Summary
השיטות הנוכחיות לניתוח הדינמיקה התוך-תאית של תאים בודדים מקוטבים הן לעתים קרובות ידניות וחסרות סטנדרטיזציה. כתב יד זה מציג צינור ניתוח תמונות חדשני לאוטומציה של חילוץ קו אמצע של תאים מקוטבים בודדים וכימות התנהגות מרחבית-זמנית ממעברי זמן בממשק מקוון ידידותי למשתמש.
Abstract
קוטביות התא היא תופעה מקרוסקופית הנוצרת על ידי אוסף של מולקולות ומבנים מרוכזים מרחבית ששיאם בהופעתם של תחומים מיוחדים ברמה התת-תאית. היא קשורה לפיתוח מבנים מורפולוגיים אסימטריים העומדים בבסיס פונקציות ביולוגיות מרכזיות כגון חלוקת תאים, גדילה והגירה. בנוסף, הפרעה בקוטביות התא נקשרה להפרעות הקשורות לרקמות כגון סרטן ודיספלסיה קיבה.
השיטות הנוכחיות להערכת הדינמיקה המרחבית-זמנית של כתבים פלואורסצנטיים בתאים מקוטבים בודדים כוללות לעתים קרובות צעדים ידניים להתחקות אחר קו אמצע לאורך הציר הראשי של התאים, דבר הגוזל זמן רב ונוטה להטיות חזקות. יתר על כן, למרות שניתוח יחסימטרי יכול לתקן את ההתפלגות הלא אחידה של מולקולות הכתב באמצעות שני ערוצים פלואורסצנטיים, טכניקות חיסור רקע הן לעתים קרובות שרירותיות וחסרות תמיכה סטטיסטית.
כתב יד זה מציג צינור חישובי חדשני לאוטומציה וכימות של ההתנהגות המרחבית-זמנית של תאים בודדים באמצעות מודל של קוטביות התא: צמיחת שיער צינור/שורש אבקה ודינמיקה של יונים ציטוסוליים. אלגוריתם בן שלושה שלבים פותח כדי לעבד תמונות יחסיות ולחלץ ייצוג כמותי של דינמיקה תוך תאית וצמיחה. השלב הראשון מפלח את התא מהרקע, ומפיק מסיכה בינארית באמצעות טכניקת סף במרחב עוצמת הפיקסלים. השלב השני עוקב אחר נתיב דרך קו האמצע של התא באמצעות פעולת שלד. לבסוף, השלב השלישי מספק את הנתונים המעובדים כקיטוע זמן יחסימטרי ומניב קימוגרף יחסימטרי (כלומר, פרופיל מרחבי 1D לאורך זמן). נתונים מתמונות יחסיות שנרכשו עם כתבים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית מגידולי אבקה שימשו כדי לבחון את השיטה. צינור זה מאפשר ייצוג מהיר, מוטה פחות ומדויק יותר של הדינמיקה המרחבית-טמפורלית לאורך קו האמצע של תאים מקוטבים, ובכך מקדם את ערכת הכלים הכמותית הזמינה לחקר קוטביות התא. קוד המקור של AMEBaS Python זמין בכתובת: https://github.com/badain/amebas.git
Introduction
קוטביות התא היא תהליך ביולוגי בסיסי שבו הפעולה המרוכזת של אוסף של מולקולות ומבנים מרוכזים מרחבית מגיעה לשיאה בהקמת תחומים תת-תאיים מורפולוגיים מיוחדים1. חלוקת תאים, גדילה ונדידה מסתמכים על אתרי קוטביות כאלה, בעוד שאובדנו נקשר לסרטן בהפרעות הקשורות לרקמת אפיתל2.
תאים הגדלים באופן אפי הם דוגמה דרמטית לקוטביות, שבה אתר הקוטביות בקצה בדרך כלל מכוון מחדש לרמזים חוץ-תאיים3. אלה כוללים נוירוטים מתפתחים, קורים פטרייתיים, שערות שורש וצינורות אבקה, שבהם תהליכים תאיים מרובים מראים הבדלים בולטים מקצה התא לכיוון השוק. בצינורות אבקה, במיוחד, פילמור אקטין (actin polymerization), סחר בשלפוחיות וריכוזים יוניים מקוטבים במידה ניכרת, ומראים שיפועים ממוקדי קצה4. צינורות אבקה הם הגמטופיטים הזכריים של צמחים פורחים והם אחראים על העברת תאי הזרע לביצית על ידי גידול בלעדי בקודקוד התא באחד מקצבי הצמיחה המהירים ביותר הידועים לתא בודד. השיפועים הממוקדים בקצה של יונים כגון סידן 5 (Ca2+) ופרוטונים 6 (H+) ממלאים תפקיד מרכזי בשמירה על צמיחת צינור האבקה, שהוא חיוני להשגת תפקידה הביולוגי העיקרי שמגיע לשיאו בהפריה כפולה 5,6. לפיכך, שיטות כמותיות לניתוח הדינמיקה המרחבית-טמפורלית לאורך קו האמצע של תאים הגדלים באופן אפי חיוניות לחקר המנגנונים התאיים והמולקולריים העומדים בבסיס צמיחה מקוטבת 7,8,9. חוקרים משתמשים לעתים קרובות בקימוגרפים, כלומר מטריצה שמייצגת את עוצמות הפיקסלים של קו האמצע של התא (למשל, עמודות) לאורך זמן (למשל, שורות), מה שמאפשר להמחיש צמיחה ונדידה של תאים באלכסון (איור 1). למרות התועלת שלהם, קימוגרפים מופקים לעתים קרובות על ידי מעקב ידני אחר קו האמצע, להיות נוטה הטיות וטעויות אנוש תוך גם להיות מייגע למדי. זה דורש שיטה אוטומטית של חילוץ קו אמצע שהיא התכונה הראשונה של הצינור שהוצג כאן בשם AMEBaS:מתיחה אוטומטית Midline Eו- Background Subtraction של מעברי זמן פלואורסצנטיים יחסיים של תאים בודדים מקוטבים.
