Summary
غالبا ما تكون الطرق الحالية لتحليل الديناميات داخل الخلايا للخلايا المفردة المستقطبة يدوية وتفتقر إلى التوحيد القياسي. تقدم هذه المخطوطة خط أنابيب جديدا لتحليل الصور لأتمتة استخراج خط الوسط للخلايا المستقطبة المفردة وتحديد السلوك الزماني المكاني من الفترات الزمنية في واجهة سهلة الاستخدام عبر الإنترنت.
Abstract
قطبية الخلية هي ظاهرة عيانية أنشأتها مجموعة من الجزيئات والهياكل المركزة مكانيا والتي بلغت ذروتها في ظهور مجالات متخصصة على المستوى دون الخلوي. يرتبط بتطوير الهياكل المورفولوجية غير المتماثلة التي تكمن وراء الوظائف البيولوجية الرئيسية مثل انقسام الخلايا والنمو والهجرة. بالإضافة إلى ذلك ، تم ربط اضطراب قطبية الخلية بالاضطرابات المرتبطة بالأنسجة مثل السرطان وخلل التنسج المعدي.
غالبا ما تتضمن الطرق الحالية لتقييم الديناميات الزمانية المكانية لمراسلي الفلورسنت في الخلايا المستقطبة الفردية خطوات يدوية لتتبع خط الوسط على طول المحور الرئيسي للخلايا ، والذي يستغرق وقتا طويلا وعرضة للتحيزات القوية. علاوة على ذلك ، على الرغم من أن التحليل النسبي يمكن أن يصحح التوزيع غير المتكافئ لجزيئات المراسل باستخدام قناتين مضان ، إلا أن تقنيات الطرح الخلفية غالبا ما تكون تعسفية وتفتقر إلى الدعم الإحصائي.
تقدم هذه المخطوطة خط أنابيب حسابي جديد لأتمتة وقياس السلوك الزماني المكاني للخلايا المفردة باستخدام نموذج لقطبية الخلية: أنبوب حبوب اللقاح / نمو شعر الجذر وديناميكيات الأيونات الخلوية. تم تطوير خوارزمية من ثلاث خطوات لمعالجة الصور التناسبية واستخراج تمثيل كمي للديناميكيات داخل الخلايا والنمو. تقوم الخطوة الأولى بتقسيم الخلية من الخلفية ، مما ينتج قناعا ثنائيا من خلال تقنية الحد الأدنى في مساحة كثافة البكسل. الخطوة الثانية تتبع مسارا عبر خط الوسط للخلية من خلال عملية الهيكل العظمي. أخيرا ، توفر الخطوة الثالثة البيانات المعالجة كفاصل زمني نسبي وتنتج كيموغراف نسبي (أي ملف تعريف مكاني 1D عبر الزمن). تم استخدام البيانات من الصور النسبية التي تم الحصول عليها باستخدام مراسلي الفلورسنت المشفرة وراثيا من أنابيب حبوب اللقاح المتنامية لقياس الطريقة. يسمح خط الأنابيب هذا بتمثيل أسرع وأقل تحيزا وأكثر دقة للديناميكيات الزمانية المكانية على طول خط الوسط للخلايا المستقطبة ، وبالتالي تطوير مجموعة الأدوات الكمية المتاحة للتحقيق في قطبية الخلية. الكود المصدري AMEBaS Python متاح على: https://github.com/badain/amebas.git
Introduction
قطبية الخلية هي عملية بيولوجية أساسية يتوج فيها العمل المتضافر لمجموعة من الجزيئات والهياكل المركزة مكانيا بإنشاء مجالات تحت خلوية مورفولوجية متخصصة1. يعتمد انقسام الخلايا ونموها وهجرتها على مواقع القطبية هذه ، في حين ارتبط فقدانها بالسرطان في الاضطرابات المرتبطة بالأنسجة الظهارية2.
تعد الخلايا النامية قميا مثالا مثيرا على القطبية ، حيث يقوم موقع القطبية عند الطرف عادة بإعادة التوجيه إلى إشارات خارج الخلية3. وتشمل هذه الخلايا العصبية النامية ، والخيوط الفطرية ، وشعيرات الجذر ، وأنابيب حبوب اللقاح ، حيث تظهر العمليات الخلوية المتعددة اختلافات واضحة من طرف الخلية نحو الساق. في أنابيب حبوب اللقاح ، على وجه الخصوص ، يتم استقطاب بلمرة الأكتين ، والاتجار بالحويصلة ، والتركيزات الأيونية بشكل ملحوظ ، مما يدل على التدرجات التي تركز على الطرف4. أنابيب حبوب اللقاح هي النباتات المشيجية الذكرية للنباتات المزهرة، وهي مسئولة عن توصيل المنوية إلى البويضة عن طريق النمو حصريا في قمة الخلية بأحد أسرع معدلات النمو المعروفة للخلية الواحدة. تلعب التدرجات التي تركز على الأطراف للأيونات مثل الكالسيوم 5 (Ca2+) والبروتونات 6 (H +) دورا رئيسيا في الحفاظ على نمو أنبوب حبوب اللقاح ، وهو أمر ضروري لإنجاز وظيفته البيولوجية الرئيسية التي تبلغ ذروتها في الإخصاب المزدوج 5,6. وبالتالي ، فإن الطرق الكمية لتحليل الديناميات الزمانية المكانية على طول خط الوسط للخلايا النامية قميا ضرورية للتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء النمو المستقطب7،8،9. غالبا ما يستخدم الباحثون أجهزة القياس الكمي ، أي مصفوفة تمثل كثافة البكسل لخط وسط الخلية (على سبيل المثال ، الأعمدة) عبر الوقت (على سبيل المثال ، الصفوف) ، مما يسمح بتصور نمو الخلية وهجرتها في القطر (الشكل 1). على الرغم من فائدتها ، يتم استخراج أجهزة التصوير المكي في كثير من الأحيان عن طريق تتبع خط الوسط يدويا ، كونها عرضة للتحيزات والأخطاء البشرية بينما تكون أيضا شاقة إلى حد ما. وهذا يستدعي طريقة آلية لاستخراج خط الوسط وهي الميزة الأولى لخط الأنابيب الذي تم تقديمه هنا باسم AMEBaS: سحب Utomatic Midline Extraction و Background Sللفترات الزمنية الفلورية النسبية للخلايا المفردة المستقطبة.
