Summary
Nuvarande metoder för att analysera den intracellulära dynamiken hos polariserade enskilda celler är ofta manuella och saknar standardisering. Detta manuskript introducerar en ny bildanalyspipeline för att automatisera mittlinjeextraktion av enstaka polariserade celler och kvantifiera spatiotemporalt beteende från time lapses i ett användarvänligt onlinegränssnitt.
Abstract
Cellpolaritet är ett makroskopiskt fenomen som etableras av en samling rumsligt koncentrerade molekyler och strukturer som kulminerar i uppkomsten av specialiserade domäner på subcellulär nivå. Det är förknippat med att utveckla asymmetriska morfologiska strukturer som ligger till grund för viktiga biologiska funktioner som celldelning, tillväxt och migration. Dessutom har störningen av cellpolariteten kopplats till vävnadsrelaterade sjukdomar som cancer och magdysplasi.
Nuvarande metoder för att utvärdera den spatiotemporala dynamiken hos fluorescerande rapportörer i enskilda polariserade celler involverar ofta manuella steg för att spåra en mittlinje längs cellernas huvudaxel, vilket är tidskrävande och benäget för starka biaser. Dessutom, även om ratiometrisk analys kan korrigera den ojämna fördelningen av reportermolekyler med hjälp av två fluorescenskanaler, är bakgrundssubtraktionstekniker ofta godtyckliga och saknar statistiskt stöd.
Detta manuskript introducerar en ny beräkningspipeline för att automatisera och kvantifiera det spatiotemporala beteendet hos enskilda celler med hjälp av en modell av cellpolaritet: pollenrör/rothårstillväxt och cytosolisk jondynamik. En trestegsalgoritm utvecklades för att bearbeta ratiometriska bilder och extrahera en kvantitativ representation av intracellulär dynamik och tillväxt. Det första steget segmenterar cellen från bakgrunden och skapar en binär mask med hjälp av en tröskelteknik i pixelintensitetsutrymmet. Det andra steget spårar en väg genom cellens mittlinje genom en skeletteringsoperation. Slutligen tillhandahåller det tredje steget bearbetade data som en ratiometrisk timelapse och ger en ratiometrisk kymograf (dvs. en 1D-rumslig profil över tid). Data från ratiometriska bilder tagna med genetiskt kodade fluorescerande rapportörer från växande pollenrör användes för att jämföra metoden. Denna pipeline möjliggör snabbare, mindre partisk och mer exakt representation av den spatiotemporala dynamiken längs mittlinjen av polariserade celler, vilket främjar den kvantitativa verktygslådan som finns tillgänglig för att undersöka cellpolaritet. AMEBaS Python-källkoden finns på: https://github.com/badain/amebas.git
Introduction
Cellpolaritet är en grundläggande biologisk process där den samordnade verkan av en samling rumsligt koncentrerade molekyler och strukturer kulminerar i etableringen av specialiserade morfologiska subcellulära domäner1. Celldelning, tillväxt och migration är beroende av sådana polaritetsplatser, medan dess förlust har associerats med cancer i epitelvävnadsrelaterade sjukdomar2.
Apiskt växande celler är ett dramatiskt exempel på polaritet, där polaritetsstället vid spetsen vanligtvis omorienteras till extracellulära signaler3. Dessa inkluderar utvecklande neuriter, svamphyfer, rothår och pollenrör, där flera cellulära processer visar uttalade skillnader från cellens spets mot skaftet. I pollenrör, i synnerhet, är aktinpolymerisation, vesikeltrafik och jonkoncentrationer markant polariserade, vilket visar spetsfokuserade gradienter4. Pollenrör är de manliga gametofyterna av blommande växter och är ansvariga för att leverera spermierna till ägget genom att växa uteslutande vid toppen av cellen med en av de snabbaste tillväxthastigheterna som är kända för en enda cell. De spetsfokuserade gradienterna av joner som kalcium 5 (Ca2+) och protoner 6 (H+) spelar en viktig roll för att upprätthålla pollenrörstillväxten, vilket är avgörande för att uppnå dess huvudsakliga biologiska funktion som kulminerar i en dubbelbefruktning 5,6. Kvantitativa metoder för att analysera den spatiotemporala dynamiken längs mittlinjen av apikalt växande celler är därför viktiga för att undersöka de cellulära och molekylära mekanismerna bakom polariserad tillväxt 7,8,9. Forskare använder ofta kymografer, dvs en matris som representerar pixelintensiteterna i cellens mittlinje (t.ex. kolumner) genom tiden (t.ex. rader), vilket gör det möjligt att visualisera celltillväxt och migration i diagonalen (figur 1). Trots sin användbarhet extraheras kymografer ofta genom att manuellt spåra mittlinjen, vilket är benäget för fördomar och mänskliga fel samtidigt som de är ganska mödosamma. Detta kräver en automatiserad metod för mittlinjeextraktion som är den första funktionen i pipelinen som introduceras häri, kallad AMEBaS: Automatic Midline Extraction and Background Subtraction of ratiometric fluorescence time lapses of polarized single cells.
