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Developmental Biology

AMEBAS: ध्रुवीकृत एकल कोशिकाओं के अनुपातमीट्रिक प्रतिदीप्ति समय-चूक का स्वचालित मध्य रेखा निष्कर्षण और पृष्ठभूमि घटाव

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/64857
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 4, 5, 6, 1, 1
1Institute of Mathematics and Statistics, University of São Paulo, 2Center for Mathematics, Computing and Cognition, Federal University of ABC, 3Department of Botany, Institute of Biosciences, University of São Paulo, 4Cell Biology and Molecular Genetics Department, University of Maryland, 5Department of Biosciences, University of Milan, 6Department of Physics, Politecnico di Milano

Summary

ध्रुवीकृत एकल कोशिकाओं की इंट्रासेल्युलर गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए वर्तमान तरीके अक्सर मैनुअल होते हैं और मानकीकरण की कमी होती है। यह पांडुलिपि एकल ध्रुवीकृत कोशिकाओं के मध्य रेखा निष्कर्षण को स्वचालित करने और उपयोगकर्ता के अनुकूल ऑनलाइन इंटरफ़ेस में समय की चूक से स्थानिक व्यवहार को निर्धारित करने के लिए एक नई छवि विश्लेषण पाइपलाइन का परिचय देती है।

Abstract

सेल ध्रुवीयता एक मैक्रोस्कोपिक घटना है जो स्थानिक रूप से केंद्रित अणुओं और संरचनाओं के संग्रह द्वारा स्थापित होती है जो उपकोशिकीय स्तर पर विशेष डोमेन के उद्भव में समाप्त होती है। यह असममित रूपात्मक संरचनाओं को विकसित करने से जुड़ा हुआ है जो कोशिका विभाजन, विकास और प्रवासन जैसे प्रमुख जैविक कार्यों को रेखांकित करते हैं। इसके अलावा, सेल ध्रुवीयता के विघटन को कैंसर और गैस्ट्रिक डिस्प्लेसिया जैसे ऊतक से संबंधित विकारों से जोड़ा गया है।

व्यक्तिगत ध्रुवीकृत कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट संवाददाताओं की स्थानिक गतिशीलता का मूल्यांकन करने के वर्तमान तरीकों में अक्सर कोशिकाओं की प्रमुख धुरी के साथ एक मध्य रेखा का पता लगाने के लिए मैनुअल कदम शामिल होते हैं, जो समय लेने वाला और मजबूत पूर्वाग्रहों से ग्रस्त होता है। इसके अलावा, हालांकि अनुपातमेट्रिक विश्लेषण दो प्रतिदीप्ति चैनलों का उपयोग करके रिपोर्टर अणुओं के असमान वितरण को सही कर सकता है, पृष्ठभूमि घटाव तकनीक अक्सर मनमानी होती है और सांख्यिकीय समर्थन की कमी होती है।

यह पांडुलिपि सेल ध्रुवीयता के एक मॉडल का उपयोग करके एकल कोशिकाओं के स्थानिक व्यवहार को स्वचालित और निर्धारित करने के लिए एक नई कम्प्यूटेशनल पाइपलाइन का परिचय देती है: पराग ट्यूब / जड़ बाल विकास और साइटोसोलिक आयन गतिशीलता। अनुपातमीट्रिक छवियों को संसाधित करने और इंट्रासेल्युलर गतिशीलता और विकास का मात्रात्मक प्रतिनिधित्व निकालने के लिए एक तीन-चरण एल्गोरिदम विकसित किया गया था। पहला चरण सेल को पृष्ठभूमि से विभाजित करता है, पिक्सेल तीव्रता स्थान में थ्रेशोल्डिंग तकनीक के माध्यम से एक बाइनरी मास्क का उत्पादन करता है। दूसरा चरण एक कंकालीकरण ऑपरेशन के माध्यम से कोशिका की मध्य रेखा के माध्यम से एक पथ का पता लगाता है। अंत में, तीसरा चरण संसाधित डेटा को अनुपातमीट्रिक टाइमलैप्स के रूप में प्रदान करता है और एक अनुपातमेट्रिक किमोग्राफ (यानी, समय के माध्यम से 1 डी स्थानिक प्रोफ़ाइल) उत्पन्न करता है। बढ़ते पराग ट्यूबों से आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट संवाददाताओं के साथ प्राप्त अनुपातमीट्रिक छवियों के डेटा का उपयोग विधि को बेंचमार्क करने के लिए किया गया था। यह पाइपलाइन ध्रुवीकृत कोशिकाओं की मध्य रेखा के साथ स्थानिक गतिशीलता के तेज, कम पक्षपाती और अधिक सटीक प्रतिनिधित्व की अनुमति देती है, इस प्रकार सेल ध्रुवीयता की जांच के लिए उपलब्ध मात्रात्मक टूलकिट को आगे बढ़ाती है। AMEBaS पायथन स्रोत कोड यहाँ उपलब्ध है: https://github.com/badain/amebas.git

Introduction

सेल ध्रुवीयता एक मौलिक जैविक प्रक्रिया है जिसमें स्थानिक रूप से केंद्रित अणुओं और संरचनाओं के संग्रह की ठोस कार्रवाई विशेष रूपात्मक उपकोशिकीय डोमेन1 की स्थापना में समाप्त होती है। कोशिका विभाजन, विकास और प्रवासन ऐसी ध्रुवीयता साइटों पर निर्भर करते हैं, जबकि इसका नुकसान उपकला ऊतक सेसंबंधित विकारों में कैंसर से जुड़ा हुआ है2.