من حيث الإجراءات التجريبية ، يمكن تحقيق التصوير الكمي للأيونات / الجزيئات / الأنواع ذات الأهمية في الخلايا المفردة باستخدام مجسات الفلورسنت المشفرة وراثيا10. من بين الخيارات الآخذة في التوسع باستمرار ، تعد مجسات القياس النسبي واحدة من أكثر الخيارات دقة لأنها تنبعث منها أطوال موجية مضان مختلفة عندما تكون مرتبطة / غير مرتبطة بالجزيئات محل الاهتمام11. وهذا يسمح بتصحيح عدم التجانس المكاني في التركيز داخل الخلايا للمسبار باستخدام نسبة قناتين مع طرح خلفية محددة بقناتهما. ومع ذلك ، يمكن أن يكون تقدير عتبة الخلفية لكل قناة ونقطة زمنية مهمة معقدة لأنها غالبا ما تختلف في المساحة بسبب تأثيرات مثل التظليل ، حيث يكون لزوايا الصورة تباين في اللمعان بالنسبة للمركز ، وفي الوقت المناسب بسبب تلاشي الفلوروفور (التبييض الضوئي)12. على الرغم من وجود العديد من الطرق الممكنة ، تقترح هذه المخطوطة تحديد كثافة الخلفية تلقائيا باستخدام عتبة التجزئة التي تم الحصول عليها باستخدام خوارزمية Isodata13 ، والتي يتم بعد ذلك تنعيمها عبر الإطارات من خلال الانحدار متعدد الحدود كمعيار. ومع ذلك ، تم تجاهل المكونات المكانية الناتجة عن عدم التجانس الفلوري غير المرتبط بالخلية المستهدفة التي تمت إزالتها في12 ، بهذه الطريقة. يمكن إجراء العتبة التلقائية بعدة طرق ، لكن خوارزمية Isodata أنتجت أفضل النتائج تجريبيا. وبالتالي ، فإن الطرح التلقائي لقيمة الخلفية وحساب قياس النسبة هما السمة الرئيسية الثانية ل AMEBaS (الشكل 1) ، والتي ، مجتمعة ، تتلقى كمدخلات كومة من صور المجهر الفلوري ثنائي القناة ، وتقدر خط الوسط للخلية والخلفية الخاصة بالقناة ، وتخرج kymographs لكلتا القناتين ونسبتهما (الإخراج الرئيسي #1) بعد طرح الخلفية ، والتنعيم ، وإزالة القيم الخارجية ، جنبا إلى جنب مع كومة من الصور ratiometric (الإخراج الرئيسي # 2).
تم اختبار AMEBaS باستخدام الفترات الزمنية الفلورية لأنابيب حبوب لقاح Arabidopsis المتنامية التي تم الحصول عليها تحت المجهر ، إما باستخدام مستشعرات Ca2+ (CaMeleon) 8 أو الأس الهيدروجيني (pHluorin) 6 المعبر عنها تحت محفز LAT52 الخاص بحبوب اللقاح. تم التقاط الصور من كل قناة كل 4 ثوان مقترنة بمجهر مقلوب ، وكاميرا بإضاءة أمامية (2560 بكسل × 2160 بكسل ، وحجم بكسل 6.45 ميكرومتر) ، وإضاءة مضان ، وعدسة موضوعية للغمر المائي 63x ، 1.2NA. كانت إعدادات المرشحات المستخدمة ل CaMeleon هي: الإثارة 426-450 نانومتر (CFP) و 505-515 نانومتر (YFP) ، والانبعاثات 458-487 نانومتر (CFP) و 520-550 نانومتر (YFP) ، بينما بالنسبة ل pHluorin ، الإثارة 318-390 نانومتر (DAPI) و 428-475 نانومتر (FITC) ، الانبعاث 435-448 نانومتر (DAPI) و 523-536 نانومتر (FITC). تمت إضافة مجموعة بيانات كاملة للاختبار في Zenodo (DOI: 10.5281 / zenodo.7975350) 14.