במונחים של הליכים ניסיוניים, הדמיה כמותית של יונים/מולקולות/מינים בעלי עניין בתאים בודדים יכולה להיות מושגת באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות מקודדות גנטית10. מבין האפשרויות המתרחבות ללא הרף, גשושיות יחסיות הן אחת המדויקות ביותר מכיוון שהן פולטות אורכי גל פלואורסצנטיים שונים כאשר הן קשורות/לא קשורות למולקולות המעניינות11. זה מאפשר תיקון של ההטרוגניות המרחבית בריכוז התוך תאי של הגשושית על ידי שימוש ביחס של שני ערוצים עם רקע ספציפי לערוץ שלהם מופחת. עם זאת, הערכת סף הרקע עבור כל ערוץ ונקודת זמן יכולה להיות משימה מורכבת, שכן לעתים קרובות היא משתנה במרחב עקב אפקטים כמו הצללה, כאשר פינות התמונה יש שונות בהירות ביחס למרכז, ועם הזמן עקב דהיית הפלואורופור (photobleaching)12. למרות שישנן מספר שיטות אפשריות, כתב יד זה מציע לקבוע את עוצמת הרקע באופן אוטומטי באמצעות סף הסגמנטציה המתקבל עם אלגוריתם איזודאטה13, אשר לאחר מכן מוחלק על פני מסגרות באמצעות רגרסיה פולינומית כסטנדרט. עם זאת, רכיבים מרחביים הנובעים מהטרוגניות פלואורסצנטית שאינה קשורה לתא המטרה שהוסרוב-12, זכו להתעלמות בשיטה זו. סף אוטומטי יכול להתבצע במספר שיטות, אך אלגוריתם איזודאטה הפיק את התוצאות הטובות ביותר מבחינה אמפירית. לפיכך, חיסור אוטומטי של ערך רקע וחישוב יחסימטרי הם התכונה העיקרית השנייה של AMEBaS (איור 1), אשר, ביחד, מקבלת כקלט ערימה של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי דו-ערוצי, מעריכה את קו האמצע של התא ואת הרקע הספציפי לערוץ, ומפיקה קימוגרפיות של שני הערוצים והיחס ביניהם (פלט ראשי #1) לאחר חיסור רקע, החלקה והסרה חריגה, יחד עם ערימה של תמונות יחסיות (פלט ראשי #2).
AMEBaS נבדק עם הפסקות זמן פלואורסצנטיות של גידולי אבקה Arabidopsis שהתקבלו תחת מיקרוסקופ, או עם Ca2+ (CaMeleon)8 או pH (pHluorin)6 חיישנים ratiometric מבוטא תחת מקדם LAT52 ספציפי אבקה. תמונות מכל ערוץ צולמו כל 4 שניות כשהוא מחובר למיקרוסקופ הפוך, מצלמה מוארת קדמית (2560 פיקסלים × 2160 פיקסלים, גודל פיקסל 6.45 מיקרומטר), תאורת פלואורסצנטיות ועדשת מטרה טבילת מים 63x, 1.2NA. הגדרות המסננים ששימשו עבור CaMeleon היו: עירור 426-450 ננומטר (CFP) ו- 505-515 ננומטר (YFP), פליטה 458-487 ננומטר (CFP) ו- 520-550 ננומטר (YFP), ואילו עבור pHluorin, עירור 318-390 ננומטר (DAPI) ו- 428-475 ננומטר (FITC), פליטה 435-448 ננומטר (DAPI) ו- 523-536 ננומטר (FITC). ערכת נתונים מלאה נוספה לבדיקה ב-Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.7975350)14.