När det gäller experimentella procedurer kan kvantitativ avbildning av joner/molekyler/arter av intresse i enskilda celler uppnås med genetiskt kodade fluorescerande sonder10. Bland de ständigt växande valen är ratiometriska sonder en av de mest exakta eftersom de avger olika fluorescensvåglängder när de är bundna/obundna till molekylerna av intresse11. Detta möjliggör korrigering av den rumsliga heterogeniteten i den intracellulära koncentrationen av sonden genom att använda förhållandet mellan två kanaler med deras kanalspecifika bakgrund subtraherad. Att uppskatta bakgrundströskeln för varje kanal och tidpunkt kan dock vara en komplex uppgift eftersom den ofta varierar i rymden på grund av effekter som skuggning, där bildens hörn har luminositetsvariation i förhållande till mitten, och i tid på grund av blekning av fluoroforen (fotoblekning)12. Även om det finns flera möjliga metoder, föreslår detta manuskript att bakgrundsintensiteten bestäms automatiskt med hjälp av segmenteringströskeln som erhålls med Isodata-algoritmen13, som sedan jämnas ut över bildrutor genom polynomregression som standard. Rumsliga komponenter som härrör från fluorescensheterogenitet som inte är relaterade till målcellen som avlägsnades i12 ignorerades dock med denna metod. Automatisk trösklar kan utföras med flera metoder, men Isodata-algoritmen gav de bästa resultaten empiriskt. Således är automatisk subtraktion av bakgrundsvärden och kvotmetrisk beräkning den andra huvudfunktionen hos AMEBaS (figur 1), som tillsammans tar emot en stapel av tvåkanaliga fluorescensmikroskopibilder, uppskattar cellens mittlinje och den kanalspecifika bakgrunden och matar ut kymografer för båda kanalerna och deras förhållande (huvudutgång #1) efter bakgrundssubtraktion, utjämning och avlägsnande av extremvärden, tillsammans med en stapel med ratiometriska bilder (huvudutgång #2).
AMEBaS testades med fluorescenstidsintervall av växande Arabidopsis pollenrör erhållna under ett mikroskop, antingen med Ca2+ (CaMeleon)8 eller pH (pHluorin)6 ratiometriska sensorer uttryckta under den pollenspecifika LAT52-promotorn. Bilder från varje kanal togs var 4:e sekund kopplad till ett inverterat mikroskop, en frontbelyst kamera (2560 pixlar × 2160 pixlar, pixelstorlek 6,45 μm), en fluorescensbelysare och en objektivlins för nedsänkning i vatten 63x, 1,2NA. Filterinställningar som användes för CaMeleon var: excitation 426-450 nm (CFP) och 505-515 nm (YFP), emission 458-487 nm (CFP) och 520-550 nm (YFP), medan för pHluorin, excitation 318-390 nm (DAPI) och 428-475 nm (FITC), emission 435-448 nm (DAPI) och 523-536 nm (FITC). En komplett datauppsättning lades till för testning vid Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.7975350)14.
Dessutom testades pipelinen med rothårsdata, där avbildning utfördes med ett light sheet-mikroskop (SPIM) som tidigare beskrivits 15,16 med Arabidopsis rothår som uttryckte den genetiskt kodade Ca2+-reportern NES-YC3.6 under kontroll av UBQ10-promotorn17. Den hemmagjorda LabView-programvaran som styrde kamerainsamlingen, provöversättningen och slutaren av ljusarksmikroskopet gjorde det möjligt att observera de två cpVenus- och CFP-kanalerna, men också att visualisera deras förhållande i realtid. Varje bild av time-lapse representerade en maximal intensitetsprojektion (MIP) mellan de fluorescerande kanalerna cpVenus och CFP bilder erhållna från 15 skivor av provet med 3 μm mellanrum. Time-lapse cpVenus/CFP-kvoten för MIP sparades och användes direkt för AMEBaS-analysen.
Även om denna pipeline kan fungera med flera typer av växande och migrerande celler, var den speciellt utformad för att analysera växande celler som växer uteslutande i spetsen, såsom pollenrör, rothår och svamphyfer, där det finns en korrespondens mellan de icke-växande cytoplasmatiska regionerna mellan ramarna. När en sådan korrespondens inte finns bör användaren välja alternativet complete_skeletonization i steg 1.3.1.1 (se avsnittet Diskussion för mer information).
Bild 1: En översikt över pipelinearbetsflödet. AMEBaS-pipelinen analyserar och bearbetar mikroskopiska tidsförlopp i tre huvudsteg: Single-Cell Segmentation, Midline Trace och Kymograph Generation. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Interaktivt protokoll för bärbar dator
Jupyter Notebook kan användas direkt på webben med hjälp av Google Colab på https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb, där instruktionerna nedan baserades. Du kan också använda Jupyter Notebook på https://github.com/badain/amebas, där den kan laddas ned och konfigureras för att köras lokalt i Jupyter (Anaconda kan ge en enkel och plattformsoberoende installationsprocess). Fullständiga testdata finns hos Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7975350), som innehåller en- och tvåkanalsdata från Arabidopsis pollenrör som uttrycker antingen pH eller Ca2+ rapportörer14. Pipelinen har delats upp i delar, där varje steg kan utföras genom att klicka på play-knappen efter att ha ställt in de användarspecifika alternativen. De filer som behövs för denna studie finns tillgängliga i AMEBaS- zip-huvudmappen (Supplementary Coding File 1).
- Öppna Jupyter Notebook och läs time-lapse-filerna.
- Gå till startsidan för den interaktiva anteckningsboken i Google Colab som nämns ovan eller ladda ned och öppna anteckningsboken AMEBaS_Local.ipynb från GitHub.
- Förbered katalogkonfigurationen för indata och utdata:
- Om du använder den lokala versionen, placera fluorescenstime-lapse som en TIFF-fil eller DV-fil i en mapp med namnet data som måste finnas i programmets rotmapp. En mapp med namnet måste skapas för att ta emot genererade data. Kör sedan kodblocket Installation.
- Om du använder anteckningsboken på Google Colab kör du kodblocket Setup för att automatiskt generera data och out-mappar .
- Kör kodblocket Filinmatning för att läsa time lapse-data genom att klicka på uppspelningsknappen. Om du använder Google Colab-versionen av anteckningsboken klickar du på knappen Välj fil för att ladda upp time lapse-filen direkt till datamappen.
OBS: Antalet kanaler kommer automatiskt att upptäckas baserat på bildens dimension. - Välj om ytterligare utdata för varje steg ska genereras genom att ange parametern "utförlig" till Sant eller Falskt.
- Detektera huvudcellen och segmentet från bakgrunden (figur 2).
- Kör kodblocket Segmentering av enstaka celler för att automatiskt separera cellen av intresse från bakgrunden genom att klicka på uppspelningsknappen .
OBS: Median- och Gauss-filter kommer att användas som ett förbehandlingssteg för att ta bort oönskat brus innan förgrunden segmenteras från bakgrunden genom att Isodata trösklar och isolerar området i det största området för att ta bort oönskade artefakter.- Justera sigma-värdet som används av Gaussian i variabeln "sigma" för att finjustera segmenteringsmaskens jämnhet. Standardvärdet är 2,0.
- Ange variabeluppskattningen till Falskt om du vill lagra tröskelvärdet som uppskattas från Isodata direkt eller till Sant för att jämna ut det över angränsande bildrutor med hjälp av lokal polynomregression (LOESS). Finjustera dess funktion genom att ändra n_points variabeln. Standardvärdet är 40.
- Kör kodblocket Segmentering av enstaka celler för att automatiskt separera cellen av intresse från bakgrunden genom att klicka på uppspelningsknappen .