एपिकल रूप से बढ़ती कोशिकाएं ध्रुवीयता का एक नाटकीय उदाहरण हैं, जहां नोक पर ध्रुवीयता साइट आमतौर पर बाह्य संकेतों 3 में बदलजाती है। इनमें न्यूरॉइट्स, फंगल हाइप, रूट हेयर और पराग ट्यूब विकसित करना शामिल है, जहां कई सेलुलर प्रक्रियाएं सेल की नोक से शंक की ओर स्पष्ट अंतर दिखाती हैं। पराग ट्यूबों में, विशेष रूप से, एक्टिन पोलीमराइजेशन, पुटिका तस्करी, और आयनिक सांद्रता स्पष्ट रूप से ध्रुवीकृत होती है, जो टिप-केंद्रित ग्रेडिएंट4 दिखाती है। पराग ट्यूब फूलों के पौधों के पुरुष गैमेटोफाइट्स हैं और एक एकल कोशिका के लिए ज्ञात सबसे तेज विकास दर में से एक पर कोशिका के शीर्ष पर विशेष रूप से बढ़ने से शुक्राणु कोशिकाओं को अंडाणु तक पहुंचाने के लिए जिम्मेदार हैं। कैल्शियम 5 (सीए2 +) और प्रोटॉन 6 (एच +) जैसे आयनों के टिप-केंद्रित ग्रेडिएंट पराग ट्यूब के विकास को बनाए रखने में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं, जो इसके मुख्य जैविक कार्य को पूरा करने के लिए आवश्यक है जो डबल निषेचन 5,6 में समाप्त होता है। इस प्रकार, ध्रुवीकृत विकास 7,8,9 के अंतर्निहित सेलुलर और आणविक तंत्र की जांच करने के लिए एपिकल रूप से बढ़ती कोशिकाओं की मध्य रेखा के साथ स्थानिक गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए मात्रात्मक तरीके आवश्यक हैं। शोधकर्ता अक्सर काइमोग्राफ का उपयोग करते हैं, यानी, एक मैट्रिक्स जो समय (जैसे, पंक्तियों) के माध्यम से सेल की मध्य रेखा (जैसे, कॉलम) की पिक्सेल तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है, जो विकर्ण में सेल विकास और माइग्रेशन की कल्पना करने की अनुमति देता है (चित्रा 1)। उनकी उपयोगिता के बावजूद, काइमोग्राफ को अक्सर मैन्युअल रूप से मध्य रेखा का पता लगाकर निकाला जाता है, पूर्वाग्रहों और मानवीय त्रुटियों से ग्रस्त होने के साथ-साथ श्रमसाध्य भी होता है। यह मिडलाइन निष्कर्षण की एक स्वचालित विधि की मांग करता है जो यहां शुरू की गई पाइपलाइन की पहली विशेषता है जिसे एएमईबीएस नाम दिया गया है: ध्रुवीकृतएकल कोशिकाओं के अनुपातमीट्रिक प्रतिदीप्ति समय अंतराल का एक यूटोमैटिक एमइडलाइन ईएक्सट्रैक्शन और बाएकग्राउंड एसउबट्रैक्शन।

प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के संदर्भ में, एकल कोशिकाओं में रुचि के आयनों / अणुओं / प्रजातियों की मात्रात्मक इमेजिंग आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट जांच10 के साथ प्राप्त की जा सकती है। लगातार विस्तारित विकल्पों में, अनुपातमीट्रिक जांच सबसे सटीक में से एक है क्योंकि वे ब्याजके अणुओं से बंधे / अनबाउंड होने पर विभिन्न प्रतिदीप्ति तरंग दैर्ध्य का उत्सर्जन करते हैं। यह दो चैनलों के अनुपात का उपयोग करके जांच की इंट्रासेल्युलर एकाग्रता में स्थानिक विषमता के सुधार की अनुमति देता है, जिसमें उनके चैनल विशिष्ट पृष्ठभूमि को घटाया जाता है। हालांकि, प्रत्येक चैनल और समय बिंदु के लिए पृष्ठभूमि सीमा का अनुमान लगाना एक जटिल कार्य हो सकता है क्योंकि यह अक्सर छायांकन जैसे प्रभावों के कारण अंतरिक्ष में भिन्न होता है, जहां छवि के कोनों में केंद्र के सापेक्ष चमक भिन्नता होती है, और समय में फ्लोरोफोरे (फोटोब्लीचिंग) 12 के लुप्त होने के कारण। यद्यपि कई संभावित तरीके हैं, यह पांडुलिपि आइसोडेटा एल्गोरिदम13 के साथ प्राप्त विभाजन सीमा का उपयोग करके स्वचालित रूप से पृष्ठभूमि की तीव्रता निर्धारित करने का प्रस्ताव करती है, जिसे तब एक मानक के रूप में बहुपद प्रतिगमन के माध्यम से फ्रेम में चिकना किया जाता है। 12 में हटाए गए लक्ष्य सेल से असंबंधित प्रतिदीप्ति विषमता से उपजी स्थानिक घटक, हालांकि, इस विधि द्वारा अनदेखा किए गए थे। स्वचालित थ्रेशोल्डिंग कई तरीकों से की जा सकती है, लेकिन आइसोडेटा एल्गोरिदम ने अनुभवजन्य रूप से सर्वोत्तम परिणाम उत्पन्न किए। इस प्रकार, स्वचालित पृष्ठभूमि मान घटाव और अनुपातमीट्रिक गणना AMEBAS (चित्रा 1) की दूसरी मुख्य विशेषता है, जो एक साथ लिया जाता है, दोहरे-चैनल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवियों का एक ढेर इनपुट के रूप में प्राप्त करता है, सेल की मध्य रेखा और चैनल-विशिष्ट पृष्ठभूमि का अनुमान लगाता है, और पृष्ठभूमि घटाव, स्मूथिंग और आउटलायर हटाने के बाद दोनों चैनलों और उनके अनुपात (मुख्य आउटपुट # 1) के किमोग्राफ आउटपुट करता है। अनुपातमीट्रिक छवियों के एक ढेर के साथ (मुख्य आउटपुट # 2)।

एएमईबीएस का परीक्षण माइक्रोस्कोप के तहत प्राप्त एराबिडोप्सिस पराग ट्यूबों के प्रतिदीप्ति समय अंतराल के साथ किया गया था, या तो सीए2 + (कैमेलियन) 8 या पीएच (पीएच (पीएचलुओरिन) 6 अनुपातमीट्रिक सेंसर के साथ पराग-विशिष्ट एलएटी 52 प्रमोटर के तहत व्यक्त किया गया था। प्रत्येक चैनल से छवियों को हर 4 सेकंड में एक उल्टे माइक्रोस्कोप, एक फ्रंट-इल्यूमिनेटेड कैमरा (2560 पिक्सेल × 2160 पिक्सेल, पिक्सेल आकार 6.45 μm), एक प्रतिदीप्ति प्रकाशक और एक जल विसर्जन उद्देश्य लेंस 63x, 1.2NA के साथ युग्मित किया गया था। कैमेलियोन के लिए उपयोग की जाने वाली फिल्टर सेटिंग्स थीं: उत्तेजना 426-450 एनएम (सीएफपी) और 505-515 एनएम (वाईएफपी), उत्सर्जन 458-487 एनएम (सीएफपी) और 520-550 एनएम (वाईएफपी), जबकि पीएचलुरिन के लिए, उत्तेजना 318-390 एनएम (डीएपीआई) और 428-475 एनएम (एफआईटीसी), उत्सर्जन 435-448 एनएम (डीएपीआई) और 535-448 एनएम (533-53)। Zenodo (DOI: 10.5281/ zenodo.7975350)14 में परीक्षण के लिए एक पूर्ण डेटा सेट जोड़ा गया था।

इसके अलावा, पाइपलाइन को रूट हेयर डेटा के साथ परीक्षण किया गया था, जहां इमेजिंग को एक लाइट शीट माइक्रोस्कोप (एसपीआईएम) के साथ किया गया था, जैसा कि पहले एराबिडोप्सिस रूट बालों के साथ15,16 वर्णित किया गया था, जो यूबीक्यू 10 प्रमोटर 17 के नियंत्रण में आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सीए2 + रिपोर्टर एनईएस-वाईसी 3.6 को व्यक्त करता था। कैमरा अधिग्रहण, नमूना अनुवाद और लाइट शीट माइक्रोस्कोप के शटर को नियंत्रित करने वाले होम-मेड लैबव्यू सॉफ्टवेयर ने दो सीपीवीनस और सीएफपी चैनलों के अवलोकन की अनुमति दी, लेकिन वास्तविक समय में उनके अनुपात का विज़ुअलाइज़ेशन भी। टाइम-लैप्स की प्रत्येक अनुपात छवि ने सीपीवीनस और सीएफपी फ्लोरोसेंट चैनल छवियों के बीच अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (एमआईपी) का प्रतिनिधित्व किया, जो नमूने के 15 स्लाइस से प्राप्त 3 μm अलग थे। एमआईपी के टाइम-लैप्स सीपीवीनस/सीएफपी अनुपात को बचाया गया और सीधे एएमईबीएस विश्लेषण के लिए उपयोग किया गया।

यद्यपि यह पाइपलाइन कई प्रकार की बढ़ती और माइग्रेटिंग कोशिकाओं के साथ काम कर सकती है, इसे विशेष रूप से बढ़ती कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए डिज़ाइन किया गया था जो विशेष रूप से नोक पर बढ़ती हैं, जैसे पराग ट्यूब, जड़ के बाल और फंगल हाइप, जहां फ्रेम के बीच गैर-बढ़ते साइटोप्लाज्मिक क्षेत्रों का पत्राचार होता है। जब ऐसा पत्राचार मौजूद नहीं है, तो उपयोगकर्ता को चरण 1.3.1.1 में complete_skeletonization विकल्प चुनना चाहिए (अधिक जानकारी के लिए चर्चा अनुभाग देखें)।

Figure 1
चित्र 1: पाइपलाइन वर्कफ़्लो का अवलोकन। एएमईबीएस पाइपलाइन तीन मुख्य चरणों में सूक्ष्म समय अंतराल का विश्लेषण और प्रक्रिया करती है: सिंगल-सेल सेगमेंटेशन, मिडलाइन ट्रेसिंग और काइमोग्राफ जनरेशन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Protocol

1. इंटरएक्टिव नोटबुक प्रोटोकॉल

Jupyter नोटबुक का उपयोग https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb पर Google Colab का उपयोग करके सीधे वेब पर किया जा सकता है, जहां नीचे दिए गए निर्देश आधारित थे। वैकल्पिक रूप से, जुपिटर नोटबुक https://github.com/badain/amebas पर उपलब्ध है, जहां इसे डाउनलोड किया जा सकता है और जुपिटर में स्थानीय रूप से चलाने के लिए कॉन्फ़िगर किया जा सकता है (एनाकोंडा एक आसान और क्रॉस-प्लेटफ़ॉर्म इंस्टॉलेशन प्रक्रिया प्रदान कर सकता है)। ज़ेनोडो (https://doi.org/10.5281/zenodo.7975350) में एक पूर्ण परीक्षण डेटा पाया जा सकता है, जिसमें एराबिडोप्सिस पराग ट्यूबों के एकल और दोहरे चैनल डेटा शामिल हैं जो पीएच या सीए2 + रिपोर्टर14 को व्यक्त करते हैं। पाइपलाइन को भागों में विभाजित किया गया है, जहां उपयोगकर्ता-विशिष्ट विकल्पों को सेट करने के बाद प्ले बटन पर क्लिक करके हर चरण को निष्पादित किया जा सकता है। इस अध्ययन के लिए आवश्यक फाइलें AMEBAS- मुख्य ज़िप फ़ोल्डर (पूरक कोडिंग फ़ाइल 1) में उपलब्ध हैं।

  1. Jupyter नोटबुक खोलें और टाइम-लैप्स फ़ाइलों को पढ़ें।
    1. ऊपर संदर्भित Google Colab में इंटरैक्टिव नोटबुक के मुखपृष्ठ पर नेविगेट करें या GitHub से AMEBaS_Local.ipynb नोटबुक डाउनलोड और खोलें।
    2. इनपुट और आउटपुट डेटा के लिए निर्देशिका सेटअप तैयार करें:
      1. यदि स्थानीय संस्करण का उपयोग कर रहे हैं, तो प्रतिदीप्ति समय-चूक को TIFF फ़ाइल या DV फ़ाइल के रूप में डेटा नामक फ़ोल्डर के अंदर रखें जो प्रोग्राम के रूट फ़ोल्डर में होना चाहिए। जेनरेट किए गए डेटा को प्राप्त करने के लिए नामित फ़ोल्डर बनाया जाना चाहिए। उसके बाद सेटअप कोड ब्लॉक चलाएँ।
      2. यदि आप Google Colab पर नोटबुक का उपयोग कर रहे हैं, तो डेटा और फ़ोल्डरको स्वचालित रूप से जनरेट करने के लिए सेटअप कोड ब्लॉक चलाएँ.
    3. प्ले बटन पर क्लिक करके टाइम लैप्स डेटा पढ़ने के लिए फ़ाइल इनपुट कोड ब्लॉक चलाएं। यदि नोटबुक के Google Colab संस्करण का उपयोग कर रहे हैं, तो डेटा फ़ोल्डर में टाइम लैप्स फ़ाइल सीधे अपलोड करने के लिए फ़ाइल चुनें बटन पर क्लिक करें.
      नोट: छवि के आयाम के आधार पर चैनलों की संख्या स्वचालित रूप से पता लगाया जाएगा।
    4. चुनें कि क्या प्रत्येक चरण के अतिरिक्त आउटपुट 'वर्बोज़' पैरामीटर को सही या गलत पर सेट करके उत्पन्न किए जाएंगे।
  2. पृष्ठभूमि से मुख्य सेल और सेगमेंट का पता लगाएं (चित्रा 2)।
    1. प्ले बटन पर क्लिक करके पृष्ठभूमि से रुचि के कक्ष को स्वचालित रूप से अलग करने के लिए एकल कक्ष विभाजन कोड ब्लॉक चलाएँ।
      नोट: मीडियन और गॉसियन फिल्टर को आइसोडेटा थ्रेशोल्डिंग द्वारा पृष्ठभूमि से अग्रभूमि को विभाजित करने और अवांछित कलाकृतियों को हटाने के लिए सबसे बड़े क्षेत्र के क्षेत्र को अलग करने से पहले अवांछित शोर को हटाने के लिए एक प्रीप्रोसेसिंग चरण के रूप में लागू किया जाएगा।
      1. विभाजन मास्क की चिकनाई को ठीक करने के लिए गॉसियन द्वारा 'सिग्मा' चर में उपयोग किए जाने वाले सिग्मा मान को समायोजित करें। डिफ़ॉल्ट मान 2.0 है।
      2. स्थानीय बहुपद प्रतिगमन (एलओईएसएस) का उपयोग करके पड़ोसी फ्रेम में इसे चिकना करने के लिए आइसोडेटा से अनुमानित सीमा को सीधे स्टोर करने के लिए या ट्रू से वेरिएबल एस्टिमेट को फॉल्स पर सेट करें। n_points चर को बदलकर इसके फ़ंक्शन को ठीक करें। डिफ़ॉल्ट मान 40 है।
  3. सेल विस्तार के साथ मध्य रेखा का पता लगाएं (चित्रा 3)।
    1. ली की विधि18 का उपयोग करके सेल को स्वचालित रूप से कंकाल बनाने के लिए प्ले बटन पर क्लिक करके सेल मिडलाइन ट्रेसिंग कोड ब्लॉक चलाएं और रैखिक एक्सट्रैक्शन के माध्यम से अंतिम कंकाल की नोक का विस्तार करें।
      1. complete_skeletonization तर्क को समायोजित करके केवल अंतिम फ्रेम पर या प्रति फ्रेम एक बार मध्य रेखा का पता लगाने का विकल्प चुनें।
        नोट: जब सभी फ्रेम कंकाल ीकृत होते हैं, तो बहिर्वेशन छोड़ दिया जाता है।
      2. interpolation_fraction चर को समायोजित करके निकालने के दौरान निकालने के दौरान कंकाल में बिंदुओं के अंश को इंटरपोलेट करने के लिए सेट करें। डिफ़ॉल्ट मान 0.25 है।
      3. चर extrapolation_length को बदलकर मध्य रेखा निकालने की लंबाई चुनें। डिफ़ॉल्ट -1 है, जो कंकाल को निकटतम किनारे तक फैलाता है।
  4. प्रत्येक चैनल के लिए काइमोग्राफ उत्पन्न करें ( चित्रा 4)।
    1. दोनों चैनलों के लिए स्वचालित रूप से काइमोग्राफ उत्पन्न करने के लिए प्ले बटन पर क्लिक करके पहला डेटा विज़ुअलाइज़ेशन कोड ब्लॉक चलाएं।
      1. चर kymograph_kernel को समायोजित करके चिकनाई के लिए उपयोग किए जाने वाले गॉसियन कर्नेल का आकार चुनें।
        नोट: यह पड़ोस के आकार (पिक्सेल में) से मेल खाती है जिस पर पिक्सेल तीव्रता औसत है। डिफ़ॉल्ट 3 पिक्सेल x 3 पिक्सेल है।
      2. गैर-विस्तारित कंकाल कैप्ड किमोग्राफ उत्पन्न करते हैं जिन्हें अपनी तीव्रता को ठीक से प्रदर्शित करने के लिए कस्टम कलरमैप का उपयोग करना चाहिए। तीव्रता का अंश प्रतिशत चुनें जिसे पृष्ठभूमि रंग, काले रंग को सौंपा जाएगा, shift_fraction चर को समायोजित करें। डिफ़ॉल्ट मान 0.7 है।
  5. चैनलों के बीच अनुपात की गणना करें (चित्रा 5)।
    1. स्वचालित रूप से अनुपातमीट्रिक किमोग्राफ और अनुपातमीट्रिक टाइमलैप्स उत्पन्न करने के लिए प्ले बटन पर क्लिक करके दूसरा डेटा विज़ुअलाइज़ेशन कोड ब्लॉक चलाएं (चित्रा 6)।
      नोट: यह चरण केवल दोहरे-चैनल समय चूक का उपयोग करते समय उपलब्ध है। चरण 1.2.1.2 में संग्रहीत पृष्ठभूमि तीव्रता सीमा प्रत्येक चैनल से घटाया जाता है।
      1. अनुपात गणना के दौरान प्रगणक और भाजक के रूप में उपयोग किए जाने वाले चैनलों के क्रम को बदलने के लिए switch_ratio चर को समायोजित करें। डिफ़ॉल्ट गलत है।
      2. चुनें कि क्या अनुपात टाइमलैप्स को smooth_ratio चर को समायोजित करके औसत फ़िल्टर पास के साथ और चिकना किया जाना चाहिए। डिफ़ॉल्ट गलत है।
      3. चुनें कि reject_outliers चर में हेरफेर करके भाजक चैनल के कम सिग्नल द्वारा उत्पादित आउटलायर्स को हटाना है या नहीं। डिफ़ॉल्ट ्स टू ट्रू और आउटलायर्स को तीसरे चतुर्थक से ऊपर इंटरक्वार्टाइल रेंज के 1.5 गुना मूल्यों के रूप में परिभाषित करता है (जहां 75% मान निहित हैं)।
      4. परिवर्तनीय background_ratio समायोजित करके चुनें कि अनुपातमीट्रिक आउटपुट में पृष्ठभूमि निर्यात की जानी चाहिए या नहीं. डिफ़ॉल्ट गलत है, जो इसे शून्य के साथ बदल देता है।

Figure 2
चित्रा 2: एकल सेल विभाजन चरण। छवि प्रसंस्करण तकनीकों जैसे फ़िल्टरिंग, थ्रेशोल्डिंग और क्षेत्र लेबलिंग का उपयोग रुचि के संकेत को अलग करने के लिए किया जाता है (चरण 1.2)। इस विशेष डेटा में निम्नतम तीव्रता के लिए निम्नलिखित मान थे: 2556, औसत: 3441, और उच्चतम तीव्रता: 32125। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: मिडलाइन ट्रेसिंग अवलोकन- एकल कोशिका की मध्य रेखा उसके कंकाल (सफेद) की गणना करके प्राप्त की जाती है। टिप (मैजेंटा) को कंकाल के अंत में अंतिम बिंदुओं से रैखिक रूप से निकाला जाता है (चरण 1.3)। इस संरचना में मध्य रेखा और इसकी नोक दोनों को मूल कोशिका पर सुपरपोज़ किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: टाइमलैप्स के काइमोग्राफ- 'complete_skeletonization' के साथ उत्पन्न प्रत्येक चैनल के लिए काइमोग्राफ की तुलना बंद हो गई (चरण 1.4)। ऊर्ध्वाधर अक्ष समय की प्रगति का वर्णन करता है, और क्षैतिज अक्ष एक एकल कोशिका के बाद विस्तारित मध्य रेखा पथ की औसत तीव्रता को दर्शाता है। इस विशेष डेटा के लिए, कलरमैप चैनल 1 न्यूनतम तीव्रता के लिए निम्नलिखित मानों का प्रतिनिधित्व करता है: 2886, औसत: 3167, उच्चतम तीव्रता: 21021। चैनल 2 सबसे कम तीव्रता: 3030, औसत: 3400, उच्चतम तीव्रता: 29688। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: पृष्ठभूमि थ्रेशोल्ड स्मूथिंग- पृष्ठभूमि विभाजन सीमा का अनुमान आइसोडेटा एल्गोरिदम के माध्यम से लगाया जाता है और फिर स्थानीय बहुपद प्रतिगमन (चरण 1.5) के माध्यम से चिकना किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: अनुपातमेट्रिक परिणाम- (ए) अनुपातमीट्रिक टाइमलैप्स के अंतिम फ्रेम और खंडित मूल पहले चैनल के बीच तुलना। (बी) अनुपातमीट्रिक टाइमलैप्स (चरण 1.5) से उत्पन्न काइमोग्राफ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

2. बैच मोड प्रोटोकॉल

  1. डाउनलोड करें और AMEBaS GitHub रिपॉजिटरी से फ़ाइल pipeline.py को डेटा के समान निर्देशिका में रखें।
  2. प्रोग्राम फ़ाइल के बाद आदेश पंक्ति पर फ़ाइल स्थान टाइप करें।
  3. यदि वांछित हो, तो पाइपलाइन के आंतरिक चरणों को दिखाने के लिए एक स्थितिगत तर्क के रूप में - -v शामिल करें।
  4. सेल विभाजन की तैयारी में गॉसियन फ़िल्टर प्रीप्रोसेसिंग चरण में उपयोग किए जाने वाले सिग्मा मान में चुनने के लिए शामिल करें । डिफ़ॉल्ट 2 है।
  5. समय अंतराल के प्रत्येक फ्रेम के लिए मध्य रेखा का पता लगाने के लिए शामिल करें। डिफ़ॉल्ट रूप से, पाइपलाइन केवल अंतिम फ्रेम का उपयोग करती है।
  6. प्रक्षेप में उपयोग किए जाने वाले कंकाल के अंश [0,1] को चुनने के लिए - -एफ शामिल करें। डिफ़ॉल्ट मान 0.25 है।
  7. विस्तारित कंकाल के पिक्सेल में लंबाई चुनने के लिए -ई शामिल करें। डिफ़ॉल्ट -1 है, जो कंकाल को निकटतम किनारे तक फैलाता है।
  8. रंग सीमा के अंश को चुनने के लिए - एसएफ शामिल करें जिसे गैर-विस्तारित किमोग्राफ में पृष्ठभूमि में स्थानांतरित किया जाएगा। डिफ़ॉल्ट मान 0.7 है।
  9. काइमोग्राफ गॉसियन फ़िल्टरिंग में उपयोग किए जाने वाले कर्नेल के आकार को निर्धारित करने के लिए - -के शामिल करें। डिफ़ॉल्ट 3 है।
  10. फ्रेम-विशिष्ट पृष्ठभूमि थ्रेशोल्ड तीव्रता के एलओईएसएस बहुपद प्रतिगमन के माध्यम से वैश्विक पृष्ठभूमि दहलीज तीव्रता का अनुमान लगाने के लिए ईबी शामिल करें।
    1. पैरामीटर - -एन को संशोधित करके पृष्ठभूमि थ्रेशोल्ड मानों के एलओईएसएस स्मूथिंग में उपयोग किए जाने वाले बिंदुओं की संख्या को अनुकूलित करें। डिफ़ॉल्ट मान 40 है।
  11. यदि टाइमलैप्स में दो चैनल हैं, तो अनुपात गणना के दौरान प्रगणक और भाजक के रूप में उपयोग किए जाने वाले चैनलों को स्विच करें, जिसमें - आर या --switch_ratio शामिल हैं। डिफ़ॉल्ट रूप से, दूसरा चैनल प्रगणक है और पहला भाजक है।
  12. चुनें कि क्या अनुपात टाइमलैप्स को - -एसएम तर्क के साथ मीडियन फ़िल्टर पास के साथ और चिकना किया जाना चाहिए। डिफ़ॉल्ट गलत है।
  13. अनुपातमीट्रिक टाइम-लैप्स पीढ़ी के दौरान असामान्य तीव्रता वाले पिक्सेल को अस्वीकार करने के लिए -ओ शामिल करें।
  14. चुनें कि क्या अनुपातमीट्रिक आउटपुट में पृष्ठभूमि को तर्क - -बी का उपयोग करके निर्यात किया जाना चाहिए। डिफ़ॉल्ट गलत है, जो इसे शून्य के साथ बदल देता है।
  15. चलाने के लिए Enter दबाएँ . आउटपुट प्रोग्राम फ़ाइल के समान निर्देशिका में उत्पन्न किया जाएगा।

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Representative Results

एएमईबीएस पाइपलाइन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवि ढेर से ध्रुवीकृत एकल कोशिकाओं की मध्य रेखा गतिशीलता के निष्कर्षण को स्वचालित करती है, जिससे यह कम समय लेने वाला और मानव त्रुटियों के लिए कम प्रवण होता है। यह विधि बढ़ती एकल कोशिकाओं में काइमोग्राफ और अनुपातमीट्रिक छवि ढेर (चित्रा 1) उत्पन्न करके इन समय अंतराल ों को निर्धारित करती है। इसे एकल कोशिकाओं को माइग्रेट करने पर काम करने के लिए समायोजित किया जा सकता है, लेकिन आगे के प्रयोग आवश्यक हैं। AMEBaS को पायथन में एक इंटरैक्टिव जुपिटर नोटबुक (अनुभाग इंटरएक्टिव नोटबुक प्रोटोकॉल में वर्णित) के रूप में लागू किया गया है, जो प्रोग्रामिंग अनुभव की आवश्यकता के बिना आसान उपयोग की अनुमति देता है, और एक कमांड लाइन टूल (अनुभाग बैच मोड प्रोटोकॉल में) के रूप में, जहां एक ही पैरामीटर सेट के साथ कई ढेर का विश्लेषण किया जा सकता है। यद्यपि या तो एक या दो प्रतिदीप्ति चैनलों का उपयोग किया जा सकता है, दो उत्सर्जन चैनलों के साथ अनुपातमीट्रिक जांच को अधिक विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने चाहिए क्योंकि जांच की अनबाउंड स्थिति का प्रतिदीप्ति उत्सर्जन साइटोप्लाज्म में प्रोटीन के असमान वितरण के कारण स्थानिक विषमता को कम कर सकता है।

पाइपलाइन पहले सबसे मजबूत चैनल पर सबसे बड़े सेल का एक बाइनरी मास्क देती है, जिसे Filename_binary_mask.tiff नाम की टीआईएफ फ़ाइल के रूप में निर्यात किया जाता है (चित्रा 2)। प्रत्येक चैनल के लिए आइसोडेटा के साथ प्राप्त थ्रेशोल्ड अनुमानों को वैकल्पिक रूप से लोइस के साथ चिकना किया जाता है और तालिका Filename_background_treshold.csv में सहेजा जाता है (चित्रा 5)। बाइनरी मास्क से निकाली गई सेल की मध्य रेखा को Filename_skeletonized.tiff नाम की टीआईएफ फ़ाइल के रूप में निर्यात किया जाता है (चित्रा 3)। प्रत्येक चैनल के काइमोग्राफ मध्य रेखा से निर्मित होते हैं, जिसका नाम Filename_kymograph_c_ * .csv है, जहां * चैनल संख्या (चित्रा 4) से मेल खाती है। अंत में, एक अनुपातमीट्रिक किमोग्राफ को Filename_kymograph_ratio.csv के रूप में सहेजा जाता है, जबकि पूर्ण अनुपातमीट्रिक स्टैक को Filename_ratiometric.tiff नाम दिया जाता है (चित्रा 6)। चित्रा 2, चित्रा 3, चित्रा 4, चित्रा 5, और चित्रा 6 से संबंधित प्लॉट वैकल्पिक रूप से पीएनजी फ़ाइलों के रूप में सहेजे जाते हैं जब उपयोगकर्ता द्वारा पहले कोड खंड (चरण 1.1) में 'वर्बोज़ == ट्रू' या '--वी' निर्दिष्ट किया जाता है।

इन परिणामों को अन्य छवि विश्लेषण पाइपलाइनों के साथ जोड़ा जा सकता है ताकि सेल की स्थानिक गतिशीलता की जांच की जा सके, जैसे कि चुकनॉरिस8, जो प्रत्येक चैनल के काइमोग्राफ को इनपुट के रूप में लेता है और विभिन्न समय-श्रृंखला विश्लेषण विधियों के साथ सबपिक्सल रिज़ॉल्यूशन के साथ विकास दर विश्लेषण करता है।

एएमईबीएस का परीक्षण पराग ट्यूब डेटा सेट ों पर इंट्रासेल्युलर सीए2 + (कैमेलियन) के लिए आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड अनुपातमीट्रिक फ्लोरोसेंट संवाददाताओं के साथ किया गया था। चित्रा 7 ए, बी) और एच + (पीएचलुरिन; चित्रा 7 सी, डी) सांद्रता एक ऑप्टिकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर प्राप्त की गई, साथ ही साथ बढ़ते जड़ बालों के सीपीवीनस / सीएफपी अनुपात का अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण जो पहले वर्णित15,16 के रूप में प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोप पर प्राप्त कैमेलॉन एनईएस-वाईसी 3.6 (चित्रा 7 ई, एफ) को व्यक्त करता है। विकास दिशा, इमेजिंग तकनीकों, फ्लोरोसेंट संवाददाताओं और सेल प्रकारों में अंतर के बावजूद पाइपलाइन ने सफलतापूर्वक काम किया। इन डेटासेट (चित्रा 7) के लिए विभाजन, मिडलाइन ट्रेसिंग और काइमोग्राफ निष्कर्षण दिखाए गए हैं, जो प्रयोगात्मक सेटअप की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए एएमईबीएस को लागू करने की क्षमता का प्रदर्शन करते हैं।

Figure 7
चित्रा 7: टिप-बढ़ती कोशिकाओं के विभिन्न प्रतिदीप्ति छवि डेटासेट के लिए प्रतिनिधि परिणाम। (ए, बी) सीए2+ रिपोर्टर कैमेलियोन को व्यक्त करने वाली पराग ट्यूब; (C, D) पीएच संकेतक पीएच को व्यक्त करने वाली पराग ट्यूब; (E, F) सीए2+ रिपोर्टर एनईएस-वाईसी 3.6 को व्यक्त करते हुए रूट बाल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 

पूरक कोडिंग फ़ाइल 1: AMEBAS-मुख्य.zip। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां प्रस्तुत नई विधि ध्रुवीकृत कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवि ढेर के विश्लेषण को सुव्यवस्थित और स्वचालित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। साहित्य में वर्णित वर्तमान विधियों, जैसे कि इमेजजे किमोग्राफ प्लगइन्स, को ध्रुवीकृत सेल ऑफ इंटरेस्ट की मध्य रेखा के मैनुअल ट्रेसिंग की आवश्यकता होती है, एक ऐसा कार्य जो न केवल समय लेने वाला है बल्कि मानवीय त्रुटियों से भी ग्रस्त है। चूंकि इस पाइपलाइन में मध्य रेखा की परिभाषा एक संख्यात्मक विधि18,19 द्वारा समर्थित है जो कंकालीकरण करती है, व्यक्तिपरक मूल्यांकन को हटा दिया जाता है, प्रक्रिया के लिए एक मात्रात्मक मानक पेश किया जाता है। यह बड़ी मात्रा में डेटा वाले शोधकर्ताओं के लिए विशेष रूप से उपयोगी है, पाइपलाइन को विभिन्न मांगों के लिए अनुकूलित करने की संभावना के साथ, जिसमें हर फ्रेम के लिए मध्य रेखा निकालना शामिल है। इसके अलावा, पृष्ठभूमि मान घटाव अक्सर मनमाना होता है, जिसमें किसी दिए गए चैनल के सभी फ्रेम के लिए हाथ से चुना गया एकल पृष्ठभूमि मान होता है। यहां, आइसोडेटा विभाजन का उपयोग प्रत्येक फ्रेम के लिए पृष्ठभूमि सीमा को निष्पक्ष रूप से निर्धारित करने के लिए किया जाता है, इसे (वैकल्पिक रूप से) स्थानीय बहुपद प्रतिगमन के साथ चिकना किया जाता है ताकि लुप्त (फोटोब्लीचिंग) के कारण प्रतिदीप्ति में दीर्घकालिक परिवर्तनों को पकड़ा जा सके। जबकि पिक्सेल क्षेत्र द्वारा बड़ी वस्तु का चयन करके पृष्ठभूमि में संभावित कलाकृतियों और माध्यमिक तत्वों को अनदेखा किया जाता है, फ्रेट-आईबीआरए12 जैसे अन्य तरीकों का उपयोग छायांकन जैसे प्रभावों को हटाने के लिए किया जा सकता है। स्थानिक कलाकृतियां (जैसे छायांकन) थ्रेशोल्डिंग द्वारा खंडित सेल के आकार को प्रभावित कर सकती हैं, जो एएमईबीएस लोगो पर चित्रित अनुपातमीट्रिक फिल्म में देखी गई ट्यूब के एक तरफ ढाल के पूर्वाग्रह के लिए जिम्मेदार हो सकती हैं (देखें गिटहब पृष्ठ या कोलाब नोटबुक)।

बहरहाल, अभी भी कुछ स्थितियां हैं जहां प्रस्तुत पाइपलाइन विफल हो सकती है और इसे चांदी की गोली समाधान के रूप में नहीं माना जाना चाहिए। छवि कैप्चर के दौरान विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए क्योंकि बड़ी गड़बड़ी लक्ष्य सेल को विभाजित करने के लिए एल्गोरिदम की क्षमता को खराब कर सकती है। छवि स्टैक को प्रीप्रोसेसिंग को इष्टतम परिणामों के लिए माना जाना चाहिए, अवांछित तत्वों और समग्र दोषपूर्ण फ्रेम को हटा ना चाहिए।

एराबिडोप्सिस पराग ट्यूबों के प्रतिबंधित डेटा सेट पर विचार करते हुए एकल एपिकल रूप से बढ़ती कोशिकाओं का विश्लेषण करने के उद्देश्य से पैरामीटर चुने गए थे, जो फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स के साथ आयनिक सांद्रता का आकलन करते हैं। इस प्रकार, अन्य डेटा को मापदंडों के समझदार विकल्पों की आवश्यकता हो सकती है। प्रीप्रोसेसिंग फ़िल्टर विभाजन (चरण 1.2) के बाद एक स्वच्छ बाइनरी मास्क का उत्पादन करने के उद्देश्य से डेटा को चिकना करते हैं, इसलिए गॉसियन और मीडियन फिल्टर के लिए उपयोग किए जाने वाले सिग्मा मान को शोर डेटा के लिए बढ़ाया जा सकता है या यदि परिणाम अत्यधिक चिकना होते हैं तो कम किया जा सकता है। सबसे मजबूत चैनल में प्राप्त बाइनरी मास्क का स्थान सबसे कमजोर चैनल के समान माना जाता है, जो दोनों चैनलों में सेल स्थान समान नहीं होने पर एक समस्या हो सकती है। यदि ऐसा है, तो प्रत्येक चैनल के लिए या तो अलग-अलग मास्क का उपयोग किया जाना चाहिए या छवि पंजीकरण किया जाना चाहिए, जैसा कि फ्रेट-आईबीआरए12 में किया गया है।