בנוסף, הצינור נבדק עם נתוני שיער שורש, כאשר ההדמיה בוצעה במיקרוסקופ יריעה קלה (SPIM) כפי שתואר קודם לכן 15,16 עם שערות שורש Arabidopsis המבטאות את כתב Ca2+ המקודד גנטית NES-YC3.6 תחת שליטתו של מקדם UBQ10 17. תוכנת LabView הביתית ששלטה ברכישת המצלמה, תרגום הדגימות והצמצם של מיקרוסקופ יריעת האור אפשרה תצפית על שני ערוצי cpVenus ו-CFP, אך גם הדמיה של היחס ביניהם בזמן אמת. כל תמונת יחס של קיטוע הזמן ייצגה הקרנה בעוצמה מרבית (MIP) בין תמונות התעלות הפלואורסצנטיות cpVenus ו-CFP שהתקבלו מ-15 פרוסות של הדגימה במרווחים של 3 מיקרומטר זו מזו. יחס cpVenus/CFP בהילוך מהיר של MIPs נשמר ושימש ישירות לניתוח AMEBaS.
אף על פי שצינור זה יכול לעבוד עם סוגים רבים של תאים גדלים ונודדים, הוא תוכנן במיוחד לנתח תאים גדלים הגדלים אך ורק בקצה, כגון צינורות אבקה, שערות שורש וקורי פטריות, שבהם יש התאמה של האזורים הציטופלזמיים שאינם גדלים בין המסגרות. כאשר התכתבות כזו אינה קיימת, על המשתמש לבחור באפשרות complete_skeletonization בשלב 1.3.1.1 (עיין בסעיף דיון לקבלת פרטים נוספים).
איור 1: מבט כולל על זרימת העבודה של קו הצינור. צנרת AMEBaS מנתחת ומעבדת מעברי זמן מיקרוסקופיים בשלושה שלבים עיקריים: סגמנטציה של תא יחיד, מעקב אחר קו אמצע ויצירת קימוגרף. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. פרוטוקול מחברת אינטראקטיבי
ניתן להשתמש במחברת Jupyter ישירות באינטרנט באמצעות Google Colab בכתובת https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb, שם התבססו ההוראות שלהלן. לחלופין, מחברת Jupyter זמינה בכתובת https://github.com/badain/amebas, שם ניתן להוריד אותה ולהגדיר אותה לרוץ באופן מקומי ב- Jupyter (אנקונדה יכולה לספק תהליך התקנה קל וחוצה פלטפורמות). נתוני בדיקה מלאים ניתן למצוא בזנודו (https://doi.org/10.5281/zenodo.7975350), המכילים נתונים חד-ערוציים ודו-ערוציים של צינורות אבקה Arabidopsis המבטאים pH או Ca2+ כתבים14. הצינור חולק לחלקים, כאשר ניתן לבצע כל צעד על ידי לחיצה על כפתור ההפעלה לאחר הגדרת האפשרויות הספציפיות למשתמש. הקבצים הדרושים למחקר זה זמינים בתיקיית ה- zip הראשית של AMEBaS (קובץ קידוד משלים 1).
- פתח את מחברת Jupyter וקרא את קבצי קיטועי הזמן.
- נווט אל דף הבית של המחברת האינטראקטיבית ב- Google Colab שהוזכר לעיל או הורד ופתח את מחברת AMEBaS_Local.ipynb מ- GitHub.
- הכן את הגדרת הספריה עבור נתוני הקלט והפלט:
- אם אתה משתמש בגירסה המקומית, מקם את קיטועי הזמן הפלואורסצנטיים כקובץ TIFF או DV בתוך תיקייה בשם data שחייבת להימצא בתיקיית הבסיס של התוכנית. יש ליצור תיקיה בשם כדי לקבל את הנתונים שנוצרו. לאחר מכן הפעל את בלוק קוד ההתקנה.
- אם אתה משתמש במחברת ב- Google Colab, הפעל את בלוק קוד ההתקנה כדי ליצור באופן אוטומטי את הנתונים ואת תיקיות היציאה .
- הפעל את בלוק קוד קלט הקובץ כדי לקרוא את נתוני קיטועי הזמן על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה . אם אתה משתמש בגירסת Google Colab של המחברת, לחץ על בחר קובץ כפתור כדי להעלות ישירות את קובץ קיטועי הזמן לתיקיית הנתונים .
הערה: מספר הערוצים יזוהה באופן אוטומטי בהתבסס על ממד התמונה. - בחר אם פלטים נוספים של כל שלב יופקו על-ידי הגדרת הפרמטר 'verbose' ל - True או False.
- זהו את התא הראשי ואת המקטע מהרקע (איור 2).
- הפעל את בלוק הקוד Single Cell Segmentation כדי להפריד באופן אוטומטי את התא המעניין מהרקע על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה .
הערה: מסנני חציון וגאוס יוחלו כשלב עיבוד מקדים להסרת רעש לא רצוי לפני פילוח החזית מהרקע לפי סף איזודאטה ובידוד האזור של האזור הגדול ביותר כדי להסיר ממצאים לא רצויים.- התאימו את ערך הסיגמא המשמש את הגאוס במשתנה 'סיגמה' כדי לכוונן את החלקות של מסיכת הסגמנטציה. ערך ברירת המחדל הוא 2.0.
- הגדר את אומדן המשתנה ל- False כדי לאחסן את הסף המוערך מ- Isodata ישירות או ל - True כדי להחליק אותו על פני מסגרות שכנות באמצעות רגרסיה פולינומית מקומית (LOESS). כוונן את הפונקציה שלו על ידי שינוי משתנה n_points . ערך ברירת המחדל הוא 40.