بالإضافة إلى ذلك ، تم اختبار خط الأنابيب باستخدام بيانات شعر الجذر ، حيث تم إجراء التصوير باستخدام مجهر ورقة ضوئية (SPIM) كما هو موضح سابقا15,16 مع شعيرات جذر Arabidopsis التي تعبر عن مراسل Ca2+ المشفر وراثيا NES-YC3.6 تحت سيطرة مروج UBQ10 17. سمح برنامج LabView محلي الصنع الذي يتحكم في الحصول على الكاميرا وترجمة العينات ومصراع مجهر ورقة الضوء بمراقبة قناتي cpVenus و CFP ، ولكن أيضا تصور نسبتهما في الوقت الفعلي. تمثل كل صورة نسبة للفاصل الزمني إسقاطا أقصى كثافة (MIP) بين صور قنوات الفلورسنت cpVenus و CFP التي تم الحصول عليها من 15 شريحة من العينة متباعدة بمقدار 3 ميكرومتر. تم حفظ نسبة cpVenus / CFP ذات الفاصل الزمني ل MIPs واستخدامها مباشرة لتحليل AMEBaS.
على الرغم من أن خط الأنابيب هذا يمكن أن يعمل مع أنواع متعددة من الخلايا النامية والمهاجرة ، فقد تم تصميمه خصيصا لتحليل الخلايا النامية التي تنمو حصريا عند الطرف ، مثل أنابيب حبوب اللقاح ، والشعيرات الجذرية ، والخيوط الفطرية ، حيث يوجد تطابق للمناطق السيتوبلازمية غير النامية بين الإطارات. في حالة عدم وجود مثل هذه المراسلات ، يجب على المستخدم اختيار خيار complete_skeletonization في الخطوة 1.3.1.1 (انظر قسم المناقشة لمزيد من التفاصيل).
الشكل 1: نظرة عامة على سير عمل خط الأنابيب. يحلل خط أنابيب AMEBaS ويعالج الفترات الزمنية المجهرية في ثلاث خطوات رئيسية: تجزئة الخلية الواحدة ، وتتبع خط الوسط ، وتوليد الكيموغراف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. بروتوكول دفتر الملاحظات التفاعلي
يمكن استخدام دفتر ملاحظات Jupyter مباشرة على الويب باستخدام Google Colab في https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb ، حيث تستند الإرشادات أدناه. بدلا من ذلك ، يتوفر دفتر Jupyter في https://github.com/badain/amebas ، حيث يمكن تنزيله وتكوينه للتشغيل محليا في Jupyter (يمكن أن يوفر Anaconda عملية تثبيت سهلة وعبر الأنظمة الأساسية). يمكن العثور على بيانات اختبار كاملة في Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7975350) ، تحتوي على بيانات أحادية ومزدوجة القناة لأنابيب حبوب اللقاح Arabidopsis التي تعبر إما عن الرقم الهيدروجيني أو Ca2+ مراسلين 14. تم تقسيم خط الأنابيب إلى أجزاء ، حيث يمكن تنفيذ كل خطوة من خلال النقر على زر التشغيل بعد تعيين الخيارات الخاصة بالمستخدم. الملفات اللازمة لهذه الدراسة متاحة في AMEBaS- المجلد المضغوط الرئيسي (ملف الترميز التكميلي 1).
- افتح دفتر Jupyter واقرأ ملفات الفاصل الزمني.
- انتقل إلى الصفحة الرئيسية لدفتر الملاحظات التفاعلي في Google Colab المشار إليه أعلاه أو قم بتنزيل وفتح دفتر ملاحظات AMEBaS_Local.ipynb من GitHub.
- قم بإعداد إعداد الدليل لبيانات الإدخال والإخراج:
- في حالة استخدام الإصدار المحلي ، ضع الفاصل الزمني الفلوري كملف TIFF أو ملف DV داخل مجلد باسم البيانات التي يجب أن تكون في المجلد الجذر للبرنامج. يجب إنشاء مجلد مسمى لتلقي البيانات التي تم إنشاؤها. ثم قم بتشغيل كتلة رمز الإعداد.
- إذا كنت تستخدم دفتر الملاحظات على Google Colab ، فقم بتشغيل كتلة رمز الإعداد لإنشاء مجلدات البيانات والمجلدات الصادرة تلقائيا.
- قم بتشغيل كتلة التعليمات البرمجية لإدخال الملف لقراءة بيانات الفاصل الزمني بالنقر فوق زر التشغيل . إذا كنت تستخدم إصدار Google Colab من دفتر الملاحظات ، فانقر فوق الزر اختيار ملف لتحميل ملف الفاصل الزمني مباشرة إلى مجلد البيانات .
ملاحظة: سيتم اكتشاف عدد القنوات تلقائيا بناء على أبعاد الصورة. - اختر ما إذا كان سيتم إنشاء مخرجات إضافية لكل خطوة عن طريق تعيين المعلمة "مطولة" إلى صواب أو خطأ.
- كشف الخلية الرئيسية والجزء من الخلفية (الشكل 2).
- قم بتشغيل كتلة التعليمات البرمجية لتجزئة الخلية المفردة لفصل الخلية ذات الأهمية تلقائيا عن الخلفية بالنقر فوق زر التشغيل .
ملاحظة: سيتم تطبيق المرشحات المتوسطة والغاوسية كخطوة معالجة مسبقة لإزالة الضوضاء غير المرغوب فيها قبل تقسيم المقدمة من الخلفية عن طريق عتبة Isodata وعزل منطقة أكبر منطقة لإزالة القطع الأثرية غير المرغوب فيها.- اضبط قيمة سيجما المستخدمة من قبل Gaussian في متغير "sigma" لضبط نعومة قناع التجزئة. القيمة الافتراضية هي 2.0.
