteurs d’insuline
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, J., Liang, S., Braam, M. J.… More

Zhao, J., Liang, S., Braam, M. J. S., Baker, R. K., Iworima, D. G., Quiskamp, N., Kieffer, T. J. Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-Producing Islet Clusters. J. Vis. Exp. (196), e64840, doi:10.3791/64840 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter