AMEBaS: Automatisk midterlinjeekstraktion og baggrundssubtraktion af ratiometrisk fluorescenstidsforløb af polariserede enkeltceller

Summary

Nuværende metoder til analyse af polariserede enkeltcellers intracellulære dynamik er ofte manuelle og mangler standardisering. Dette manuskript introducerer en ny billedanalysepipeline til automatisering af midterlinjeekstraktion af enkeltpolariserede celler og kvantificering af rumlig tidsmæssig adfærd fra tidsforløb i en brugervenlig onlinegrænseflade.

Abstract

Cellepolaritet er et makroskopisk fænomen etableret af en samling rumligt koncentrerede molekyler og strukturer, der kulminerer i fremkomsten af specialiserede domæner på subcellulært niveau. Det er forbundet med at udvikle asymmetriske morfologiske strukturer, der ligger til grund for centrale biologiske funktioner såsom celledeling, vækst og migration. Derudover har forstyrrelsen af cellepolaritet været forbundet med vævsrelaterede lidelser som kræft og gastrisk dysplasi.

Nuværende metoder til evaluering af den rumlige tidsmæssige dynamik hos fluorescerende reportere i individuelle polariserede celler involverer ofte manuelle trin for at spore en midterlinje langs cellernes hovedakse, hvilket er tidskrævende og tilbøjeligt til stærke forstyrrelser. Selvom ratiometrisk analyse kan korrigere den ujævne fordeling af reportermolekyler ved hjælp af to fluorescenskanaler, er baggrundssubtraktionsteknikker ofte vilkårlige og mangler statistisk støtte.

Dette manuskript introducerer en ny beregningspipeline til automatisering og kvantificering af enkeltcellers rumlige tidsmæssige opførsel ved hjælp af en model af cellepolaritet: pollenrør / rodhårvækst og cytosolisk iondynamik. En tretrinsalgoritme blev udviklet til at behandle ratiometriske billeder og udtrække en kvantitativ repræsentation af intracellulær dynamik og vækst. Det første trin segmenterer cellen fra baggrunden og producerer en binær maske gennem en tærskelteknik i pixelintensitetsrummet. Det andet trin sporer en sti gennem cellens midterlinje gennem en skeletoniseringsoperation. Endelig giver det tredje trin de behandlede data som en ratiometrisk timelapse og giver en ratiometrisk kymograf (dvs. en 1D rumlig profil gennem tiden). Data fra ratiometriske billeder erhvervet med genetisk kodede fluorescerende reportere fra voksende pollenrør blev brugt til at benchmarke metoden. Denne pipeline giver mulighed for hurtigere, mindre forudindtaget og mere nøjagtig repræsentation af den rumlige temporale dynamik langs midterlinjen af polariserede celler, hvilket fremmer det kvantitative værktøjssæt, der er tilgængeligt til at undersøge cellepolaritet. AMEBaS Python-kildekoden er tilgængelig på: https://github.com/badain/amebas.git

Introduction

Cellepolaritet er en grundlæggende biologisk proces, hvor den samordnede virkning af en samling rumligt koncentrerede molekyler og strukturer kulminerer i etableringen af specialiserede morfologiske subcellulære domæner¹. Celledeling, vækst og migration er afhængige af sådanne polaritetssteder, mens dets tab har været forbundet med kræft i epitelvævsrelaterede lidelser².

Apikalt voksende celler er et dramatisk eksempel på polaritet, hvor polaritetsstedet ved spidsen typisk omdirigerer til ekstracellulære signaler³. Disse omfatter udvikling af neuritter, svampehyfer, rodhår og pollenrør, hvor flere cellulære processer viser udtalte forskelle fra spidsen af cellen mod skaftet. Især i pollenrør er actinpolymerisation, vesikelhandel og ionkoncentrationer markant polariserede, hvilket viser spidsfokuserede gradienter⁴. Pollenrør er de mandlige gametofytter af blomstrende planter og er ansvarlige for at levere sædcellerne til ægget ved udelukkende at vokse i toppen af cellen med en af de hurtigste vækstrater, der er kendt for en enkelt celle. De spidsfokuserede gradienter af ioner som calcium 5 (Ca²⁺) og protoner 6 (H ⁺) spiller en vigtig rolle i opretholdelsen af pollenrørvækst, hvilket er afgørende for at opnå sin vigtigste biologiske funktion, der kulminerer i en dobbelt befrugtning ^5,6. Således er kvantitative metoder til at analysere den rumlige tidsmæssige dynamik langs midterlinjen af apikalt voksende celler afgørende for at undersøge de cellulære og molekylære mekanismer, der ligger til grund for polariseret vækst ^7,8,9. Forskere bruger ofte kymografer, dvs. en matrix, der repræsenterer pixelintensiteterne af cellens midterlinje (fx kolonner) gennem tiden (f.eks. Rækker), hvilket gør det muligt at visualisere cellevækst og migration i diagonalen (figur 1). På trods af deres anvendelighed ekstraheres kymografer ofte ved manuelt at spore midterlinjen, være tilbøjelige til bias og menneskelige fejl, samtidig med at de er ret besværlige. Dette kræver en automatiseret metode til midterlinjeekstraktion, der er det første træk ved rørledningen, der introduceres heri ved navn AMEBaS: Enutomatisk M-idlineE-xtraktion og Background S-ubtraktionaf ratiometrisk fluorescenstidsbortfald af polariserede enkeltceller.

Med hensyn til eksperimentelle procedurer kan kvantitativ billeddannelse af ioner / molekyler / arter af interesse i enkeltceller opnås med genetisk kodede fluorescerende sonder¹⁰. Blandt de stadigt voksende valg er ratiometriske sonder en af de mest nøjagtige, da de udsender forskellige fluorescensbølgelængder, når de er bundet / ubundet til molekylerne af interesse¹¹. Dette muliggør korrektion af den rumlige heterogenitet i sondens intracellulære koncentration ved at anvende forholdet mellem to kanaler med deres kanalspecifikke baggrund trukket fra. Det kan dog være en kompleks opgave at estimere baggrundstærsklen for hver kanal og hvert tidspunkt, da det ofte varierer i rum på grund af effekter som skygge, hvor billedets hjørner har lysstyrkevariation i forhold til midten og i tid på grund af falmning af fluoroforen (fotoblegning)¹². Selvom der er flere mulige metoder, foreslår dette manuskript automatisk at bestemme baggrundsintensiteten ved hjælp af segmenteringstærsklen opnået med isodataalgoritmen¹³, som derefter udjævnes over rammer gennem polynomisk regression som standard. Rumlige komponenter, der stammer fra fluorescensheterogenitet, der ikke er relateret til målcellen fjernet i¹², blev imidlertid ignoreret ved denne metode. Automatisk tærskelværdi kan udføres ved flere metoder, men isodataalgoritmen gav empirisk de bedste resultater. Således er automatisk baggrundsværdisubtraktion og ratiometrisk beregning det andet hovedtræk ved AMEBaS (figur 1), som tilsammen modtager som input en stak dobbeltkanals fluorescensmikroskopibilleder, estimerer cellens midterlinje og den kanalspecifikke baggrund og udsender kymografer af begge kanaler og deres forhold (hovedudgang # 1) efter baggrundssubtraktion, udjævning og fjernelse af afvigende værdier, sammen med en stak ratiometriske billeder (hovedoutput #2).

AMEBaS blev testet med fluorescenstidsforløb af voksende Arabidopsis-pollenrør opnået under et mikroskop, enten med Ca²⁺ (CaMeleon)⁸ eller pH (pHluorin)⁶ ratiometriske sensorer udtrykt under den pollenspecifikke LAT52-promotor. Billeder fra hver kanal blev taget hver 4. sek. koblet til et omvendt mikroskop, et frontbelyst kamera (2560 pixels × 2160 pixels, pixelstørrelse 6,45 μm), en fluorescensbelysning og en objektivlinse til nedsænkning af vand 63x, 1.2NA. Filterindstillinger, der blev brugt til CaMeleon, var: excitation 426-450 nm (CFP) og 505-515 nm (YFP), emission 458-487 nm (CFP) og 520-550 nm (YFP), mens for pHluorin, excitation 318-390 nm (DAPI) og 428-475 nm (FITC), emission 435-448 nm (DAPI) og 523-536 nm (FITC). Et komplet datasæt blev tilføjet til test på Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.7975350)¹⁴.

Derudover blev rørledningen testet med rodhårsdata, hvor billeddannelse blev udført med et lysarkmikroskop (SPIM) som tidligere beskrevet ^15,16 med Arabidopsis-rodhår, der udtrykker den genetisk kodede Ca²⁺ reporter NES-YC3.6 under kontrol af UBQ10-promotoren¹⁷. Den hjemmelavede LabView-software, der styrede kameraoptagelsen, prøveoversættelsen og lukkeren af lysarkmikroskopet, tillod observation af de to cpVenus- og CFP-kanaler, men også visualisering af deres forhold i realtid. Hvert forholdsbillede af timelapsen repræsenterede en maksimal intensitetsprojektion (MIP) mellem cpVenus- og CFP-fluorescerende kanalbilleder opnået fra 15 skiver af prøven med en afstand på 3 μm fra hinanden. Time-lapse cpVenus/CFP-forholdet mellem MIP'er blev gemt og anvendt direkte til AMEBaS-analysen.

Selvom denne pipeline kan arbejde med flere typer voksende og migrerende celler, blev den specielt designet til at analysere voksende celler, der udelukkende vokser ved spidsen, såsom pollenrør, rodhår og svampehyfer, hvor der er en korrespondance mellem de ikke-voksende cytoplasmatiske regioner mellem rammer. Når en sådan korrespondance ikke er til stede, skal brugeren vælge complete_skeletonization mulighed i trin 1.3.1.1 (se afsnittet Diskussion for flere detaljer).

Figur 1: En oversigt over pipelinens arbejdsgang. AMEBaS-pipelinen analyserer og behandler mikroskopiske tidsforløb i tre hovedtrin: Single-Cell Segmentation, Midline Tracering og Kymograph Generation. Klik her for at se en større version af denne figur.

Protocol

1. Interaktiv notesbogsprotokol

Jupyter-notesbogen kan bruges direkte på nettet ved hjælp af Google Colab at https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb, hvor instruktionerne nedenfor var baseret. Alternativt er Jupyter-notesbogen tilgængelig på https://github.com/badain/amebas, hvor den kan downloades og konfigureres til at køre lokalt i Jupyter (Anaconda kan give en nem installationsproces på tværs af platforme). En komplet testdata kan findes på Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7975350), der indeholder enkelt- og dobbeltkanaldata fra Arabidopsis-pollenrør, der udtrykker enten pH^{- eller Ca2+} -reportere¹⁴. Rørledningen er opdelt i dele, hvor hvert trin kan udføres ved at klikke på afspilningsknappen efter indstilling af de brugerspecifikke indstillinger. De nødvendige filer til denne undersøgelse er tilgængelige i AMEBaS-hoved zip-mappe (supplerende kodningsfil 1).