- اضبط تقدير المتغير على False لتخزين الحد المقدر من Isodata مباشرة أو إلى True لتنعيمه عبر الإطارات المجاورة باستخدام الانحدار متعدد الحدود المحلي (LOESS). صقل وظيفتها عن طريق تغيير متغير n_points . القيمة الافتراضية هي 40.
- قم بتشغيل كتلة التعليمات البرمجية لتجزئة الخلية المفردة لفصل الخلية ذات الأهمية تلقائيا عن الخلفية بالنقر فوق زر التشغيل .
- تتبع خط الوسط على طول امتداد الخلية (الشكل 3).
- قم بتشغيل كتلة التعليمات البرمجية لتتبع خط الوسط للخلية بالنقر فوق زر التشغيل لهيكلة الخلية تلقائيا باستخدام طريقة لي18 وتمديد طرف الهيكل العظمي الأخير من خلال الاستقراء الخطي.
- اختر تتبع خط الوسط فقط على الإطار الأخير أو مرة واحدة لكل إطار بضبط وسيطة complete_skeletonization .
ملاحظة: عندما يتم هيكل عظمي لجميع الإطارات، يتم تخطي الاستقراء. - اضبط جزء النقاط في الهيكل العظمي المراد استيفاءه أثناء الاستقراء عن طريق ضبط المتغير interpolation_fraction . القيمة الافتراضية هي 0.25.
- اختر طول استقراء خط الوسط عن طريق تغيير extrapolation_length المتغير. الافتراضي هو -1 ، والذي يمتد الهيكل العظمي حتى أقرب حافة.
- اختر تتبع خط الوسط فقط على الإطار الأخير أو مرة واحدة لكل إطار بضبط وسيطة complete_skeletonization .
- قم بتشغيل كتلة التعليمات البرمجية لتتبع خط الوسط للخلية بالنقر فوق زر التشغيل لهيكلة الخلية تلقائيا باستخدام طريقة لي18 وتمديد طرف الهيكل العظمي الأخير من خلال الاستقراء الخطي.
- قم بإنشاء مخططات كيموجرافية لكل قناة ( الشكل 4).
- قم بتشغيل أول كتلة رمز لتصور البيانات بالنقر فوق زر التشغيل لإنشاء صور كيموجرافية تلقائيا لكلتا القناتين.
- اختر حجم النواة الغاوسية المستخدمة للتنعيم عن طريق ضبط kymograph_kernel المتغير.
ملاحظة: يتوافق مع حجم الحي (بالبكسل) الذي يتم حساب متوسط كثافة البكسل فوقه. الافتراضي هو 3 بكسل × 3 بكسل. - تولد الهياكل العظمية غير الممتدة مخططات Kymographs مغطاة يجب أن تستخدم خريطة ألوان مخصصة لعرض شدتها بشكل صحيح. اختر النسبة المئوية للكسر من الشدة التي سيتم تعيينها للون الخلفية ، أسود ، واضبط متغير shift_fraction . القيمة الافتراضية هي 0.7.
- اختر حجم النواة الغاوسية المستخدمة للتنعيم عن طريق ضبط kymograph_kernel المتغير.
- قم بتشغيل أول كتلة رمز لتصور البيانات بالنقر فوق زر التشغيل لإنشاء صور كيموجرافية تلقائيا لكلتا القناتين.
- احسب النسبة بين القنوات (الشكل 5).
- قم بتشغيل كتلة رمز تصور البيانات الثانية بالنقر فوق زر التشغيل لإنشاء كيموغراف نسبي وفاصل زمني نسبي تلقائيا (الشكل 6).
ملاحظة: لا تتوفر هذه الخطوة إلا عند استخدام اللقطات المتتابعة ثنائية القناة. يتم طرح عتبة كثافة الخلفية المخزنة في الخطوة 1.2.1.2 من كل قناة.- اضبط المتغير switch_ratio لتبديل ترتيب القنوات المستخدمة كبسط ومقام أثناء حسابات النسبة. الافتراضي هو خطأ.
- اختر ما إذا كان يجب زيادة سلاسة الفاصل الزمني للنسبة باستخدام مرشح متوسط عن طريق ضبط متغير smooth_ratio . الافتراضي هو خطأ.
- اختر ما إذا كنت تريد إزالة القيم المتطرفة الناتجة عن الإشارة المنخفضة لقناة المقام عن طريق معالجة متغير reject_outliers . الإعدادات الافتراضية إلى True وتعرف القيم المتطرفة على أنها قيم 1.5 ضعف النطاق الربيعي فوق الربع الثالث (حيث تقع 75٪ من القيم).
- اختر ما إذا كان يجب تصدير الخلفية في مخرجات القياس النسبي عن طريق ضبط background_ratio المتغير. الافتراضي هو False ، والذي يستبدله بالأصفار.
- قم بتشغيل كتلة رمز تصور البيانات الثانية بالنقر فوق زر التشغيل لإنشاء كيموغراف نسبي وفاصل زمني نسبي تلقائيا (الشكل 6).
الشكل 2: خطوة تجزئة الخلية الواحدة. تستخدم تقنيات معالجة الصور مثل التصفية والحدود وتسمية المنطقة لعزل إشارة الاهتمام (الخطوة 1.2). تحتوي هذه البيانات الخاصة على القيم التالية لأقل كثافة: 2556 ، الوسيط: 3441 ، وأعلى كثافة: 32125. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: نظرة عامة على تتبع خط الوسط - يتم الحصول على خط الوسط للخلية المفردة عن طريق حساب هيكلها العظمي (أبيض). يتم استقراء الطرف (أرجواني) خطيا من النقاط الأخيرة في نهاية الهيكل العظمي (الخطوة 1.3). في هذا التكوين ، يتم تراكب كل من خط الوسط وطرفه فوق الخلية الأصلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: أجهزة القياس الكمي الخاصة ب Timelapse - مقارنة بين أجهزة kymographs لكل قناة تم إنشاؤها مع إيقاف تشغيل "complete_skeletonization" (الخطوة 1.4). يصف المحور الرأسي تقدم الوقت ، ويرسم المحور الأفقي متوسط شدة مسار خط الوسط المستنبط متبوعا بخلية واحدة. بالنسبة لهذه البيانات المحددة ، تمثل خريطة الألوان القيم التالية للقناة 1 أدنى كثافة: 2886 ، الوسيط: 3167 ، أعلى كثافة: 21021. القناة 2 أدنى كثافة: 3030 ، المتوسط: 3400 ، أعلى كثافة: 29688. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تجانس عتبة الخلفية - يتم تقدير عتبة تجزئة الخلفية عبر خوارزمية isodata ثم يتم تنعيمها عبر الانحدار المحلي متعدد الحدود (الخطوة 1.5). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: نتائج القياس النسبي - (أ) مقارنة بين الإطار الأخير للفاصل الزمني النسبي والقناة الأولى الأصلية المجزأة. (ب) الكيموغراف الناتج عن الفاصل الزمني النسبي (الخطوة 1.5). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
2. بروتوكول وضع الدفعات
- قم بتنزيل pipeline.py الملف ووضعه من مستودع AMEBaS GitHub في نفس الدليل مثل البيانات.
- اكتب موقع الملف في سطر الأوامر بعد ملف البرنامج.
- قم بتضمين - -v كوسيطة موضعية لإظهار الخطوات الداخلية لخط الأنابيب، إذا رغبت في ذلك.
- قم بتضمين - -s للاختيار في قيمة سيجما المستخدمة في خطوة المعالجة المسبقة لمرشح Gaussian استعدادا لتجزئة الخلية. الافتراضي هو 2.
- قم بتضمين - -a لتتبع خط الوسط لكل إطار من الفاصل الزمني. بشكل افتراضي، يستخدم خط الأنابيب الإطار الأخير فقط.
- قم بتضمين - -f لاختيار الكسر [0,1] من الهيكل العظمي لاستخدامه في الاستيفاء. القيمة الافتراضية هي 0.25.
- قم بتضمين -e لاختيار الطول بالبكسل للهيكل العظمي المستنبط. الافتراضي هو -1 ، والذي يمتد الهيكل العظمي حتى أقرب حافة.
- قم بتضمين - -sf لاختيار جزء نطاق الألوان الذي سيتم نقله إلى الخلفية في أجهزة القياس الصوتي غير المستنبطة. القيمة الافتراضية هي 0.7.
- قم بتضمين - -k لتحديد حجم النواة المستخدمة في ترشيح kymograph Gaussian. الافتراضي هو 3.
- قم بتضمين - -eb لتقدير كثافة عتبة الخلفية العالمية عبر الانحدار متعدد الحدود LOESS لشدة عتبة الخلفية الخاصة بالإطار.
- قم بتخصيص عدد النقاط المستخدمة في تجانس LOESS لقيم عتبة الخلفية عن طريق تعديل المعلمة --n. القيمة الافتراضية هي 40.
- قم بتبديل القنوات المستخدمة كبسط ومقام أثناء حسابات النسبة، بما في ذلك - r أو - -switch_ratio، إذا كان الفاصل الزمني يحتوي على قناتين. بشكل افتراضي ، القناة الثانية هي البسط والأولى هي المقام.
- اختر ما إذا كان يجب تنعيم الفاصل الزمني للنسبة بشكل أكبر باستخدام تمرير عامل تصفية الوسيط باستخدام الوسيطة --sm . الافتراضي هو خطأ.
- قم بتضمين -o لرفض وحدات البكسل ذات الكثافة غير الطبيعية أثناء إنشاء الفاصل الزمني النسبي.
- اختر ما إذا كان يجب تصدير الخلفية في ناتج القياس النسبي باستخدام الوسيطة - -b. الافتراضي هو False ، والذي يستبدله بالأصفار.
- اضغط على Enter للتشغيل. سيتم إنشاء الإخراج في نفس الدليل مثل ملف البرنامج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يعمل خط أنابيب AMEBaS على أتمتة استخراج ديناميكيات خط الوسط للخلايا المفردة المستقطبة من مكدسات الصور المجهرية الفلورية ، مما يجعلها أقل استهلاكا للوقت وأقل عرضة للأخطاء البشرية. تحدد الطريقة هذه الفترات الزمنية عن طريق إنشاء مخططات كيموجرافية ومكدسات صور نسبية (الشكل 1) في الخلايا المفردة النامية. يمكن تعديله للعمل على ترحيل الخلايا المفردة ، ولكن من الضروري إجراء المزيد من التجارب. يتم تنفيذ AMEBaS في Python كدفتر ملاحظات Jupyter تفاعلي (موصوف في القسم بروتوكول دفتر الملاحظات التفاعلي) ، مما يسمح باستخدام أسهل دون الحاجة إلى خبرة في البرمجة ، وكأداة سطر أوامر (في قسم بروتوكول وضع الدفعات) ، حيث يمكن تحليل مكدسات متعددة بنفس مجموعة المعلمات. على الرغم من أنه يمكن استخدام قناة أو قناتين مضان ، إلا أن مجسات القياس النسبي مع قناتين للانبعاث يجب أن تسفر عن نتائج أكثر موثوقية لأن الانبعاث الفلوري للحالة غير المنضمة للمسبار يمكن أن يخفف من عدم التجانس المكاني الناجم عن التوزيع غير المتكافئ للبروتين في السيتوبلازم.
ينتج خط الأنابيب أولا قناعا ثنائيا لأكبر خلية على أقوى قناة ، يتم تصديره كملف tif باسم Filename_binary_mask.tiff (الشكل 2). يتم اختياريا تسوية تقديرات العتبة التي تم الحصول عليها باستخدام بيانات isodata لكل قناة باستخدام اللوس وحفظها في الجدول Filename_background_treshold.csv (الشكل 5). يتم تصدير خط وسط الخلية ، المستخرج من القناع الثنائي ، كملف tif باسم Filename_skeletonized.tiff (الشكل 3). يتم إنتاج Kymographs لكل قناة من خط الوسط ، المسمى Filename_kymograph_c_ * .csv ، حيث * يتوافق مع رقم القناة (الشكل 4). أخيرا ، يتم حفظ مقياس القياس النسبي ك Filename_kymograph_ratio.csv ، بينما يتم تسمية مكدس القياس النسبي الكامل Filename_ratiometric.tiff (الشكل 6). يتم حفظ المؤامرات المقابلة للشكل 2 والشكل 3 والشكل 4 والشكل 5 والشكل 6 اختياريا كملفات PNG عندما يتم تحديد "مطول == صحيح" أو "--v" من قبل المستخدم في جزء التعليمات البرمجية الأول (الخطوة 1.1).
يمكن إقران هذه النتائج بخطوط أنابيب تحليل الصور الأخرى لمزيد من التحقيق في الديناميكيات الزمانية المكانية للخلية ، مثل CHUKNORRIS8 ، الذي يأخذ الكيموجرافات لكل قناة كمدخل ويقوم بتحليل معدل النمو بدقة subpixel ، جنبا إلى جنب مع طرق تحليل السلاسل الزمنية المختلفة.
تم اختبار AMEBaS على مجموعات بيانات أنبوب حبوب اللقاح مع مراسلي الفلورسنت النسبي المشفر وراثيا ل Ca2+ داخل الخلايا (CaMeleon; الشكل 7A,B) وH+ (pHluorin; الشكل 7C ، D) التركيزات المكتسبة على مجهر مضان بصري ، بالإضافة إلى الإسقاط الأقصى لكثافة نسب cpVenus / CFP لنمو الشعيرات الجذرية التي تعبر عن CaMeleon NES-YC3.6 (الشكل 7E ، F) المكتسبة على مجهر ورقة ضوئية كما هو موضح سابقا 15,16. عمل خط الأنابيب بنجاح على الرغم من الاختلافات في اتجاه النمو وتقنيات التصوير ومراسلي الفلورسنت وأنواع الخلايا. يتم عرض التجزئة وتتبع خط الوسط واستخراج kymograph لمجموعات البيانات هذه (الشكل 7) ، مما يدل على إمكانية تطبيق AMEBaS على مجموعة واسعة من الإعدادات التجريبية.
الشكل 7: النتائج التمثيلية لمجموعات بيانات صور مضان مختلفة للخلايا النامية طرفا. (أ، ب) أنبوب حبوب اللقاح يعبر عن مراسل Ca2+ CaMeleon ؛ (ج، د) أنابيب حبوب اللقاح معبرة عن مؤشر الأس الهيدروجيني pHluorin ؛ (ه، و) الشعيرات الجذرية التي تعبر عن مراسل Ca2+ NES-YC3.6. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ملف الترميز التكميلي 1: AMEBaS-main.zip. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الطريقة الجديدة المعروضة هنا هي أداة قوية لتبسيط وأتمتة تحليل مكدسات الصور المجهرية الفلورية للخلايا المستقطبة. تتطلب الطرق الحالية الموضحة في الأدبيات ، مثل المكونات الإضافية ImageJ Kymograph ، تتبعا يدويا لخط الوسط للخلية المستقطبة محل الاهتمام ، وهي مهمة لا تستغرق وقتا طويلا فحسب ، بل إنها أيضا عرضة للأخطاء البشرية. نظرا لأن تعريف خط الوسط في خط الأنابيب هذا مدعوم بطريقة عددية18,19 تؤدي إلى الهيكل العظمي ، تتم إزالة التقييم الذاتي ، مما يقدم معيارا كميا للإجراء. هذا مفيد بشكل خاص للباحثين الذين لديهم كميات كبيرة من البيانات ، مع إمكانية تخصيص خط الأنابيب لمتطلبات مختلفة ، بما في ذلك استخراج خط الوسط لكل إطار. علاوة على ذلك ، غالبا ما يكون طرح قيمة الخلفية تعسفيا ، مع اختيار قيمة خلفية واحدة يدويا لجميع إطارات قناة معينة. هنا ، يتم استخدام تجزئة isodata لتحديد عتبة الخلفية لكل إطار بشكل موضوعي ، وتنعيمها (اختياريا) مع انحدار متعدد الحدود المحلي لالتقاط التغيرات طويلة المدى في التألق الناجم عن التلاشي (التبييض الضوئي). بينما يتم تجاهل القطع الأثرية والعناصر الثانوية المحتملة في الخلفية عن طريق تحديد الكائن الأكبر حسب مساحة البكسل ، يمكن استخدام طرق أخرى مثل FRET-IBRA12 لإزالة التأثيرات مثل التظليل. يمكن أن تؤثر القطع الأثرية المكانية (مثل التظليل) على شكل الخلية المجزأة عن طريق العتبة ، والتي قد تفسر تحيز التدرج نحو جانب واحد من الأنبوب الذي شوهد في فيلم القياس النسبي المميز على شعار AMEBaS (انظر صفحة GitHub أو دفتر ملاحظات كولاب).
ومع ذلك ، لا تزال هناك بعض الحالات التي قد يفشل فيها خط الأنابيب المقدم ولا ينبغي اعتباره حلا سحريا. يجب إيلاء اهتمام خاص أثناء التقاط الصورة لأن الاضطرابات الكبيرة يمكن أن تضعف قدرة الخوارزمية على تقسيم الخلية المستهدفة. يجب مراعاة المعالجة المسبقة لمكدس الصور للحصول على أفضل النتائج ، وإزالة العناصر غير المرغوب فيها والإطارات المعيبة بشكل عام.
تم اختيار المعلمات التي تهدف إلى تحليل الخلايا المفردة التي تنمو قميا مع الأخذ في الاعتبار مجموعة البيانات المحدودة لأنابيب حبوب اللقاح Arabidopsis التي تفحص التركيزات الأيونية مع مراسلي الفلورسنت. وبالتالي ، قد تتطلب البيانات الأخرى خيارات معقولة للمعلمات. تعمل مرشحات المعالجة المسبقة على تنعيم البيانات بهدف إنتاج قناع ثنائي نظيف بعد التجزئة (الخطوة 1.2) ، لذلك يمكن زيادة قيمة سيجما المستخدمة لمرشحات Gaussian والوسيط للبيانات الأكثر ضوضاء أو تقليلها إذا كانت النتائج سلسة بشكل مفرط. يفترض أن يكون موقع القناع الثنائي الذي تم الحصول عليه في أقوى قناة هو نفسه أضعف قناة ، مما قد يمثل مشكلة إذا لم يكن موقع الخلية هو نفسه في كلتا القناتين. إذا كانت هذه هي الحالة ، فيجب استخدام أقنعة مختلفة لكل قناة أو يجب إجراء تسجيل الصورة ، كما هو الحال في FRET-IBRA12.
يتم إجراء الهيكل العظمي حصريا في الإطار الأخير (الخطوة 1.3) افتراضيا ، والذي يفترض وجود خلية تنمو في الطرف تحافظ على موقع السيتوبلازم بمرور الوقت (بخلاف القمة). من خلال تمديد الهيكل العظمي ، من الممكن إنشاء مخططات كيموجرافية تسمح بتحليل معدل النمو ، حتى مع دقة البكسل الفرعي ، باستخدام طرق مثل CHUKNORRIS8. يتم هذا التمديد عن طريق الاستقراء الخطي مع الأخذ في الاعتبار أول 25٪ نقطة في الطرف المتنامي للهيكل العظمي (الخطوة 1.3) ويمكن ضبطه عن طريق ضبط interpolation_fraction من 0٪ إلى 100٪ من نقاط الهيكل العظمي بأكمله. ومع ذلك ، إذا انحرفت الخلية في الموقع بين الإطارات أو كانت خلية مهاجرة ، يصبح تحليل معدل النمو أكثر تعقيدا. في مثل هذا السيناريو ، يمكن إنشاء هياكل عظمية مستقلة لكل إطار مع اختيار المعلمات complete_skeletonization = TRUE ، والتي ستنتج هياكل عظمية بدون تمديد خارج الخلية. سيظل من الممكن تحليل معدل النمو ، لكن الدقة ستكون محدودة بالقناع الثنائي الناتج باستخدام عتبة isodata. علاوة على ذلك ، يفترض الميموغراف الناتج أنه يمكن محاذاة الهياكل العظمية المتتالية من خلال إحداثياتها الافتراضية ، والتي ، إن لم تكن صحيحة ، تجعلها غير مناسبة لتحليل الديناميات داخل الخلايا.
عند إنشاء أجهزة القياس البياني (الخطوة 1.4) ، يستخدم AMEBaS المتوسط باستخدام نواة Gaussian بدلا من استخدام هامش البكسل التقليدي حول خط الوسط. القيمة الافتراضية ل 3x3 هي أصغر حجم ممكن ، والتي يمكن زيادتها إذا كانت البيانات صاخبة جدا و / أو إذا كانت الخلية كبيرة. ومع ذلك ، قد تتسبب هذه الخطوة في الإفراط في التنعيم ، وفي هذه الحالة يجب إيقاف تشغيل الفلتر تماما عن طريق ضبط kymograph_kernel = 0. أخيرا ، يمكن تنعيم الخلفية المقدرة لكل إطار لكل قناة عندما يتوقع المستخدم التلاشي (التبييض الضوئي) أو باستخدام التقديرات الأولية (الخطوة 1.5). يمكن ضبط تجانس قيم الخلفية باستخدام انحدار LOESS متعدد الحدود (الخطوة 1.5) عن طريق تعيين عدد النقاط المستخدمة في n_points النافذة بحد أدنى 3 وحد أقصى لعدد الإطارات في المكدس (يتم تغطيتها تلقائيا). يمكن تحقيق وظيفة أبسط تصف تغيير الخلفية بمرور الوقت من خلال نافذة أكبر ، مما يؤدي إلى ملاءمة أكثر خشونة.
نظرا لأن هذه الطريقة تدمج خطوات يدوية متعددة يقوم بها الباحثون عادة ، فإن خط أنابيب AMEBaS هو أداة نهج أكثر كفاءة وغير متحيزة ودقيقة لتحليل السلوك الزماني المكاني للفواصل الزمنية للخلية المستقطبة المفردة. في المستقبل ، هذه الطريقة لديها القدرة على توسيعها لدعم تحليل الخلايا المفردة المهاجرة. علاوة على ذلك ، من الضروري إجراء مزيد من التحليل لتقييم أداء هذه الطريقة عبر مجموعة واسعة من أنواع الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن مؤلفو هذه المخطوطة عدم وجود مصالح مالية متنافسة أو تضارب مصالح آخر.
Acknowledgments
يعرب المؤلفون عن امتنانهم لمنح FAPESP 2015/22308-2 و 2019/23343-7 و 2019/26129-6 و 2020/06744-5 و 2021/05363-0 و CNPq و NIH R01 Grant GM131043 ومنح NSF MCB1714993 MCB1930165 للدعم المالي. تم إنتاج بيانات الشعر الجذري باستخدام البنية التحتية وتحت إشراف البروفيسور أندريا باسي والبروفيسور أليكس كوستا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Github | Github | https://github.com/badain/amebas | |
| Google Colab | https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb |
References
- Drubin, D. G., Nelson, W. J.
- Wodarz, A., Näthke, I. Cell polarity in development and cancer. Nature Cell Biology. 9 (9), 1016-1024 (2007).
- Palanivelu, R., Preuss, D. Pollen tube targeting and axon guidance: parallels in tip growth mechanisms. Trends in Cell Biology. 10 (12), 517-524 (2000).
- Portes, M. T., et al. The Pollen Tube Oscillator: Integrating Biophysics and Biochemistry into Cellular Growth and Morphogenesis. Rhythms in Plants: Dynamic Responses in a Dynamic Environment. , Springer. Cham. (2015).
- Wudick, M. M., et al. CORNICHON sorting and regulation of GLR channels underlie pollen tube Ca2+ homeostasis. Science. 360 (6388), 533-536 (2018).
- Hoffmann, R. D., et al. Plasma membrane H+-ATPases sustain pollen tube growth and fertilization. Nature Communications. 11 (1), 1-15 (2020).
- Michard, E., et al. Glutamate receptor-like genes form Ca2+ channels in pollen tubes and are regulated by pistil D-serine. Science. 332 (6028), 434-437 (2011).
- Damineli, D. S., Portes, M. T., Feijó, J. A. Oscillatory signatures underlie growth regimes in Arabidopsis pollen tubes: computational methods to estimate tip location, periodicity, and synchronization in growing cells. Journal of Experimental Botany. 68 (12), 3267-3281 (2017).
- Li, K., et al. An optimized genetically encoded dual reporter for simultaneous ratio imaging of Ca2+ and H+ reveals new insights into ion signaling in plants. New Phytologist. 230 (6), 2292-2310 (2021).
- Sadoine, M., et al. Designs, applications, and limitations of genetically encoded fluorescent sensors to explore plant biology. Plant Physiology. 187 (2), 485-503 (2021).
- Grenzi, M., et al. Illuminating the hidden world of calcium ions in plants with a universe of indicators. Plant Physiology. 187 (2), 550-571 (2021).
- Munglani, G., Vogler, H., Grossniklaus, U. Fast and flexible processing of large FRET image stacks using the FRET-IBRA toolkit. PLoS Computational Biology. 18 (4), 1009242 (2022).
- Ridler, T., Calvard, S. Picture thresholding using an iterative selection method. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 8 (8), 630-632 (1978).
- Portes, M. T., Feijó, J. Growing Arabidopsis pollen tubes expressing genetically encoded reporters for calcium and pH. , (2023).
- Candeo, A., Doccula, F. G., Valentini, G., Bassi, A., Costa, A. Light sheet fluorescence microscopy quantifies calcium oscillations in root hairs of Arabidopsis thaliana. Plant & Cell Physiology. 58 (7), 1161-1172 (2017).
- Romano Armada, N., et al. In vivo light sheet fluorescence microscopy of calcium oscillations in Arabidopsis thaliana. Methods in Molecular Biology. 1925, 87-101 (2019).
- Krebs, M., et al. FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca2+ dynamics. The Plant Journal. 69 (1), 181-192 (2012).
- Lee, T. -C., Kashyap, R. L., Chu, C. -N. Building skeleton models via 3-D medial surface axis thinning algorithms. CVGIP: Graphical Models and Image Processing. 56 (6), 462-478 (1994).
- Nunez-Iglesias, J., Blanch, A. J., Looker, O., Dixon, M. W., Tilley, L. A new Python library to analyse skeleton images confirms malaria parasite remodelling of the red blood cell membrane skeleton. PeerJ. 6, 4312 (2018).