- הפעל את בלוק הקוד Single Cell Segmentation כדי להפריד באופן אוטומטי את התא המעניין מהרקע על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה .
- עקבו אחר קו האמצע לאורך שלוחת התא (איור 3).
- הפעל את בלוק הקוד Cell Midline Tracing על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה כדי להפוך את התא באופן אוטומטי לשלד באמצעות שיטה18 של לי ולהרחיב את קצה השלד האחרון באמצעות אקסטרפולציה ליניארית.
- בחר לעקוב אחר קו האמצע רק במסגרת האחרונה או פעם אחת בכל מסגרת על-ידי התאמת הארגומנט complete_skeletonization .
הערה: כאשר כל המסגרות הן שלד, מדלגים על אקסטרפולציה. - הגדר את שבר הנקודות בשלד לאינטרפולציה במהלך אקסטרפולציה על ידי התאמת משתנה interpolation_fraction . ערך ברירת המחדל הוא 0.25.
- בחר את אורך אקסטרפולציית קו האמצע על-ידי שינוי extrapolation_length המשתנה. ברירת המחדל היא -1, המרחיבה את השלד עד לקצה הקרוב ביותר.
- בחר לעקוב אחר קו האמצע רק במסגרת האחרונה או פעם אחת בכל מסגרת על-ידי התאמת הארגומנט complete_skeletonization .
- הפעל את בלוק הקוד Cell Midline Tracing על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה כדי להפוך את התא באופן אוטומטי לשלד באמצעות שיטה18 של לי ולהרחיב את קצה השלד האחרון באמצעות אקסטרפולציה ליניארית.
- צור קימוגרפים עבור כל ערוץ ( איור 4).
- הפעל את בלוק הקוד הראשון של תצוגה חזותית של נתונים על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה כדי ליצור קימוגרפים באופן אוטומטי עבור שני הערוצים.
- בחר את גודל ליבת גאוס המשמשת להחלקה על-ידי התאמת kymograph_kernel המשתנה.
הערה: היא תואמת לגודל השכונה (בפיקסלים) שמעליה ממוצעות עוצמות הפיקסלים. ברירת המחדל היא 3 פיקסלים x 3 פיקסלים. - שלדים לא מורחבים יוצרים קימוגרפים מכוסים שחייבים להשתמש במפת צבע מותאמת אישית כדי להציג כראוי את העוצמות שלהם. בחר את אחוז השבר של העוצמות שיוקצו לצבע הרקע, שחור, תוך התאמת משתנה shift_fraction . ערך ברירת המחדל הוא 0.7.
- בחר את גודל ליבת גאוס המשמשת להחלקה על-ידי התאמת kymograph_kernel המשתנה.
- הפעל את בלוק הקוד הראשון של תצוגה חזותית של נתונים על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה כדי ליצור קימוגרפים באופן אוטומטי עבור שני הערוצים.
- חשב את היחס בין הערוצים (איור 5).
- הפעל את בלוק הקוד השני של תצוגה חזותית של נתונים על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה כדי ליצור באופן אוטומטי קימוגרף יחסימטרי וקיטועי זמן יחסיים (איור 6).
הערה: שלב זה זמין רק בעת שימוש בהפסקות זמן דו-ערוציות. סף עוצמת הרקע המאוחסן בשלב 1.2.1.2 מופחת מכל ערוץ.- התאם את משתנה switch_ratio כדי להחליף את סדר הערוצים המשמשים כמונה וכמכנה במהלך חישובי היחס. ברירת המחדל היא False.
- בחר אם יש להחליק עוד יותר את קיטוע הזמן של היחס באמצעות מעבר מסנן חציוני על-ידי התאמת משתנה smooth_ratio . ברירת המחדל היא False.
- בחר אם להסיר חריגות הנוצרות על-ידי האות הנמוך של ערוץ המכנה על-ידי מניפולציה של משתנה reject_outliers . ברירת המחדל היא True והגדרת חריגים כערכים פי 1.5 מהטווח הבין-רבעוני שמעל הרביעון השלישי (שבו נמצאים 75% מהערכים).
- בחר אם יש לייצא את הרקע בפלט היחסימטרי על-ידי התאמת background_ratio המשתנה. ברירת המחדל היא False, שמחליפה אותו באפסים.
- הפעל את בלוק הקוד השני של תצוגה חזותית של נתונים על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה כדי ליצור באופן אוטומטי קימוגרף יחסימטרי וקיטועי זמן יחסיים (איור 6).
איור 2: שלב פילוח תא בודד. טכניקות עיבוד תמונה כגון סינון, סף ותיוג שטח משמשות לבידוד אות העניין (שלב 1.2). לנתונים מסוימים אלה היו הערכים הבאים עבור העוצמה הנמוכה ביותר: 2556, חציון: 3441 והעוצמה הגבוהה ביותר: 32125. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: סקירה כללית של מעקב אחר קו אמצע – קו האמצע של התא הבודד מתקבל על-ידי חישוב השלד שלו (לבן). הקצה (מגנטה) מחושב באופן ליניארי מהנקודות האחרונות בסוף השלד (שלב 1.3). בהרכב זה הן קו האמצע והן קצהו מונחים על גבי התא המקורי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: קימוגרפיות של Timelapse - השוואה בין הקימוגרפים עבור כל ערוץ שנוצר כאשר 'complete_skeletonization' כבוי (שלב 1.4). הציר האנכי מתאר את התקדמות הזמן, והציר האופקי משרטט את העוצמה הממוצעת של נתיב קו האמצע האקסטרפולטיבי ואחריו תא בודד. עבור נתונים מסוימים אלה, מפת הצבעים מייצגת את הערכים הבאים עבור ערוץ 1 העוצמה הנמוכה ביותר: 2886, חציון: 3167, העוצמה הגבוהה ביותר: 21021. ערוץ 2 העוצמה הנמוכה ביותר: 3030, חציון: 3400, העוצמה הגבוהה ביותר: 29688. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: החלקת סף רקע - סף סגמנטציית הרקע נאמד באמצעות אלגוריתם איזודאטה ולאחר מכן מוחלק באמצעות רגרסיה פולינומית מקומית (שלב 1.5). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: תוצאות יחסיות- (A) השוואה בין הפריים האחרון של הערוץ הראשון היחסי, לבין הערוץ הראשון המקורי המקוטע. (B) קימוגרף שנוצר מה-timelapse היחסי-מטרי (שלב 1.5). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
2. פרוטוקול מצב אצווה
- הורד ומקם את pipeline.py הקובץ ממאגר AMEBaS GitHub באותה ספרייה שבה נמצאים הנתונים.
- הקלד את מיקום הקובץ בשורת הפקודה לאחר קובץ התוכנית.
- כלול - -v כארגומנט מיקום כדי להציג את השלבים הפנימיים של הצינור, אם תרצה.
- כלול - -s לבחירה בערך סיגמה המשמש בשלב העיבוד המקדים של מסנן גאוס כהכנה לסגמנטציה של תאים. ברירת המחדל היא 2.
- כלול - -a כדי לעקוב אחר קו האמצע עבור כל מסגרת של חלוף הזמן. כברירת מחדל, קו הצינור משתמש רק במסגרת האחרונה.
- כלול - -f כדי לבחור את השבר [0,1] של השלד שישמש באינטרפולציה. ערך ברירת המחדל הוא 0.25.
- כלול -e כדי לבחור את האורך בפיקסלים של השלד האקסטרפולטיבי. ברירת המחדל היא -1, המרחיבה את השלד עד לקצה הקרוב ביותר.
- כלול --sf כדי לבחור את החלק של טווח הצבעים שיועבר לרקע בקימוגרפים שאינם אקסטרפולציה. ערך ברירת המחדל הוא 0.7.
- כלול - -k כדי לקבוע את גודל הליבה המשמשת בסינון הקימוגרף גאוס. ברירת המחדל היא 3.
- כלול - -eb כדי להעריך את עוצמת סף הרקע הכללית באמצעות רגרסיה פולינומית LOESS של עוצמות סף הרקע הספציפיות למסגרת.
- התאם אישית את מספר הנקודות המשמשות בהחלקת LOESS של ערכי סף הרקע על-ידי שינוי הפרמטר - -n. ערך ברירת המחדל הוא 40.
- החלף את הערוצים המשמשים כמונה וכמכנה במהלך חישובי היחס, כולל - r או - -switch_ratio, אם חלוף הזמן כולל שני ערוצים. כברירת מחדל, הערוץ השני הוא המונה והראשון הוא המכנה.
- בחר אם יש להחליק עוד יותר את קיטוע הזמן של היחס באמצעות מעבר מסנן חציוני עם הארגומנט - -sm . ברירת המחדל היא False.
- כלול -o כדי לדחות פיקסלים בעוצמות חריגות במהלך יצירת קיטועי זמן יחסיים.
- בחר אם יש לייצא את הרקע בפלט היחסימטרי באמצעות הארגומנט --b. ברירת המחדל היא False, שמחליפה אותו באפסים.
- הקש Enter כדי להפעיל. הפלט יופק באותה ספרייה כמו קובץ התוכנית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
צינור AMEBaS הופך את החילוץ של דינמיקת קו האמצע של תאים בודדים מקוטבים מערימות תמונות במיקרוסקופ פלואורסצנטי לאוטומטי, מה שהופך אותו לפחות גוזל זמן ופחות מועד לטעויות אנוש. השיטה מכמתת את הפסקות הזמן האלה על-ידי יצירת קימוגרפים וערימות תמונות יחסיות (איור 1) בגידול תאים בודדים. ניתן להתאים אותו לעבודה על תאים בודדים נודדים, אך יש צורך בניסויים נוספים. AMEBaS מיושמת בפייתון כמחברת Jupyter אינטראקטיבית (המתוארת בסעיף פרוטוקול מחברת אינטראקטיבי), המאפשר שימוש קל יותר ללא צורך בניסיון בתכנות, וככלי שורת פקודה (בסעיף פרוטוקול מצב אצווה), שבו ניתן לנתח ערימות מרובות עם אותה ערכת פרמטרים. למרות שניתן להשתמש בתעלה פלואורסצנטית אחת או שתיים, בדיקות יחסיות עם שתי תעלות פליטה אמורות להניב תוצאות אמינות יותר מכיוון שפליטת הפלואורסצנטיות של המצב הבלתי קשור של הגשושית יכולה להקל על ההטרוגניות המרחבית הנגרמת על ידי התפלגות לא אחידה של החלבון בציטופלסמה.
הצינור מניב תחילה מסכה בינארית של התא הגדול ביותר בתעלה החזקה ביותר, המיוצאת כקובץ tif בשם Filename_binary_mask.tiff (איור 2). אומדני סף המתקבלים עם איזונתונים עבור כל ערוץ מוחלקים באופן אופציונלי עם לס ונשמרים בטבלה Filename_background_treshold.csv (איור 5). קו האמצע של התא, המופק מהמסיכה הבינארית, מיוצא כקובץ TIF בשם Filename_skeletonized.tiff (איור 3). קימוגרפים של כל ערוץ מופקים מקו האמצע, שנקרא Filename_kymograph_c_*.csv, כאשר * מתאים למספר הערוץ (איור 4). לבסוף, קימוגרף יחסימטרי נשמר כ-Filename_kymograph_ratio.csv, בעוד שהערימה היחסימטרית המלאה נקראת Filename_ratiometric.tiff (איור 6). חלקות המתאימות לאיור 2, איור 3, איור 4, איור 5 ואיור 6 נשמרות באופן אופציונלי כקובצי PNG כאשר המשתמש מציין 'verbose == True' או '--v' בגוש הקוד הראשון (שלב 1.1).
ניתן להצמיד תוצאות אלה לצינורות ניתוח תמונה אחרים כדי להמשיך לחקור את הדינמיקה המרחבית-זמנית של התא, כגון CHUKNORRIS8, אשר לוקח את הקימוגרפים של כל ערוץ כקלט ומבצע ניתוח קצב צמיחה ברזולוציה תת-פיקסלים, יחד עם שיטות ניתוח שונות של סדרות זמן.
AMEBaS נבדק על מערכי נתונים של שפופרות אבקה עם כתבים פלואורסצנטיים יחסיים מקודדים גנטית עבור Ca2+ תוך תאי (CaMeleon; איור 7A,B) ו-H+ (pHluorin; איור 7C,D) ריכוזים שנרכשו במיקרוסקופ פלואורסצנטי אופטי, כמו גם הקרנה בעוצמה מרבית של יחסי cpVenus/CFP של שערות שורש גדלות המבטאות את CaMeleon NES-YC3.6 (איור 7E,F) שנרכשו במיקרוסקופ יריעות אור כפי שתואר קודם לכן15,16. הצינור עבד בהצלחה למרות הבדלים בכיוון הגידול, טכניקות הדמיה, כתבים פלואורסצנטיים וסוגי תאים. סגמנטציה, מעקב אחר קו אמצע וחילוץ קימוגרף מוצגים עבור מערכי נתונים אלה (איור 7), מה שמדגים את הפוטנציאל של יישום AMEBaS במגוון רחב של מערכי ניסוי.
איור 7: תוצאות מייצגות עבור מערכי נתונים שונים של תמונות פלואורסצנטיות של תאים שגדלו בחוד. (א,ב) שפופרת אבקה המבטאת את כתב Ca2+ CaMeleon; (ג,ד) צינורות אבקה המבטאים את מחוון ה- pH pHluorin; (ה,ו) שערות שורש המבטאות את כתב Ca2+ NES-YC3.6. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
קובץ קידוד משלים 1: AMEBaS-main.zip. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה החדשנית המוצגת כאן היא כלי רב עוצמה לייעול ואוטומציה של ניתוח ערימות תמונה במיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאים מקוטבים. השיטות הנוכחיות המתוארות בספרות, כגון תוספי קימוגרף של ImageJ, דורשות מעקב ידני אחר קו האמצע של התא המקוטב המעניין, משימה שהיא לא רק גוזלת זמן אלא גם מועדת לטעויות אנוש. מכיוון שהגדרת קו האמצע בצנרת זו נתמכת בשיטה נומרית18,19 המבצעת שלד, מוסרת הערכה סובייקטיבית, ומציגה תקן כמותי לנוהל. זה שימושי במיוחד עבור חוקרים עם כמויות גדולות של נתונים, עם אפשרות להתאים אישית את הצינור לדרישות שונות, כולל חילוץ קו האמצע עבור כל מסגרת. יתר על כן, חיסור ערך הרקע הוא לעתים קרובות שרירותי, עם ערך רקע יחיד שנבחר ביד עבור כל המסגרות של ערוץ נתון. כאן, פילוח איזודאטה משמש כדי לקבוע באופן אובייקטיבי את סף הרקע עבור כל מסגרת, להחליק אותו (אופציונלי) עם רגרסיה פולינומית מקומית כדי ללכוד שינויים ארוכי טווח בפלואורסצנטיות הנגרמים על ידי דהייה (photobleaching). בעוד שמתעלמים מהלכלוכים האפשריים ומהרכיבים המשניים ברקע על-ידי בחירת האובייקט הגדול יותר לפי אזור פיקסלים, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון FRET-IBRA12, להסרת אפקטים כגון הצללה. ממצאים מרחביים (כגון הצללה) יכולים להשפיע על צורת התא המקוטעת לפי סף, מה שעשוי להסביר את ההטיה של השיפוע לכיוון צד אחד של הצינור שנראה בסרט היחס המופיע בלוגו AMEBaS (ראה דף GitHub או מחברת Colab).