- Rita mittlinjen längs cellförlängningen (figur 3).
- Kör kodblocket Cell Midline Tracing genom att klicka på play-knappen för att automatiskt skelettera cellen med Lees metod18 och förlänga spetsen på det sista skelettet genom linjär extrapolering.
- Välj om du bara vill spåra mittlinjen på den sista bildrutan eller en gång per bildruta genom att justera argumentet complete_skeletonization .
OBS: När alla bildrutor är skeletterade hoppas extrapoleringen över. - Ställ in fraktionen av punkter i skelettet som ska interpoleras under extrapoleringen genom att justera interpolation_fraction variabeln. Standardvärdet är 0,25.
- Välj längden på mittlinjeextrapoleringen genom att ändra variabeln extrapolation_length. Standardvärdet är -1, vilket förlänger skelettet upp till närmaste kant.
- Välj om du bara vill spåra mittlinjen på den sista bildrutan eller en gång per bildruta genom att justera argumentet complete_skeletonization .
- Kör kodblocket Cell Midline Tracing genom att klicka på play-knappen för att automatiskt skelettera cellen med Lees metod18 och förlänga spetsen på det sista skelettet genom linjär extrapolering.
- Generera kymografer för varje kanal ( Figur 4).
- Kör det första kodblocket för datavisualisering genom att klicka på uppspelningsknappen för att automatiskt generera kymografer för båda kanalerna.
- Välj storleken på den gaussiska kärnan som används för utjämning genom att justera variabeln kymograph_kernel.
Det motsvarar storleken på det område (i pixlar) som pixelintensiteten beräknas över i genomsnitt. Standardvärdet är 3 x 3 pixlar. - Icke-utökade skelett genererar täckta kymografer som måste använda en anpassad färgkarta för att korrekt visa deras intensitet. Välj bråkprocenten av intensiteterna som ska tilldelas bakgrundsfärgen, svart, och justera variabeln shift_fraction . Standardvärdet är 0,7.
- Välj storleken på den gaussiska kärnan som används för utjämning genom att justera variabeln kymograph_kernel.
- Kör det första kodblocket för datavisualisering genom att klicka på uppspelningsknappen för att automatiskt generera kymografer för båda kanalerna.
- Beräkna förhållandet mellan kanalerna (figur 5).
- Kör det andra kodblocket för datavisualisering genom att klicka på uppspelningsknappen för att automatiskt generera en ratiometrisk kymograf och en ratiometrisk timelapse (figur 6).
OBS: Detta steg är endast tillgängligt när du använder tidsförlopp med dubbla kanaler. Tröskelvärdet för bakgrundsintensitet som lagrades i steg 1.2.1.2 subtraheras från varje kanal.- Justera variabeln switch_ratio för att byta ordning på kanalerna som används som täljare och nämnare under kvotberäkningar. Standardvärdet är False.
- Välj om förhållandet timelapse måste jämnas ut ytterligare med ett medianfilterpass genom att justera smooth_ratio variabeln. Standardvärdet är False.
- Välj om du vill ta bort extremvärden som produceras av den låga signalen från nämnarkanalen genom att manipulera den reject_outliers variabeln. Standardvärdet är True och definierar extremvärden som värden som är 1,5 gånger kvartilintervallet ovanför den tredje kvartilen (där 75 % av värdena ligger).
- Välj om bakgrunden i ratiometrisk utmatning ska exporteras genom att justera variabeln background_ratio. Standardvärdet är False, vilket ersätter det med nollor.
- Kör det andra kodblocket för datavisualisering genom att klicka på uppspelningsknappen för att automatiskt generera en ratiometrisk kymograf och en ratiometrisk timelapse (figur 6).
Bild 2: Segmenteringssteg för enskilda celler. Bildbehandlingstekniker som filtrering, trösklar och områdesmärkning används för att isolera signalen av intresse (steg 1.2). Dessa data hade följande värden för lägsta intensitet: 2556, median: 3441 och högsta intensitet: 32125. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Översikt över mittlinjespårning - Mittlinjen för den enskilda cellen erhålls genom att beräkna dess skelett (vitt). Spetsen (magenta) extrapoleras linjärt från de sista punkterna i slutet av skelettet (steg 1.3). I denna komposition är både mittlinjen och dess spets överlagrade över den ursprungliga cellen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Timelapses kymografer - Jämförelse av kymograferna för varje kanal som genereras med "complete_skeletonization" avstängd (steg 1.4). Den lodräta axeln beskriver tidens förlopp och den vågräta axeln ritar den genomsnittliga intensiteten för den extrapolerade mittlinjebanan följt av en enda cell. För just dessa data representerar färgkartan följande värden för kanal 1 lägsta intensitet: 2886, median: 3167, högsta intensitet: 21021. Kanal 2 Lägsta intensitet: 3030, Median: 3400, Högsta intensitet: 29688. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Utjämning av bakgrundströskel – Tröskelvärdet för bakgrundssegmentering uppskattas via isodataalgoritmen och utjämnas sedan via lokal polynomregression (steg 1.5). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Ratiometriska resultat- (A) Jämförelse mellan den sista bildrutan i den ratiometriska timelapsen och den segmenterade ursprungliga första kanalen. (B) Kymograf genererad från den ratiometriska timelapse (steg 1.5). Klicka här för att se en större version av denna figur.
2. Protokoll för batchläge
- Ladda ned och placera filen pipeline.py från AMEBaS GitHub-lagringsplatsen i samma katalog som data.
- Skriv in filplatsen på kommandoraden efter programfilen.
- Inkludera - -v som ett positionsargument för att visa de interna stegen i pipelinen, om du vill.
- Inkludera --s för att välja i sigma-värdet som används i förbehandlingssteget för gaussiskt filter som förberedelse för cellsegmentering. Standardvärdet är 2.
- Inkludera - -a för att spåra mittlinjen för varje bildruta i tidsfördröjningen. Som standard använder pipelinen bara den sista bildrutan.
- Inkludera - -f för att välja bråket [0,1] av skelettet som ska användas i interpolationen. Standardvärdet är 0,25.
- Inkludera -e för att välja längden i pixlar för det extrapolerade skelettet. Standardvärdet är -1, vilket förlänger skelettet upp till närmaste kant.
- Inkludera -- sf för att välja den del av färgintervallet som ska flyttas till bakgrunden i icke-extrapolerade kymografer. Standardvärdet är 0,7.
- Inkludera - -k för att bestämma storleken på kärnan som används i kymografens Gaussiska filtrering. Standardvärdet är 3.
- Inkludera -- eb för att uppskatta intensiteten för det globala bakgrundströskelvärdet via polynomregression för LOESS-polynomregression av de bildrutespecifika bakgrundströskelintensiteterna.
- Anpassa antalet punkter som används i LOESS-utjämning av bakgrundströskelvärdena genom att ändra parametern - -n. Standardvärdet är 40.
- Byt kanal som används som täljare och nämnare under kvotberäkningar, inklusive - r eller - -switch_ratio, om timelapsen har två kanaler. Som standard är den andra kanalen täljaren och den första nämnaren.
- Välj om kvottimelapsen måste jämnas ut ytterligare med ett medianfilterpass med argumentet --sm . Standardvärdet är False.
- Inkludera -o för att avvisa pixlar med onormal intensitet under generering av ratiometrisk time-lapse .
- Välj om bakgrunden i ratiometrisk utmatning måste exporteras med argumentet - -b. Standardvärdet är False, vilket ersätter det med nollor.
- Tryck på enter för att köra. Utdata genereras i samma katalog som programfilen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AMEBaS-pipelinen automatiserar extraktionen av mittlinjedynamiken hos polariserade enskilda celler från fluorescensmikroskopibilder, vilket gör den mindre tidskrävande och mindre benägen för mänskliga fel. Metoden kvantifierar dessa tidsförlopp genom att generera kymografer och ratiometriska bildstaplar (Figur 1) i växande enskilda celler. Den kan justeras för att fungera på migrerande enstaka celler, men ytterligare experiment är nödvändiga. AMEBaS implementeras i Python som en interaktiv Jupyter Notebook (beskrivs i avsnittet Interaktivt notebook-protokoll), vilket möjliggör enklare användning utan att det krävs programmeringserfarenhet, och som ett kommandoradsverktyg (i avsnittet Batchlägesprotokoll), där flera stackar kan analyseras med samma parameteruppsättning. Även om antingen en eller två fluorescenskanaler kan användas, bör ratiometriska sonder med två emissionskanaler ge mer tillförlitliga resultat eftersom fluorescensemissionen av sondens obundna tillstånd kan lindra den rumsliga heterogeniteten som orsakas av den ojämna fördelningen av proteinet i cytoplasman.