कंकालीकरण विशेष रूप से अंतिम फ्रेम (चरण 1.3) में डिफ़ॉल्ट रूप से किया जाता है, जो एक टिप-बढ़ती कोशिका को मानता है जो समय के साथ अपने साइटोप्लाज्म के स्थान को बनाए रखता है (शीर्ष के अलावा)। कंकाल का विस्तार करके, किमोग्राफ उत्पन्न करना संभव है जो विकास दर के विश्लेषण की अनुमति देता है, यहां तक कि सबपिक्सल रिज़ॉल्यूशन के साथ, चुकनॉरिस8 जैसे तरीकों का उपयोग करके। यह विस्तार कंकाल के बढ़ते सिरे (चरण 1.3) में पहले 25% बिंदुओं पर विचार करके रैखिक बहिर्वेशन द्वारा किया जाता है और पूरे कंकाल के 0% से 100% बिंदुओं तक interpolation_fraction को समायोजित करके ट्यून किया जा सकता है। हालांकि, अगर सेल फ्रेम के बीच स्थान में बह जाता है या एक माइग्रेटिंग सेल है, तो विकास दर विश्लेषण अधिक जटिल हो जाता है। ऐसे परिदृश्य में, मापदंडों complete_skeletonization = ट्रू की पसंद के साथ हर फ्रेम के लिए स्वतंत्र कंकाल उत्पन्न किए जा सकते हैं, जो बाह्य विस्तार के बिना कंकाल का उत्पादन करेंगे। विकास दर का विश्लेषण करना अभी भी संभव होगा, लेकिन रिज़ॉल्यूशन आइसोडेटा थ्रेशोल्डिंग के साथ उत्पादित बाइनरी मास्क द्वारा सीमित होगा। इसके अलावा, परिणामी किमोग्राफ मानता है कि लगातार कंकाल ों को उनके डिफ़ॉल्ट निर्देशांक द्वारा संरेखित किया जा सकता है, जो यदि सच नहीं है, तो इसे इंट्रासेल्युलर गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए अनुपयुक्त बनाता है।

काइमोग्राफ (चरण 1.4) उत्पन्न करते समय, एएमईबीएस मध्य रेखा के चारों ओर पारंपरिक पिक्सेल मार्जिन का उपयोग करने के बजाय गॉसियन कर्नेल के साथ औसत का उपयोग करता है। 3x3 का डिफ़ॉल्ट मान सबसे छोटा संभव आकार है, जिसे तब बढ़ाया जा सकता है जब डेटा बहुत शोर है और / या यदि सेल बड़ा है। हालांकि, यह चरण ओवर-स्मूथिंग का कारण बन सकता है, इस स्थिति में फ़िल्टर को kymograph_kernel = 0 सेट करके पूरी तरह से बंद कर दिया जाना चाहिए। अंत में, प्रत्येक चैनल के प्रत्येक फ्रेम के लिए अनुमानित पृष्ठभूमि को तब चिकना किया जा सकता है जब उपयोगकर्ता लुप्त (फोटोब्लीचिंग) या कच्चे अनुमानों (चरण 1.5) का उपयोग करके उम्मीद करता है। एलओईएसएस बहुपद प्रतिगमन (चरण 1.5) के साथ पृष्ठभूमि मानों की स्मूथिंग को विंडो n_points में उपयोग किए जाने वाले बिंदुओं की संख्या को न्यूनतम 3 और स्टैक में फ्रेम की अधिकतम संख्या (स्वचालित रूप से कैप्ड) सेट करके ट्यून किया जा सकता है। समय के साथ पृष्ठभूमि परिवर्तन का वर्णन करने वाला एक सरल कार्य एक बड़ी खिड़की के साथ प्राप्त किया जा सकता है, जिससे एक मोटा फिट मिलता है।

चूंकि यह विधि आमतौर पर शोधकर्ताओं द्वारा आयोजित कई मैनुअल चरणों को समेकित करती है, एएमईबीएस पाइपलाइन एकल ध्रुवीकृत सेल टाइम-लैप्स के स्थानिक व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए एक अधिक कुशल, निष्पक्ष और सटीक दृष्टिकोण उपकरण है। भविष्य में, इस विधि में एकल कोशिकाओं के पलायन के विश्लेषण का समर्थन करने के लिए विस्तारित करने की क्षमता है। इसके अलावा, सेल प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला में इस विधि के प्रदर्शन का आकलन करने के लिए आगे का विश्लेषण आवश्यक है।

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Disclosures

इस पांडुलिपि के लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों या हितों के अन्य टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

लेखक वित्तीय सहायता के लिए एफएपीईएसपी अनुदान 2015/22308-2, 2019/23343-7, 2019/26129-6, 2020/06744-5, 2021/05363-0, सीएनपीक्यू, एनआईएच आर 01 अनुदान GM131043 और एनएसएफ अनुदान MCB1714993, MCB1930165 के आभारी हैं। रूट हेयर डेटा का उत्पादन बुनियादी ढांचे के साथ और प्रोफेसर एंड्रिया बस्सी और प्रोफेसर एलेक्स कोस्टा की देखरेख में किया गया था।

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Name Company Catalog Number Comments
Github Github https://github.com/badain/amebas
Google Colab Google https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 196 पृष्ठभूमि घटाव अनुपातमीट्रिक प्रतिदीप्ति समय-चूक ध्रुवीकृत एकल कोशिकाएं सेल ध्रुवीयता मैक्रोस्कोपिक घटना स्थानिक रूप से केंद्रित अणु विशेष डोमेन उपकोशिकीय स्तर असममित रूपात्मक संरचनाएं कोशिका विभाजन विकास प्रवासन कोशिका ध्रुवीयता का विघटन ऊतक से संबंधित विकार कैंसर गैस्ट्रिक डिस्प्लेसिया स्थानिक गतिशीलता फ्लोरोसेंट रिपोर्टर मैनुअल कदम मिडलाइन ट्रेसिंग समय लेने वाला पूर्वाग्रह अनुपातमीट्रिक विश्लेषण रिपोर्टर अणुओं का असमान वितरण पृष्ठभूमि घटाव तकनीक कम्प्यूटेशनल पाइपलाइन स्थानिक व्यवहार एकल कोशिकाओं पराग ट्यूब / जड़ बाल विकास साइटोसोलिक आयन गतिशीलता को स्वचालित और परिमाणित करना
AMEBAS: ध्रुवीकृत एकल कोशिकाओं के अनुपातमीट्रिक प्रतिदीप्ति समय-चूक का स्वचालित मध्य रेखा निष्कर्षण और पृष्ठभूमि घटाव
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Badain, R., Damineli, D. S. C.,… More

Badain, R., Damineli, D. S. C., Portes, M. T., Feijó, J., Buratti, S., Tortora, G., Neves de Oliveira, H., Cesar Jr, R. M. AMEBaS: Automatic Midline Extraction and Background Subtraction of Ratiometric Fluorescence Time-Lapses of Polarized Single Cells. J. Vis. Exp. (196), e64857, doi:10.3791/64857 (2023).

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