1. Åbn Jupyter-notesbogen, og læs timelapse-filerne.
   1. Naviger til startsiden for den interaktive notesbog i Google Colab, der er nævnt ovenfor, eller download og åbn AMEBaS_Local.ipynb-notesbogen fra GitHub.
   2. Forbered katalogopsætningen til input- og outputdataene:
      1. Hvis du bruger den lokale version, skal du placere fluorescenstidsforløbet som en TIFF-fil eller DV-fil i en mappe med navnet data , der skal være i programmets rodmappe. Der skal oprettes en mappe med navnet for at modtage de genererede data. Kør derefter installationskodeblokken.
      2. Hvis du bruger notesbogen på Google Colab, skal du køre konfigurationskodeblokken for automatisk at generere dataene og mapperne ud .
   3. Kør blokken Filindtastningskode for at læse tidsforløbsdataene ved at klikke på afspilningsknappen . Hvis du bruger Google Colab-versionen af notesbogen, skal du klikke på knappen Vælg fil for direkte at uploade timelapse-filen til datamappen .
      BEMÆRK: Antallet af kanaler registreres automatisk baseret på billedets dimension.
   4. Vælg, om der skal genereres yderligere output fra hvert trin, ved at indstille parameteren "verbose" til True eller False.
2. Registrer hovedcellen og segmentet fra baggrunden (figur 2).
   1. Kør kodeblokken for segmentering af en enkelt celle for automatisk at adskille den pågældende celle fra baggrunden ved at klikke på afspilningsknappen .
      BEMÆRK: Median- og Gaussian-filtre vil blive anvendt som et forbehandlingstrin for at fjerne uønsket støj, før forgrunden segmenteres fra baggrunden ved hjælp af isodatatærskel og isolering af området for det største område for at fjerne uønskede artefakter.
      1. Juster sigma-værdien, der bruges af Gaussian i variablen 'sigma' for at finjustere glatheden af segmenteringsmasken. Standardværdien er 2,0.
      2. Indstil variabelestimatet til Falsk for at gemme den estimerede tærskel fra Isodata direkte eller til True for at udjævne det på tværs af naborammer ved hjælp af lokal polynomial regression (LOESS). Finjuster dens funktion ved at ændre n_points variablen. Standardværdien er 40.
3. Spor midterlinjen langs celleforlængelsen (figur 3).
   1. Kør kodeblokken Cell Midline Tracing ved at klikke på afspilningsknappen for automatisk at skeletonisere cellen ved hjælp af Lees metode¹⁸ og forlænge spidsen af det sidste skelet gennem lineær ekstrapolering.
      1. Vælg kun at tegne midterlinjen på den sidste ramme eller én gang pr. ramme ved at justere argumentet complete_skeletonization .
         BEMÆRK: Når alle rammer er skeletoniseret, springes ekstrapolering over.
      2. Indstil brøkdelen af punkter i skelettet, der skal interpoleres under ekstrapolering ved at justere interpolation_fraction variablen. Standardværdien er 0,25.
      3. Vælg længden af midterlinjeekstrapolationen ved at ændre variablen extrapolation_length. Standard er -1, hvilket strækker skelettet op til nærmeste kant.
4. Generer kymografer for hver kanal ( figur 4).
   1. Kør den første datavisualiseringskodeblok ved at klikke på afspilningsknappen for automatisk at generere kymografer til begge kanaler.
      1. Vælg størrelsen på den gaussiske kerne, der bruges til udjævning, ved at justere variablen kymograph_kernel.
         BEMÆRK: Det svarer til størrelsen af kvarteret (i pixels), over hvilket pixelintensiteterne er gennemsnitlige. Standardværdien er 3 pixel x 3 pixel.
      2. Ikke-udvidede skeletter genererer lukkede Kymographs, der skal bruge et brugerdefineret farvekort for korrekt at vise deres intensiteter. Vælg den brøkdel procentdel af intensiteterne, der vil blive tildelt baggrundsfarven, sort, justering af shift_fraction variablen. Standardværdien er 0,7.
5. Beregn forholdet mellem kanaler (figur 5).
   1. Kør den anden datavisualiseringskodeblok ved at klikke på afspilningsknappen for automatisk at generere en ratiometrisk kymograf og en ratiometrisk timelapse (figur 6).
      BEMÆRK: Dette trin er kun tilgængeligt, når du bruger dual-channel time lapses. Baggrundsintensitetstærsklen, der er gemt i trin 1.2.1.2, trækkes fra hver kanal.
      1. Juster switch_ratio-variablen for at skifte rækkefølgen af kanaler, der bruges som tæller og nævner under forholdsberegninger. Standardværdien er Falsk.
      2. Vælg, om forholdet timelapse skal udjævnes yderligere med et medianfiltergennemløb ved at justere smooth_ratio variablen. Standardværdien er Falsk.
      3. Vælg, om du vil fjerne afvigende værdier, der produceres af nævnerens kanals lave signal, ved at manipulere variablen reject_outliers . Standardindstillingen er Sand , og afvigende værdier defineres som værdier, der er 1,5 gange det interkvartile område over den tredje kvartil (hvor 75 % af værdierne ligger).
      4. Vælg, om baggrunden i det ratiometriske output skal eksporteres, ved at justere variablen background_ratio. Standardværdien er False, som erstatter den med nuller.

Figur 2: Trin til segmentering af en enkelt celle. Billedbehandlingsteknikker såsom filtrering, tærskelværdi og områdemærkning bruges til at isolere interessesignalet (trin 1.2). Disse særlige data havde følgende værdier for laveste intensitet: 2556, median: 3441 og højeste intensitet: 32125. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Midterlinjesporingsoversigt- Midterlinjen i den enkelte celle opnås ved at beregne dens skelet (hvid). Spidsen (magenta) ekstrapoleres lineært fra de sidste punkter i slutningen af skelettet (trin 1.3). I denne sammensætning er både midterlinjen og dens spids overlejret over den oprindelige celle. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Timelapses kymografer - Sammenligning af kymograferne for hver kanal, der genereres med 'complete_skeletonization' slået fra (trin 1.4). Den lodrette akse beskriver tidens progression, og den vandrette akse afbilder gennemsnitsintensiteten af den ekstrapolerede midterlinjekurve efterfulgt af en enkelt celle. For disse bestemte data repræsenterer farvekortet følgende værdier for kanal 1 laveste intensitet: 2886, median: 3167, højeste intensitet: 21021. Kanal 2 Laveste intensitet: 3030, Median: 3400, Højeste intensitet: 29688. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Udjævning af baggrundstærskel - Baggrundssegmenteringstærsklen estimeres via isodataalgoritmen og udjævnes derefter via lokal polynomial regression (trin 1.5). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: Ratiometriske resultater- (A) Sammenligning mellem den sidste ramme i den ratiometriske timelapse og den segmenterede oprindelige første kanal. B) Kymograf genereret fra den ratiometriske timelapse (trin 1.5). Klik her for at se en større version af denne figur.

2. Protokol for batch-tilstand

1. Download og placer filen pipeline.py fra AMEBaS GitHub-lageret i samme mappe som dataene.
2. Indtast filplaceringen på kommandolinjen efter programfilen.
3. Medtag - -v som et positionsargument for at vise rørledningens interne trin, hvis det ønskes.
4. Medtag - -s at vælge i sigma-værdien, der bruges i Gaussisk filterforbehandlingstrin som forberedelse til cellesegmentering. Standardværdien er 2.
5. Medtag - -a for at spore midterlinjen for hvert billede i tidsforløbet. Som standard bruger pipelinen kun den sidste ramme.
6. Inkluder - -f for at vælge den brøkdel [0,1] af skelettet, der skal bruges i interpolationen. Standardværdien er 0,25.
7. Medtag -e for at vælge længden i pixels af det ekstrapolerede skelet. Standard er -1, hvilket strækker skelettet op til nærmeste kant.
8. Medtag -- sf for at vælge den brøkdel af farveområdet, der skal flyttes til baggrunden i ikke-ekstrapolerede kymografer. Standardværdien er 0,7.
9. Inkluder - -k for at bestemme størrelsen på kernen, der bruges i kymografen Gaussisk filtrering. Standardværdien er 3.
10. Inkluder -- eb for at estimere den globale baggrundstærskelintensitet via LOESS-polynomisk regression af de rammespecifikke baggrundstærskelintensiteter.
    1. Tilpas antallet af punkter, der bruges i LOESS-udjævning af baggrundstærskelværdierne ved at ændre parameteren - -n. Standardværdien er 40.
11. Skift de kanaler, der bruges som tæller og nævner under forholdsberegninger, herunder - r eller - -switch_ratio, hvis timelapsen har to kanaler. Som standard er den anden kanal tælleren, og den første er nævneren.
12. Vælg, om forholdet timelapse skal udjævnes yderligere med et medianfilterpass med argumentet - -sm . Standardværdien er Falsk.
13. Medtag -o for at afvise pixel med unormale intensiteter under ratiometrisk timelapsegenerering.
14. Vælg, om baggrunden i det ratiometriske output skal eksporteres ved hjælp af argumentet - -b. Standardværdien er False, som erstatter den med nuller.
15. Tryk på enter for at køre. Outputtet genereres i samme mappe som programfilen.

Representative Results

AMEBaS-rørledningen automatiserer ekstraktionen af midterlinjedynamikken i polariserede enkeltceller fra fluorescensmikroskopi-billedstakke, hvilket gør det mindre tidskrævende og mindre tilbøjeligt til menneskelige fejl. Metoden kvantificerer disse tidsforløb ved at generere kymografer og ratiometriske billedstakke (figur 1) i voksende enkeltceller. Det kan justeres til at arbejde på migrerende enkeltceller, men yderligere eksperimenter er nødvendige. AMEBaS implementeres i Python som en interaktiv Jupyter Notebook (beskrevet i afsnittet Interaktiv notesbogsprotokol), der muliggør lettere brug uden at kræve programmeringserfaring, og som et kommandolinjeværktøj (i afsnittet Batchtilstandsprotokol), hvor flere stakke kan analyseres med det samme parametersæt. Selv om enten en eller to fluorescenskanaler kan anvendes, bør ratiometriske sonder med to emissionskanaler give mere pålidelige resultater, da fluorescensemissionen af sondens ubundne tilstand kan afhjælpe den rumlige heterogenitet forårsaget af den ujævne fordeling af proteinet i cytoplasmaet.