עם זאת, ישנם עדיין כמה מצבים שבהם הצינור המוצג עלול להיכשל ואין לראות בו פתרון של כדור כסף. יש להקדיש תשומת לב מיוחדת במהלך לכידת התמונה מכיוון שהפרעות גדולות עלולות לפגוע ביכולת האלגוריתם לפלח את תא המטרה. יש לשקול עיבוד מראש של אוסף התמונות לקבלת תוצאות מיטביות, הסרת אלמנטים לא רצויים ומסגרות פגומות באופן כללי.
הפרמטרים נבחרו במטרה לנתח תאים בודדים הגדלים באופן אפי בהתחשב במערך נתונים מוגבל של צינורות אבקה Arabidopsis המעריכים ריכוזים יוניים עם כתבים פלואורסצנטיים. לפיכך, נתונים אחרים עשויים לדרוש בחירות הגיוניות של פרמטרים. מסנני עיבוד מקדים מחליקים את הנתונים במטרה ליצור מסיכה בינארית נקייה לאחר סגמנטציה (שלב 1.2), כך שניתן להגדיל את ערך הסיגמא המשמש עבור מסנני גאוס וחציון לקבלת נתונים רועשים יותר או להקטין אותם אם התוצאות מוחלקות יתר על המידה. המיקום של המסיכה הבינארית המתקבלת בערוץ החזק ביותר הוא ההנחה להיות זהה לערוץ החלש ביותר, מה שיכול להוות בעיה אם מיקום התא אינו זהה בשני הערוצים. אם זה המקרה, יש להשתמש במסיכות שונות לכל ערוץ או לבצע רישום תמונה, כפי שנעשה ב- FRET-IBRA12.
השלד נעשה אך ורק במסגרת האחרונה (שלב 1.3) כברירת מחדל, המניחה תא גידול חוד השומר על מיקום הציטופלסמה שלו לאורך זמן (למעט בקודקוד). על ידי הרחבת השלד, ניתן ליצור קימוגרפים המאפשרים ניתוח של קצב הצמיחה, אפילו עם רזולוציה subpixel, באמצעות שיטות כמו CHUKNORRIS8. הרחבה זו נעשית על ידי אקסטרפולציה ליניארית בהתחשב ב-25% הנקודות הראשונות בקצה הגידול של השלד (שלב 1.3) וניתן לכוונן אותה על ידי התאמת interpolation_fraction מ-0% ל-100% נקודות של השלד כולו. עם זאת, אם התא נסחף במיקום בין מסגרות או שהוא תא נודד, ניתוח קצב הצמיחה הופך מורכב יותר. בתרחיש כזה ניתן לייצר שלדים עצמאיים לכל פריים עם בחירת פרמטרים complete_skeletonization=TRUE, שייצרו שלדים ללא הרחבה חוץ-תאית. עדיין ניתן יהיה לנתח את קצב הצמיחה, אך הרזולוציה תוגבל על ידי המסכה הבינארית המיוצרת עם סף איזודאטה. יתר על כן, הקימוגרף המתקבל מניח שניתן ליישר שלדים עוקבים על ידי קואורדינטות ברירת המחדל שלהם, מה שהופך אותו, אם אינו נכון, הופך אותו ללא מתאים לניתוח דינמיקה תוך-תאית.
בעת יצירת קימוגרפים (שלב 1.4), AMEBaS משתמש בממוצע עם ליבת גאוס במקום להשתמש בשולי הפיקסלים המסורתיים סביב קו האמצע. ערך ברירת המחדל של 3x3 הוא הגודל הקטן ביותר האפשרי, שניתן להגדיל אם הנתונים רועשים מדי ו/או אם התא גדול. עם זאת, שלב זה עלול לגרום להחלקת יתר, ובמקרה כזה יש לכבות את המסנן לחלוטין על-ידי הגדרת kymograph_kernel = 0. לבסוף, ניתן להחליק את הרקע המוערך עבור כל פריים של כל ערוץ כאשר המשתמש מצפה לדהייה (photobleaching) או באמצעות הערכות גולמיות (שלב 1.5). ניתן לכוונן את החלקת ערכי הרקע עם רגרסיה פולינומית LOESS (שלב 1.5) על ידי הגדרת מספר הנקודות המשמשות בחלון n_points למינימום של 3 ומקסימום של מספר המסגרות בערימה (מכוסים אוטומטית). פונקציה פשוטה יותר המתארת את שינוי הרקע לאורך זמן יכולה להיות מושגת עם חלון גדול יותר, המניב התאמה גסה יותר.
מכיוון ששיטה זו מאחדת מספר שלבים ידניים המבוצעים בדרך כלל על ידי חוקרים, צינור AMEBaS הוא כלי גישה יעיל, בלתי מוטה ומדויק יותר לניתוח ההתנהגות המרחבית-זמנית של קיטועי זמן של תא מקוטב יחיד. בעתיד, שיטה זו יש פוטנציאל להיות מורחב כדי לתמוך בניתוח של תאים בודדים נודדים. יתר על כן, ניתוח נוסף נחוץ כדי להעריך את הביצועים של שיטה זו על פני מגוון רחב יותר של סוגי תאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
מחברי כתב היד אינם מצהירים על אינטרסים כלכליים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים.
Acknowledgments
המחברים אסירי תודה למענקי FAPESP 2015/22308-2, 2019/23343-7, 2019/26129-6, 2020/06744-5, 2021/05363-0, CNPq, GM131043 המענקים של NIH R01 ומענקי NSF MCB1714993, MCB1930165 לתמיכה כספית. נתוני שיער השורש הופקו עם התשתית ובהנחייתם של פרופ' אנדריאה באסי ופרופ' אלכס קוסטה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Github | Github | https://github.com/badain/amebas | |
| Google Colab | https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb |
References
- Drubin, D. G., Nelson, W. J.
- Wodarz, A., Näthke, I. Cell polarity in development and cancer. Nature Cell Biology. 9 (9), 1016-1024 (2007).
- Palanivelu, R., Preuss, D. Pollen tube targeting and axon guidance: parallels in tip growth mechanisms. Trends in Cell Biology. 10 (12), 517-524 (2000).
- Portes, M. T., et al. The Pollen Tube Oscillator: Integrating Biophysics and Biochemistry into Cellular Growth and Morphogenesis. Rhythms in Plants: Dynamic Responses in a Dynamic Environment. , Springer. Cham. (2015).
- Wudick, M. M., et al. CORNICHON sorting and regulation of GLR channels underlie pollen tube Ca2+ homeostasis. Science. 360 (6388), 533-536 (2018).
- Hoffmann, R. D., et al. Plasma membrane H+-ATPases sustain pollen tube growth and fertilization. Nature Communications. 11 (1), 1-15 (2020).
- Michard, E., et al. Glutamate receptor-like genes form Ca2+ channels in pollen tubes and are regulated by pistil D-serine. Science. 332 (6028), 434-437 (2011).
- Damineli, D. S., Portes, M. T., Feijó, J. A. Oscillatory signatures underlie growth regimes in Arabidopsis pollen tubes: computational methods to estimate tip location, periodicity, and synchronization in growing cells. Journal of Experimental Botany. 68 (12), 3267-3281 (2017).
- Li, K., et al. An optimized genetically encoded dual reporter for simultaneous ratio imaging of Ca2+ and H+ reveals new insights into ion signaling in plants. New Phytologist. 230 (6), 2292-2310 (2021).
- Sadoine, M., et al. Designs, applications, and limitations of genetically encoded fluorescent sensors to explore plant biology. Plant Physiology. 187 (2), 485-503 (2021).
- Grenzi, M., et al. Illuminating the hidden world of calcium ions in plants with a universe of indicators. Plant Physiology. 187 (2), 550-571 (2021).
- Munglani, G., Vogler, H., Grossniklaus, U. Fast and flexible processing of large FRET image stacks using the FRET-IBRA toolkit. PLoS Computational Biology. 18 (4), 1009242 (2022).
- Ridler, T., Calvard, S. Picture thresholding using an iterative selection method. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 8 (8), 630-632 (1978).
- Portes, M. T., Feijó, J. Growing Arabidopsis pollen tubes expressing genetically encoded reporters for calcium and pH. , (2023).
- Candeo, A., Doccula, F. G., Valentini, G., Bassi, A., Costa, A. Light sheet fluorescence microscopy quantifies calcium oscillations in root hairs of Arabidopsis thaliana. Plant & Cell Physiology. 58 (7), 1161-1172 (2017).
- Romano Armada, N., et al. In vivo light sheet fluorescence microscopy of calcium oscillations in Arabidopsis thaliana. Methods in Molecular Biology. 1925, 87-101 (2019).
- Krebs, M., et al. FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca2+ dynamics. The Plant Journal. 69 (1), 181-192 (2012).
- Lee, T. -C., Kashyap, R. L., Chu, C. -N. Building skeleton models via 3-D medial surface axis thinning algorithms. CVGIP: Graphical Models and Image Processing. 56 (6), 462-478 (1994).
- Nunez-Iglesias, J., Blanch, A. J., Looker, O., Dixon, M. W., Tilley, L. A new Python library to analyse skeleton images confirms malaria parasite remodelling of the red blood cell membrane skeleton. PeerJ. 6, 4312 (2018).