Pipelinen ger först en binär mask av den största cellen på den starkaste kanalen, exporterad som en tif-fil med namnet Filename_binary_mask.tiff (figur 2). Tröskelvärden som erhålls med isodata för varje kanal utjämnas eventuellt med lössjord och sparas i tabellen Filename_background_treshold.csv (figur 5). Cellens mittlinje, extraherad från den binära masken, exporteras som en tif-fil med namnet Filename_skeletonized.tiff (figur 3). Kymografer för varje kanal produceras från mittlinjen, benämnd Filename_kymograph_c_*.csv, där * motsvarar kanalnumret (figur 4). Slutligen sparas en ratiometrisk kymograf som Filename_kymograph_ratio.csv, medan den fullständiga ratiometriska stacken namnges Filename_ratiometric.tiff (figur 6). Diagram som motsvarar figur 2, figur 3, figur 4, figur 5 och figur 6 kan eventuellt sparas som PNG-filer när "verbose == True" eller "--v" anges av användaren i det första kodsegmentet (steg 1.1).
Dessa resultat kan kopplas till andra bildanalyspipelines för att ytterligare undersöka cellens spatiotemporala dynamik, såsom CHUKNORRIS8, som tar kymograferna för varje kanal som indata och utför tillväxthastighetsanalys med subpixelupplösning, tillsammans med olika tidsserieanalysmetoder.
AMEBaS testades på pollenrörsdata med genetiskt kodade ratiometriska fluorescerande rapportörer för intracellulärt Ca2+ (CaMeleon; Figur 7A,B) och H+ (pHluorin; Figur 7C,D) koncentrationer erhållna på ett optiskt fluorescensmikroskop, samt maximal intensitetsprojektion av cpVenus/CFP-förhållanden för växande rothår som uttrycker CaMeleon NES-YC3.6 (Figur 7E,F) erhållen på ett light-sheet-mikroskop som tidigare beskrivits 15,16. Pipelinen fungerade framgångsrikt trots skillnader i tillväxtriktning, avbildningstekniker, fluorescerande rapportörer och celltyper. Segmentering, mittlinjespårning och kymografextraktion visas för dessa datauppsättningar (figur 7), vilket visar potentialen för att tillämpa AMEBaS på ett brett spektrum av experimentella uppställningar.
Figur 7: Representativa resultat för olika fluorescensbilddatauppsättningar av spetsväxandeceller. (A,B) Pollenrör som uttrycker Ca2+ reporter CaMeleon; (C,D) Pollenrör som uttrycker pH-indikatorn pHluorin; (E,F) Rothår som uttrycker Ca2+ reporter NES-YC3.6. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande kodningsfil 1: AMEBaS-main.zip. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nya metoden som presenteras här är ett kraftfullt verktyg för att effektivisera och automatisera analysen av fluorescensmikroskopibilder av polariserade celler. Nuvarande metoder som beskrivs i litteraturen, såsom ImageJ Kymograph-plugins, kräver manuell spårning av mittlinjen i den polariserade cellen av intresse, en uppgift som inte bara är tidskrävande utan också utsatt för mänskliga fel. Eftersom definitionen av mittlinjen i denna pipeline stöds av en numerisk metod18,19 som utför skelettering, tas subjektiv utvärdering bort, vilket introducerar en kvantitativ standard för proceduren. Detta är särskilt användbart för forskare med stora mängder data, med möjlighet att anpassa pipelinen till olika krav, inklusive att extrahera mittlinjen för varje bildruta. Dessutom är subtraktionen av bakgrundsvärden ofta godtycklig, med ett enda bakgrundsvärde som väljs för hand för alla bildrutor i en given kanal. Här används isodatasegmentering för att objektivt bestämma bakgrundströskeln för varje bildruta, och jämna ut den (valfritt) med en lokal polynomregression för att fånga långsiktiga förändringar i fluorescens orsakad av blekning (fotoblekning). Medan möjliga artefakter och sekundära element ignoreras i bakgrunden genom att välja det större objektet per pixelområde, kan andra metoder som FRET-IBRA12 användas för att ta bort effekter som skuggning. Rumsliga artefakter (till exempel skuggning) kan påverka formen på cellen som segmenteras genom tröskelvärde, vilket kan förklara gradientens bias mot ena sidan av röret som visas i den ratiometriska filmen som visas på AMEBaS-logotypen (se GitHub-sidan eller Colab-anteckningsboken).
Icke desto mindre finns det fortfarande några situationer där den presenterade rörledningen kan misslyckas och inte bör betraktas som en silverkulalösning. Särskild uppmärksamhet måste ägnas vid bildtagning eftersom stora störningar kan försämra algoritmens förmåga att segmentera målcellen. Förbehandling av bildstapeln bör övervägas för optimala resultat, ta bort oönskade element och övergripande felaktiga ramar.
Parametrar valdes som syftade till att analysera enstaka apikalt växande celler med hänsyn till begränsad datamängd av Arabidopsis pollenrör som analyserade jonkoncentrationer med fluorescerande rapportörer. Således kan andra data kräva förnuftiga val av parametrar. Förbearbetningsfilter jämnar ut data med målet att skapa en ren binär mask efter segmentering (steg 1.2), så sigmavärdet som används för de gaussiska filtren och medianfiltren kan ökas för bullrigare data eller minskas om resultaten är alltför utjämnade. Placeringen av den binära masken som erhålls i den starkaste kanalen antas vara densamma som den svagaste kanalen, vilket kan vara ett problem om cellplatsen inte är densamma i båda kanalerna. Om så är fallet måste antingen olika masker användas för varje kanal eller så måste bildregistrering utföras, som görs i FRET-IBRA12.
Skelettisering görs uteslutande i den sista bilden (steg 1.3) som standard, vilket förutsätter en spetsväxande cell som bibehåller platsen för sin cytoplasma över tid (annat än vid toppen). Genom att förlänga skelettet är det möjligt att generera kymografer som möjliggör analys av tillväxthastigheten, även med subpixelupplösning, med hjälp av metoder som CHUKNORRIS8. Denna förlängning görs genom linjär extrapolering med hänsyn till de första 25 %-punkterna i skelettets växande spets (steg 1.3) och kan justeras genom att justera interpolation_fraction från 0 % till 100 %-punkter för hela skelettet. Men om cellen glider i plats mellan ramar eller är en migrerande cell blir analysen av tillväxthastigheten mer komplex. I ett sådant scenario kan oberoende skelett genereras för varje bildruta med valet av parametrar complete_skeletonization=TRUE, vilket kommer att producera skelett utan extracellulär förlängning. Det skulle fortfarande vara möjligt att analysera tillväxthastigheten, men upplösningen skulle begränsas av den binära masken som produceras med isodatatröskelvärde. Dessutom antar den resulterande kymografen att på varandra följande skelett kan justeras efter sina standardkoordinater, vilket, om det inte är sant, gör den olämplig för att analysera intracellulär dynamik.
Vid generering av kymografer (steg 1.4) använder AMEBaS medelvärdesberäkning med en gaussisk kärna istället för att använda den traditionella pixelmarginalen runt mittlinjen. Standardvärdet för 3x3 är den minsta möjliga storleken, som kan ökas om data är för bullriga och/eller om cellen är stor. Detta steg kan dock orsaka överutjämning, i vilket fall filtret bör stängas av helt genom att ställa in kymograph_kernel = 0. Slutligen kan den uppskattade bakgrunden för varje bildruta i varje kanal jämnas ut när användaren förväntar sig blekning (fotoblekning) eller med hjälp av råa uppskattningar (steg 1.5). Utjämning av bakgrundsvärdena med LOESS-polynomregression (steg 1.5) kan justeras genom att ange antalet punkter som används i fönstret n_points till minst 3 och högst antalet bildrutor i stacken (begränsas automatiskt). En enklare funktion som beskriver bakgrundsförändringen över tid kan uppnås med ett större fönster, vilket ger en grövre passning.
Eftersom denna metod konsoliderar flera manuella steg som vanligtvis utförs av forskare, är AMEBaS-pipelinen ett mer effektivt, opartiskt och exakt tillvägagångssätt för att analysera det spatiotemporala beteendet hos enstaka polariserade cell-time-lapses. I framtiden har denna metod potential att utvidgas till att stödja analys av migrerande enskilda celler. Dessutom krävs ytterligare analyser för att bedöma metodens prestanda över ett bredare spektrum av celltyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna till detta manuskript deklarerar inga konkurrerande ekonomiska intressen eller andra intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma för FAPESP-anslagen 2015/22308-2, 2019/23343-7, 2019/26129-6, 2020/06744-5, 2021/05363-0, CNPq, NIH R01 grant GM131043 och NSF-bidragen MCB1714993, MCB1930165 för ekonomiskt stöd. Rothårsdata producerades med infrastrukturen och under överinseende av Prof. Andrea Bassi och Prof. Alex Costa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Github | Github | https://github.com/badain/amebas | |
| Google Colab | https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb |
References
- Drubin, D. G., Nelson, W. J.
- Wodarz, A., Näthke, I. Cell polarity in development and cancer. Nature Cell Biology. 9 (9), 1016-1024 (2007).
- Palanivelu, R., Preuss, D. Pollen tube targeting and axon guidance: parallels in tip growth mechanisms. Trends in Cell Biology. 10 (12), 517-524 (2000).
- Portes, M. T., et al. The Pollen Tube Oscillator: Integrating Biophysics and Biochemistry into Cellular Growth and Morphogenesis. Rhythms in Plants: Dynamic Responses in a Dynamic Environment. , Springer. Cham. (2015).
- Wudick, M. M., et al. CORNICHON sorting and regulation of GLR channels underlie pollen tube Ca2+ homeostasis. Science. 360 (6388), 533-536 (2018).
- Hoffmann, R. D., et al. Plasma membrane H+-ATPases sustain pollen tube growth and fertilization. Nature Communications. 11 (1), 1-15 (2020).
- Michard, E., et al. Glutamate receptor-like genes form Ca2+ channels in pollen tubes and are regulated by pistil D-serine. Science. 332 (6028), 434-437 (2011).
- Damineli, D. S., Portes, M. T., Feijó, J. A. Oscillatory signatures underlie growth regimes in Arabidopsis pollen tubes: computational methods to estimate tip location, periodicity, and synchronization in growing cells. Journal of Experimental Botany. 68 (12), 3267-3281 (2017).
- Li, K., et al. An optimized genetically encoded dual reporter for simultaneous ratio imaging of Ca2+ and H+ reveals new insights into ion signaling in plants. New Phytologist. 230 (6), 2292-2310 (2021).
- Sadoine, M., et al. Designs, applications, and limitations of genetically encoded fluorescent sensors to explore plant biology. Plant Physiology. 187 (2), 485-503 (2021).
- Grenzi, M., et al. Illuminating the hidden world of calcium ions in plants with a universe of indicators. Plant Physiology. 187 (2), 550-571 (2021).
- Munglani, G., Vogler, H., Grossniklaus, U. Fast and flexible processing of large FRET image stacks using the FRET-IBRA toolkit. PLoS Computational Biology. 18 (4), 1009242 (2022).
- Ridler, T., Calvard, S. Picture thresholding using an iterative selection method. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 8 (8), 630-632 (1978).
- Portes, M. T., Feijó, J. Growing Arabidopsis pollen tubes expressing genetically encoded reporters for calcium and pH. , (2023).
- Candeo, A., Doccula, F. G., Valentini, G., Bassi, A., Costa, A. Light sheet fluorescence microscopy quantifies calcium oscillations in root hairs of Arabidopsis thaliana. Plant & Cell Physiology. 58 (7), 1161-1172 (2017).
- Romano Armada, N., et al. In vivo light sheet fluorescence microscopy of calcium oscillations in Arabidopsis thaliana. Methods in Molecular Biology. 1925, 87-101 (2019).
- Krebs, M., et al. FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca2+ dynamics. The Plant Journal. 69 (1), 181-192 (2012).
- Lee, T. -C., Kashyap, R. L., Chu, C. -N. Building skeleton models via 3-D medial surface axis thinning algorithms. CVGIP: Graphical Models and Image Processing. 56 (6), 462-478 (1994).
- Nunez-Iglesias, J., Blanch, A. J., Looker, O., Dixon, M. W., Tilley, L. A new Python library to analyse skeleton images confirms malaria parasite remodelling of the red blood cell membrane skeleton. PeerJ. 6, 4312 (2018).