Pipelinen giver først en binær maske af den største celle på den stærkeste kanal, eksporteret som en tif-fil med navnet Filename_binary_mask.tiff (figur 2). Tærskelestimater opnået med isodata for hver kanal udjævnes valgfrit med løss og gemmes i tabellen Filename_background_treshold.csv (figur 5). Cellens midterlinje, der ekstraheres fra den binære maske, eksporteres som en tif-fil med navnet Filename_skeletonized.tiff (figur 3). Kymografer af hver kanal produceres fra midterlinjen, navngivet Filename_kymograph_c_*.csv, hvor * svarer til kanalnummeret (figur 4). Endelig gemmes en ratiometrisk kymograf, som Filename_kymograph_ratio.csv, mens den fulde ratiometriske stak hedder Filename_ratiometric.tiff (figur 6). Plots svarende til figur 2, figur 3, figur 4, figur 5 og figur 6 gemmes valgfrit som PNG-filer, når 'verbose == True' eller '--v' er angivet af brugeren i den første kodedel (trin 1.1).

Disse resultater kan kobles til andre billedanalyserørledninger for yderligere at undersøge cellens rumlige tidsdynamik, såsom CHUKNORRIS⁸, der tager kymograferne for hver kanal som input og udfører væksthastighedsanalyse med subpixelopløsning sammen med forskellige tidsserieanalysemetoder.

AMEBaS blev testet på pollenrørsdatasæt med genetisk kodede ratiometriske fluorescerende reportere for intracellulær Ca²⁺ (CaMeleon; Figur 7A,B) og H⁺ (pHluorin; Figur 7C,D) koncentrationer opnået på et optisk fluorescensmikroskop samt maksimal intensitetsprojektion af cpVenus/CFP-forholdet mellem voksende rodhår, der udtrykker CaMeleon NES-YC3.6 (figur 7E,F) erhvervet på et lysarkmikroskop som tidligere beskrevet ^15,16. Rørledningen fungerede med succes på trods af forskelle i vækstretningen, billeddannelsesteknikker, fluorescerende reportere og celletyper. Segmentering, midterlinjesporing og kymografudtrækning vises for disse datasæt (figur 7), hvilket viser potentialet ved at anvende AMEBaS på en lang række eksperimentelle opsætninger.

Figur 7: Repræsentative resultater for forskellige fluorescensbilleddatasæt af spidsvoksendeceller. (A,B) Pollenrør, der udtrykker Ca²⁺ reporteren CaMeleon; (C,D) Pollenrør, der udtrykker pH-indikatoren pHluorin; (E,F) Rodhår, der udtrykker Ca²⁺-reporteren NES-YC3.6. Klik her for at se en større version af denne figur. 

Supplerende kodningsfil 1: AMEBaS-main.zip. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Den nye metode, der præsenteres her, er et potent værktøj til at strømline og automatisere analysen af fluorescensmikroskopi-billedstakke af polariserede celler. Nuværende metoder beskrevet i litteraturen, såsom ImageJ Kymograph-plugins, kræver manuel sporing af midterlinjen i den polariserede celle af interesse, en opgave, der ikke kun er tidskrævende, men også tilbøjelig til menneskelige fejl. Da definitionen af midterlinjen i denne rørledning understøttes af en numerisk metode^18,19, der udfører skeletonisering^, fjernes subjektiv evaluering, hvilket introducerer en kvantitativ standard for proceduren. Dette er især nyttigt for forskere med store mængder data med mulighed for at tilpasse rørledningen til forskellige krav, herunder udtrækning af midterlinjen for hver ramme. Desuden er baggrundsværdisubtraktionen ofte vilkårlig, med en enkelt baggrundsværdi valgt manuelt for alle rammer i en given kanal. Her bruges isodatasegmentering til objektivt at bestemme baggrundstærsklen for hver ramme og udjævne den (valgfrit) med en lokal polynomial regression for at fange langsigtede ændringer i fluorescens forårsaget af fading (fotoblegning). Mens de mulige artefakter og sekundære elementer ignoreres i baggrunden ved at markere det større objekt efter pixelområde, kan andre metoder som FRET-IBRA¹² bruges til at fjerne effekter som skygge. Rumlige artefakter (f.eks. skygger) kan påvirke cellens form, der er segmenteret ved hjælp af tærskelværdier, hvilket kan forklare gradientens skævhed mod den ene side af røret, der ses i den ratiometriske film på AMEBaS-logoet (se GitHub-siden eller Colab-notesbogen).

Ikke desto mindre er der stadig nogle få situationer, hvor den præsenterede rørledning kan svigte og ikke bør betragtes som en sølvkugleløsning. Der skal lægges særlig vægt under billedoptagelse, fordi store forstyrrelser kan forringe algoritmens evne til at segmentere målcellen. Forbehandling af billedstakken bør overvejes for optimale resultater, fjernelse af uønskede elementer og overordnede defekte rammer.

Parametre blev valgt med det formål at analysere enkelte apikale voksende celler under hensyntagen til begrænset datasæt af Arabidopsis pollenrør, der analyserer ioniske koncentrationer med fluorescerende reportere. Andre data kan således kræve fornuftige valg af parametre. Forbehandlingsfiltre udjævner dataene med det formål at producere en ren binær maske efter segmentering (trin 1.2), så sigma-værdien, der bruges til Gaussian- og medianfiltrene, kan øges for mere støjende data eller reduceres, hvis resultaterne udjævnes for meget. Placeringen af den binære maske opnået i den stærkeste kanal antages at være den samme som den svageste kanal, hvilket kan være et problem, hvis celleplaceringen ikke er den samme i begge kanaler. Hvis dette er tilfældet, skal der enten bruges forskellige masker til hver kanal, eller der skal udføres billedregistrering, som det gøres i FRET-IBRA¹².

Skeletonisering udføres udelukkende i den sidste ramme (trin 1.3) som standard, hvilket forudsætter en spidsvoksende celle, der opretholder placeringen af dens cytoplasma over tid (bortset fra ved toppen). Ved at udvide skelettet er det muligt at generere kymografer, der muliggør analyse af væksthastigheden, selv med subpixelopløsning, ved hjælp af metoder som CHUKNORRIS⁸. Denne udvidelse udføres ved lineær ekstrapolering under hensyntagen til de første 25% punkter i skeletets voksende spids (trin 1.3) og kan indstilles ved at justere interpolation_fraction fra 0% til 100% punkter på hele skelettet. Men hvis cellen driver i placering mellem rammer eller er en migrerende celle, bliver væksthastighedsanalyse mere kompleks. I et sådant scenarie kan uafhængige skeletter genereres for hver ramme med valget af parametre complete_skeletonization=TRUE, som vil producere skeletter uden ekstracellulær forlængelse. Det ville stadig være muligt at analysere vækstraten, men opløsningen ville være begrænset af den binære maske produceret med isodatatærskel. Desuden antager den resulterende kymograf, at på hinanden følgende skeletter kan justeres efter deres standardkoordinater, hvilket, hvis det ikke er sandt, gør det uegnet til analyse af intracellulær dynamik.

Ved generering af kymografer (trin 1.4) bruger AMEBaS gennemsnit med en gaussisk kerne i stedet for at bruge den traditionelle pixelmargen omkring midterlinjen. Standardværdien for en 3x3 er den mindst mulige størrelse, som kan øges, hvis dataene er for støjende, og/eller hvis cellen er stor. Dette trin kan dog forårsage overudjævning, i hvilket tilfælde filteret skal slukkes helt ved at indstille kymograph_kernel = 0. Endelig kan den estimerede baggrund for hvert billede i hver kanal udjævnes, når brugeren forventer fading (fotoblegning) eller ved hjælp af de rå estimater (trin 1.5). Udjævning af baggrundsværdierne med LOESS-polynomial regression (trin 1.5) kan indstilles ved at indstille antallet af punkter, der bruges i vinduet, n_points til mindst 3 og maksimalt antallet af billeder i stakken (lukkes automatisk). En enklere funktion, der beskriver baggrundsændringen over tid, kan opnås med et større vindue, hvilket giver en grovere pasform.

Da denne metode konsoliderer flere manuelle trin, der typisk udføres af forskere, er AMEBaS-rørledningen et mere effektivt, upartisk og præcist tilgangsværktøj til at analysere den rumlige tidsmæssige opførsel af enkeltpolariserede celletidsforløb. I fremtiden har denne metode potentiale til at blive udvidet til at understøtte analysen af migrerende enkeltceller. Desuden er yderligere analyse nødvendig for at vurdere ydeevnen af denne metode på tværs af en bredere vifte af celletyper.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Github	Github		https://github.com/badain/amebas
Google Colab	Google		https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb